KR20120116518A - 폐암 조기 진단용 ＸＡＧＥ-1ａ 마커 및 이의 용도 - Google Patents

폐암 조기 진단용 ＸＡＧＥ-1ａ 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 조성물, 폐암 조기 진단용 키트 및 폐암 조기 진단용 마이크로어레이, 상기 XAGE-1a 단백질 특이적 항체를 이용하여 폐암 조기 진단용 혈액 마커 XAGE-1a의 검출 방법 및 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암의 예후(prognosis) 예측용 조성물에 관한 것이다.

Description

폐암 조기 진단용 ＸＡＧＥ-1ａ 마커 및 이의 용도{XAGE-1a marker for early diagnosis of lung cancer and uses thereof}
본 발명은 폐암 조기 진단용 XAGE-1a 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 조성물, 폐암 조기 진단용 키트 및 폐암 조기 진단용 마이크로어레이, 상기 XAGE-1a 단백질 특이적 항체를 이용하여 폐암 조기 진단용 혈액 마커 XAGE-1a의 검출 방법 및 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암의 예후(prognosis) 예측용 조성물에 관한 것이다.
2008년에 발표된 한국중앙암등록본부 자료에 의하면 2003~2005년 우리나라 연평균 암 발생 중 폐암은 남녀를 합쳐서 전체 암 발생의 12.1%로 2위를 차지하였으며, 인구 10만명 당 발생률은 33.2건이었다. 남녀의 성비는 3.83:1로 남자에게서 더 많이 발생하였고, 발생 건수로는 남성의 암 중에서 2위를 차지하였고 여성의 암 중에서는 5위를 차지하였다. 남녀를 합쳐서 본 연령대별로는 60대가 34.3%로 가장 많고, 70대가 31.0%, 50대가 14.6%의 순이다. 더욱이 폐암은 흡연 인구의 증가 및 대기오염 등의 원인으로 우리나라에서도 급속히 증가하고 있는 종양이며, 암 종별 사망률은 21.4%로 1위이고, 남녀 사망률은 24.9% 및 15.1%로 각각 1위 및 2위이다.
폐암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직 침범 또는 기도폐쇄 및 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 환자의 10~15% 정도에서는 아무런 증상이 없이도 정기 검진에서 폐암으로 진단된다. 또한, 대부분의 폐암이 진단 당시에는 상당히 진행된 상태가 되므로 완치가 어려운 경우들이 대부분이라는 문제가 있다. 따라서 폐암을 조기에 진단하여 폐암으로 인한 사망률을 줄이는 것이 시급한 문제이다(Wulfkuhle et al., Nat. Rev. Cancer 3, 267-275, 2003).
폐암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 사용되고 있는데, 현재까지는 종양의 크기를 측정하는 방법, 림프절로의 전이 유무를 조사하는 방법, 폐 종양 조직이나 림프절 등을 생검하여 면역조직화학방법으로 분석하는 방법, 흉부 전산화 단층 촬영 및 기관지 내시경 등을 이용하고 있다(Manser et al., Curr. Opin. Pulm. Med. 10, 266-271, 2004). 그러나, 흉부 단층 촬영의 경우 폐암의 크기가 약 0.1 cm 이상 되어야 측정가능한데, 이 시기는 이미 암이 다른 조직으로 전이되었을 가능성이 높으며, 내시경이 기관지로 삽입되어 폐 내부를 직접 관찰할 수 있는 기관지 내시경 방법은 폐 말단에 있는 종양을 관찰하기 곤란한 한계를 가지고 있다.
따라서, 폐암 마커를 이용하여 암을 진단하기 위한 연구들이 진행되었는데, 다중 표적유전자나 단백질의 발현을 조사함으로써 폐암 진단 마커를 발굴한 연구는 이미 보고되었으며, 마이크로어레이 기술을 이용하여 폐암 마커 유전자를 발굴하고 암을 진단하려는 보고도 있었다(Hibi et al., Am. J. Pathol. 1999, 155: 711-715). 또한, 환자의 혈액에서 AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine transaminase), 총 빌리루빈(total bilirubin) 또는 크레아티닌(creatinine)의 농도를 측정하여 폐암을 진단하려는 시도가 있었다(Nagamine et al., Clin. Chem. 29, 379-381, 1983). 그러나, 이러한 종양 마커들에 대한 연구에도 불구하고 아직까지 제한적으로 사용되고 있을 뿐 공식적으로 권장되고 있는 폐암 혈액마커는 없는 실정이다. 본 발명에서 대조군으로 사용한 CEA(carcinoembryionic antigen)는 결장암의 마커로 알려져 있지만 폐암 및 췌장암에서도 높은 친화도를 보여 간접적인 폐암 표지자로 보고되고 있다(Hansen et al. Human Pathology, 1974, 5(2), 139-147). 또한 CYFRA 21-1(사이토케라틴 19 절편)은 폐암 마커로서 발굴되었으나 최근 유방암에서도 발현이 확인되어 폐암에 대한 특이 마커는 부족한 형편이다(Nakata et al. British Journal of Cancer, 2004, 91, 873-878).
