JP6415547B2 - 膵臓癌診断用組成物およびこれを用いた膵臓癌診断方法 - Google Patents
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Description
(a)CA19−9(carbohydrate antigen 19−9);
(b)LRG1(Leucine−rich alpha−2−glycoprotein 1、LRG1);および
(c)TTR(Transthyretin、ATTR、Prealbumin、TBPA)、C1R(Complement C1r subcomponent precursor)、CLU(Clusterin preproprotein)およびKLKB1(Plasma Kallikrein protein)からなる群より選択された一つ以上のマーカー遺伝子を
含む膵臓癌診断用マーカーを含む。
前記試料から少なくとも3種類またはそれ以上のマーカー遺伝子の組み合わせであって、具体的に(a)CA19−9;(b)LRG1;および(c)TTR、C1R、CLUおよびKLKB1からなる群より選択されたいずれか一つ以上のマーカー遺伝子を含む膵臓癌マーカーの蛋白質の発現水準またはmRNA発現水準をそれぞれ測定する段階;
前記対象から得られたマーカー遺伝子の発現水準をそれぞれ正常対照群試料での発現水準と比較して、前記膵臓癌発病有無を診断しようとする対象を膵臓癌または発病可能性の高い対象群と決定する段階を含む、膵臓癌の診断方法または膵臓癌診断の情報を提供する方法に関するものである。
LRG1(Leucine−rich alpha−2−glycoprotein 1、LRG1)、CA19−9(carbohydrate antigen 19−9)、TTR(Transthyretin、ATTR、Prealbumin、TBPA)、C1R(Complement C1r subcomponent precursor)およびKLKB1(Plasma Kallikrein protein;)からなる群より選択された一つ以上のマーカーを含むIPMNマーカー蛋白質またはこれを暗号化する遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤を含む、高危険群IPMNの選別診断用組成物に関するものである。例えば、前記IPMNマーカーは、LRG1、CA19−9、TTR、C1RおよびKLKB1からなる群より選択された1種のマーカーとCLUを含む組み合わせマーカー、またはLRG1、CA19−9、TTR、C1RおよびKLKB1からなる群より選択された2種のマーカーとLRG1を含む組み合わせマーカーであり得る。
前記測定されたマーカーの発現水準を、対照群マーカーの発現水準と比較する段階、および
前記マーカー発現水準の比較結果を用いて前記対象の高危険IPMN有無を決定する段階を含む、
高危険群IPMNを診断する方法に関するものである。
WHOの腫瘍分類ではIPMNを、主膵管またはその主要分枝から発生する腫瘍であって上皮が体腔内に乳頭状に成長し多様な程度に粘液を分泌して膵管が嚢胞性に拡張することが特徴である腫瘍であると定義している。
膵臓癌発病有無を診断しようとする対象から試料を得る段階;
前記対象試料から(a)CA19−9、(b)LRG1および(c)TTR、C1R、CLUおよびKLKB1からなる群より選択されたいずれか一つ以上のマーカーを含む膵臓癌マーカーの蛋白質発現水準またはmRNAの発現水準を測定する段階;
前記対象試料の(a)CA19−9、(b)LRG1および(c)TTR、C1R、CLUおよびKLKB1からなる群より選択されたいずれか一つ以上のマーカーを含む膵臓癌マーカーの発現水準を、それぞれ相応する正常対照群試料のマーカーの発現水準と比較する段階;および
前記マーカーの発現水準比較結果を用いて対象の膵臓癌有無を決定する段階。
<関数式1>
xは、膵臓癌診断用マーカーの発現水準測定値、
αiは、SVMにおけるラグランジュ乗数、
yiは、正常群/膵臓癌群の識別子、
xiは、基準測定値を、そして
bは、補正値を意味する。
<関数式1>
LRG1(Leucine−rich alpha−2−glycoprotein 1、LRG1)、CA19−9(carbohydrate antigen 19−9)、TTR(Transthyretin、ATTR、Prealbumin、TBPA)、C1R(Complement C1r subcomponent precursor)およびKLKB1(Plasma Kallikrein protein;)からなる群より選択された一つ以上のマーカーを含むIPMNマーカー蛋白質またはこれを暗号化する遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤を含む、高危険群IPMNの選別診断用組成物に関するものである。
前記測定されたマーカーの発現水準を、対照群マーカーの発現水準と比較する段階、および
前記マーカー発現水準の比較結果を用いて前記対象の高危険IPMN有無を決定する段階を含む、高危険群IPMNを診断する方法に関するものである。
膵臓癌を効果的に診断するための蛋白質組み合わせを発掘するために、下記表2および表3のように、5ヶ病院の患者の同意下に膵臓癌、その他の癌、膵臓炎および胆嚢炎患者群(表2)と正常群(表3)を構成した。
−NCC:National Cancer Center(国立癌センター)
−SMC:Samsung Medical Center(三星ソウル病院)
−SNUH:Seoul National University Hospital(ソウル大学校病院)
−YMC:Yonsei Medical Center(セブランス病院)
*訓練セットから導出された分類子(classifier)で全ての試験遂行
<2−1>血液試料前処理
各血液試料40μlを除去カラム(depletion column)に通過させて血液の最も多い比率を占めている7個の蛋白質を欠失させ、3kDaフィルターで濃縮した後、BCA定量を行って、そのうちの200μgに該当する血漿を取って6Mウレア(urea)で変性させ、20mM DTTおよび50mM ヨード酢酸(iodoacetic acid)を使用して還元およびアルキル化させた。ここにトリプシンを50:1(蛋白質:トリプシン、w/w)の比率で37℃で16時間処理して蛋白質をペプチドに作った後、前記ペプチドをC18 OASISカラム(Waters、USA)を用いて脱塩し凍結乾燥した。前記凍結乾燥されたペプチドを溶液A(98%蒸留水、2%アセトニトリル、0.1%ホルム酸)に溶かし、これに対してMRM分析を行った。
