CN104345154B - 一种检测多肿瘤相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测多肿瘤相关“多肽‑蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒。该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，其中，捕获抗体与前体蛋白HKa特异性结合；检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合。采用本发明提供的试剂盒检测HKP09/HKP15‑HKa组合式标志物具有良好的准确性和灵敏性。其最低检测限为1.7ng/mL，检测范围为6ng/mL～120ng/mL。实验表明，本发明的试剂盒能够显著区分6种肿瘤样本(胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌)和正常人样本。本发明的试剂盒检测灵敏度和特异性高，适用于临床多肿瘤相关组合式标志物的早期筛查。

Description

一种检测多肿瘤相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹 心试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测多肿瘤相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒。

背景技术

恶性肿瘤在全球的发病率和死亡率正越来越高，已经成为威胁人类生命健康的第一杀手。随着大气污染、粉尘侵袭和雾霾等严重影响生活环境的因素存在，肺癌已经排在了全球的恶性肿瘤之首；由于饮食不规律，也使得胃癌、食管癌和肠癌等消化系统肿瘤也上升为主要的恶性肿瘤；同时，酒精摄入过量、脂肪堆积过多、以及人口流动所带来的病毒性肝炎传染加快等因素，肝癌已成为了我国的代表性恶性肿瘤之一；此外，乳腺癌这类恶性肿瘤的突发也严重影响着女性的生活质量。恶性肿瘤的积极防治和有效治疗，对于提高人类的健康水平，有着重大的意义。

随着科技手段的迅猛发展，对肿瘤的治疗方法和手段日渐丰富，肿瘤切除和器官移植仍然是肿瘤患者治疗的主要方法，但真正意义上的肿瘤根治，在临床应用上仍然难以实现，因此肿瘤的早期发现和早期诊断，变得尤为重要。需要注意的是，早期的肿瘤发病隐匿、无明显症状、病理活检或影像学检查难以定位出微型肿瘤病发区，导致了多数肿瘤患者就诊时已失去手术治疗的机会。因此，开发出更灵敏的检查技术或更特异的生物标志物，已经成为了当前的恶性肿瘤早期诊断研究热点和难点，一旦这类研究成果出现，将大大的促进肺癌、消化道癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤实现早期诊断，并将带来巨大的社会价值和市场价值。

对多种肿瘤同时进行生物标志物的表达水平检测，既可以提高肿瘤的防范，又可以降低多种肿瘤标志物单独检测时所造成的高成本。多肿瘤检测的代表性研究主要是多肿瘤标志物蛋白芯片和全自动化学发光检测。有报道称多肿瘤标志物蛋白芯片在健康体检中的应用价值较明显，而对确诊的肿瘤患者,化学发光检测变得更加可靠。多种肿瘤标志物芯片检测系统是将试剂点到一定的固相上，然后与待检的组织或细胞“结合”,再通过自动化仪器检测其结果，具有高通量、高效率、研究全面、诊断更准确、方法简易等优势，但多数研究目前仍停留在实验室阶段，相关产品的报道较少。

近年来，生物标志物联检在肿瘤的早期诊断中的应用研究得到很大重视。当机体发生病变甚至是癌变时，干扰了正常的蛋白代谢，刺激了酶降解蛋白形成多肽的进程，也打破了血清多肽和前体蛋白在机体的存在平衡。通过分析可以查找出哪些血清多肽或前体蛋白与机体病变和病变程度相关，这些血清多肽或前体蛋白就成为了研究某些疾病的潜在标志物。目前，被人们所认可的生物标志物多为血清蛋白标志物，也有少量解离的多肽标志物，但对于蛋白标志物来说，普遍存在疾病敏感性不强的问题，而蛋白所解离的多肽标志物分子量小、抗原表位少等缺陷，难以实现特异性高的双抗体夹心ELISA，使得多肽标志物研究的存在着检测成本高、操作复杂的问题。因此，未完全解离的多肽-前体蛋白成为了肿瘤标志物的理想选择。

