CN105934670A - 用于分离外泌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于从生物液体中分离外泌体的方法所述方法包括至少下述两个连续的亲和纯化步骤:a)第一步骤使用外泌体通用配体的至少一种特异性抗配体，以便获得外泌体群体P，将所述外泌体与所述抗配体分离，和b)第二步骤，其应用于所述外泌体群体P，使用外泌体亚群体SP特有配体的至少一种特异性抗配体，以便获得所述外泌体亚群体SP，将所述外泌体任选与所述抗配体分离。本发明还涉及此方法的应用。

Description

用于分离外泌体的方法
技术领域
本发明涉及一种用于从生物样品中分离外泌体的方法，和将这一方法作为工具用于表征所述样品中存在的外泌体的用途，以及在人或者动物中用于病理诊断和预后和/或病理临床分期的诊断和预后，并且用于监测病理演变、治疗与否的用途。
背景技术
外泌体是由不同细胞类型在体内分泌的直径40-120nm的质膜囊泡。鉴于他们的来源和他们的生物发生，外泌体反映了他们所来源的细胞的内含物和正常状态或病理生理状态。它们被发现于许多生物液体中诸如血液、血浆、血清、尿液、唾液、脑脊髓液(CSF)、淋巴液、胆汁、支气管肺泡灌洗液、精液、滑膜液、羊水、母乳、恶性腹水，……
对于增殖细胞诸如癌细胞而言，分泌过程是非常活跃的。他们从所述肿瘤细胞分泌，包含所述肿瘤细胞的核酸和蛋白质标记，因此，他们被看作是潜在的新颖癌症生物标记库。因此，对于他们的研究显示了科学界对于他们不断增长的兴趣。
对于他们的研究的主要限制在于，使用相关技术领域中可用的现有技术，从前述的不同生物液体中获得纯化且充分富集的制备物。实际上，鉴于由诸如超速离心或纳米过滤技术共纯化的，特别由蛋白质、微粒体组分或细胞器污染的制备物，或者鉴于源自免疫分离技术、几乎没有富集到外泌体而无法用于分析的制备物，参考文献强调了外泌体评估的复杂性。到目前为止，甚至这些技术的组合也未被证明是完全令人满意的。
以表征外泌体为目的而进行的大部分工作已经基于恶性细胞培养物展开。用纯化细胞在发育过程中分泌的外泌体的纯化技术处理这些培养物，并且测定所分离外泌体的蛋白质表达谱。因此，根据文章S.Mathivanan et al.,Mol Cell Proteomics.2010Feb；9(2):197-208，作者已经从人类结肠癌细胞系LIM1215中分离了外泌体。首先对培养基进行一系列超速离心处理，以便从其中分离具有40-100nm粒度的颗粒群体，接着使用特异识别结肠上皮细胞的人源化抗体A33对该颗粒群体进行免疫纯化。鉴定了394个蛋白质，属于多种蛋白质类别，有些是从人尿液细胞系培养物中和从鼠肥大细胞系培养物中分离的那些蛋白质所共有的，从而表明外泌体的多功能性作用。
外泌体的重要性已经确定，有必要提供用于分离外泌体的有效且特异的技术，同时具有可靠性、常规适用性，并且不要求大体积量的生物样品。
发明内容
本发明涉及一种用于分离外泌体的方法，其包括基于亲和分离技术的两个连续的分离步骤。这种依次分离赋予本发明的方法以高特异性。而且，其使得所述方法能够适用于每一种生物液体或流体样品。
本发明的方法构成了一种可以常规使用的工具。它克服了本领域技术人员到目前为止所面临的障碍，从而为表征外泌体开启了一条通用的捷径。
本发明的方法包括至少下述两个连续步骤：
a)亲和纯化第一步骤，其应用于生物液体，使用外泌体通用配体的至少一种特异性抗配体，以便获得外泌体群体P，将所述外泌体与所述抗配体分离，和
b)亲和纯化第二步骤，其应用于所述外泌体群体P，使用外泌体亚群体SP特有配体的至少一种特异性抗配体，以便获得所述外泌体亚群体SP，将所述外泌体与所述抗配体分离或者不分离。
在详细揭露本发明之前，将本文中使用的用于表征本发明的一些术语定义如下。
外泌体属于由生物液体中的细胞分泌的纳米囊泡组分。在结构上，它们是具有脂质双分子层的囊泡，在其表面包括蛋白质和糖类。他们根据其从30至200nm各不同的粒度来定义，更特别由至少40nm，或甚至至少50nm，以至多150nm，或甚至至多120nm和甚至至多100nm的粒度而定义。
术语生物液体和生物流体互换使用。生物液体由健康的或者患病的、诊断或未诊断的人或者动物产生。其直接地或间接地从人或动物中采集或穿刺而得。间接地理解为可能在人或动物中采集培养于合适的培养基中的细胞或者细胞组织，在所述合适的培养基中，所述细胞将分泌外泌体并且所述外泌体的全部或部分将被收集起来进行本发明的分离方法。作为非限定性的实例，我们会提到细胞上清液、粪便和骨髓收集物。