MRM分析を行うために、特定蛋白質の特徴的な電荷対質量比(m/z)を有するペプチドを選定し(Q1)、このペプチドを電気的な衝撃で断片化させた時に発生する様々な切片イオンのうちの該当ペプチドに対して特徴的なm/zを有する断片イオンを選定した(Q3)。このQ1とQ3の組み合わせは特定蛋白質に特異的なイオンの組み合わせであって、これをトランジションと称し、高分解能(triple quadrupole)質量分光分析器でこの特徴的なQ1とQ3でイオンを順次に通過させた時に得られる信号を定量的情報に換算して定量分析を行った。米国ワシントン大学のMacCoss研究チームで開発したスカイライン(SKYLine)という公開ソフトウェアを用いてNIST(National Institute of Standards and Technology)ライブラリーのペプチドタンデム質量スペクトル(peptide tandem mass spectra)を基盤にしてms/msデータが存在するペプチドに対して、総強度が高い順に1個の蛋白質当り最大10個のペプチドを選定した。ペプチドの長さはアミノ酸最小7個から最大24個に選定した。
(a)該当ペプチド内にメチオニンが存在する場合、生体内ROS(reactive oxygen species)によって酸化が発生し質量値が32Da増加;
(b)該当ペプチド内にヒスチジンが存在する場合、R−グループの正電荷によって該当ペプチドの電荷状態が変わる;
(c)該当ペプチド内にNxS/Tモチーフが存在する場合、N−糖化が発生し質量値が移動(shift)する;
(d)該当ペプチド内にトリプシンによって切られるRやKの次にプロリンが存在する場合、未切断(missed cleavage)が発生することがある。
LCはアジレント社の1260−毛細管LCを使用し、ペプチドの分離のために毛細管RR0.5×150の3.5umのカラムを使用した。試料は5μlを注入し、流速は20μl/分に設定した。先ず、カラムをSol A(体積基準に95%蒸留水、5%アセトニトリル、0.1%ホルム酸)で10分間平衡化した後、Sol AとSol B(体積基準に5%蒸留水、95%アセトニトリル、0.1%ホルム酸)を50分間95:5から15:85まで、5分間15:85の体積比率で濃度勾配を加えてペプチドを溶出した。
定量性を確認するために、内部標準ペプチドであるβ−ガラクトシダーゼペプチド(GDFQFNISR[C13N15]、547.3/646.4m/z)を0.09、0.27、0.82、2.5、7.4、22.2、66.7および200fmolにそれぞれ希釈した後、ここに標的ペプチド分析条件と同様に血漿10ugをマトリックスに入れて分析を行った。また、内因性(endogenous)信号を確認する目的で内部標準ペプチドを入れない場合も分析に含ませ、全ての9個の濃度点で3回繰り返してMRM定量し標準曲線(standard curve)を決定した。
膵臓癌患者群および正常群を対象にしてLRG1、TTRおよびCLU蛋白質の発現量をELISA法によって測定した。LRG1の場合はIBL社のhLRG1 ELISAキットを使用し、TTRの場合はAssayPro社のプレアルブミンELISAキットを使用し、CLUの場合はR&D Systems社のHuman Clusterin Quantikineキットを使用し、各ELISA測定は製造会社のプロトコルによって行った。
膵臓癌患者群および正常群を対象にしてTTR蛋白質の発現量を免疫比濁法(immunoturbidimetric assay)によって測定した。前記測定は、ロシュダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社のCOBAS INTEGRA 800 Prealbuminを用いて製造社のプロトコルによって行った。
<5−1>PDAC区分のためのCA19−9、LRG1およびTTR組み合わせマーカーの診断性能
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質はロシュダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社のCOBAS Elecsys CA 19−9機器を用いた化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびTTR蛋白質はMRM定量分析によって測定した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌初期病期区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびTTR蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表5および図12に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの癌および膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびTTR蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表5および図13に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能をCA19−9<37U/mlの実験群を対象に分析した。主に臨床では測定者のCA19−9測定値が37U/ml以上である時に膵臓癌と判断する。したがって、CA19−9<37U/mlの実験群ではCA19−9が膵臓癌診断マーカーとしての性能を発揮できない。前記CA19−9蛋白質はロシュダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社のCOBAS Elecsys CA 19−9機器を用いた化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびTTR蛋白質はMRM定量分析によって測定した。
実施例5でMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析したことをELISA方法で性能再現有無を確認し、ELISA方法でもCA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせは膵臓癌診断性能が優れているのを確認することができた。
実施例3のELISA方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびTTR蛋白質はELISA方法によって測定した。