高分子量激肽原(High Molecular Weight Kininogen.缩写为HWMK或HK)是血浆中的一种糖蛋白，分子量120kDa，其分子可划分为6个结构域，其中D1、D2和D3组成分子的重链，D4含有缓激肽肽段，D5和D6区组成分子的轻链。HK被激肽释放酶活化，释放D4区的缓激肽并产生双链高分子激肽原(HKa)。HKa的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。HK转变为HKa后，发生较大的构像变化，使D5区暴露更加明显，D5是HKa的活性中心，发挥HKa的主要作用，如介导炎症反应、抑制血管内皮细胞增殖及转移、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长与转移等。Villanueva J等人的研究报道称HKa蛋白所降解获得的相关肽段可诊断乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种肿瘤。

但是，目前对于新型的“多肽-蛋白组合式标志物”仍鲜有研究，因此，研制一种能够用于多肿瘤检测的组合式标志物检测试剂盒是十分必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测多肿瘤相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒。本发明提供的试剂盒能够对血清中的“HKP09/HKP15-HKa”实现灵敏和准确的检测。

蛋白HKa和多肽HKP09、多肽HKP15同属于激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system，KKS)代谢通路。本发明通过实验发现，多肽标志物HKP15和HKP09由HKa代谢产生。具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D4区，具体位于HKa蛋白的381～389位氨基酸，命名为HKP09。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D5区，具体位于497～511位氨基酸，命名为HKP15。HKP09和HKP15即为HKa降解，多肽HKP09和HKP15以未完全解离的形式存在于HKa表面。采用多肽及其前体蛋白两种特异性抗体，对HKP15/HKP09-HKa标志物进行定量检测，或许可以更精确的反映样品中标志物的表达情况，更加精确的区分胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌样品与正常人样品。

本发明提供的“多肽-蛋白组合式标志物”的关键是前体蛋白结构中的特定多肽与对应的游离型的特定多肽序列结构完全一致、免疫特性一致，多肽通过酰胺键或二硫键等化学键形式存在于前体蛋白表面，是前体蛋白的一个重要结构域，多肽和蛋白互不干扰各自的免疫学特异性结合位点。本发明提供的“多肽-蛋白组合式标志物”首次将激酶降解的多肽HKP09及HKP15与其前体蛋白HKa进行优化组合，在检测时可同时分析紧密联系的多肽和前体蛋白，而不能完全孤立的去分析蛋白或者多肽。突破“混合式”或单一标志物的局限，最终实现该新型标志物与疾病之间的内在联系。所述组合式标志物不同于单一蛋白标志物或单一多肽标志物，也不能理解为单一多肽和蛋白的简单混合。

本发明提供了一种检测胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒，包括捕获抗体和检测抗体；

捕获抗体与蛋白HKa特异性结合；

检测抗体与多肽HKP15、多肽HKP09或蛋白HKa均特异性结合；

多肽HKP09的全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

多肽HKP15的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

蛋白HKa的全长氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明中通过对比多种肿瘤患者血清差异谱，筛选出肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、食管癌和肠癌中异常表达的多肽HKP09和多肽HKP15，再利用数据库和免疫共沉淀技术，查找出HKP09和HKP15的前体蛋白为HKa。蛋白HKa、多肽HKP09和多肽HKP15共同存在于激肽释放酶—激肽系统(Kallikrein—Kinin system，KKS)代谢通路，该代谢通路与多种肿瘤的发生发展有着一定相关性。在“多肽-蛋白组合式”标志物中，多肽HKP09和HKP15通过酰胺键或二硫键等化学键形式存在于HKa表面。

作为优选，捕获抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

优选的，捕获抗体为单克隆抗体。

作为优选，检测抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

优选的，检测抗体为单克隆抗体。

作为优选，捕获抗体由保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆细胞株2G6分泌。

作为优选，检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。

其中，捕获抗体与蛋白HKa特异性结合；检测抗体与多肽HKP09和HKP15特异性结合；同时，捕获抗体与检测抗体的抗原结合表位不同，进一步理解为捕获抗体不与多肽HKP09或多肽HKP15特异性结合。

作为优选，检测抗体结合有标记物质。

优选的，标记物质为酶。

更优选的，酶为辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶ALP

最优选的，检测抗体上标记HRP酶。

作为优选，本发明所提供的试剂盒还包括HKa标准品、碳酸盐包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、卵清蛋白封闭剂、底物液、硫酸终止液和96孔酶标板。