亲和纯化技术，理解为基于外泌体携带的外泌体配体和抗配体之间的特异相互作用或特异识别的一种技术。这种识别可能具有免疫学的性质并且形成免疫复合物，诸如抗原/抗体、表位/抗体、表位/抗体决定簇、抗原/抗体决定簇相互作用……然后是免疫纯化的问题。这种识别也可以具有任意其他性质，例如具有共价性质。这种技术允许从样品中分离仍与所述抗配体相连的外泌体，或者例如在洗脱之后与所述抗配体分离的外泌体。本发明的这种技术的一个优选实现方式主要是直接或间接地将所述抗配体连接到固相载体，例如磁珠、膜、色谱基质、微孔板，或者静止微流体装置上。
在间接连接的情况下，可以通过使用磁珠作为固相载体(例如膜)与抗配体之间的介质而实现抗配体与固相载体的连接。为了这样做，活化固相载体后方的磁体将允许磁珠连接到固相载体，并且钝化所述磁体将允许从固相载体分离，连接到抗配体上的外泌体相应地连接到磁珠上。
正常细胞理解为不具有可检测的标记或者可检测的标记水平的细胞，所述标记为细胞异常状态所特有。这一定义包括干细胞，特别是间叶细胞、神经细胞和造血细胞，这些细胞分泌非分化状态特有的外泌体。相比之下，如果细胞具有一种或若干种可检测的标记或者可检测的标记水平，所述标记为与正常细胞状态不同的状态，且特别是所述细胞的病理状态或者可能演化为病理状态的状态所特有，那么所述细胞被看作是异常的。这一定义特别包括癌细胞、肿瘤细胞、感染细胞、炎性细胞、免疫刺激细胞、日晒伤细胞，并且更一般地包括由任意类型的刺激物侵袭的细胞。
如上所示，尽管他们粒度很小，但外泌体的优势在于其积累了非常大量的蛋白质，这些蛋白质构成了他们的可溯性，并且这些蛋白质是分泌他们的细胞的精髓，特别是细胞组织、细胞正常或异常状态的本质……
本发明的方法包括亲和纯化第一步骤，其允许分离外泌体群体P，其基于外泌体特异性标记的存在，所述特异性标记可能在他们发育的阶段中呈现或暴露在外泌体表面。这些标记将被称为通用配体，是抗原、受体、生长因子，以及任意其他的颗粒或分子，和其任意部分，能够被抗配体特异地识别。
因此，该第一步骤提供至少一种特异地识别至少一种上述标记或配体的抗配体。根据配体对于外泌体的特异性，并且为了改进这一步骤的有效性，可以使用两种或两种以上抗配体，每种抗配体分别对于两种或两种以上通用配体是特异的，这些通用配体对于外泌体群体是特异的。根据本发明的一种变型，所述第一步骤仅包括一步单一的纯化，在此期间，使用前述抗配体中的一种或者若干种。根据本发明的另一种变型，所述第一步骤可以包括两个或两个以上连续的子步骤，每个子步骤分别涉及一种或者若干种通用配体的一种或者若干种特异性抗配体。
如实施例中所阐述，所述第一步骤导致获得外泌体群体P，其与外泌体通用配体的所述特异性抗配体分离。优选地，这一分离步骤在处于本领域技术人员能力范围内的条件下通过洗脱来实现，
这一第一步骤a)可以应用于如上文定义的任意生物液体。
可以事先处理这一液体。因此，不背离本发明范围的情况下，可以通过物理分离步骤根据粒度对所述生物液体进行预处理，允许分离不含有粒度大于800nm，优选500nm的分子或颗粒的生物液体组分，然后将所述生物液体组分进行第一步骤a)处理。
这一物理分离步骤可以通过任意合适的技术实现，诸如在离心技术和/或过滤技术(诸如连续过滤、超滤、大小排阻层析、和这些技术的组合)中选择的那些。
在亲和纯化连续步骤之前的这一物理分离步骤的一个优势在于其允许在实施所述亲和纯化步骤之前富集样品，从而产生甚至具有更高纯度的外泌体。
第一步骤a)完成时，获得外泌体群体P并且接着将其纳入本发明的方法的所述第二步骤b)中。
本发明的方法的所述亲和纯化第二步骤允许从所述外泌体群体P分离外泌体亚群体SP，其基于对有些外泌体特定或有些外泌体特有的特异性标记的存在，所述标记可能在他们发育的阶段中呈现或暴露在外泌体表面。这些标记将被称为特定配体，与通用配体相对，是抗原、受体、生长因子，以及任意其他的颗粒或者分子，和其任意部分，能够被抗配体特异地识别。
所述第二步骤b)提供至少一种特异地识别至少一种上述特定标记或配体的抗配体。根据所述配体对于所述外泌体的特异性，并且为了改进这一步骤的有效性，可以使用两种或两种以上抗配体，每种抗配体分别对于两种或两种以上特定配体是特异的。
如实施例中所阐述，并且取决于根据本发明分离的外泌体接着要涉及其中的技术，所述第二步骤导致获得外泌体亚群体SP，所述外泌体亚群体SP与外泌体亚群体SP的所述特有配体的所述特异性抗配体相连，或者所述外泌体亚群体SP与所述抗配体分离。在后面这一情况下，所获得的外泌体从每种载体上释放并且是可溶的。优选地，外泌体从抗配体分离在处于本领域技术人员能力范围内的条件下通过洗脱来实现
根据本发明的一种变型，所述第二步骤b)仅包括一步纯化步骤，其间使用一种或若干种前述抗配体。这一第二步骤b)的纯化可以通过涉及一种或若干种抗配体的若干子步骤实现，有助于分离相同的外泌体亚群体SP，所述外泌体亚群体SP因而将越来越特异。