実施例3のELISA方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌初期病期区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびTTR蛋白質はELISA方法によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表6および図16に示した。
実施例3のELISA方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの癌および膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびTTR蛋白質はELISA方法によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表6および図17に示した。
実施例3のELISA方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能をCA19−9<37U/mlの実験群を対象にして分析した。主に臨床では測定者のCA19−9測定値が37U/ml以上である時に膵臓癌と判断する。したがって、CA19−9<37U/mlの実験群ではCA19−9が膵臓癌診断マーカーとしての性能を発揮できない。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびTTR蛋白質はELISA方法によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表6および図18に示した。
実施例5でMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析したことを免疫比濁法で性能再現有無を確認し、免疫比濁法でもCA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせは膵臓癌診断性能が優れているのを確認することができた。
実施例4の免疫比濁法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1蛋白質はELISA方法によって、TTR蛋白質は免疫比濁法によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表7および図19に示した。
実施例4の免疫比濁法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌初期病期区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1蛋白質はELISA方法によって、TTR蛋白質は免疫比濁法によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表7および図20に示した。
実施例4の免疫比濁法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの癌および膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1蛋白質はELISA方法によって、TTR蛋白質は免疫比濁法によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表7および図21に示した。
実施例4の免疫比濁法を用いて、CA19−9、LRG1およびTTRの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能をCA19−9<37U/mlの実験群を対象にして分析した。主に臨床では測定者のCA19−9測定値が37U/ml以上である時に膵臓癌と判断する。したがって、CA19−9<37U/mlの実験群ではCA19−9が膵臓癌診断マーカーとしての性能を発揮できない。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1蛋白質はELISA方法によって、TTR蛋白質は免疫比濁法によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表7および図22に示した。
<8−1>PDAC区分のためのCA19−9、LRG1およびC1R組み合わせマーカーの診断性能
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびC1Rの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびC1R蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表8および図23に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびC1Rの組み合わせマーカーの膵臓癌初期病期区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびC1R蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表9および図24に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびC1Rの組み合わせマーカーの癌および膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびC1R蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表10および図25に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびC1Rの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびC1R蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表10および図26に示した。
<9−1>PDAC区分のためのCA19−9、LRG1およびCLU組み合わせマーカーの診断性能
