JP4336898B2 - 悪性黒色腫（メラノーマ）の診断剤 - Google Patents

Description

本発明は、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断剤及び診断キット、並びに悪性黒色腫（メラノーマ）の診断方法に関する。

メラノーマは悪性黒色腫と呼ばれる皮膚がんの一種である。皮膚がんの種類は多様であるが、メラノーマは最も悪性度が高い皮膚がんである。皮膚を構成している細胞のなかにメラニン色素を産生する細胞があり、これを色素細胞（メラノサイト）と呼ぶが、この細胞ががん化したものがメラノーマである。
日本におけるメラノーマの発生数は人口１０万人当たり１．５〜２人程度であり、日本では年間１５００人〜２０００人程度発生していると推測されている。欧米では人口１０万人あたり１０数人以上の発生率と言われ、オーストラリアでは人口１０万人あたり２０数人以上の発生率で世界一発生数が高いと言われている。それだけに欧米やオーストラリアの人々はメラノーマに関心を持ち、メラノーマの発生に注意をしている。また、驚くことに、外国でも日本でもメラノーマの発生数は年々増加傾向が認められている。最近の調査では、日本におけるこの病気による年間死亡者数は４５０人前後もいる。メラノーマは何歳の人でも発生しているが、特に４０歳以上になると発生が多くなり、６０歳〜７０歳台が最も多くなっている。小児の発生は非常に少ないが、発生しないということはなく、最近２０〜３０歳台の若年者の発生が多くなっている傾向がある。性別では特にどちらかに多いという傾向はなく、男女どちらにも発生する。日本人のメラノーマが発生しやすい部位は、足底（足のうら）が最も多く、約３割程度を占めている。足や指の爪の部分にも多くできることが、日本人の特徴である。そのほか、欧米人と同様に体、手、足、顔、頭など、どこの皮膚にも発生する。
一方、血清腫瘍マーカーの測定は、メラノーマの診断のみならず、術後症例における再発の早期発見と、進行期例の治療効果の判定に重要である。メラノーマの腫瘍マーカーとしては、これまでに血清のＬＤＨや５−Ｓ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ ｄｏｐａ（５−Ｓ−ＣＤ）の有用性が知られていたが、さらに近年、Ｓ−１００β蛋白およびｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＭＩＡ）がより鋭敏なマーカーとして報告されている。日本においては、メラノーマの腫瘍マーカーとしては、５−Ｓ−ＣＤが広く用いられている。しかし、いずれの腫瘍マーカーも、Ｓｔａｇｅ ＩＶといったかなり進行したものでないと陽性にならず、メラノーマの診断や、術後再発の早期発見という面では、有用性は限られているといわざるを得ない。
本発明者等は先に、２３，０４０種の遺伝子を含むゲノムワイドのｃＤＮＡマイクロアレイの使用によって、２０種の原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）および胎生期を含む様々な正常臓器におけるこれらの遺伝子の発現プロファイルを検討し、グリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３；ＧＰＣ３）が、胎生期の肝臓、腎臓、肺に発現し、成人の正常臓器では胎盤以外ほとんど発現しないのに対し、ほとんどのＨＣＣで高発現することを見いだした。さらに、このグリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３；ＧＰＣ３）が、分泌蛋白であり、ＥＬＩＳＡ法を用いて４０％のＨＣＣ患者の血清中にグリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３；ＧＰＣ３）を検出することができ、これが、ＨＣＣの新しい腫瘍マーカーとして有用であることを報告した（Ｎａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０６，１６−２５（２００３））。
１９９６年、Ｐｉｌｉａらは、グリピカンファミリーのメンバーの１種をコードするグリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３；ＧＰＣ３）が、Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｇｏｌａｂｉ−Ｂｅｈｍｅｌ症候詳（ＳＧＢＳ）患者において変異していることを報告した（Ｐｉｌｉａ，Ｇ．ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２，２４１−２４７（１９９６））。ＳＧＢＳは出生前後の過成長、及び女性キャリアにおける非常に軽い表現型から男性乳児の致死的症状までの幅広い臨床的発現によって特徴付けられるＸ連鎖障害である（Ｎｅｒｉ，Ｇ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．７９，２７９−２８３（１９９８））。ＳＧＢＳの臨床的特徴としては、特徴的な顔貌（ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆａｃｉａｌ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）、口蓋裂、合指、多指、副乳、嚢胞性及び異形成腎、先天性心欠陥等が挙げられる（Ｂｅｈｍｅｌ，Ａ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６７，４０９−４１３（１９８４）；Ｇａｒｇａｎｔａ，Ｃ．