KR20120021518A - 간암 진단용 조성물 및 진단방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간암 진단용 조성물 및 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 HCCR-1에 대한 항체 및 AFP에 대한 항체를 포함하는 간암 진단용 조성물 및 이들 항체를 협동적으로 이용한 간암 진단방법에 관한 것이다.

Description

간암 진단용 조성물 및 진단방법{Composition and method for diagnosing hepatocellular carcinoma}
본 발명은 간암 진단용 조성물 및 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 HCCR-1에 대한 항체 및 AFP에 대한 항체를 포함하는 간암 진단용 조성물 및 이들 항체를 협동적으로 이용한 간암 진단방법에 관한 것이다.
간암 또는 간세포암(Hepatocellular carcinoma; 이하,‘HCC’라 함)은 세계에서 가장 빈도가 높은 악성 종양 중의 하나이다. HCC의 진단에 널리 사용되고 있는 유일한 혈청 마커가 알파-fetoprotein(이하, ‘AFP’라 함)이다. 그러나 AFP 레벨은 HCC에 대한 낮은 민감도와 특이성을 가진다[Bruix J, 등; EASL Panel of Experts on HCC:Clinical management of hepatocellular carcinoma. Conclusions of the Barcelona-2000 EASL conference. European Association for the Study of the Liver. J Hepatol 2001, 35:421303].
HCC의 초기 진단에 대한 새로운 방법이 바이오마커의 형태 또는 방사선 테스트의 형태로 필요하다.
비록 혈청 AFP 레벨이 HCC의 검출 및 모니터링에 대한 유용한 종양 마커이지만, AFP 레벨 단독으로는 위-음성률이 초기 단계 HCC를 가지는 환자에 대해서는 40% 만큼 높다[Stefaniuk P, 등: Present and future possibilities for early diagnosis of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2010, 16(4):418-424.]. 심지어 진행된 HCC를 가지는 환자에 있어서, AFP 레벨은 환자의 15%-30%에서 정상을 유지할 수 있다.
des-g-카르복실 프로트롬빈, 알칼라인 포스파테이즈 이소자임-Ⅰ, 및 조직 폴리펩타이드 특이 항원과 같은 다른 HCC 마커들이 민감도, 특이도, 초기 검출 및 예후의 에측을 개선하기 위하여 개발되었다; 그러나 전체 결과는 불만족스럽다 [Soresi M, 등: Usefulness of alpha-fetoprotein in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Anticancer Res 2003, 23:1747-1753].
HCCR-1은 간암을 포함하는 여러 인간 종양에서 과발현되는 42 kDa 단백질이다[Yoon SK, Lim NK, Ha S-A, Yoon SK, Lim NK, Ha SA, Park YG, Choi JY, Chung KW, Sun HS, Choi MJ, Chung J, Wands JR, Kim JW: Cancer Res 2004, 64:5434441;Ko J, Lee YH, Hwang SY, Lee YS, Shin SM, Hwang JH, Kim J, Kim YW, Jang SW,Ryoo ZY, Kim IK, Namkoong SE, Kim JW: Oncogene 2003, 22:4679689;Ko J, Shin SM, Oh YM, Lee YS, Ryoo ZY, Lee YH, Na DS, Kim JW: Oncogene 2004, 23:1950953]. 노던 및 웨스턴 블럿 분석 및 면역조직화학적 연구들은 HCCR-1 mRNA 및 단백질이 HCC의 비 종양성 간경변 조직과 비교하여 종양성 조직에서 과발현되었다[Yoon SK, Lim NK, Ha S-A, Yoon SK, Lim NK, Ha SA, Park YG, Choi JY, Chung KW, Sun HS, Choi MJ, Chung J, Wands JR, Kim JW: Cancer Res 2004, 64:5434441]. 이러한 결과들은 HCCR-1이 p53 종양 억제자의 네가티브 조절자로 작용하여 간 종양형성과 관련된 새로운 원암유전자임을 나타낸다 [;Ko J, Lee YH, Hwang SY, Lee YS, Shin SM, Hwang JH, Kim J, Kim YW, Jang SW,Ryoo ZY, Kim IK, Namkoong SE, Kim JW: Oncogene 2003, 22:4679689;Ko J, Shin SM, Oh YM, Lee YS, Ryoo ZY, Lee YH, Na DS, Kim JW: Oncogene 2004, 23:1950953].