본 발명자들은 폐암 세포에서 발현이 증가하는 단백질들을 발굴하였고, 이 중 XAGE-1d 단백질이 폐암 특이적으로 환자의 혈액에 존재한다는 사실을 새로이 알아내었다. 상기 XAGE-1d의 검출을 통하여 면역화학법으로 폐암을 간편하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 PCT를 출원하였다(PCT/KR2010/003710). 본 발명의 XAGE-1a는 원래 XAGE-1b로 알려졌으나 기존의 XAGE-1a(146개 아미노산)가 기록에서 없어지면서 대신 XAGE-1a로 현재 기록되고 있는 단백질이다. 본 발명의 XAGE-1a는 XAGE-1d와는 명확하게 구별되며 또한 폐암환자의 혈액에서 높은 발현을 보여 본 발명을 완성하게 되었다.
한국등록특허 제10-0661931호에는 트랜스페린의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-0931997호에는 KLK-6 유전자를 이용한 간세포암 진단 방법이 개시되어 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 초기 단계의 폐암 환자의 혈액에서 XAGE-1a 단백질의 농도가 현저하게 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 XAGE-1a 단백질 특이적 항체를 이용하여 폐암 조기 진단용 혈액 마커 XAGE-1a의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암의 예후(prognosis) 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 XAGE-1a 혈액 마커를 이용한 폐암의 조기 진단 방법은 혈액으로부터 샘플을 수집하므로 다른 방법에 비해 실시가 용이하고 통증이 비교적 적다. 또한 초기 단계의 폐암을 특이적으로 진단할 수 있으므로, 폐암에 의한 사망률을 낮추는데 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 종양 세포주에서 XAGE-1a 및 XAGE-1d의 세포내 발현을 나타낸 것이다. HEK293T: 신장 세포주(대조군), A549, NCI-H460 및 Hop-92: 폐암 세포주, MCF-7, MDA-MB-453 및 T-47D: 유방암 세포주.
도 2는 비오틴-XAGE-1a 펩티드의 농도에 따른 흡광도(A) 및 XAGE-1a 펩티드의 농도에 따른 항원 경쟁 ELISA에 의한 정량화 표준곡선(B)을 나타낸 것이다. B: 비오틴-XAGE-1a 펩티드에 XAGE-1a 펩티드를 첨가한 흡광도 값, Bo: 비오틴-XAGE-1a 펩티드만의 흡광도 값.
도 3은 XAGE-1a 펩티드의 농도에 따른 비오틴-XAGE-1a 펩티드의 결합을 나타낸 것이다.
도 4는 폐암 및 유방암 세포주의 배지에 분비되는 XAGE-1a의 시간별 농도를 나타낸 것이다.
도 5는 정상인과 환자 혈액에서 XAGE-1a (A)와 대조군인 CEA(B) 및 CYFRA 21-1(C)의 분포를 나타낸 것이다.
도 6은 XAGE-1a(A)와 대조군인 CEA(B) 및 CYFRA 21-1(C)의 ROC 그래프를 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 폐암 조기 진단 마커 XAGE-1a 단백질은 폐암의 초기 단계에서 다른 폐암 진단 마커인 CEA 및 CYFRA 21-1보다 높게 검출되었으므로, 폐암의 조기 진단에 더욱 효과적일 수 있다.