Ｌ．及びＢｏｄｕｒｔｈａ，Ｊ．Ｎ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４４，１２９−１３５（１９９２）；Ｇｏｌａｂｉ，Ｍ．及びＲｏｓｅｎ，Ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１７，３４５−３５８（１９８４）；及びＧｕｒｒｉｅｒｉ，Ｆ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．４４，１３６−１３７（１９９２））。ＧＰＣ３変異のほとんどは点突然変異またはエクソンを含む数塩基の欠失であると報告されている（Ｈｕｇｈｅｓ−Ｂｅｎｚｉｅ，Ｒ．Ｍ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．６６，２２７−２３４（１９９６）；Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３４，４８０−４８３（１９９７）；Ｖｅｕｇｅｌｅｒｓ．Ｍ．ら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９，１３２１−１３２８（２０００）；及びＸｕａｎ，Ｊ．Ｙ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３６，５７−５８（１９９９））。また、患者の表現型と変異の位置に相関性がないことから、ＳＧＢＳは機能的ＧＰＣ３タンパク質の欠損と、ファミリー内及びファミリー間の表現型の際に関連する他の遺伝的要因によって引き起こされる可能性が挙げられており（Ｈｕｇｈｅｓ−Ｂｅｎｚｉｅ，Ｒ．Ｍ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．６６，２２７−２３４（１９９６））、ＧＰＣ３欠損マウスの研究からも、この仮説に対する支持が得られている（Ｃａｎｏ−Ｇａｕｃｉ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４６，２５５−２６４（１９９９））。これらのマウスはＳＧＢＳ患者に見られる、過成長、嚢胞性及び異形成腎を含む異常のいくつかを有している。
ノーザンブロット解析を用いた研究から、ＧＰＣ３ ｍＲＮＡはＨＣＣ、胎盤、胎児肝臟、胎児肺、胎児腎臓で過剰発現していることが報告されている（Ｚｈｕ，Ｚ．Ｗ．ら，Ｇｕｔ ４８，５５８−５６４（２００１）；Ｈｓｕ．Ｈ．Ｃ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７，５１７９−５１８４（１９９７）；及びＰｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｄｅｖ Ｄｙｎ．２１３，４３１−４３９（１９９８））。
また、ＧＰＣ３は細胞増殖の阻害剤であり、ある種の腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し得るため（Ｃａｎｏ−Ｇａｕｃｉ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４６，２５５−２６４（１９９９）；及びＤｕｅｎａｓ Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４１，１４０７−１４１４（１９９８））、ＧＰＣ３発現が種々の起源の腫瘍においてダウンレギュレートされているという報告がある。Ｌｉｎらは、ＧＰＣ３は正常な卵巣で発現しているが、ある種の卵巣癌細胞系においては検出できないことを示した（Ｌｉｎ，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，８０７−８１０（１９９９））。ＧＰＣ３発現が見られない全てのケースにおいて、ＧＰＣ３プロモーターが過度にメチル化されており、コード領域における変異はなく、また脱メチル化剤で処理することによってＧＰＣ３発現は回復した。更に、ＧＰＣ３の異所性発現は数種の卵巣癌細胞系においてコロニー形成活性を阻害することが報告されている。ＧＰＣ３と癌を関連付ける他のデータとしては、正常なラット中皮細胞及び中皮腫細胞系に関するディファレンシャルｍＲＮＡディスプレイ研究から得られたものがある（Ｍｕｒｔｈｙ，Ｓ．Ｓ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９，４１０−４１６（２０００））。この研究において、ＧＰＣ３は腫瘍細胞系において絶えずダウンレギュレートされていることが見出された。更に、同様のダウンレギュレーションは原発性ラット中皮腫及びヒトの中皮腫由来の細胞系においても見られている。卵巣癌と同様に、ＧＰＣ３コード配列中に変異は見出されていないが、ほとんどの細胞系でＧＰＣ３プロモーター領域に異常なメチル化が見られている。報告されているように（Ｄｕｅｎａｓ Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４１，１４０７−１４１４（１９９８））、中皮腫細胞系におけるＧＰＣ３の異所性発現はコロニー形成活性を阻害することが示された。更に最近、Ｘｉａｎｇらは、ＧＰＣ３がヒトの乳癌においても発現していないことを報告した（Ｘｉａｎｇ，Ｙ．Ｙ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０，７４０８−７４１２（２００１））。これらのデータから、ＧＰＣ３がこれらの癌における成長の負のレギュレーターとして作用し得ることが示唆される。すなわち、ＧＰＣ３の発現は成人のＧＰＣ３陽性組織から生じる癌における腫瘍の進行の間に低減し、この低減が悪性の表現型の発生において何らかの役割を果たしているように思われる。