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 특히 효과적인 초기 단계 및/또는 작은 크기의 간암 진단 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특히 효과적인 초기 단계 및/또는 작은 크기의 간암 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 HCCR-1에 대한 항체 및 AFP에 대한 항체를 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 조성물은 초기 간암 진단에 유용한 것을 특징으로 하고,
본 발명의 다른 구현예 1항에 있어서, 상기 본 발명의 조성물은 2cm 이하의 간암 진단에 유용한 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 a)환자로부터 샘플을 얻는 단계;및
b) 상기 샘플을 HCCR-1에 대한 항체로 처리하고, AFP에 대한 항체로 처리하여 샘플 내의 HCCR-1과 AFP 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 간암 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 진단 방법은 초기 간암 진단에 유용한 것을 특징으로 하고, 2cm 이하의 간암 진단에 유용한 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 HCCR-1에 대한 컷 오프 값은 10ng/ml이과 상기 AFP에 대한 컷 오프 값은 11ng/ml인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다
본 발명에서 본 발명자들은 1)HCC에서 HCCR-1의 진단효율을 조사하고, 2) 작은 크기의 HCC에 대한 초기 진단에서 그것의 유용성을 조사하고, 3) AFP 테스트와 비교하고, 4) 특히 작은 크기의 HCC에서 AFP 및 HCCR-1의 협동적인 HCC의 분석을 테스트하였다.
HCCR-1가 HCC에 대한 바이오마커로 사용될 수 있는지를 결정하기 위하여,혈청 HCCR-1 레벨을 HCC 환자들에서 조사하였다. 1338 HCC 환자들 중에서, 46%가 AFP에 대해서 혈청양성이었고, 51.3%가 HCCR-1에 대해서 혈청양성이었다. AFP 및 HCCR-1의 협동적 사용에서 양성률은 74.1%까지 증가하였다.
작은 크기 HCC (< 2cm)에서, AFP 및 HCCR-1의 양성률은 각각 23.4% 및 40.1%이었다. AFP 또는 HCCR-1에 대한 양성률은 작은 크기 HCC에서 56.9%까지 증가하였다. 따라서 AFP 및 HCCR-1의 협동적인 분석은 작은 크기 HCC에서 진단률을 향상시켰다. 작은 크기의 HCC에서 HCCR-1의 진단률은 AFP의 것에 비하여 매우 높다. 본 발명의 결과들은 HCCR-1 분석이 초기 간암을 가지는 환자에서 더 빈발하게 양성이므로 APF분석에 비하여 우수하다는 것을 나타낸다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, HCC의 진단률은 HCCR-1 및 AFP를 동시 측정을 통해서 개선될 수 있다. HCCR-1는 HCC진단에서 AFP의 보충적인 수단으로 사용될 수 있으나 그들 각각은 HCC를 분석하는데 있어서 충분한 정확도를 가지지 않는다.
HCC의 높은 이종성(heterogeneity)이 주어져서, HCC에 대한 적정 혈청 테스트가 둘 또는 세 개의 높은 특이적 혈청 마커의 동시 측정에 기반될 것이다.
AFP 및 HCCR-1으로부터 정보를 결합하면 특히 작은 크기 HCC에서 AFP 단독보다 진단률이 증가하고 초기 단계에서 HCC발생을 발견할 수 있을 것이다. 본 발명의 결과들은 HCCR-1 분석이 초기 간암을 가지는 환자에서 더 빈발하게 양성이므로 APF분석에 비하여 우수하다는 것을 나타낸다.