根据本发明的另一种变型，本发明的方法包括至少一个亲和纯化第三步骤c)，这一步骤被应用于所述亚群体SP并且使用外泌体亚群体SP’特有配体的至少一种特异性抗配体，所述亚群体SP’被包括在所述亚群体SP中，以便获得所述亚群体SP’。与所述第二步骤b)类似，这一第三纯化步骤c)可以包括有助于分离相同的外泌体亚群体SP’的子步骤。
当然，一步或若干步额外的亲和纯化后续步骤可以进一步完善本发明的方法。在这种情况下，所述外泌体将在最后一步亲和纯化之前的亲和纯化期间与所述抗配体分离，然后所述外泌体在最后的纯化步骤期间可能与所述抗配体分离或者不分离。
亚群体SP和亚群体SP’是外泌体的特定群体。取决于所使用的特定抗配体，所述亚群体SP或者所述亚群体SP’可以集合在一起，例如，来自相同器官、相同细胞组织、或者相同细胞类型的外泌体。所述组织或者原始细胞可以是正常的或者异常的。
实际上，在阐明本发明的方法的实现和优势之前，在随后的实施例中，源自所述第一步骤a)的所述群体P可以在病理器官(例如前列腺肿瘤)特有配体的一种或若干种特异性抗配体存在下进行本发明的所述第二步骤b)，以便分离前列腺肿瘤特有外泌体亚群体SP。在另一实施方式中，所述群体P可以在器官(例如前列腺)特有配体的一种或若干种特异性抗配体存在下进行所述第二步骤b)，对于器官的正常或病理状态不做任何说明。为了改善所述分离方法，可以使用异常细胞标记配体的特异性抗配体对这一亚群体SP进行第三步骤c)处理，以便能够分离前列腺肿瘤特有外泌体亚群体SP’。也可能认为这一亚群体SP’是通过以下步骤获得的：在第二步骤b)中在异常细胞标记配体的特异性抗配体存在下处理源自所述第一步骤a)的群体P以便分离异常细胞特有的外泌体亚群体SP；然后，使用前列腺特有配体的特异性抗配体对这一亚群体SP进行第三步骤c)处理。
所述通用配体和/或所述特有配体可以选自多肽、蛋白质、抗原、受体、酶、生长因子、糖脂类、多糖，并且所述配体的特异性抗配体是抗体，抗体片段诸如F(ab’)2、scFv片段，抗体类似物，血凝素，适体，肽。根据本发明，所述通用配体或至少一种所述通用配体不同于所述特有配体或至少一种所述特有配体。
“抗体类似物”表示的意思是与抗体或抗体片段具有相同的结合能力或者相似结合能力的生物学和/或者化学组分。特别地，抗体类似物包括小蛋白质，其与抗体相似，能够与生物学靶标结合，从而允许检测所述靶标、捕获所述靶标或者单纯地在有机物中或在生物样品中靶向所述靶标。这些抗体类似物的应用领域几乎与抗体的应用领域一样广泛。作为实例，可以提到NanofitinesTM，其为AFFILOGIC公司的商业化小蛋白。
更特别的是，所述通用配体选自四跨膜蛋白家族的蛋白质，诸如四跨膜蛋白CD63、CD9、CD81；涉及黏附的蛋白质，诸如乳凝集素(或MFGE-8)、ICAM-1；涉及运输和Rab-GTPases家族膜融合的蛋白质，诸如Rab5和Rab7和膜联蛋白；以及主要组织相容性复合物(MHC)(诸如MHI、MHII)的分子。
优选地，亚群体的特有配体选自PSCA,膜联蛋白A3、PSMA,窖蛋白、B7H3、内源性逆转录病毒来源的蛋白质诸如包膜蛋白。
此外，本发明在于如前所述方法的用途，其用于表征和/或定量外泌体。如上文所示，根据本发明分离的外泌体可以与亲和纯化步骤b)中或者如果开展了亲和纯化的其他步骤时与亲和纯化的最后步骤中涉及的抗配体分离。
根据本发明的方法所分离的外泌体与每种载体分离并且是可溶的，其特别可用于如下所述说明性而非限制性的应用：
-纳米技术
-外泌体内容物测序/基因型分型
-疗法：纳米载体和治疗靶标的传递
-体外研究：细胞信使。
本发明的方法也可以应用于在患病的人或动物中用于病理诊断和预后和/或病理临床分期的诊断和预后，也用于监测病理演变、治疗与否，或者用于在患病的人或者动物中监测这一病理治疗的有效性。
该病理可以是慢性的或急性的感染源或非感染源。在所述方法的一种用途中，所述病理是腺瘤、癌、炎症、败血病、神经系统疾病诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症和阮病毒疾病，或者是妊娠病理，诸如先兆子痫。
所述治疗可以是药物治疗、放射疗法或移植。
附图说明
本发明阐明于下述实施例中，在所述实施例中所述方法应用于健康和患病患者(即患有前列腺癌的患者)的不同生物液体，用于第二步骤的抗配体是前列腺特有的。这些实施例涉及下述附图：
图1表示由本发明的方法，使用通用标记CD63和特异性标记PSMA(前列腺特异性膜抗原)和窖蛋白，从健康和患病受试者的血清池中免疫纯化的亚群体中，通过Rab5/CD63 ExoTEST夹心分析法以ng/μl检测外泌体。
图2表示由本发明的方法，使用通用标记CD63和标记AnxA3、PSCA(前列腺干细胞抗原)和B7H3(肿瘤上皮细胞和前列腺癌的标记)，从患病受试者的血浆CaP池中免疫纯化的亚群体中，通过Rab5/CD63ExoTEST夹心分析法以ng/μl检测外泌体。