바람직하게는 상기 XAGE-1a 단백질은 XAGE-1a 카르복실 말단일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 XAGE-1a 카르복실 말단은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열(CATWKVIC KSCISQTPGI NLDLGSGVKV KIIPKEEHCK MPEAGEEQPQ V)로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 아미노산 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 서열이다. 구체적으로, XAGE-1a 카르복실 말단은 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 XAGE-1a만을 특이적으로 인지할 수 있다. 상기 항체는 바람직하게는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제가 결합될 수 있으며, 상기 검출 표지제는 효소, 보결분자족, 형광물질, 발광물질, 생물 발광물질 또는 방사성 물질일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 폐암은 폐에 발생하는 악성 종양을 의미하며, 바람직하게는 비소세포폐암(non-small cell lung cancer)일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 조성물은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 인지하는 2차 항체를 추가로 포함할 수 있으며, 검출 표지제가 2차 항체에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 검출 표지제가 효소인 경우에 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 검출 표지제로 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 아세틸콜린 에스터라제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 글루코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산 디하이드로게나아제 또는 인버타제 등을 포함하고; 적합한 보결분자족 복합체의 예는 스트렙트아비딘/비오틴 또는 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드, 피코에리트린 또는 피코빌리프로테인 등을 포함하고; 발광물질의 예는 루미놀, 이소루시놀 또는 루시제닌 등을 포함하고; 생물 발광물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 또는 아에쿠오린 등을 포함하며; 적합한 방사선 물질의 예는 125I, 131I, 111In, 99Tc 14C 또는 3H 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 용어, "항체"는 당업계에 공지된 용어이며 공지된 항원에 결합하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fv 분자, 키메릭 항체 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 사용되는 항체는 면역원(항원)으로 면역시킨 포유동물의 혈청에서 분리하여 얻을 수 있다. 상기 포유동물은 바람직하게는 마우스, 토끼 또는 염소일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 항체의 제조에 이용되는 포유동물은 더 많은 항체를 분리할 수 있는 더 많은 양의 혈청을 가지는 비교적 큰 포유동물이 우선적으로 선택될 수 있다. 상기 포유동물에 면역원이 주입되면, 면역계의 B 세포를 자극하여 면역원에 대해 특이적인 면역글로불린(Ig, immunoglobulin)이 생산된다. 상기 면역글로불린은 여과, 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 혈청으로부터 정제될 수 있다. 상기 항체의 제조에 있어서, 주사되는 면역원에 대한 포유동물의 면역 반응을 증강시킬 목적으로 Freund's, Alum, the Ribi Adjuvant System 또는 Titermax와 같은 면역 보강제(adjuvant)가 주입될 수 있다. 상기 면역 보강제는 항원과 혼합하였을 때 항원성을 높여 항체가 많이 생성되도록 도와주는 역할을 한다.
또한, 본 발명은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 키트를 제공한다. 바람직하게는 상기 XAGE-1a 단백질은 XAGE-1a 카르복실 말단일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 키트는 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 인지하는 2차 항체를 추가로 포함할 수 있으며, 검출 표지제가 2차 항체에 결합될 수 있다. 상기 키트는 본 발명에 따른 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 적합한 담체 용액, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제를 포함하는 용기 및 사용설명서를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 검출 표지제가 효소인 경우에 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 마이크로어레이를 제공한다. 바람직하게는 상기 XAGE-1a 단백질은 XAGE-1a 카르복실 말단일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 마이크로어레이는 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은
환자로부터 혈액을 수집하는 단계;
상기 혈액과 XAGE-1a 단백질 특이적 항체를 반응시키는 단계; 및
상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 폐암 조기 진단용 혈액 마커 XAGE-1a의 검출 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 XAGE-1a 단백질은 XAGE-1a 카르복실 말단일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 XAGE-1a 카르복실 말단은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 면역블롯법, 효소면역법, 면역침강법, 형광면역법, 효소기질발색법 또는 항원항체 응집법일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 항원을 검출하고/하거나 정량하는데 사용되는 수많은 면역분석법들이 당업자에게 공지되어 있다.
또한, 본 발명은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암의 예후(prognosis) 예측용 조성물을 제공한다. 본 발명의 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 폐암의 조기 진단뿐만 아니라, 폐암 환자의 예후 예측에도 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: XAGE -1a 단백질의 구조
XAGE1은 처음에 a, b, c 및 d의 4종류의 전사 변이체로 알려졌으나, 최근에는 81개의 아미노산 및 69개의 아미노산을 갖는 2개의 전사 변이체만이 확인되고 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/653219?). 본 발명은 81개 아미노산으로 구성된 전사 변이체 XAGE-1a에 관한 것으로, 69개 아미노산으로 구성된 XAGE-1d와는 아미노 말단의 32개 아미노산 서열은 동일하나 나머지 카르복실 말단의 서열이 서로 다르다(표 1).