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびCLU蛋白質はMRM定量分析によって測定された。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表11および図27に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせマーカーの膵臓癌初期病期区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびCLU蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表12および図28に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせマーカーの癌および膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびCLU蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表12および図29に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびCLU蛋白質はMRM定量分析によって測定された。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表12および図30に示した。
実施例9でMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析したことをELISA方法で性能再現有無を確認し、ELISA方法でもCA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせは膵臓癌診断性能が優れているのを確認することができた。
実施例3のELISA方法を用いて、CA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびCLU蛋白質はELISA定量分析によって測定された。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表13および図31に示した。
実施例3のELISA方法を用いて、CA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせマーカーの膵臓癌初期病期区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびCLU蛋白質はELISA定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表14および図32に示した。
実施例3のELISA方法を用いて、CA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせマーカーの癌および膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびCLU蛋白質はELISA定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表14および図33に示した。
実施例3のELISA方法を用いて、CA19−9、LRG1およびCLUの組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびCLU蛋白質はELISA定量分析によって測定された。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表14および図34に示した。
<11−1>PDAC区分のためのCA19−9、LRG1およびKLKB1組み合わせマーカーの診断性能
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびKLKB1の組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびKLKB1蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表15および図35に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびKLKB1の組み合わせマーカーの膵臓癌初期病期区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびKLKB1蛋白質はMRM定量分析によって測定された。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表16および図36に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびKLKB1の組み合わせマーカーの癌および膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびKLKB1蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表16および図37に示した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、CA19−9、LRG1およびKLKB1の組み合わせマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質は化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびKLKB1蛋白質はMRM定量分析によって測定した。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表16および図38に示した。
<12−1>CA19−9+LRG1+TTR
統計分析のためにSVM(Support Vector Machine)を用いた。SVMはラグランジュ最適化理論(Lagrangian optimization theory)に基づいて与えられた条件を満足する関数を推定するアルゴリズムであって、この中の最大マージン分類子(Maximum margin classifier)を使用する分類分析方法を使用する場合をサポートベクター分類(Support Vector Classification、SVC)という。本実施例では二つのサンプル群のうちの一つのサンプル群を使用し、該当サンプル群内の二つの集団(正常集団と癌患者集団)間差を最大にするSVCを機械学習を通じて導出して下記のような膵臓癌診断関数を構成した。
統計分析のためにSVM(Support Vector Machine)に基づいた関数式1を用いて膵臓癌有無を判断した。
統計分析のためにSVM(Support Vector Machine)に基づいた関数式1を用いて膵臓癌有無を判断した。3名の正常対照群からCA19−9測定値、LRG1およびCLUのMRM定量値としてそれぞれ(7.4、1.451、3.3803)、(6.3、1.0718、3.1325)および(26.1、1.2053、2.8642)を得て、これを前記診断関数に代入した結果、関数値がそれぞれf(7.4、1.451、3.3803)=−1、f(6.3、1.0718、3.1325)=−1、f(26.1、1.2053、2.8642)=−1と計算され、前記対象を正常と判別することができた。