图3是磁珠上的从血清池中分离的CD63/PSMA亚群体外泌体的TEM观察结果。
图4是磁珠上的从血清池中分离的CD63/AnxA3亚群体外泌体的TEM观察结果。
图5是从血清池中分离的CD63/AnxA3亚群体外泌体在洗脱(或解吸附)之后的TEM观察结果。
图6表示由本发明的方法，使用通用标记CD63和标记PSMA、窖蛋白和AnxA3，分别测试患有前列腺癌的受试者的2份血清P1和P2而免疫纯化的亚群体中，通过Rab5/CD63 ExoTEST夹心分析法，以ng/μl检测外泌体。
图7表示由本发明的方法，使用通用标记CD63和标记CD9、PSMA、和AnxA3，从CaP血浆池和EFS血浆池免疫纯化的亚群体中，通过Rab5/CD63 ExoTEST夹心分析法以ng/μl检测外泌体，。
图8表示使用纳米颗粒跟踪(Nanosight)技术和使用ExoTEST在血浆来源(EFS和CaP)的CD63/AnxA3亚群体中检测外泌体的比较结果。
图9表示使用纳米颗粒跟踪(Nanosight)技术和使用ExoTEST在血浆来源(EFS和CaP)的CD63/PSMA亚群体中检测外泌体的比较结果。
图10表示由本发明的方法，使用通用标记CD63和特异性标记PSCA，从患有前列腺癌的受试者(n＝6)和健康受试者(n＝3)的血清免疫纯化的亚群体中，通过Rab5/CD63 ExoTEST夹心分析法以ng/μl检测外泌体。
具体实施方式
实施例1：将本发明的方法应用于血液样品(血清或血浆)或尿液样 品，以便分离前列腺肿瘤细胞特有外泌体。
1)设备
1.1)生物液体样品
患病受试者样品
CaP血清池：
所述纯化方法借助血清池(V＝2.5ml)进行，所述血清池由处在前列腺癌不同阶段的患者的6份样品组成，使用格里森评分测量癌细胞的侵袭性，处在6至9的范围内(在2至10的等级)。
单独CaP血清：
对于源自上文所述样品池的2份单独血清的研究已经基于减至V＝1.2ml体积的血清展开，即测试样品减少1/2。其由分别来自具有7分和8分的格里森评分的患者的2份血清(P1和P2)组成。
CaP血浆池：
所述纯化方法已应用于血浆池(V＝2.5ml)，所述血浆池由处在前列腺癌转移阶段的患者的4份样品组成。
CaP尿液池：
Pool of urines CaP:
所述纯化方法已应用于以下患者的尿液池：患有前列腺癌格里森评分为7、进行直肠指诊后的患者(post-DRE)，患有前列腺癌格里森评分为7、进行按摩后的患者(CaP)，以及患有良性前列腺增生(BPH)的患者。
健康受试者样品
EFS血清池：
来自法国血液局(French Blood Establishment，EFS)的6位健康捐献者的血清样品使得构成EFS血清池(V＝2.5ml)，其作为研究的对照组。
EFS血浆池:
来自EFS的6位健康捐献者的血浆样品使得构成了EFS血浆池(V＝2.5ml)，其作为研究的对照组。
1.2)使用的抗体
他们列于下述表1中。
表1
抗体 克隆 类型 靶标 标记
抗-CD631 MX-49,129,5 小鼠单克隆 CD63 通用
抗-CD92 MEM-61 小鼠单克隆 CD9 通用
抗-PSM1 K1H7 小鼠单克隆 PSMA 前列腺癌
抗-PSCA3 5C2 小鼠单克隆 PSCA 前列腺癌
抗-AnxA34 13A12G4 小鼠单克隆 膜联蛋白A3 前列腺癌
抗-B7H31 4396 小鼠单克隆 B7H3 侵袭性癌症
抗-窖蛋白1 N-20 兔多克隆 窖蛋白 癌症
1:由圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Technology)提供
2:由Novus Biological公司提供
3:由西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)提供
4:由FR2968767A1中描述的bioMérieux公司生产
2)抗配体制备
前述的抗体与涂覆了链霉亲和素的磁珠(链霉亲和素M-280)偶联。
使用美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)销售的商业化试剂盒“一步抗体生物素化(One-step Antibody Biotinylation)”，根据供应商的说明事先进行抗体的生物素化步骤。
收集150μl体积的MP-280磁珠(即108磁珠)，然后用500μl缓冲液+0.5％吐温清洗5分钟。将试管放置在磁化载体上，以便去除上清液。添加在缓冲液+0.5％吐温中稀释为20μg/ml浓度的500μl抗-CD63、抗PSMA、抗-AnxA3、抗-窖蛋白或者抗-CD9人单克隆抗体并且在旋转搅拌下孵育30分钟。为了封闭游离位点，添加10mM生物素溶液并且在旋转搅拌下孵育30分钟。然后，用500μl缓冲液+0.5％吐温将磁珠清洗5次每次5分钟。链霉亲和素磁珠MP-280/生物素化抗体缀合物已备好用于与血液样品接触。