XAGE1 전사 변이체의 단백질 서열
단백질명 Ref_seq No. 아미노산 서열 아미노산 수
XAGE-1a NP_001091061 MESPKKKNQQ LKVGILHLGS RQKKIRIQLR SQCATWKVIC KSCISQTPGI NLDLGSGVKV KIIPKEEHCK MPEAGEEQPQ V (서열번호 2) 81개
XAGE-1d NP_001091062 MESPKKKNQQ LKVGILHLGS RQKKIRIQLR SQVLGREMRD MEGDLQELHQ SNTGDKSGFG FRRQGEDNT (서열번호 3) 69개
* 상기 두 단백질은 밑줄친 아미노산을 아미노 말단에 공통으로 포함하고 있다.
실시예 2: XAGE -1a의 세포내 발현 확인
세포내 XAGE-1a의 발현을 관찰하기 위하여 세포주를 5×105 세포가 되도록 100 mm 배양 접시에 각각 접종하여 2일 동안 배양한 후, 트립신을 처리하여 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포를 RIPA 완충액으로 용균한 후, 10 ㎍의 단백질을 15% 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하고 니트로셀룰로즈 막으로 전이시켰다. XAGE-1a의 카르복실 말단(CPEAGEEQPQV)에 특이적인 염소항체(Abcam사, ab21198)를 막에 가하여 반응시키고, 다시 HRP (horseradish peroxidase)가 결합된 항-염소 생쥐항체 및 ECL을 이용하여 XAGE-1a 단백질을 검출하였다.
XAGE-1a의 발현을 XAGE-1d과 비교하기 위하여, XAGE-1d의 발현을 관찰하였는데, 상기 실험에는 XAGE-1d의 카르복실 말단(GFGFRRQGEDNT)에 특이적인 염소항체(Abcam사, ab27477)를 사용하였다. 상기 XAGE-1d 단백질(7.6 kD)은 HEK293T 신장세포를 제외한 3종의 폐암 및 유방암 세포주의 세포 내에서 유사한 정도의 발현을 나타낸 반면, XAGE-1a(9 kD)는 폐암 세포주인 NCI-H460 및 유방암 세포주인 MCF-7에서 발현이 다소 적게 관찰되었다(도 1).
실시예 3: 항원 경쟁 효소면역 측정법(antigen competition ELISA)를 이용한 표준곡선( standard curve )의 제작
XAGE-1a의 양을 정량적으로 표시하기 위하여 XAGE-1a의 카르복실 말단에 해당하는 펩티드(CPEAGEEQPQV) 및 상기 펩티드에 비오틴이 결합된 비오틴-CPEAGEEQPQV를 제조(Peptron사)하여, 항원 경쟁 ELISA를 수행하였다. 상기 펩티드를 특이적 항체로 인식한 후, 비오틴:스트렙트아비딘(streptavidin) 결합과 스트렙트아비딘에 컨쥬게이션(conjugation)된 HRP 반응에 의해 용액 내 XAGE-1a의 양을 검출하고자 하였다.
먼저, XAGE-1a를 정량화하기 위한 표준곡선을 그리기 위하여, 비오틴-XAGE-1a 펩티드(biotin-CPEAGEEQPQV)의 농도별 흡광도를 측정하였다. 상기 XAGE-1a의 카르복실 말단에 특이적으로 결합하는 항체(ab21998)를 코팅 용액(1L 당 Na2CO3 1.59 g, NaHCO3 2.93 g 및 10% NaN3 2 mL, pH 9.5)에 녹인 다음, 96-웰 플레이트(Nunc #439454)에 웰 당 1 ㎍으로 24시간 동안 처리하였다. 상기 코팅 후, 웰 당 200 ㎕의 차단(blocking) 용액(0.1% BSA (Bovine serum albumin) 및 0.02% 티메로살(thimerosal)이 포함된 PBS)을 상온에서 2시간 동안 처리하여 비특이적 결합을 억제하였다. 그 후, 세척 용액(0.02% 티메로살 및 0.05% 트윈-20(Tween-20)이 포함된 PBS)으로 코팅되지 않은 항체나 차단 용액을 세척하였다. 비오틴-XAGE-1a 펩티드(biotin-CPEAGEEQPQV)를 PBS에 농도별로 녹인 다음, 상기 플레이트에 100 ㎕씩 첨가하고 2~3시간 동안 상온에서 반응시켰다. 세척 용액으로 상기 플레이트를 5회 세척한 후, 각 웰에 비오틴에 특이적인 스트렙트아비딘(STR)에 HRP가 결합된 STR-HRP(Pierce사)를 1:10,000으로 희석하여 첨가하고, 2~3시간 동안 반응시킨 후 다시 웰을 세척 용액으로 세척하였다. 그 후, 퍼옥시다제 발색을 위하여 각 웰에 50 ㎕의 TMB(tetramethylbenzidine) 기질용액(GenDEPOT)을 첨가하여 상온에서 반응시킨 후, 다시 50 ㎕의 정지(stop)용액(GenDEPOT)를 첨가하여 반응을 정지시키고, 465 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 비오틴-XAGE-1a 펩티드(biotin-CPEAGEEQPQV)가 코팅된 항체에 특이적으로 결합하며, 또한 비오틴에 결합한 STR-HRP에 의해 발색되고, 비오틴-펩티드의 양에 비례하여 흡광도가 증가함을 확인할 수 있었다(도 2A).