反対に、ＨＣＣの場合、腫瘍は胎児においてのみＧＰＣ３を発現する肝臓組織から生じ、ＧＰＣ３発現は悪性への形質転換において再び現れる傾向がある。ＧＰＣ３の再発現がこれらの腫瘍の進行において重要であるか否かは明らかでない。ここ数年の間に、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）が線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及びＷｎｔ等のヘパリン結合性成長因子の最適活性に必要であることが明らかとなった（Ｙａｙｏｎ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ ６４，８４１−８４８（１９９１）；及びＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ ８３，３５７−３６０（１９９５））。グリピカンはＧＰＩアンカー型細胞表面ＨＳＰＧのファミリーであり、腫瘍形成とＧＰＣ３の発現レベルの関係におけるこの組織特異的な差異は、ＧＰＣ３が各組織において成長と生存因子を異なって調節しているためではないかと推測される。ＧＰＣ３は少なくともこれらの臓器において癌胎児性タンパク質として働いているように思われる。一般に、癌胎児性タンパク質は腫瘍の進行において重要な役割を持つとはされていないが、腫瘍マーカーまたは免疫治療の標的として使用されてきた（Ｃｏｇｇｉｎ，Ｊ．Ｈ．Ｊｒ．，ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ５，３７−５５（１９９２）；及びＭａｔｓｕｕｒａ，Ｈ．及びＨａｋｏｍｏｒｉ Ｓ．−Ｉ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，６５１７−６５２１（１９８５））。ＧＰＣ３の癌胎児性挙動が臨床的用途に利用し得るか否か、このグリピカンの再発現がＨＣＣの進行において重要であるか否かは、更に研究の余地がある。

メラノーマの腫瘍マーカーとしては、血清のＬＤＨや日本で広く用いられている５−Ｓ−ｃｙｓｔｅｉｎｙｌｄｏｐａ（５−Ｓ−ＣＤ）、さらに近年、より鋭敏なマーカーとして報告されているＳ−１００β蛋白およびｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＭＩＡ）があるが、いずれの腫瘍マーカーも、Ｓｔａｇｅ ＩＶといったかなり進行したものでないと陽性にならず、メラノーマの早期診断や、術後再発の早期発見という面では、有用性は限られているといわざるを得ない。メラノーマの早期診断には他に有用な腫瘍マーカーが必要である。即ち、本発明は、悪性黒色腫（メラノーマ）の新規かつ臨床的に有用な診断剤を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者等は、先に、ｃＤＮＡマイクロアレイに基づいてヒト肝細胞癌において特異的に過剰発現している新規な癌胎児性タンパク質としてグリピカン３（ＧＰＣ３）を同定し、ＨＣＣ患者血清中に可溶性ＧＰＣ３タンパク質を検出し、ＧＰＣ３はＨＣＣの新たな腫瘍マーカーとなり得ることを明らかにした。本発明者等は今回、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６にＧＰＣ３が発現することを初めて発見し、ＧＰＣ３がメラノーマにおいてもＨＣＣと同様に高発現しており、有用な腫瘍マーカーになりうるのではないかと考えた。そこで本発明者等は、確認のための実験を行った結果、ＧＰＣ３がメラノーマにおいて今までになかった早期診断のできる腫瘍マーカーであることを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）を提供する。
（１） ＧＰＣ３に対する抗体、又はＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断剤。
（２） ＧＰＣ３に対する抗体、又はＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断のためのキット。
（３） サンプル中のＧＰＣ３を検出又は測定することを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断方法。
（４） サンプルとＧＰＣ３に対する抗体とを接触させることを含む、（３）に記載の診断方法。
（５） サンプル中のＧＰＣ３を定量することを含む、（３）又は（４）に記載の診断方法。
（６） 悪性黒色腫（メラノーマ）の腫瘍マーカーとしてＧＰＣを使用する方法。

図１は、ＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現を示す。
Ａ：マウス細胞系におけるＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現
レーン１：ＥＬ４，２：Ｃｏｌｏｎ２６，３：Ｂ１６，４：ＭＨ１２９Ｆ，５：ＭＨ１２９Ｐ，６：ＭＨ１３４
その結果、Ｂ１６メラノーマ細胞系においてＧＰＣ３ ｍＲＮＡの強い発現が示されたが、ＥＬ４，Ｃｏｌｏｎ２６，ＭＨ１２９Ｆ，ＭＨ１２９Ｐ，ＭＨ１３４ではそのような発現は見られなかった。
Ｂ：ヒトメラノーマ細胞株におけるＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現
