JP4834839B2 - 悪性黒色腫(メラノーマ)の新規な診断キット - Google Patents
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Description
(1)SPARCに対する抗体、及びGPC3に対する抗体を含む、悪性黒色腫(メラノーマ)の診断キット。
(2)サンプル中のSPARC及びGPC3を測定することを特徴とする、悪性黒色腫(メラノーマ)の診断方法。
(4) サンプル中のSPARC及びGPC3を定量することを含む、(2)又は(3)に記載の診断方法。
(5) サンプルが血清あるいは血漿である、(2)から(4)の何れかに記載の診断方法。
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
逆転写-PCR(RT-PCR)を用いたSPARC mRNA発現を検討した。マウス細胞系であるB16, B16F1, B16F10, EL4 MCA,及びLLCは東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから入手した。
センス:5'-GTCCCACACTGAGCTGGC-3'(配列番号1)
アンチセンス:5'-AAGCACAGAGTCTGGGTGAGTG-3'(配列番号2)である。
逆転写-PCR(RT-PCR)を用いて、SPARC mRNA発現を検討した。メラノーマ細胞系であるG361, CRL1579, SK-MEL-28及びHMV-Iは東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから入手した。526mel, 888melは慶応大学のY. Kawakami博士よりご供与頂いた。また164、SK-MEL-19、HM3KO、MEWO, colo38は熊本大学のT. Kageshita博士よりご供与頂いた。さらに、正常ヒト表皮メラニン細胞NHEMは、クラボウ(倉敷紡績株式会社)より購入した。
センス:5'-CGAAGAGGAGGTGGTGGCGGAAAA-3'(配列番号3)
アンチセンス:5'-GGTTGTTGTCCTCATCCCTCTCATAC-3'(配列番号4)であり、
対照実験のためのβ-アクチン PCRプライマー配列は、
センス:5'-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3'(配列番号5)
アンチセンス:5'-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3'(配列番号6)である。
Western blotting法を用いて、ヒト正常皮膚、ヒト色素性母斑、ヒトメラノーマ組織におけるSPARC蛋白の発現を調べた。検体は、熊本大学医学部皮膚科学講座において治療されたインフォームドコンセントの得られたものを、T.Kageshita博士より御供与頂いた。
96ウェルのELISAプレート(Nunc, Denmark)を室温で一晩、PBS、pH7.4中0.05μg/ウェルの抗-ヒトSPARCモノクロ-ナル抗体(Zymed laboratories,San Francisco)でコートした。次いで、100%ブロックエース(大日本製薬株式会社)を用い、室温で1時間、プレートをブロッキングした。陽性対照の標準サンプル及び培養上清、10%ブロックエースで200倍希釈した患者血清をビオチン化抗-ヒトSPARCポリクローナル抗体(R&D system,minneapolis)と共に添加し、室温で2時間インキュベーションした。PBSで3回洗浄した後、各ウェルにHRP-コンジュゲートストレプトアビジン(ENDOGEN, Woburn)を添加した。30分のインキュベーションの後、プレートをPBSで3回洗浄し、TMB基質溶液(ENDOGEN)を添加した。解析のためにELISAリーダー(モデル550、Bio-Rad)を450nmで用いた。
Claims (5)
- SPARCに対する抗体、及びGPC3に対する抗体を含む、悪性黒色腫(メラノーマ)の診断キット。
- 悪性黒色腫(メラノーマ)の診断のために、サンプル中のSPARC及びGPC3を測定する方法。
- サンプルとSPARCに対する抗体を接触させる工程、及びサンプルとGPC3に対する抗体を接触させることを含む、請求項2に記載の方法。
- サンプル中のSPARC及びGPC3を定量することを含む、請求項2又は3に記載の方法。
- サンプルが血清あるいは血漿である、請求項2から4の何れかに記載の方法。
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