또한 4 ng/mL의 비오틴-XAGE-1a 펩티드를 사용하여 항원 경쟁 효소면역 측정을 수행하였다. 상기 도 2A 실험에서 비오틴-XAGE-1a 펩티드를 첨가하는 과정 대신, 40 ng/mL 비오틴-XAGE-1a 펩티드(biotin-CPEAGEEQPQV) 100 ㎕에 여러 농도의 XAGE-1a 펩티드를 혼합하여 반응시킨 후 흡광도를 측정하였다. XAGE-1a 펩티드의 농도에 대한 B/Bo (B: 비오틴-XAGE-1a 펩티드에 XAGE-1a 펩티드를 첨가한 흡광도 값, Bo: 비오틴-XAGE-1a 펩티드만의 흡광도 값)를 이용하여 표준곡선을 그리고 선형 회귀(linear regression)한 표준화 식(R2=0.9971)으로 흡광도에 대한 펩티드의 농도를 환산하였다(도 2B). 분자량의 비(4.067=(9,077: XAGE-1a 단백질)/(2,231: XAGE-1a 펩티드))를 농도에 환산하면 용액 속에 존재하는 XAGE-1a 단백질의 농도를 구할 수 있다.
실시예 4: XAGE -1a의 특이적 검출을 위한 ELISA
아미노 말단의 32개 아미노산이 동일하고 카르복실 말단의 45~49개 아미노산이 상이한 XAGE-1a를 XAGE-1d와 구별하여 선택적으로 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여, XAGE-1a를 인식하는 항체(ab21198)를 ELISA 플레이트에 웰 당 1 ㎍씩 코팅한 후, 40 ng/mL의 비오틴-XAGE-1a 펩티드(biotin-CPEAGEEQPQV) 100 ㎕에 XAGE-1a 펩티드 및 XAGE-1d 펩티드를 농도별로 섞은 혼합용액을 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 결합시킨 후 STR-HRP를 사용하여 흡광도를 비교하였고, XAGE-1a 특이적 항체에 대한 XAGE-1a 펩티드의 결합 및 XAGE-1d의 비특이적 결합을 관찰하였다. XAGE-1a 또는 XAGE-1d 펩티드가 첨가되지 않고 비오틴-XAGE-1a 펩티드만을 결합시킨 경우를 기준(100%)으로 하여 첨가한 펩티드의 농도에 대한 흡광도를 관찰한 결과, XAGE-1d 펩티드는 비오틴-XAGE-1a 펩티드의 항체에 대한 결합을 전혀 억제하지 못한 반면, XAGE-1a 펩티드는 비오틴-XAGE-1a 펩티드의 결합을 농도에 비례하여 억제하였고, 10 ng/mL의 농도에서는 약 10% 정도의 결합을 나타내었다(도 3). 상기 결과는 XAGE-1a 특이적인 항체 및 비오틴-XAGE-1a 펩티드를 이용한 ELISA가 매우 특이적으로 XAGE-1a 단백질을 검출할 수 있을 것임을 보여준다.