レーン１：１６４，２：８８８ｍｅｌ，３：Ｉｈａｒａ，４：ＣＲＬ１５７９，５：５２６ｍｅｌ，６：Ｇ３６１，７：ＭｅＷｏ，８：ＳＫ−ＭＥＬ−２８，９：ＳＫ−ＭＥＬ−１９，１０：Ｃｏｌｏ３８，１１：ＨＭＶ−Ｉ，１２：ＨＥＭｎ（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）
１６４，８８８ｍｅｌ，Ｉｈａｒａ，ＣＲＬ１５７９，ＭｅＷｏメラノーマ細胞系においてＧＰＣ３ ｍＲＮＡの強い発現が示され、５２６ｍｅｌ，Ｇ３６１，ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞系において中程度の発現が示されたが、ＳＫ−ＭＥＬ−１９，Ｃｏｌｏ３８，ＨＭＶ−Ｉではそのような発現は見られなかった（図１Ｂ）。尚、培養メラノサイトにも若干発現がみられた。
Ｃ：ヒトメラノーマ組織におけるＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現
レーン１：正常皮膚，２：Ｐｔ１メラノーマ原発巣，３：Ｐｔ２メラノーマ原発巣，４：Ｐｔ２メラノーマリンパ節転移巣，５：Ｐｔ３メラノーマ原発巣，６：Ｐｔ４メラノーマ原発巣，７：先天性色素性母斑症例１，８：先天性色素性母斑症例２
正常皮膚にはＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現は認めなかったが、ほとんどのメラノーマ組織でＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現を認めた。一方、先天性色素性母斑でもＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現を認めた。
図２は、免疫組織化学分析によるメラノーマおよび色素性母斑におけるＧＰＣ３タンパクの発現を示す。
Ａ：（Ｐｔ６）Ｘ１００ ＧＰＣ３ メラノーマ癌部非癌部境界部，Ｂ：（Ｐｔ７）Ｘ２００ ＧＰＣ３メラノーマ癌部，Ｃ：色素性母斑症例３ Ｘ１００ ＧＰＣ３
正常皮膚にはＧＰＣ３タンパクがほとんど発現しないのに対し、メラノーマ細胞および色素性母斑では、ＧＰＣ３タンパクが高発現していた。
図３Ａはメラノーマ細胞系の培養上清中に分泌されるＧＰＣ３タンパク質のＥＬＩＳＡによる定量の結果を示す。ＨｅｐＧ２細胞１×１０^５個の２４時間培養後の培養上清１ｍｌ中のＧＰＣ３タンパク質の濃度を１Ｕ／ｍｌと規定した。ＨｅｐＧ２培養上清中のＧＰＣ３タンパク質の量よりは少ないが、１１種類のメラノーマ細胞株のうち、５種類の培養上清中にＧＰＣ３タンパクが検出された。
図３Ｂはメラノーマ患者血清中の可溶性ＧＰＣ３タンパク質の存在を示す。９１名の術前メラノーマ患者、５名の巨大先天性色素性母斑患者、及び６０名の健康なドナー（ＨＤ）の血清中のＧＰＣ３タンパク質の量をＥＬＩＳＡによって評価した（図３Ｂ）。６０名のＨＤ、５名の巨大先天性色素性母斑患者の血清中にはＧＰＣ３タンパク質は全く検出されなかった。９１名のメラノーマ患者の３９．６％（３６／９１）、５名の巨大先天性色素性母斑患者の０％（０／５）、ＨＤの０％（０／６０）がＧＰＣ３タンパク質陽性であった。さらに、そのうち、術後の経過をおうことができた１４例すべてにおいて、摘出手術後には血清中にＧＰＣ３タンパクが検出されなくなった。
図４Ａはメラノーマ患者血清中のＳｔａｇｅ別可溶性ＧＰＣ３タンパク質の存在を示す。（＋）は術前患者、（−）は術後で患者さんにメラノーマが存在しないと思われる症例。Ｎは症例数。
図４Ｂはメラノーマ患者血清中のＳｔａｇｅ別５−Ｓ−ＣＤを示す。
図４Ａと同じ症例の５−Ｓ−ＣＤ（ｎｍｏｌ／Ｌ）を示す。カットオフ値を１０（ｎｍｏｌ／Ｌ）に設定した。
図４Ｃはメラノーマ患者血清中のＳｔａｇｅ別ＭＩＡを示す。
図４Ａと同じ症例のＭＩＡ（ｎｇ／ｍｌ）を示す。カットオフ値を１７（ｎｇ／ｍｌ）に設定した。

本発明者等は、（Ｎａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０６，１６−２５（２００３））に記載の方法を用い、グリピカン３（ＧＰＣ３）がメラノーマの早期診断に有用な血清腫瘍マーカーであることを見いだした。
ヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋのタンパク質データベースにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ００４４７５として登録されており、当業者であれば容易に入手することができる。
本発明は、ＧＰＣ３に対する抗体、又はＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断剤を提供する。
ＧＰＣ３に対する抗体は、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１，タンパク質Ｉ，３８９−４０６，東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ＧＰＣタンパク質はアミノ酸配列が前記のように公知であり、該アミノ酸配列に基づいて通常のタンパク質発現技術を用いて製造でき、また市販のもの（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を利用することも可能である。市販のＧＰＣ３を用いる場合は、必要に応じてＳＤＳ−ＯｕｔＴＭ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬより購入）を用いてＳＤＳを除いて使用することが好ましい。またＧＰＣ３の部分ペプチドは、ＧＰＣ３のアミノ酸配列から適当な部分配列を選択し、通常のペプチド合成技術を用いて製造できる。