統計分析のためにSVM(Support Vector Machine)に基づいた関数式1を用いて膵臓癌有無を判断した。3名の正常対照群からCA19−9測定値、LRG1およびKLKB1のMRM定量値としてそれぞれ(7.4、1.451、1.2801)、(6.3、1.0718、0.961)および(26.1、1.2053、1.5657)を得て、これを前記診断関数に代入した結果、関数値がそれぞれf(7.4、1.451、1.2801)=−1、f(6.3、1.0718、0.961)=−1、f(26.1、1.2053、1.5657)=−1と計算され、前記対象を正常と判別することができた。
統計分析のためにSVM(Support Vector Machine)に基づいた関数式1を用いて膵臓癌初期病期有無を判断した。3名の正常対照群からCA19−9測定値、LRG1およびKLKB1のMRM定量値としてそれぞれ(7.4、1.451、1.2801)、(6.3、1.0718、0.961)および(26.1、1.2053、1.5657)を得て、これを前記診断関数に代入した結果、関数値がそれぞれf(7.4、1.451、1.2801)=−1、f(6.3、1.0718、0.961)=−1、f(26.1、1.2053、1.5657)=−1と計算され、前記対象を正常と判別することができた。
統計分析のためにSVM(Support Vector Machine)に基づいた関数式1を用いて膵臓癌初期病期有無を判断した。3名のその他の癌患者からCA19−9測定値、LRG1およびKLKB1のMRM定量値としてそれぞれ(8、1.3985、0.7085)、(10.68、0.9864、0.776)および(7.32、1.1431、0.9214)を得て、これを前記診断関数に代入した結果、関数値がそれぞれf(8、1.3985、0.7085)=−1、f(10.68、0.9864、0.776)=−1、f(7.32、1.1431、0.9214)=−1と計算され、前記対象をその他の癌患者と判別することができた。
悪性亜型(malignant subtype)のIPMNを効果的に探知するために、下記表17のように、ソウル大学校病院の患者の同意下に正常群と実験群(高危険群)に区分した。
実施例2のMRM−MS方法を用いて、下記表32のマーカーの高危険IPMNに対する診断性能を分析した。前記CA19−9蛋白質はロシュダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)社のCOBAS Elecsys CA 19−9機器を用いた化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)によって、LRG1およびTTR蛋白質はMRM定量分析によって測定した。
低危険IPMNと高危険IPMNを区別して探知するために、実施例15の試料試験6に対して、実施例16のMMS分析法と実質的に同様な方法で下記表19に示す試験を行った。前記AUCおよびSn|Sp=0.9の測定結果を表19および図64乃至図89に示した。
実施例17でMRM−MS方法を用いてマーカーの膵臓癌区分に対する診断性能を分析したことをELISA方法で性能再現有無を確認し、ELISA方法でも表20のマーカー組み合わせは高危険IPMNの区別診断性能が優れているのを確認することができた。
以下、本発明の実施形態を示す。
(1)(a)CA19−9(carbohydrate antigen 19−9)、(b)LRG1(Leucine−rich alpha−2−glycoprotein 1、LRG)および(c)TTR(Transthyretin、ATTR、Prealbumin、TBPA);C1R(Complement C1r subcomponent precursor)、CLU(Clusterin preproprotein)およびKLKB1(Plasma Kallikrein protein;)からなる群より選択された一つ以上のマーカーを含む膵臓癌診断用マーカー蛋白質またはこれを暗号化する遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤を含む、膵臓癌診断用組成物。
(2)前記膵臓癌診断は、正常群と区別して膵臓癌を選別的に検出するか、多様な癌のうちの膵臓癌を選別的に検出するか、CA19−9の数値が37U/ml未満である膵臓癌を検出することである(1)に記載の組成物。
(3)前記膵臓癌は、膵管腺癌腫または高危険群膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm、IPMN)である(1)に記載の組成物。
(4)前記膵管腺癌腫は、1期または2期の膵管腺癌腫である(3)に記載の組成物。
(5)膵管腺癌腫は、IPMN由来したものではない(3)に記載の組成物。
(6)前記LRG1蛋白質はNCPI Accession No:NP_443204.1のアミノ酸配列を含み、前記TTR蛋白質はNCPI Accession No:NP_000362.1のアミノ酸配列を含み、前記C1R蛋白質はNCPI Accession No:NP_001724.3のアミノ酸配列を含み、前記CLU蛋白質はNCPI Accession No:NP_001822.3のアミノ酸配列を含み、前記KLKB1蛋白質はNCPI Accession No:NP_000883.2アミノ酸配列を含む(1)に記載の組成物。
(7)前記マーカー蛋白質の発現水準を測定する製剤が前記蛋白質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、PNA(peptide nucleic acid)またはアプタマー(aptamer)を含むことを特徴とする、(1)に記載の膵臓癌診断用組成物。
(8)前記マーカーmRNAの発現水準を測定する製剤が前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含むことを特徴とする、(1)に記載の膵臓癌診断用組成物。
(9)(1)乃至(8)のうちのいずれか一による組成物を含む、膵臓癌診断用キット。
(10)前記キットがRT−PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)キット、DNAチップキット、ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)キット、蛋白質チップキット、ラピッド(rapid)キットまたはMRM(Multiple reaction monitoring)キットであることを特徴とする、(9)に記載の膵臓癌診断用キット。