도 1은 다른 민감도, 특이도 및 정확도를 가진 대표적인 컷오프값을 나타낸 그래프이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
제조예 1: HCCR -1 다중클론 항체의 생산
<1-1> HCCR -1 재조합 단백질의 생산
간암 진단을 위한 종양 표지물질로서 인간 원암유전자 HCCR-1에 특이적인 항체를 생산하기 위하여 인간 원암유전자 HCCR-1의 일부 (GenBank Accession No. AF195651의 아미노산 서열 167 내지 360에 해당)를 포함하는 pMALTM-p2X 발현벡터 (New England Biolabs, MA)의 다중 클로닝 부위에 삽입하여 pMALTM-p2X/HCCR-2110-304 벡터를 제작하였다. 상기 벡터를 대장균 BL21(DE3)(Novagen, WI)에 형질전환한 후 1 mM IPTG (isopropyl β-D-thiogalacto-pyranoside, Sigama) 처리로 발현을 유도하여 약 45 KDa의 말토스 단백질이 융합된 87 KDa의 HCCR-1 융합단백질을 생산하였고 이를 amylose resin 키트 (New England Biolabs)로 정제하였다. 정제된 재조합 단백질을 면역 블롯팅한 결과, 약 87 kDa의 융합단백질이 다량 함유되어 있음을 확인하였다. 이와 같이 분리정제된 HCCR-1 재조합 단백질은 토끼의 면역화 및 다중클론 항체를 생산하기 위한 항원-항체 결합반응의 항원으로 사용되었다.
<1-2> 토끼의 면역화
상기 <1-1>에서 획득한 HCCR-1 재조합 단백질에 특이적인 항체 생산을 위한 동물은 약 2.5 kg 중량의 NZW 토끼를 사용하였다. HCCR-1 재조합 단백질 (200 ㎍/㎖)과 프로인트 완전 보조제 (Sigma Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화시켰다. 상기 유화액 2 ㎖를 토끼의 피하에 각각 0.25 ㎖씩 8곳에 근육 주사하여 1차 접종하였다. 추가 항원주입 (Booster injection)은 1차 접종 후 2주 간격으로 실시하였으며, 면역항원을 프로인트 불완전 보조제 (Sigma Chemical Co.)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 2주 간격으로 실시하였다.
<1-3> 토끼 혈청 ( Rabbit serum )의 분리 및 특이 다중항체의 선별
혈액은 토끼 이동맥에서 2주 간격으로 채취하여 혈청을 분리한 후 -20℃에 보관하여 각종 실험측정에 이용하였다. 상기 혈청은 항체특이성을 조사하였을 때 인간 원암유전자 HCCR-1 단백질에만 특이적으로 반응하였다. 채취한 혈청들 중에서 인간 원암유전자 HCCR-1 재조합 단백질 항원에만 특이적으로 반응하는 혈청들을 선별하기 위하여, 상기 <1-1>의 대장균 형질전환체로부터 분리정제된 HCCR-1 재조합 단백질을 항원으로 사용한 ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 비특이성 면역 반응을 억제하기 위하여 96 웰 플레이트 (Falcon Co., USA)를 1% 탈지분유 (skim milk)-PBS를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 노출시켜 코팅한 후, 웰당 1 ug의 재조합 단백질들을 코팅하였다. 상기 웰에 토끼혈청 원액을 2% BSA를 함유한 PBS 용액으로 각각 1 X 103, 1 X 104,1 X 105,1 X 106,1 X 107의 농도별로 희석 시킨 후 희석액들을 well 당 각각 100 ul 씩 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 항원-항체 결합반응을 진행시켰으며 이후 PBS 용액으로 3회 세척하였다. 이후 2% (W/V) BSA를 함유하는 PBS 완충용액으로 희석 (1 : 10,000)된 염소 유래의 항-토끼 IgG-HRP (Sigma Co., USA) 2차 항체를 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
이후, 0.1 M 시트레이트 인산염 완충용액 (phosphate buffered citrate, pH 5.0) 10 ㎖에 1 ㎎의 TMB (3.3', 5.5'-tetramethylbenzidine, Sigma Co., USA) 와 20 ㎕의 35% 과산화수소를 혼합하여 제조한 기질용액을 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 효소반응을 유도하였다. 실온에서 15분간 효소반응을 유지시킨 후 동량의 2 N 황산용액을 첨가하여 효소 반응을 중단시킨 다음 발색 반응의 정도를 450 ㎚에서 측정하였다. 이로부터 HCCR-1 항원에 대한 특이항체를 가지고 있는 다중클론 항체를 ELISA로 분석시 항체 역가가 음성 대조군보다 10배 이상 높은 혈청을 다시 선별하여 특성분석을 시작하였다.