本发明提供的试剂盒中捕获抗体可以为独立分装，也可包被于酶标板，本发明对此不作限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。

在本发明的实施例中，HKa标准品的浓度为0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL。

底物液以酶催化显色或发光，优选的，底物液为OPD显色液、TMB显色液或NBT/BCIP显色液。

更优选的，底物液为TMB显色液。

优选的，包被缓冲液为0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液。

优选的，洗涤缓冲液为20mmol/L，pH7.4的PBST缓冲液。

优选的，卵清蛋白封闭剂的质量分数为2％。

优选的，终止液为2mol/L的硫酸水溶液。

本发明提供的检测试剂盒在制备在制备胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌双抗体夹心检测产品中的应用。

本发明还提供了试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

步骤1：以捕获抗体捕获待测样品中的组合式标志物中的蛋白HKa；

步骤2：以检测抗体检测上述已捕获的蛋白HKa的表位多肽HKP09或多肽HKP15；

步骤3：根据检测值绘制标准曲线，获得待测样品中“多肽-蛋白组合式标志物”的含量。

本发明提供的试剂盒的使用方法中，标准曲线以HKa标准品溶液的浓度为横坐标，以相应浓度孔中的OD₄₅₀值的平均值为纵坐标。

作为优选，试剂盒中捕获抗体由保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆细胞株2G6分泌。

作为优选，试剂盒中检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。

作为优选，试剂盒中的捕获抗体包被于固相载体。

优选的，固相载体为酶标板。

作为优选，试剂盒中的检测抗体上含有标记物质。

优选的，标记物质为辣根过氧化物酶HRP。

作为优选，捕获抗体的包被浓度为1000ng/mL。

作为优选，检测抗体的检测滴度为1：2000。

作为优选，本发明提供的试剂盒的使用方法包括以下步骤：

步骤1：取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板，分别加入0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL的HKa标准品或以1:20稀释的待测血清样本，每孔100μL。37℃静置孵育1.5小时；

步骤2：弃溶液，各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次，拍干；

步骤3：每孔加入100μL经HRP标记的检测抗体，37℃静置孵育40分钟；

步骤4：弃溶液，各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次，拍干；

步骤5：每孔加入100μL与HRP相作用的TMB底物显色液，37℃避光显色15分钟；

步骤6：每孔加入50μL,2mol/L的硫酸终止液，用酶联检测仪测定OD₄₅₀值。

步骤7：平行测量3次，以HKa标准品溶液的浓度为横坐标，以相应浓度孔的OD₄₅₀值的平均值为纵坐标，绘制标准曲线和线性方程，将待测样本的OD₄₅₀值带入线性方程，计算得到样本中的组合式标志物含量。

本发明提供了一种试剂盒及其应用，该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体；其中，捕获抗体与蛋白HKa特异性结合；检测抗体与多肽HKP09、多肽HKP15或蛋白HKa特异性结合。采用本发明提供的试剂盒能够检测与胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌相关的“多肽-蛋白组合式标志物”，且具有良好的准确性和灵敏性。实验表明，本发明提供试剂盒的最低检测限为1.7ng/mL，检测范围为6ng/mL～120ng/mL。对108例正常人血清中HKP09/HKP15-HKa的含量进行分析统计，计算出正常人中该标志物的含量不高于28.4ng/mL。

本发明通过ROC曲线分析，本发明提供的试剂盒检测肠癌和正常样本的特异性、灵敏度均在90％以上；检测食管癌和正常样本的特异性为86.2％，灵敏度为93.75％；检测胃癌和正常样本的特异性为86.2％，灵敏度为84.4％；检测乳腺癌和正常样本的特异性为83.5％，灵敏度为81.2％；检测肺癌和正常样本的特异性为95.4％，灵敏度为75.0％；检测肝癌和正常样本的特异性为66.1％，灵敏度为96.9％。上述结果表明，本发明的试剂盒能够显著区分多种肿瘤(肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、肠癌)和正常人样本，检测灵敏度和特异性高。

生物保藏说明

2G6，分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.9332，于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

3D11，分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCC No.9331，于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1示本发明提供试剂盒捕获抗体与检测抗体的检测条件优化；