ポリクローナル抗体の調製は、例えば、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの動物に適量のＧＰＣ３タンパク質またはその部分ペプチドを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（ＦＩＡやＦＣＡ）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、ＧＰＣ３タンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臟またはリンパ節を採取する。この脾臟またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインＡや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。尚、本発明の目的のためには、抗体はＧＰＣ３のいかなるエピトープを認識するものであっても良い。
本発明で使用する抗体は、上記の通り調製したイムノグロブリン分画を使用してもよいが、さらにＧＰＣ３タンパク質との結合部位のみを分離したＦ（ａｂ’）_２，Ｆａｂ’，Ｆａｂなどの分画を使用することもできる。
診断剤としての正確性のためには、抗体はヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。ヒト型抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体であれば、ＧＰＣ３タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのＨ鎖定常部をヒトＩｇＥ Ｈ鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＧＰＣ３タンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
本発明の診断剤における抗体の濃度は特に限定されないが、例えば０．１から１０μｇ／ｍｌの濃度で用いることができる。診断剤には上記ＧＰＣ３に対する抗体の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体等を適宜含有させることができる。
本発明は更に、サンプル中のＧＰＣ３を検出又は測定することを含む、メラノーマの診断方法を提供する。例えば、サンプルとＧＰＣ３に対する抗体を接触させることによって、サンプル中のＧＰＣ３を検出又は測定することができる。本発明におけるサンプルとしては、メラノーマに罹患しているおそれのある被験者から得られる血清、唾液又は尿などの体液、あるいは皮膚組織切片等が挙げられるが、特に好ましくは血清である。サンプルと上記抗体との接触は、当分野において通常行われている方法に基づいて行えばよく、特に限定するものではない。
皮膚組織切片をサンプルとする場合は、常法に従って作製した臓器の組織切片をＧＰＣ３に対する抗体を用いて、免疫染色を行い、ＧＰＣ３の発現の有無を見ることによって、悪性黒色腫（メラノーマ）が生じているかどうかを判定することができる。
また、血清などの体液をサンプルとする場合には、例えばサンプルと上記抗体との接触の後、サンプル中に存在し得るＧＰＣ３と抗体との特異的結合を、蛍光物質や発光物質、酵素等で標識した二次抗体等を使用して定量的に検出することにより行うことができる。
即ち、本発明の方法によりサンプル中のＧＰＣ３を検出又は測定するためには、サンプルとＧＰＣ３に対する抗体とを反応させ、反応生成物である複合体を検出すればよい。酵素、放射性物質、蛍光物質などの標識をあらかじめ抗体に結合させておくことにより、反応生成物である複合体を検出することが可能になる。具体的には、ＧＰＣ３に対する抗体を用いて、例えばサンドイッチ法、競合法、凝集法、またウエスタンブロッティング法などの公知の測定法によりＧＰＣ３を検出又は測定することによって悪性黒色腫（メラノーマ）の診断が可能である。
また、診断のための反応をウェル等の液相中で行ってもよく、あるいはＧＰＣ３に対する抗体を固定した固相支持体上で行ってもよい。この場合、メラノーマに罹患していない正常なサンプル、あるいはメラノーマであることが判明しているサンプルを用いて予め作製した標準値と比較することによって、測定された値がメラノーマ陽性であるか否かを判定することができる。また、診断の際には、多数のメラノーマ患者と健常人の血清中ＧＰＣ３量を測定して、カットオフ値を設定することが好ましい。
本発明の診断方法は、メラノーマに罹患しているか否かの診断に用いることができる他、メラノーマに対する治療の効果を確認するために経時的に行うこともできる。
さらに本発明の悪性黒色腫（メラノーマ）の診断においてＧＰＣ３を検出又は測定する場合、ＧＰＣ３を蛋白質として検出するだけではなく、ＧＰＣ３のｍＲＮＡを検出する方法を用いてもよい。即ち、ＧＰＣ３のｍＲＮＡとハイブリダイズしうるＤＮＡまたはＲＮＡを試料と反応させ、試料中のＧＰＣ３のｍＲＮＡと、ＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション生成物を検出すればよい。ｍＲＮＡを検出する方法としては、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノーザンブロッテイング法、ＲＴ−ＰＣＲ法などが挙げられる。即ち、本発明によれば、ＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断剤が提供される。上記プローブ若しくはプライマーは、公知のヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列（例えばＧｅｎＢａｎｋのタンパク質データベースのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ００４４７５）に基づいて当業者であれば適宜設計及び入手することができる。