제조예 2: HCCR -1 단클론 항체의 생산
단클론항체의 제조를 위해서, BALB/c 마우스를 피하 주사로 2회 면역화하였다. 첫 번째 면역화는 Freund's complete 어쥬번트에서 50 ㎍ HCCR-1167-360를 사용하여 수행되었다. 2 주 후에, 두 번째 면역화를 HCCR-1167-360로 시작하였다. 최대 항체 타이터를 보이는 마우스들은 비장 적출 전에 HCCR-1167-360의 부스트를 받았다. 그 비장세포들을 Kennett RH. Cell fusion. Methods Enzymol 1979;58:345?59 및 Armandola EA, Mariani SM, Ferrone S. Serological andmolecular characterization ofmouse anti-idiotypic monoclonal antibodies elicited with the syngeneic anti-HLA-A2, 28 monoclonal antibody CR11-351.Mol Immunol1993;30:287?300에 기재된 방법을 사용하여 The splenocytes were fused to P3-X63-Ag8 myeloma 세포에 융합하였다.
실시예 1: 환자 및 실험 디자인
1380 대상들을 2003년 9월부터 2007 년 8월까지 대한민국, 가톨릭대학교, 서울대학교, 중국 난징대학교 및 일본의 산요 화학 회사로부터 모집하였다(표 1). 그 코호트는 평균 연령 54.4세의 1006 명의 남성(76.1%) 및 평균 연령 56.6세의 332 명의 여성 (23.9%)으로 구성되었다 (표 2).
Figure pat00001
표 1은 임상처 정보 관련 HCC의 환자 프로파일을 나타낸다.
HCCR-1에 대한 모든 혈액 샘플은 분석을 위해 냉동하여 본 임상처로 수송되었다. 임상 데이터는 혈청 화학적 데이터, 증상을 나타내는 이미지(CT, MRI 및/또는 초음파), 투약/간격/화학요법제, 및 간염을 포함한 다른 의학 정보에 대하여 수집되었다(표 2).
등록기준은 다음과 같다:
1) 실험 개시에 HBV 또는 HCV 감염을 가진 것으로 확인된 환자,
2) 경피 생검에 의하여 얻어진 간 견본의 조사에 의하여 조직학적으로 HCC 진단이 확인됨,
3) 병리학적 등급이 Edmonson 분류에 따라 모든 환자에서 전후 관계로 평가되고,
4) AFP 및 HCCR-1 결정을 위하여 혈액 샘플을 공급하겠다는 환자의 동의.
배제 기준은 1) 불완전한 의학 기록, 2) 오진, 3) 30개월 기간 내에 follow-up 방문이 수행될 수 없는 경우 및 4) 인터페론과 같은 면역조절제의 이전 사용이었다.
임상 실험은 포함 및 배제 모두를 만족하는 환자들로 구성되었다. 시간이 우리가 HCC 진행을 결정하기에 부적절하기 때문에 우리는 성공 기준을 언급할 수 없어서 방문 시기에 HCCR-1 값을 단순하게 측정하였다.
실험의 종기에 평가할만한 대상들을 생검에 기반한 부위 조사관, 외식된(explanted) 간 조직학, 종양 부하의 이미지 해석 등에 의하여 네 범주로 나누었다: 실험 개시에 HCC(그룹 1), 실험 동안에 진행 확인된 HCC (그룹 2), 가능한 HCC 의심(그룹 3) 및 HCC 아님 (그룹 4) (표 1 및 표 2).
본 발명자들은 HCC의 진행에 대하여 환자의 추적 기간을 30개월로 잡아서, 첫 번째 HCCR-1 양성 결과 및 실험의 종기 사이에 30 개월을 가진 대상들은 그룹 4로부터 42 대상들을 배제를 야기하는 것을 포함하였다. 여기서, 30 개월 지속은 임상적 적절함을 의미하는 것이 아니라 HCC 진행에 대한 환자를 관찰하는 결정 지속기간이다. 대상의 최종 수는 1338이었다.
대상들 중 아무도 다른 악성 종양이나 활성 폐질환을 가지지 않았다. 모든 대상들 및 대조군들은 실험에 대하여 개별적인 동의를 가지고 분석되었고, 혈액 샘플의 사용은 네 곳의 임상처의 윤리 위원회의 승인을 받았다.
Figure pat00002
표 2는 성별 분포, 연령 분포 간염 상태 및 HCCR-1 값 관련된 HCC의 환자 프로파일을 나타낸 표이다.