3)样品预处理
对血清或血浆样品优先进行超速离心处理，所述处理由下述的两步差速离心和过滤组成。
将样品(2.5ml体积)在+4℃以500g离心10分钟，以便排除血细胞和细胞碎片，然后在+4℃以16500g离心20分钟以从流体中除去微粒和凋亡小体。在0.45μm滤膜上进行过滤步骤以便排除细胞外囊泡和粒度大于450nm的蛋白质聚集体。
依次地对尿液样品也优先进行差速离心处理，然后在0.45μm滤膜上进行过滤。然后，在Vivaspin 20(阻滞10kD,Vivasciences)上将尿液浓缩5X。
4)应用本发明的方法的第一免疫纯化步骤a)，以获得群体P
对于这一步骤，靶标是四跨膜通用配体。
所使用的抗配体是抗-四跨膜抗体，更明确地是抗-CD63抗体。
借助抗-四跨膜CD63抗体的第一次免疫纯化通过2次孵育预处理的血液样品而进行。首先，通过将1.25ml体积的样品与链霉亲和素磁珠/生物素化抗-CD63抗体缀合物在室温下旋转搅拌孵育3小时进行一批次处理。剩下的1.25ml体积预处理血清与生物缀合物在室温下旋转搅拌批量孵育过夜。使用500μl缓冲液+0.5％Tween清洗5次每次5分钟。在与生物缀合物孵育2分钟之后，通过加入100μl洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸,HCl,pH 2.2+1mg/ml BSA)并轻轻涡旋几秒钟以进行最后的洗脱步骤。将14μl中和缓冲液(2M Tris,pH 9.5)添加到100μl第一洗脱体积E1中。进行第二次同样的洗脱+中和E2。混合洗脱液E1和E2并将228μl终洗脱体积保存在-80℃直至用于分析。
在相同的条件下，使用抗-四跨膜抗体抗-CD81对于患病患者(CaP)血清池进行这一免疫纯化步骤。
使用抗-四跨膜CD63抗体对CaP和BPH尿液池进行第一免疫纯化第一步骤处理。
5)应用本发明的方法的第二免疫纯化步骤b)，以获得亚群体SP
对于这一步骤，特有配体是PSMA、窖蛋白和膜联蛋白A3。
所使用的抗配体是抗-PSMA、抗-窖蛋白、抗-膜联蛋白A3抗体。
这一免疫纯化的第二步骤分别从4)步骤中获得的洗脱组分P CD63和P CD81进行。使用缓冲液将205μl体积的洗脱液P调整至终体积1200μl并且分为400μl的三份，之后用于与缀合物磁珠/生物素化抗-PSMA抗体、磁珠/生物素化抗-窖蛋白抗体和磁珠/生物素化抗-膜联蛋白A3抗体在室温下旋转搅拌接触3小时。使用500μl缓冲液+0.5％吐温清洗5次，每次5分钟。对于群体P应用相同的方法，进行两次洗脱，将获得的228μl终洗脱体积保存在-80℃直至用于分析。
获得了下述亚群体SP：CD63/PSMA、CD63/窖蛋白、CD63/膜联蛋白A3、CD81/PSMA、CD81/PSCA、CD81/膜联蛋白A3。
使用抗-PSMA抗体对CaP和BPH尿液池进行第二免疫纯化步骤处理。
实施例2：用于检测由本发明的方法纯化的外泌体的技术
1)通过ELISA、 (由HansaBiomed公司提供)免疫检测外 泌体
为了检测由前述本发明的方法所纯化的组分中是否存在外泌体，使用HansaBiomed公司商业化的ExoTEST测试。其由ELISA夹心法微孔板检测测试组成，使用针对蛋白质Rab5(属于RabGTPases家族)的单克隆抗体用于捕获和抗-CD63单克隆抗体用于检测。夹心法平台通过减少检测蛋白污染物而允许特异性捕获外泌体。此外，由于该试剂盒中包括的校正标准物的存在，该测试允许对来自生物样品和来自纯化并富集了外泌体的制备物中的外泌体进行定量。根据供应商的说明进行样品检测。
2)借助物理方法NTA(纳米颗粒示踪分析法)检测外泌体
NanoSight公司的商业化分析仪器LM10-HS允许测量和表征多分散样品内具有包括在10nm和1μm之间的粒度的所有类型的纳米颗粒。使用405nm激光激发纳米颗粒并且借助光学显微镜监测他们的布朗运动并用摄像机拍摄。随设备提供的软件(Nanosight 2.0)允许分析样品中存在的不同颗粒的粒度和浓度。
通过注射6次预先在0.22μm滤膜上过滤2次的1X PBS缓冲液而获得的测量值确定检测阈值。这一阈值对应与数值的平均值+3倍标准差，即0.42x108颗粒/ml。
在开始每一个操作时，控制用于稀释样品的1X PBS缓冲液的质量(临时在0.1μm滤膜上过滤)。空白数值不应该超过检测阈值。
根据本发明的方法免疫纯化的组分经1X PBS缓冲液稀释为1/50用于分析。源自超速离心预处理(参照实施例1和3)的组分用1X PBS稀释为1/500。
对于每一个样品，就注射5至6次后获得的浓度和粒度(模式和平均数)测量值计算变异系数(CV)。这些测量值允许评估样品NTA分析的再现性。