图2示本发明提供试剂盒检测HKa标准品的标准曲线；

图3示HKP09/HKP15-HKa标志物在108例正常人中含量分布；

图4示HKP09/HKP15-HKa标志物在多肿瘤与正常人血清样本中含量；

图5示本发明提供的试剂盒检测肠癌样品的ROC曲线图；

图6示本发明提供的试剂盒检测食管癌样品的ROC曲线图；

图7示本发明提供的试剂盒检测胃癌样品的ROC曲线图；

图8示本发明提供的试剂盒检测乳腺癌样品的ROC曲线图；

图9示本发明提供的试剂盒检测肺癌样品的ROC曲线图；

图10示本发明提供的试剂盒检测肝癌样品的ROC曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种检测多肿瘤相关“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂及材料皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：捕获抗体与检测抗体的检测条件优化

1)将捕获抗体用包被缓冲液分别稀释成50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL，按照100μL/孔，4℃放置过夜。

2)取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板，各孔加入100ng/mL的HKa标准品，每孔100μL。37℃静置孵育1.5小时；

3)弃溶液，各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次，拍干；

4)用PBST将HRP标记的检测抗体分别按照1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000稀释，每孔加入100μL，37℃静置孵育40分钟；

5)弃溶液，各孔用300μL PBST洗涤缓冲液清洗5次，拍干；

6)各孔加入100μL与HRP相作用的TMB底物显色液，37℃避光显色15分钟；

7)各孔加入50μL,2mol/L的硫酸终止液，用酶联检测仪测定OD₄₅₀值。

以不同捕获抗体的包被浓度为横坐标，以不同检测抗体工作滴度所对应的OD₄₅₀值为纵坐标，绘制散点图，以OD₄₅₀值为1.5处的明显拐点所对应的捕获抗体浓度和检测抗体滴度为最佳的抗体工作条件。由图1中的椭圆形虚线框所标示处的拐点，可得捕获抗体的较优包被浓度为1000ng/mL，检测抗体的较优工作滴度为1：2000。

实施例2：试剂盒的制备

1、试剂的配制

碳酸盐包被缓冲液：pH9.6，0.1mol/L，称取Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g

加去离子水至1000mL。

PBST洗涤缓冲液：pH值为7.4，其中包括80mmol/L的Na₂HPO₄、20mmol/L的KH₂PO₄、100mmol/L的KCl、1400mmol/L的NaCl、体积分数为0.5％的Tween-20。

TMB显色液：底物显色A液：醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30％双氧水0.3mL,蒸馏水加至500mL；底物显色B液:乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50mL,取0.15g TMB溶于3mLDMSO中，蒸馏水加至500mL。取底物显色A液与底物显色B液等体积混合，即得TMB显色液。

硫酸终止液：配制浓度为2M的硫酸水溶液。

2、捕获抗体的包被

取保藏编号为CGMCC No.9332的单克隆杂交瘤细胞株2G6，经小鼠体内诱生制得与HKa特异性结合的单克隆抗体，用包被液稀释至浓度为1000ng/mL。取100μL置于96孔酶标板板中，4℃放置过夜；弃包被液，用20mmol/L、pH7.4的PBST缓冲液300μL清洗5次，拍干；加入300μL质量分数为2％的OVA封闭液，37℃静置封闭2小时；弃OVA封闭液用20mmol/L、pH7.4PBST缓冲液300μL清洗5次，拍干。

3、检测抗体的标记

取保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆杂交瘤细胞株3D11，经小鼠体内诱生制得能与多肽HKP15/HKP09特异性结合的单克隆抗体，在抗体上标记HPR酶，以PBST缓冲液稀释，使最终检测滴度为1:2000。

4、分装

取PBST缓冲液、TMB显色液、硫酸终止液、经标记的检测抗体，包被有捕获抗体的酶标板分别独立包装，即得。

实施例3：试剂盒最低检测限及检测范围的鉴定

取实施例2制得的试剂盒，配制梯度浓度的HKa标准品溶液为待测样品，HKa标准品的浓度为：0ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL、150ng/mL。

取试剂盒中包被有捕获抗体的酶标板，分别加入不同浓度的HKa标准品溶液，每孔100μL，每一浓度重复3次。37℃静置孵育1.5小时；弃溶液，各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次，拍干；