실시예 2;샌드위치 ELISA 에 의한 혈청에서 HCCR -1의 검출
본 실험에서 사용된 ELISA는 효소적으로 증폭된 “2단계”샌드위치 타입 면역분석이었다. 그 HCCR-1 레벨은 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정되었다. 표준 곡선은 20에서부터 320 ng/mL 범위의 HCCR-116760의 연속적인 희석에 의하여 구축되었다. 20, 40, 80, 160, 및 320 ng/ml의 HCCR-116760 단백질을 사용하여, 교정 곡선을 작도하였다.
분석에서 표준, 대조군 및 미지 혈청 샘플을 제조예 2에서 제조된 항-HCCR-1 단클론 항체(mAb) 54115로 코팅된 아미크로적정 웰에 배양하였다. 배양 및 세척 후, 그 웰들을 효소 호스래대쉬 퍼옥시다제(HRP)로 표지된 또다른 제조예 1에서 제조된 HCCR-1 검출 다클론 항체로 처리하였다. 레퍼런스 범위는 receiver operating characteristics (ROC) 곡선 분석에 의하여 얻었다: 10 ng/ml를 HCC에 대한 컷오프 값으로 사용하였다. 혈청 HCCR-1 컷오프 값을 결정하기 위하여 ROC 분석을 HCC를 가지는 880명 환자 및 간경병 또는 만성 간염을 가지는 380 환자들로 구성된 실험 군을 사용하여 수행하였다.
ROC 곡선 분석은 민감도 및 특이도가 각각 48.5% 및 93.4%인 10 ng/ml의 컷 오프 값을 나타내었다. 이 컷오프 값을 가지고 본 발명자들은 HCC 의 진단에서 두 종양 마커의 동시 측정의 유의성을 조사하기 위하여 또 다른 1338 환자에 대한 실험을 수행하였다(표 7 및 도 1).
실시예 3: 혈청 AFP 농도
AFP 레벨은 통상적으로 유용한 키트(IRMA AFP MONOCLONAL, BECKMAN COULTER Inc.,Fullerton, CA, USA)를 사용한 2단계 샌드위치 면역방사선 분석에 의하여 수행되었다. 양성 반응을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 제조업자에 의하여 지시한 것과 같이 AFP에 대한 컷오프로 11 ng/ml의 값을 사용하였다.
실시예 4: 통계 분석
양성 반응을 결정하기 위하여 본 발명자들은 HCC를 가지는 880명 환자 및 간경병 또는 만성 간염을 가지는 380 환자들로부터 유래된 ROC 곡선 분석으로부터 유래된 구성된 11 ng/ml를 AFP에 대한 컷오프값으로 10 ng/ml을 HCCR-1에 대한 컷오프 값으로 사용하였다. HCCR-1의 혈청 수준은 Wilcoxon 랭크 섬 테스트 및 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 비교되고 평균±표준편자로 나타내었다. AFP 및 HCCR-1의 양성 반응률은 마지널(marginal) 비율의 관점에서 나타내었고, 각각 각 단계의 임상병리학상 인자에서 모든 환자에 대한 McNemar 테스트에 의하여 비교되었다. 두 테일된 유의성 수준의 5% 및 SAS (버젼 9.1)를 모든 통계 분석에 대하여 사용하였다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
컷오프 값들의 결정
HCCR-1에 대한 컷오프 값을 결정하기 위하여 본 발명자들은 HCC를 가지는 880명 환자 및 간경병 또는 만성 간염을 가지는 380 환자들을 사용하여 ROC 곡선 분석을 수행하였다. 대상들 중 아무도 다른 악성 종양이나 활성 폐질환을 가지지 않았다. 간경병 또는 만성 간염을 가지는 380 환자들 및 HCC를 가지는 880명 환자에서 각각 혈청 HCCR-1의 평균값은 9.5 ±14.4 및 2436.3 ± 3300.9 ng/ml이었다 ( 표 3). HCC 환자들 및 간 경변 환자들 사이에서 HCCR-1의 평균 값 사이에는 통계적으로 유의적인 차이가 있었다(P < 0.001).
HCC 환자들 및 간 경변 환자들에 대한 ROC 곡선은 얻어졌고, 다섯 컷오프 값들에 대한 전체 정확도, 민감도 및 특이도를 나타내었다(표 7 및 도 1).