3)借助透射电镜(TEM)检测外泌体
通过透射电镜直接观察负染色之后上清液中的外泌体。观察到a)与磁珠偶联的外泌体和b)洗脱后，单独的外泌体。
实施例3：源自根据本发明的血清池的免疫纯化外泌体的检测应用
在本实施例中，将实施例2中揭露的不同检测技术应用于外泌体亚群体CD63/AnxA3和CD63/PSMA，所述外泌体亚群体源自经实施例1的4)和5)处理之后的实施例1的血清池。
1)使用 检测
从患有前列腺癌的患者的血清池CaP和来自健康捐献者的血清池(EFS)开始，借助Rab5/CD63 ExoTEST夹心法ELSIA检测实施对于通过通用和特异性依次免疫亲和所分离的循环外泌体的检测。用检测对应于各个所获得外泌体分离组分的1/4体积的测试样品。
图1和2显示了在第二免疫纯化步骤中针对不同测试标记获得的以ng/μl计外泌体浓度。
图1呈现了在下述组分中检测血清外泌体：
-群体CD63/PSMA对应于通过下述步骤源自根据本发明的双重免疫纯化方法的外泌体亚群体：使用针对通用配体CD63的抗配体，对于CaP(患有前列腺癌的受试者)血清池和EFS(健康受试者)血清池应用该方法的步骤a)；然后使用针对前列腺癌特异性标记PSMA的抗配体，对于由此分离的群体应用步骤b)。
-群体CD63/窖蛋白对应于通过下述步骤源自根据本发明的双重免疫纯化方法的外泌体亚群体：使用针对通用配体CD63的抗配体，对于CaP(患有前列腺癌的受试者)血清池应用该方法的步骤a)；然后使用针对前列腺癌特异性标记窖蛋白的抗配体，对于由此分离的群体应用步骤b)。
与来自健康捐献者的血清池相比，前列腺癌CaP血清池检测到较高浓度的外泌体。
图2呈现了在下述组分中检测血清外泌体：
外泌体亚群体CD63/AnxA3、CD63/PSCA和CD63/B7H3在通过下述步骤完成根据本发明的双重免疫纯化方法时获得：使用针对通用配体CD63的抗配体，对于CaP(患有前列腺癌的受试者)血清池应用该方法的步骤a)；然后分别使用针对特异性标记AnxA3、PSCA和B7H3的抗配体，对于由此分离的群体应用步骤b)。
已经通过Luminex夹心法免疫检测CD63/AnxA3亚群体的AnxA3来证实本发明的分离方法的特异性。这一检测非常灵敏，其计算出的检测极限为1.1pg/ml。通过这一检测，测量到在CD63/AnxA3亚群体中AnxA3浓度为50pg/mL。
下述表2给出了由应用于亚群体CD81/PSMA、CD81/PSCA、CD81/AnxA3所检测的外泌体浓度值：
表2
2)NTA检测
由NTA对于源自CaP血清池的CD63/AnxA3亚群体SP和CD63/PSMA亚群体SP实施的分析显示了外泌体的浓度，以及下述表3中呈现的纯化样品主要峰值粒度和平均峰值粒度。
表3
观察到，对于每一个所研究的标记而言，包括在90和100nm之间的主要峰值粒度的粒度分布曲线具有良好的再现性，并且与所描述的外泌体粒度保持一致。
3)TEM检测
通过透射电子显微镜实施所分离囊泡的形态学表征。
a)观察与磁珠相连的外泌体：
直接在与生物素化抗-AnxA3和抗-PSMA抗体缀合的磁珠(链霉亲和素M-280)上观察捕获的囊泡。因此，在借助抗-CD63抗体进行血清外泌体的第一免疫纯化步骤后，将洗脱液与涂覆有抗-AnxA3抗体或者涂覆有抗-PSMA抗体的磁珠孵育，在PBS中清洗并处理。
这一观察的结果呈现于下述图3(图3A和3B，针对CD63/PSMA亚群体SP)和图4(图4A和4B，针对CD63/AnxA3亚群体SP)中的图，其中呈现了在磁珠表面捕获的小囊泡。
b)观察洗脱后的单独外泌体：
通过在第一步骤中使用抗-CD63抗体和在第二步骤中分别使用抗-AnxA3抗体和抗-PSMA抗体,对7.5mL体积的血清池进行根据本发明的双重免疫纯化步骤。将CD63/AnxA3和CD63/PSMA各个亚群体SP用0.2M甘氨酸缓冲液2x60μl在pH为2.5条件下洗脱，然后进行中和。
这一观察的结果呈现于图5(图5A和5B)中。所观察囊泡具有的“杯形”形态和50至120nm的不同粒度是外泌体特有的，从而说明了本发明的方法的有效性。
实施例4:源自根据本发明的单独血清的免疫纯化外泌体的检测应用
在本实施例中，将实施例2中揭露的使用的检测技术应用于外泌体亚群体CD63/AnxA3和CD63/PSMA，所述外泌体亚群体源自经实施例1中的4)和5)处理后的实施例1中1.1的CaP(患病受试者)单独血清。
图6显示了针对源自患有前列腺癌的患者血清池的单独血清P1和P2所获得的外泌体浓度。外泌体群体PSMA、窖蛋白和AnxA3在通过下述步骤进行的本发明的双重免疫纯化方法后获得：使用针对通用配体CD63的抗配体，对于血清P1和P2应用该方法的步骤a)；然后分别使用针对特异性标记PSMA、窖蛋白和AnxA3的抗配体，对于由此分离的群体应用步骤b)。