本発明はさらに、ＧＰＣ３に対する抗体、又はＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断のためのキットを提供する。本発明のキットとしては、ＧＰＣ３に対する抗体を用いる場合には、例えば、サンドイッチ法、競合法、凝集法、またウエスタンブロッティング法などの分析を行うのに必要な試薬を含むキットが挙げられる。また、ＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを用いる場合には、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノーザンブロッテイング法、ＲＴ−ＰＣＲ法などの分析を行うのに必要な試薬を含むキットが挙げられる。
本発明はさらに、悪性黒色腫（メラノーマ）の腫瘍マーカーとしてＧＰＣ３を使用する方法にも関する。該方法は、悪性黒色腫（メラノーマ）の腫瘍マーカーとしてＧＰＣ３を使用することによって悪性黒色腫（メラノーマ）を診断する方法の全てを包含するものであり、その態様が限定されない。悪性黒色腫（メラノーマ）の腫瘍マーカーとしてＧＰＣ３を使用する方法の具体例としては、ＧＰＣ３に対する抗体を用いてサンプル中のＧＰＣ３を、例えば、サンドイッチ法、競合法、凝集法、またウエスタンブロッティング法などにより検出又は測定する方法、並びに、ＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを用いることによって、サンプル中のＧＰＣ３の発現をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノーザンブロッテイング法、ＲＴ−ＰＣＲ法などにより検出又は測定する方法が包含される。
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例１］マウス細胞株におけるＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現
逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いたＧＰＣ３ ｍＲＮＡ発現を検討した。マウス細胞系であるＭＨ１２９Ｆ，ＭＨ１２９Ｐ及びＭＨ１３４は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから入手した。ＥＬ４，Ｃｏｌｏｎ２６，Ｂ１６は熊本大学のＭ．Ｏｇａｗａ博士よりご供与頂いた。
ＲＴ−ＰＣＲは公知の方法（例えばＮａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８１，９３６−９４４（２００１））に従って行った。５００ｂｐの断片を増幅するマウスＧＰＣ３遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを設計し、これを用いて９４℃、５分の初期変性、及び５８℃のアニーリング温度での３０増幅サイクルからなるＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。用いたＧＰＣ３ ＰＣＲプライマー配列は、センス：５’−ＡＣＧＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡ−３’（配列番号１）、アンチセンス：５’ＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡ−３’（配列番号２）である。
マウス細胞系におけるＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現を比較した。その結果、Ｂ１６メラノーマ細胞系においてＧＰＣ３ ｍＲＮＡの強い発現が示されたが、ＥＬ４，Ｃｏｌｏｎ２６，ＭＨ１２９Ｆ，ＭＨ１２９Ｐ，ＭＨ１３４ではそのような発現は見られなかった（図１Ａ）。
［実施例２］ヒトメラノーマ細胞株におけるＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現
逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いたＧＰＣ３ ｍＲＮＡ発現を検討した。メラノーマ細胞系であるＧ３６１，ＣＲＬ１５７９，ＳＫ−ＭＥＬ−２８，ＨＭＶ−Ｉ及びＨＭＶ−ＩＩは東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから入手した。５２６ｍｅｌ，８８８ｍｅｌは慶応大学のＹ．Ｋａｗａｋａｍｉ博士よりご供与頂いた。また、Ｉｈａｒａ、ＭｅＷｏ，ｃｏｌｏ３８は熊本大学のＴ．Ｋａｇｅｓｈｉｔａ博士よりご供与頂いた。さらに、培養ヒト表皮メラニン細胞ＨＥＭｎは、クラボウ（倉敷紡績株式会社）より購入した。