실시예 5: 폐암 세포주 배양액에서 XAGE -1a의 검출
폐암환자의 혈액에서 검출할 수 있는 단백질인 경우 폐암 세포주의 배양액에서도 존재할 가능성을 갖는다. 따라서, A549, NCI-H460 및 HOP-92 등의 폐암 세포주를 배양한 후, 상기 세포 배양액 100 ㎕를 취하여 XAGE-1a의 존재를 확인하였다. 또한 XAGE-1a의 발현이 유방암 세포에서 높다고 알려져 있고(Egland et al. Molecular Cancer Therapeutics, 2002, 1, 441-450), 폐암 특이 혈액 마커가 부재한 현실에서 폐암 진단에 간접적으로 활용되고 있는 대조군 CEA(carcinoembryionic antigen) 및 CYFRA 21-1(사이토케라틴 19 절편)이 유방암 환자의 혈청에서 관찰된다는 보고가 있기 때문에, 유방암 세포주를 이용하여 XAGE-1a의 분비를 세포 배양액에서 관찰하였다(Nakata et al. British Journal of Cancer, 2004, 91, 873-878). 세포주 배양액을 얻기 위하여 5×105 세포를 100 mm 배양 용기에 접종한 후, 배양액 10 mL를 첨가하여 배양하면서 배양액을 12시간 간격으로 72시간까지 100 ㎕씩 샘플링하여 4℃에 보관하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 정량화 항원 경쟁 ELISA를 수행하였다. XAGE-1a의 카르복실 말단 CPEAGEEQPQV에 특이적으로 결합하는 항체(ab21198, Abcam)를 코팅용액(1L 당 Na2CO3 1.59 g, NaHCO3 2.93 g 및 10% NaN3 2 mL, pH 9.5)에 녹여 웰 당 1 ㎍씩 96-웰 플레이트(Nunc #439454)에 24시간 동안 처리하여 코팅하였다. 비특이적 결합을 억제하기 위하여, 웰 당 200 ㎕의 차단용액(0.1% BSA 및 0.02% 티메로살이 포함된 PBS)을 상온에서 2시간 동안 처리하였다. 상기 차단용액을 버린 후, 웰을 세척용액(0.02% 티메로살 및 0.05% 트윈-20이 포함된 PBS)으로 5번 세척하고 웰 당 비오틴-XAGE-1a 펩티드(40 ng/mL) 100 ㎕ 및 세포주 배양액 100 ㎕를 혼합하여 첨가한 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 웰 당 200 ㎕의 세척용액으로 다시 세척한 다음, HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 스트렙트아비딘을 1:10,000으로 희석하여 첨가하고 2~3시간 동안 결합시켰다. 다시 웰을 세척용액으로 세척한 후, 퍼옥시다제 발색을 위하여 각 웰에 50 ㎕의 TMB 기질용액(GenDEPOT)을 첨가하여 상온에서 반응시킨 다음, 50 ㎕의 정지용액(GenDEPOT)을 첨가하여 반응을 정지시키고 465 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
상기 실시예 3에서 기재한 것처럼 흡광도의 값을 정량화 표준곡선 식에 대입하고 분자량의 비를 환산하여 용액에 포함된 XAGE-1a 단백질의 농도를 구한 다음, 세포의 전체 단백질에 대한 상대적인 값으로 나타내었다. 폐암 세포주 A549는 시간에 따라 완만하게 XAGE-1a의 분비가 일어나 72시간에는 1 ng/ml?㎍ protein에 도달한 반면, NCI-H460 세포주는 동일한 시간대에 약 3 ng/mL?㎍ protein의 단백질이 배지에서 관찰되었다. 폐암 세포주 Hop-92 및 다른 3개의 유방암 세포주는 배지에서 XAGE-1a 단백질의 발현 증가를 관찰할 수 없었다(도 4).
실시예 6: 폐암 환자의 혈액에서 XAGE -1a의 검출
XAGE-1a가 혈청에서 검출되는지를 조사하기 위하여 정상 및 폐암 환자의 혈청을 각각 194개씩을 확보하고, 상기 실시예 5의 방법에서 세포 배양액 대신에 혈청 100 ㎕를 첨가하여 분석하였다. 대조군으로서 CEA(carcinoembryionic antigen, Accubind, #1825-300) 및 CYFRA 21-1(사이토케라틴 19 절편, Fujirebio, #211-10)을 제조사의 분석 키트 매뉴얼에 따라 분석하였다.