实施例5:源自根据本发明的血浆池的免疫纯化外泌体的检测应用
在本实施例中，将实施例2中揭露的使用和通过NTA的检测技术应用于外泌体亚群体CD63/AnxA3和CD63/PSMA，所述外泌体亚群体源自经实施例1中的4)和5)处理后的实施例1中的CaP(患病受试者)血浆池和EFS(健康受试者)血浆池。
1)使用 检测
从患有前列腺癌的患者的血浆池和健康捐献者的血浆池开始，借助Rab5/CD63 ExoTEST夹心法ELSIA检测实施对于根据本发明的方法所分离的循环外泌体的检测。将所获得的不同外泌体分离组分用1X PBS稀释至1/2，并且用ExoTEST进行检测。
图7显示了在下述组分中获得的以ng/μl计外泌体浓度：
-群体CD63/PSMA对应于通过下述步骤源自根据本发明的双重免疫纯化方法的外泌体亚群体：使用针对通用配体CD63的抗配体，对于CaP(患有前列腺癌的受试者)血浆池和EFS(健康患者)血浆池应用该方法的步骤a)；然后使用针对前列腺癌特异性标记PSMA的抗配体，对于由此分离的群体应用步骤b)。
-群体CD63/AnxA3对应于通过下述步骤源自根据本发明的双重免疫纯化方法的外泌体亚群体：使用针对通用配体CD63的抗配体，对于CaP(患有前列腺癌的受试者)血浆池和EFS(健康受试者)血浆池应用该方法的步骤a)；然后使用针对前列腺癌特异性标记物膜联蛋白A3的抗配体，对于由此分离的群体应用步骤b)。
与用于PSMA标记的健康捐献者的血浆池相比，CaP血浆池观察到具有较高浓度的外泌体。
有趣的是，对于AnxA3标记而言，在健康捐献者的血浆池和CaP血浆池之间观察到浓度差，第一者浓度比第二者浓度高。
2)NTA检测
由NTA对于源自CaP血浆池和源自EFS血浆池的CD63/AnxA3亚群体SP和CD63/PSMA亚群体SP实施的分析显示了外泌体的浓度，以及下述表4中呈现的纯化样品主要峰值粒度和平均峰值粒度。
表4
主要峰值粒度与所描述的外泌体粒度一致。
图8和图9显示了两种技术ExoTEST和NTA之间的比较，其分别用于CD63/AnxA3亚群体SP和CD63/PSMA亚群体SP。观察到这两种检测技术之间的充分性。
实施例6：源自根据本发明的血浆的免疫纯化外泌体的检测应用
在本实施例中，将实施例2中揭露的使用的检测技术应用于外泌体亚群体CD63/PSCA，所述外泌体亚群体分别源自患有前列腺癌的患者的血浆和健康受试者的血浆。
图10显示了分别针对健康患者组(n＝3)和针对患有前列腺癌的患者组(n＝6)分离的CD63/PSCA亚群体SP中的外泌体平均浓度。在患病患者中观察到比健康患者更高水平的血浆外泌体。
实施例7：源自根据本发明的尿液池的免疫纯化外泌体的检测应用
由ExoTEST ELISA检测分析下述免疫纯化组分。结果呈现于下述表5中。
表5
检测到CaP池的外泌体浓度相对于BPH池高两倍。因此，递呈前列腺表面标记PSMA的尿样外泌体在患有CaP的患者的尿样中多两倍。
实施例8：特异性检测总前列腺特异性抗原(tPSA)标记
在CaP血清池和EFS血清池中，以及在纯化的外泌体组分中检测tPSA，以便验证双重免疫纯化后所获得外泌体组分的质量。
为了这一目的，在Luminex平台中调整TPSA VIDAS夹心分析法，使用单克隆抗体12C11C3进行捕获和生物素化抗体11E5C6用于检测。在悬浮液中使用微球体，这一技术允许在小体积的相同样品中以高灵敏度检测和定量许多生物分子。
具有5.6μm直径、基于其红光/红外含量递呈光谱范围的磁珠作为该检测的载体。将9μg量的捕获抗体12C11C3根据供应商的说明嫁接到磁珠(Bio-Rad,Bio-Plex Pro Magnetic COOH Beads Amine Coupling Kit)的表面。
对于血清池和血浆池分析，用TBST缓冲液将样品稀释至1/5。对于纯化的外泌体组分，使用所洗脱外泌体组分的1/8体积开展tPSA检测。
在与捕获抗体偶联的5000磁珠存在下将样品在96孔板(Bio-Rad,171025001)中于37℃、650rpm避光孵育2小时。在每一步骤之间，用0.05％TBST清洗孔三次。使用100μl生物素化的第二抗体11E5C6以0.005μg/ml的浓度在37℃搅拌1小时以进行检测。通过与100μl 2μg/ml浓度的偶联至藻红蛋白(RPE)的链霉亲和素(Dako)在37℃搅拌孵育30分钟，形成免疫复合物。最后的步骤主要是将免疫复合物重悬在100μlTBS中由Bio-Plex 200(Bio-Rad)自动化技术实施流式荧光分析。每个磁珠经历双重激发：红色激光(633nm)用于对其进行鉴定，且绿色激光(532nm)用于通过测量荧光缀合物而对分析物进行定量。