ＲＴ−ＰＣＲは公知の方法（例えばＮａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８１，９３６−９４４（２００１））に従って行った。９３９ｂｐの断片を増幅するヒトＧＰＣ３遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを設計し、これを用いて９４℃、５分の初期変性、及び５８℃のアニーリング温度での３０増幅サイクルからなるＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。用いたＧＰＣ３ ＰＣＲプライマー配列は、センス：５’−ＧＴＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＣ−３’（配列番号３）、アンチセンス：５’−ＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＡＴＧＴ−３’（配列番号４）であり、対照実験のためのβ−アクチンＰＣＲプライマー配列は、センス：５’−ＣＣＴＣＧＣＣＴＴＴＧＣＣＧＡＴＣＣ−３’（配列番号５）、アンチセンス：５’−ＧＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣ−３’（配列番号６）である。
対照であるβ−アクチンｍＲＮＡによる標準化の後、メラノーマ細胞系におけるＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現を比較した。その結果、１６４，８８８ｍｅｌ，Ｉｈａｒａ，ＣＲＬ１５７９，ＭｅＷｏメラノーマ細胞系においてＧＰＣ３ ｍＲＮＡの強い発現が示され、５２６ｍｅｌ，Ｇ３６１，ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞系において中程度の発現が示されたが、ＳＫ−ＭＥＬ−１９，Ｃｏｌｏ３８，ＨＭＶ−Ｉではそのような発現は見られなかった（図１Ｂ）。尚、培養メラノサイトにも若干発現がみられた。
［実施例３］ヒトメラノーマ組織におけるＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現
同様に、ヒト正常皮膚、ヒトメラノーマ、ヒト色素性母斑組織におけるＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現を調べた。検体は、熊本大学医学部皮膚科学講座において治療されたインフォームドコンセントの得られたものを、Ｔ．Ｋａｇｅｓｈｉｔａ博士より御供与頂いた。その結果、正常皮膚にはＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現は認めなかったが、ほとんどのメラノーマ組織でＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現を認めた。一方、先天性色素性母斑でもＧＰＣ３ ｍＲＮＡの発現を認めた。
［実施例４］メラノーマにおけるＧＰＣ３タンパク質の発現
２１名のメラノーマ患者から切除したメラノーマ組織周辺のメラノーマ及び非癌性領域および１１名の色素性母斑患者から切除した色素性母斑組織周辺の色素性母斑及び正常皮膚領域におけるＧＰＣ３の免疫組織化学分析を行った。
免疫組織化学分析は、当分野において公知の方法に従って行った（Ｎａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８１，９３６−９４４（２００１））。ホルマリン固定してパラフィン包埋した厚さ４μｍの組織サンプル切片を１：２００に希釈した抗−ＧＰＣ３抗体と共に染色した。代表的な結果を図２に示す。
図２Ａ，Ｂに示すように、メラノーマ２例とも、正常皮膚にはＧＰＣ３タンパクがほとんど発現しないのに対し、メラノーマ細胞では、ＧＰＣ３タンパクが高発現していた。一方、図２Ｃに示すように、色素性母斑でもＧＰＣ３タンパクは高発現していた。メラノーマの２１例中１７例（８１．０％）および色素性母斑の１１例中１０例でＧＰＣ３タンパクは高発現していた。
［実施例５］メラノーマ細胞系の培養上清及びメラノーマ患者血清中の可溶性ＧＰＣ３タンパク質の存在
ＧＰＣ３ ３０３−４６４のアミノ酸に対応する組換えタンパク質に対して作製された抗−ＧＰＣ３ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のビオチン化のためにＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｍｉｎｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｆ−６３４７）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ）を使用した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を４℃で一晩、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中０．１μｇ／ウェルの抗−ヒトＧＰＣ３ ３０３−４６４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）でコートした。次いで、１００％ブロックエース（大日本製薬株式会社）を用い、室温で１時間、プレートをブロッキングした。陽性対照の標準サンプル及び培養上清、１０％ブロックエースで２００倍希釈した患者血清をビオチン化抗−ＧＰＣ３抗体と共に添加し、室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄した後、各ウェルにＨＲＰ−コンジュゲートストレプトアビジン（ＥＮＤＯＧＥＮ，Ｗｏｂｕｒｎ）を添加した。３０分のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（ＥＮＤＯＧＥＮ）を添加した。解析のためにＥＬＩＳＡリーダー（モデル５５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を４０５ｎｍで用いた。