그 결과, XAGE-1a는 정상인(평균 3.0 ng/ml)에 비해 폐암 환자(평균 11.7 ng/ml)에서 약 4배 정도 더 많은 양이 존재하였는데, 이는 CEA 및 CYFRA 21-1의 1.4~1.5배 보다 현저하게 더 높은 비율이며, 샘플의 수가 적은 30대를 제외하면 3배 이상의 값을 유지하였다. 남녀 성비로는 대조군이 유사한 값을 나타낸 반면, XAGE-1a는 정상 및 환자에서 남성이 여성에 비해 2배 이상 높은 수치를 나타내었다(표 2). 상기 결과는 XAGE-1a가 잘 알려진 대조군 CEA 및 CYFRA 21-1보다 더 좋은 진단 마커가 될 수 있음을 보여 준다(Stieber et al. Cancer, 1993, 72(3), 707-713).
나이 및 성별에 따른 XAGE-1a의 혈청내 농도
　 인원 XAGE-1a (ng/ml) CEA (ng/ml) CYFRA 21-1 (ng/ml)
정상 환자 정상 환자 정상 환자 정상 환자
31~40세 남 1 6 1 6 0.6 3.3 18.3 7.7 13.9 8.8 20.3 20.3 8.9 9.8 20.3 18.6
여 5 5 3.9 5.6 8.2 21.0 9.3 18.3
41~50세 남 9 27 10 27 1.6 1.2 6.8 7.7 11.3 8.2 14.9 16.6 12.1 9.7 18.3 17.9
여 18 17 1.0 8.3 6.4 17.5 7.5 16.8
51~60세 남 28 45 27 45 3.5 2.8 12.3 8.6 11.2 11.6 14.6 13.8 11.1 12.5 16.6 16.8
여 17 18 1.8 3.1 12.3 13.9 12.9 17.3
61~70세 남 88 116 88 116 3.9 3.5 16.0 14.0 10.3 10.1 17.2 17.7 11.0 11.7 17.2 17.9
여 28 28 2.2 7.7 10.8 19.0 11.6 19.2
총(평균) 남 126 126 3.6 14.5 10.6 16.5 11.1 17.2
여 68 68 1.9 6.4 9.8 17.4 10.7 18.0
총 194 194 3.0 11.7 10.2 16.7 11.6 17.7
실시예 7: 폐암 혈액 마커 XAGE -1a의 민감도 및 특이도 분석
XAGE-1a의 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 분석하여 대조군과 비교하였다. 정상인에서 XAGE-1a의 최대값은 평균값의 6배 정도로 나타났으며, 이는 CEA 및 CYFRA 21-1의 2~2.6배에 비해 큰 수치이다. 또한, 폐암 환자에서 XAGE-1a의 최소값도 매우 낮다. 그럼에도 불구하고 정상인의 평균값(3.03 ng/ml)이 매우 낮고, 폐암 환자의 평균값이 정상인에 비해 4배 정도 높은 것은 대조군과 특별히 구별되는 점이다. 또한 민감도는 약간 낮은 반면, 특이도는 대조군, 특히 CYFRA 21-1(41.50 ng/ml)에 비해 매우 높은 것은 유용한 마커가 될 수 있음을 나타낸다(표 3).
XAGE-1a의 민감도 및 특이도
XAGE-1a CEA CYFRA 21-1
정상 환자 정상 환자 정상 환자
194 194 194 194 194 194
최대량(ng/㎖) 18.57 65.18 20.30 34.86 29.23 41.50
최소량(ng/㎖) 0.06 0.13 1.44 2.57 0.47 5.01
평균(ng/㎖) 3.03 11.66 10.35 16.81 10.92 17.50
≤ 정상평균 133 57 96 30 82 30
> 정상평균 61 137 98 164 112 164
민감도(%) (137/194)×100=70.62 (163/194)×100=84.54 (164/194)×100=84.54
특이도(%) (133/194)×100=68.56 (104/194)×100=49.48 (82/194)×100=42.27
실시예 8: 혈청에서의 XAGE -1a 분포
XAGE-1a의 중간값 및 사분범위(median and interquartile range)는 정상인에서 3.03 및 0.68~3.72, 폐암 환자에서 11.66 및 2.59~16.28이었다. CEA의 경우는 정상인에서 10.35 및 7.95~12.40이었고, 폐암 환자에서는 16.81 및 13.10~20.83이었다. CYFRA21-1은 정상인에서 11.92 및 7.96~13.65이었고, 폐암 환자에서는 17.50 및 12.96~21.22이었다(도 5). 따라서, 상기 분석한 3개의 마커는 정상 및 폐암 환자에서 현저한 차이를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다(Mann-Whitney U-test, p<0.001).