在Luminex上发展的该tPSA检测的分析检测极限达到1.1pg/mltPSA的极佳灵敏度。
CaP血清中的分析结果呈现于下述的表6中。
表6
Luminex tPSA检测结果表明，在CaP血清池中检测到血清tPSA标记的浓度为2.98ng/ml。血清池经纯化后，在所纯化的外泌体组分中没有检测到tPSA标记或者检测到很少。这一结果显示了由本发明的方法获得的经纯化外泌体组分的质量，其中在所纯化的制备物中去除了可溶性蛋白质tPSA标记。
实施例9：该方法的重复性和再现性
在4天时间内研究了本发明的分离方法的重复性(也就是组内精密度)和再现性(也就是组间和日间精密度)。
进行该测试用于从患病患者的血清池中分离CD63/AnxA3和CD63/PSMA外泌体亚群体。外泌体免疫检测由ExoTEST实施，并且结果呈现于下述表7中。
表7
对于配体AnxA3观察到非常好的重复性，CV为4.87％。对于这一标记，日间的再现性也显示很好的7.5％的CV。
对于特异性标记PSMA，观察到稍为显著但仍完全可以接受的变动。

Claims (19)

1.一种用于从生物液体中分离外泌体的方法，其特征在于其包括至少下述两个连续的亲和纯化步骤:
a)第一步骤使用外泌体通用配体的至少一种特异性抗配体，以便获得外泌体群体P，将所述外泌体与所述抗配体分离，和
b)第二步骤，其应用于所述外泌体群体P，使用外泌体亚群体SP特有配体的至少一种特异性抗配体，以便获得所述外泌体亚群体SP，将所述外泌体与所述抗配体分离或者不分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述第二步骤使用至少两种抗配体，所述抗配体中的每一种对于群体SP1和SP2各自的特有配体是特异的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述第一步骤使用至少两种抗配体，所述抗配体中的每一种对于所述外泌体各自的通用配体是特异的。
4.根据权利要求1至3中任意权利要求所述的方法，其特征在于其包括至少一个亲和纯化第三步骤c)，这一步骤被应用于所述亚群体SP并且使用外泌体亚群体SP’特有配体的至少一种特异性抗配体，所述亚群体SP’被包括在所述亚群体SP内，以便获得所述亚群体SP’。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述第三步骤使用至少两种抗配体，所述抗配体中的每一种对于亚群体SP’1和SP’2各自的特有配体是特异的。
6.根据权利要求1至5中任意权利要求所述的方法，其特征在于所述外泌体通用配体和/或所述外泌体亚群体SP特有配体或所述外泌体亚群体SP’特有配体从呈现在所述外泌体表面的配体中选择。
7.根据权利要求1至6中任意权利要求所述的方法，其特征在于所述外泌体亚群体是来自相同器官的外泌体亚群体。
8.根据权利要求1至7中任意权利要求所述的方法，其特征在于所述外泌体亚群体是来自相同组织的外泌体亚群体。
9.根据权利要求1至8中任意权利要求所述的方法，其特征在于所述外泌体亚群体是来自相同细胞类型的外泌体亚群体。
10.根据权利要求1至9中任意权利要求所述的方法，其特征在于所述外泌体亚群体是来自健康组织或细胞，或者来自异常组织或细胞的外泌体亚群体。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述异常组织或细胞为肿瘤。
12.根据权利要求1至11中任意权利要求所述的方法，其特征在于所述配体是来自前列腺的外泌体亚群体SP特有的。
13.根据权利要求1至12中任意权利要求所述的方法，其特征在于，在所述第一步骤a)之前，所述生物液体经过一步依据粒度的物理分离步骤处理，其允许分离不包含粒度大于800nm，优选500nm的分子或微粒的生物液体组分，所述生物液体组分将进行所述第一步骤a)处理。
14.根据权利要求1至13中任意权利要求所述的方法，其特征在于，步骤a)完成时，通过洗脱将所述外泌体与所述抗配体分离。
15.根据权利要求1至14中任意权利要求所述的方法，其特征在于，步骤b)完成时，通过洗脱将所述外泌体与所述抗配体分离。
16.根据权利要求1至15中任意权利要求所述的方法的用途，其用于表征和/或定量外泌体。
17.根据权利要求16所述的用途，其在人或者动物中用于病理诊断和预后和/或病理临床分期的诊断和预后，和用于监测病理演变、治疗与否，或者用于监测病理治疗的有效性。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于所述病理是慢性的或急性的感染源或非感染源。
19.根据权利要求17或18所述的用途，其特征在于所述治疗是药物治疗、放射疗法或者移植。
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