インフォームドコンセントを得た後、熊本大学医学部皮膚科学講座において治療を受けたメラノーマ患者から血清サンプルを得た。ＧＰＣ３はＧＰＩ−アンカー型膜タンパク質であり、分泌タンパク質である可能性が報告されている（Ｆｉｌｍｕｓ Ｊ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １１，１９Ｒ−２３Ｒ（２００１））。本発明者らは先に、このグリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３；ＧＰＣ３）が、分泌蛋白であり、ＥＬＩＳＡ法を用いて４０％のＨＣＣ患者の血清中にグリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３；ＧＰＣ３）を検出することができ、これが、ＨＣＣの新しい腫瘍マーカーとして有用であることを報告した（Ｎａｋａｔｓｕｒａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０６，１６−２５（２００３））。そこで、今回、メラノーマにおいてもＧＰＣ３タンパク質が分泌されるかどうかの検出を試みた。
抗−ＧＰＣ３ ３０３−４６４抗体及びビオチン化抗−ＧＰＣ３抗体を用いて酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）による検出を行った。ＧＰＣ３ ３０３−４６４に対応する市販の組換えタンパク質を用い、ＥＬＩＳＡ系におけるＧＰＣ３の定量の精度を確認した。ＨｅｐＧ２培養上清の連続希釈を用い、ＯＤデータに基づいてＧＰＣ３タンパク質を定量する標準曲線を評価した。１×１０^５個のＨｅｐＧ２細胞を２４時間培養した後の培養上清１ｍｌ中のＧＰＣ３タンパク質の濃度を１Ｕ／ｍｌと規定した。ＨｅｐＧ２培養上清中のＧＰＣ３タンパク質の量よりは少ないが、１１種類のメラノーマ細胞株のうち、５種類の培養上清中にＧＰＣ３タンパクが検出された。また、培養メラノサイトの培養上清中にはＧＰＣ３タンパクは検出されなかった（図３Ａ）。
次に、メラノーマ患者血清中の可溶性ＧＰＣ３タンパク質の検出を行った（図３Ｂ）。９１名の術前メラノーマ患者から血液サンプルを採取し、医療記録から患者のプロファイルを集めてＴＮＭ分類に基づいて臨床段階を決定した。９１名のメラノーマ患者、５名の巨大先天性色素性母斑患者、及び６０名の健康なドナー（ＨＤ）の血清中のＧＰＣ３タンパク質の量をＥＬＩＳＡによって評価した（図３Ｂ）。６０名のＨＤおよび５名の巨大先天性色素性母斑患者の血清中にはＧＰＣ３タンパク質は全く検出されなかった。９１名のメラノーマ患者の３９．６％（３６／９１）、５名の巨大先天性色素性母斑患者の０％（０／５）、ＨＤの０％（０／６０）がＧＰＣ３タンパク質陽性であった。さらに、そのうち、術後の経過をおうことができた１４例すべてにおいて、摘出手術後には血清中にＧＰＣ３タンパクが検出されなくなった。表１は、メラノーマ患者血清中の可溶性ＧＰＣ３，５−Ｓ−ＣＤ，ＭＩＡを示す。

図４Ａ，Ｂ，Ｃ，並びに表１の結果から明らかなように、従来のメラノーマの腫瘍マーカー、５−Ｓ−ＣＤ（図４Ｂ）、最近注目されているＭＩＡ（図４Ｃ）はいずれもＳｔａｇｅ ＩＩＩ，ＩＶの進行したメラノーマでしか有用でないが、ＧＰＣ３（図４Ａ）はＳｔａｇｅ０，Ｉ，ＩＩの早期でもメラノーマの診断に有効で、メラノーマの新規な腫瘍マーカーとして有用であることが明らかとなった。なお、ＭＩＡの測定には、ドイツ Ｒｏｃｈｅ社のＭＩＡ ＥＬＩＳＡキットを用いた。
表２は、メラノーマ肉眼分類別のメラノーマ患者血清中可溶性ＧＰＣ３を示す。

表２の結果は、日本人に多い足の裏にできる末端黒子型よりもむしろ欧米人に多くみられる表在拡大型や悪性黒子型の診断に若干強いことが示唆され、日本だけでなく、世界中のメラノーマの診断に十分寄与すると考えられた。

本発明により、ＧＰＣ３がメラノーマを早期に診断できる腫瘍マーカーとして有用であることが実証された。本発明によりメラノーマの腫瘍マーカーとしてＧＰＣ３を使用することによって、メラノーマに罹患しているか否かを早期かつ簡便に診断することが可能になる。ＧＰＣ３は、世界中の多くのメラノーマ患者に対する癌診断における用途に対して非常に有用である。

Claims (6)

1. ＧＰＣ３に対する抗体、又はＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断剤。
2. ＧＰＣ３に対する抗体、又はＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断のためのキット。
3. サンプル中のＧＰＣ３を検出又は測定することを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の検査方法。
4. サンプルとＧＰＣ３に対する抗体とを接触させることを含む、請求項３に記載の検査方法。
5. サンプル中のＧＰＣ３を定量することを含む、請求項３又は４に記載の検査方法。
6. 悪性黒色腫（メラノーマ）の腫瘍マーカーとしてＧＰＣ３を使用する方法。

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