실시예 9: ROC ( receiver operating characteristics ) 곡선 분석
상기 XAGE-1a의 분석 결과를 바탕으로 하여 ROC 곡선 분석을 수행하였다. AUC(area under the curve)는 XAGE-1a가 0.787, CEA가 0.815, 그리고 CYFRA 21-1이 0.803으로, XAGE-1a는 전반적으로 대조군과 유사한 값을 나타내었다(도 6).
종양의 발생 단계에 따라 샘플을 구분하여 ROC 곡선을 분석하였다. IA~IIIA 단계 및 IIIB~IV 단계를 구분하여 분석한 결과, XAGE-1a는 IA~IIIA 단계에서 대조군보다 높은 AUC를 나타내었다(표 4). 상기 결과는 XAGE-1a가 폐암의 초기 단계에서 대조군보다 효과적인 진단 마커로 사용될 수 있음을 나타낸다.
폐암의 발생 단계에 따른 ROC 곡선의 AUC
단계 환자수 정상인수 XAGE-1a CEA CYFRA 21-1
IA~IIIA 84 194 0.815 0.799 0.783
IIIB~IV 110 194 0.739 0.822 0.821
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> XAGE-1a marker for early diagnosis of lung cancer and uses thereof <130> PN11039 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Ala Thr Trp Lys Val Ile Cys Lys Ser Cys Ile Ser Gln Thr Pro 1 5 10 15 Gly Ile Asn Leu Asp Leu Gly Ser Gly Val Lys Val Lys Ile Ile Pro 20 25 30 Lys Glu Glu His Cys Lys Met Pro Glu Ala Gly Glu Glu Gln Pro Gln 35 40 45 Val <210> 2 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Ser Pro Lys Lys Lys Asn Gln Gln Leu Lys Val Gly Ile Leu 1 5 10 15 His Leu Gly Ser Arg Gln Lys Lys Ile Arg Ile Gln Leu Arg Ser Gln 20 25 30 Cys Ala Thr Trp Lys Val Ile Cys Lys Ser Cys Ile Ser Gln Thr Pro 35 40 45 Gly Ile Asn Leu Asp Leu Gly Ser Gly Val Lys Val Lys Ile Ile Pro 50 55 60 Lys Glu Glu His Cys Lys Met Pro Glu Ala Gly Glu Glu Gln Pro Gln 65 70 75 80 Val <210> 3 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Ser Pro Lys Lys Lys Asn Gln Gln Leu Lys Val Gly Ile Leu 1 5 10 15 His Leu Gly Ser Arg Gln Lys Lys Ile Arg Ile Gln Leu Arg Ser Gln 20 25 30 Val Leu Gly Arg Glu Met Arg Asp Met Glu Gly Asp Leu Gln Glu Leu 35 40 45 His Gln Ser Asn Thr Gly Asp Lys Ser Gly Phe Gly Phe Arg Arg Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Asn Thr 65

Claims (13)

  1. XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 XAGE-1a 단백질은 XAGE-1a 카르복실 말단인 것을 특징으로 하는 폐암 조기 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 XAGE-1a 카르복실 말단은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폐암 조기 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 인지하는 2차 항체를 추가로 포함하며, 검출 표지제가 2차 항체에 결합됨을 특징으로 하는 폐암 조기 진단용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 검출 표지제가 효소이고, 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 폐암 조기 진단용 조성물.
  6. XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 XAGE-1a 단백질은 XAGE-1a 카르복실 말단인 것을 특징으로 하는 폐암 조기 진단용 키트.
  8. XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 조기 진단용 마이크로어레이.
  9. 제8항에 있어서, 상기 XAGE-1a 단백질은 XAGE-1a 카르복실 말단인 것을 특징으로 하는 폐암 조기 진단용 마이크로어레이.
  10. 환자로부터 혈액을 수집하는 단계;
    상기 혈액과 XAGE-1a 단백질 특이적 항체를 반응시키는 단계; 및
    상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 폐암 조기 진단용 혈액 마커 XAGE-1a의 검출 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 XAGE-1a 단백질은 XAGE-1a 카르복실 말단인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 XAGE-1a 카르복실 말단은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. XAGE-1a 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암의 예후(prognosis) 예측용 조성물.
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