各孔加入100μL以HRP标记的检测抗体，37℃静置孵育40分钟；弃溶液，各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次，拍干；

各孔加入100μL TMB显色液，37℃避光显色15分钟；加入50μL 2mol/L硫酸溶液，终止反应；用酶联检测仪测定OD₄₅₀值。

以HKa标准品溶液的浓度为横坐标，以相应浓度孔中的OD₄₅₀值的平均值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。该标准曲线回归方程为y＝0.0146x+0.0043，R²＝0.9993。

如图2所示，本发明提供的试剂盒的检测范围为6ng/mL～120ng/mL，最低检测限为1.7ng/mL，

实施例4 试剂盒的使用

取实施例1制备的试剂盒，以肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、肠癌肿瘤患者的血清为待测样品，以正常人血清为阴性对照样品，说明本发明提供试剂盒的使用方法。

实验设计如表1所示：

表1 实验设计

分别取各组待测样品，每个血清样品以试剂盒中提供的PBST缓冲液按1:20稀释后，取100μL加入包被有捕获抗体的酶标板上，37℃静置孵育1.5小时；弃溶液，各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次，拍干；各孔加入100μL以HRP标记的检测抗体，37℃静置孵育40分钟；弃溶液，各孔用300μL试剂盒中PBST缓冲液清洗5次，拍干；各孔加入100μL TMB显色液，37℃避光显色15分钟；加入50μL 2mol/L硫酸溶液，终止反应；用酶联检测仪测定OD₄₅₀值。根据实施例3绘制的标准曲线，确定各血清样品中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的含量。

表2 各组血清样品中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的含量

另外，“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”在正常人中的含量分布如图3所示，各肿瘤和正常人血清样品中的含量差异如图4所示。

结果显示：108例正常人血清中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的平均含量为10.9mg/mL，检测值的标准偏差SD为8.78，以平均值+2SD作为其在正常人群的界定值，含量为28.4ng/mL，依据此界定值作为区分标准，则所检测的108例正常人样本中，有103例的检测值低于28.4ng/mL，与临床阴性符合率为95.37％。与正常样本相比，各肿瘤组样本的标志物含量要显著升高(P<0.001)。其中，HKP09/HKP15-HKa标志物在肺癌、胃癌、肠癌、食管癌样本中平均含量最高，乳腺癌中含量次之，在肝癌中的含量相对低。

可见，采用本发明提供的试剂盒,通过检测“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”在血清中的含量，可以区分正常人与多肿瘤(肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、肠癌)。正常人血清中“HKP09/HKP15-HKa组合式标志物”的界定值不高于28.4ng/mL。

实施例5 试剂盒检测特异性和灵敏度检测

根据实施例4提供的检测结果，分别绘制各患者血清样品的ROC曲线(受试者工作特征曲线)，结果表明：

检测肠癌和正常样本的特异性为92.7％、灵敏度为93.7％，如图5；

检测食管癌和正常样本的特异性为86.2％，灵敏度为93.75，如图6；

检测胃癌和正常样本的特异性为86.2％，灵敏度为84.4％，如图7；

检测乳腺癌和正常样本的特异性为83.5％，灵敏度为81.2％，如图8；

检测肺癌和正常样本的特异性为95.4％，灵敏度为75.0％，如图9；

检测肝癌和正常样本的特异性为66.1％，灵敏度为96.9％，如图10。

综合结果表明，本发明的试剂盒能够显著区分多肿瘤样本(肠癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝癌)和正常人样本，检测灵敏度和特异性高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种检测胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌“多肽-蛋白组合式标志物”的双抗体夹心试剂盒，其特征在于，包括捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体与蛋白HKa特异性结合；所述检测抗体与多肽HKP15/HKP09特异性结合，

所述多肽HKP09的全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述多肽HKP15的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述蛋白HKa的全长氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述检测抗体由保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆细胞株3D11分泌。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体由保藏编号为CGMCCNo.9332的单克隆细胞株2G6分泌。

4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HKa标准品、碳酸盐包被缓冲液、PBST洗涤缓冲液、卵清蛋白封闭剂、底物液、硫酸终止液和96孔酶标板。

5.如权利要求1～4任一项所述的试剂盒在制备胃癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌双抗体夹心检测产品中的应用。