본 발명자들은 비록 민감도는 낮지만 특이도가 90% 이상이기 때문에 10 ng/ml를 임상 평가에 대한 컷오프 값으로 선택하였다. 이후부터, AFP 및 HCCR-1에 대한 컷오프 값을 각각 11 ng/ml 및 10 ng/ml일 것이다.
Figure pat00003
표 3은 혈청 컷 오프 결정에 대한 380 명의 간경변 또는 만성 간염 환자 및 880 명의 HCC 환자들에서 혈청 HCCR-1 값을 나타낸 표이다.
임상 결과
HCCR-1가 HCC에 대한 바이오마커로 사용될 수 있는지를 평가하기 위하여, 혈청 HCCR 1 레벨을 HCC 환자에서 조사하고 종양 크기와 같은 임상병리학적 특성과 관련성 및 AFP 레벨을 결정하였다 (표 2 및 표 5).
AFP와 비교된 HCCR-1의 임상 결과는 Table 5에 요약되었다. 1338 환자들 중에서, 616 (46%)은 AFP에 대한 혈청-양성이고 686 (51.3%)은 HCCR-1에 대한 혈청-양성이었다(표 4). 비록 HCC에 대한 AFP 및 HCCR-1의 결합 분석에서 현저하게 다른 진단률을 나타내었지만 (P < 0.001) (표 5), AFP (46 %) 및 HCCR-1 (51.3%)의 진단 효율 사이에 통계적 유의성이 있다(P = 0.011 by McNemar test) (Table 4). AFP 및 HCCR-1의 협동적인 사용에서 양성률은 74.1%로 증가하였다(1338 HCC 중에서 990) (Table 5). AFP 및 HCCR-1 모두에 대한 음성 케이스는 317 (25.9%)이었다. 많은 경우의 AFP-음성 HCC가 HCCR-1에 대해서 양성이고 그 반대도 존재하였고, 이는 HCCR-1의 발현이 많은 HCC에서 AFP와 연관이 없다는 것을 나타낸다. AFP-음성 HCC에서 HCCR-1에 대한 양성률은 56.1% (722 중 405)이었고, HCCR-1-음성 HCC에서 AFP에 대한 양성률은 51.4% (652 중 335)이었다(표 4).
결론적으로 적어도 두 마커 중 하나의 혈청 레벨이 대부분의 HCC환자에서 평가되었다. 이 결과들은 진단률은 HCCR-1 및 AFP 모두를 동시적인 측정을 통하여 현저하게 개선될 수 있을 것이다. 따라서 HCCR-1을 HCC의 진단에 대한 AFP와 함께 사용할 때 유용한 종양 마커가 될 수 있을 것이다.
Figure pat00004
표 4는 1338명의 환자들 사이에 AFP와 비교한 HCCR-1의 진단 결과를 나타낸 표이다.
성별, 연령, 간암 및 국가들 사이에서 HCCR -1 래밸의 관계
성별(P = 0.3742), 연령(P = 0.9412), 및 간염 B, C, 또는 양쪽 모두 (P = 0.5290)사이에서 HCCR-1 레벨에서 통계적 유의성은 없었다. 또한 국가 간 사이에 HCCR-1 사이에도 유의적인 차이는 없었다(P = 0.2202). HCCR-1 혈청 레벨과 간 기능(AST, ALT, GGT,alkaline phosphatase, albumin, 및 비리루빈 레벨) 사이에 상관관계도 없었다(도시 안함).
HCCR -1 레벨과 종양 크기의 관계
HCC에 대한 총 혈청 AFP 및 HCCR-1의 진단 값의 비교를 Tables 5 및 6에 나타내었다. 전체 1338 중에서 641 작은 HCC를 제외한 697 큰 HCC (> 2cm) 중에서 HCCR-1 및 AFP의 양성률은 각각 61.5 % 및 66.8 %이었다(표 5). 이것은 HCCR-1의 진단률이 AFP 큰 HCC(> 2 cm)의 것과는 큰 차이가 있다는 것을 나타낸다( McNemar 테스트에 의한 P = 0.011).
그러나 중요하게도 HCCR-1의 진단률(40.1%)은 작은 HCC에서 AFP의 것(23.4%)에 비하여는 매우 높다(P < 0.001) (표 5). 이것은 HCCR-1의 진단률이 작은 HCC에서 더 분명하다는 것을 나타낸다.
HCC에 대한 AFP 및 HCCR-1의 결합 분석을 수행하였고, HCC에 대한 양성률은 HCC에서 74.1%까지 증가하였다. 특히 작은 HCC에 대한 양성률은 56.9%까지 증가하였다. 이 증가는 AFP 또는 HCCR-1 단독의 분석과 비교하여 통계적으로 유의성이 있다 (표 5). 따라서 AFP 및 HCCR-1의 협동적 분석은 큰 또는 작은 크기의 HCC 모두에서 HCC의 진단률을 개량하였다(P < 0.001) (표 5). 이것은 AFP 및 HCCR-1의 동시 검출이 작은 크기의 HCC의 초기 진단에 특히 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다.
Figure pat00005
표 5는 HCC 환자의 종양 크기와 관련된 AFP 및 HCCR-1 레벨을 나타낸 표이다.
다른 GI 및 비 - GI 암들에서 HCCR -1 수준
다른 GI 및 비 -GI 암들을 가진 250명 환자들에서 HCCR-1 수준의 분포를 평가하였다 (표 6). 비-HCC GI 암(위, 대장, 결장, 췌장)을 가진 170 환자들 중에서 10명이 증가된 HCCR-1 레벨을 가졌다. GI 암에서 전체 빈도수는 5.9%이었다. 나머지 80명의 비-GI 암 환자 중에서 50 명의 자궁경부암 환자 중 3명, 30명의 폐암 환자들 중 3명은 증가된 HCCR-1 레벨을 가졌다.
비-GI 암에서 전체 빈도수는 7.5%이었다. 아래 표는 요약된 결과를 나타낸다 (표 6).
Figure pat00006
표 6은 다른 GI 및 비 -GI 암들을 가진 250명 환자들에서 HCCR-1 값의 분포를 나타낸 표이다.
컷 오프 (ng/ml) 민감도 (%) 특이도 (%) 정확도 (%)
10 48.5 93.4 62.1
9 59.6 79.2 65.5
8 67.4 69.7 68.1
7 78.3 54.0 71.0
6 90.7 43.7 76.5
표 7은 다른 민감도, 특이도 및 정확도를 가진 대표적인 컷오프값을 나타낸 표이다.

Claims (8)

  1. HCCR-1에 대한 항체 및 AFP에 대한 항체를 포함하는 간암 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 초기 간암 진단에 유용한 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 2cm 이하의 간암 진단에 유용한 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
  4. a)환자로부터 샘플을 얻는 단계;및
    b) 상기 샘플을 HCCR-1에 대한 항체로 처리하고, AFP에 대한 항체로 처리하여 샘플 내의 HCCR-1과 AFP 레벨을 측정하는 단계를 포함하는 간암 진단 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 진단 방법은 HCCR-1에 대한 단클론 항체 및 다중클론 항체를 동시에 이용한 샌드위치 ElISA 방법을 사용한 것을 특징으로 하는 간암 진단 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 진단 방법은 초기 간암 진단에 유용한 것을 특징으로 하는 간암 진단 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 진단 방법은 2cm 이하의 간암 진단에 유용한 것을 특징으로 하는 간암 진단 방법.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 HCCR-1에 대한 컷 오프 값은 10ng/ml이고 상기 AFP에 대한 컷 오프 값은 11ng/ml인 것을 특징으로 하는 간암 진단 방법.
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WO2014148780A1 (ko) * 2013-03-20 2014-09-25 서울대학교산학협력단 간암 진단용 바이오 마커
CN107942055A (zh) * 2017-11-22 2018-04-20 南宁科城汇信息科技有限公司 一种肝癌生物学过程中转录组和蛋白组学的elisa方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014148780A1 (ko) * 2013-03-20 2014-09-25 서울대학교산학협력단 간암 진단용 바이오 마커
KR101520615B1 (ko) * 2013-03-20 2015-05-18 서울대학교산학협력단 간암 진단용 바이오 마커
CN107942055A (zh) * 2017-11-22 2018-04-20 南宁科城汇信息科技有限公司 一种肝癌生物学过程中转录组和蛋白组学的elisa方法

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