(11)対象の試料での少なくとも3種以上の膵臓癌マーカー蛋白質の発現水準またはこれを暗号化する遺伝子のmRNA発現水準を測定する段階、
前記測定された各マーカーの発現水準を、それぞれ正常対照群試料から得られたマーカーの発現水準と比較する段階、および
前記発現水準の比較結果を用いて前記対象の膵臓癌発病危険性を決定する段階を含み、
前記少なくとも3種以上の膵臓癌マーカーは、(a)CA19−9(carbohydrate antigen 19−9)、(b)LRG1(Leucine−rich alpha−2−glycoprotein 1、LRG)および(c)TTR(Transthyretin、ATTR、Prealbumin、TBPA);C1R(Complement C1r subcomponent precursor)、CLU(Clusterin preproprotein)およびKLKB1(Plasma Kallikrein protein;)からなる群より選択された一つ以上のマーカーを含む膵臓癌診断用マーカーである、膵臓癌の診断方法。
(12)前記決定段階は、前記マーカーの発現水準を比較した結果、測定対象の試料での(a)CA19−9および(b)LRG1発現水準がそれぞれ正常対照群での発現水準より高く、測定対象の試料での(c)TTR、CLU、およびKLKB1発現水準が正常対照群での発現水準より低いか、測定対象の試料でのC1Rの発現水準が正常対照群での発現水準より高い場合、膵臓癌と決定する、(11)に記載の膵臓癌の診断方法。
(13)前記膵臓癌の決定段階は、前記マーカーの発現水準を下記関数式1に代入して膵臓癌発病可能性を判定する段階を含む、(11)に記載の膵臓癌の診断方法:
<関数式1>
xは膵臓癌マーカーのうちのいずれか一つの発現水準測定値、
α i はSVM(Support Vector Machine)におけるラグランジュ乗数、
y i は正常群/膵臓癌群の識別子、
x i は基準測定値、そして
bは補正値を意味する。
(14)前記試料が血液、血清または血漿である、(11)に記載の膵臓癌の診断方法。
(15)前記マーカーの発現水準測定が該当蛋白質にそれぞれ特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、PNA(peptide nucleic acid)またはアプタマー(aptamer)を用いることである、(11)に記載の膵臓癌の診断方法。
(16)前記マーカーの発現水準測定または比較が、
蛋白質チップ分析、免疫測定法、リガンドバインディングアッセイ、MALDI−TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)分析、SELDI−TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)分析、放射免疫測定、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、補体結合分析法、二次元電気泳動分析、液体クロマトグラフィー−質量分析(liquid chromatography−Mass Spectrometry、LC−MS)、LC−MS/MS(liquid chromatography−Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)、ウエスタンブロット法およびELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)からなる群より選択されるものを用いて行われる、(11)に記載の膵臓癌の診断方法。
(17)前記mRNA発現水準測定が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、競合的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ(RPA)、ノーザンブロッティングまたはDNAチップによって行われる、(11)に記載の膵臓癌の診断方法。
(18)前記膵臓癌は膵管腺癌腫(PDAC)可能性を有する対象である(11)に記載の方法。
(19)前記膵管腺癌腫は、IPMN由来の膵管腺癌腫である(18)に記載の方法。
(20)前記膵臓癌診断は、正常群および癌以外の膵臓関連疾患と区別して膵臓癌を選別的に検出するか、多様な癌のうちの膵臓癌を選別的に検出するか、CA19−9の数値が37U/ml未満である膵臓癌を検出することである(11)に記載の方法。
(21)前記膵臓癌診断は、膵臓炎および胆嚢炎からなる群れより選択された1種以上の膵臓関連疾患から膵臓癌を選別的に検出することである(20)に記載の方法。
(22)前記膵臓癌は、膵管腺癌腫または高危険群膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm、IPMN)である(11)に記載の方法。
(23)LRG1(Leucine−rich alpha−2−glycoprotein1、LRG1)を含む膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm、IPMN)マーカー蛋白質またはこれを暗号化する遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤を含む、
高危険群IPMNの選別診断用組成物。
(24)前記組成物は、低危険群IPMNと区別して高危険群IPMNを選別するものである(23)に記載の組成物。
(25)前記IPMNマーカーは、CA19−9(carbohydrate antigen 19−9)、TTR、C1R、CLUおよびKLKB1からなる群より選択された1種以上のマーカーを追加的に含むものである(23)に記載の組成物。
(26)前記IPMNマーカーは、TTR、C1R、CLUおよびKLKB1からなる群より選択された1種マーカーとLRG1を含むマーカーである(25)に記載の組成物。
(27)前記IPMNマーカーは、TTR、C1R、CLUおよびKLKB1からなる群より選択された2種のマーカーとLRG1を含む組み合わせマーカーである(25)に記載の組成物。
(28)CLU(Clusterin preproprotein);および
LRG1(Leucine−rich alpha−2−glycoprotein 1、LRG1)、CA19−9(carbohydrate antigen 19−9)、TTR(Transthyretin、ATTR、Prealbumin、TBPA)、C1R(Complement C1r subcomponent precursor)およびKLKB1(Plasma Kallikrein protein;)からなる群より選択された一つ以上のマーカーを含むIPMNマーカー蛋白質またはこれを暗号化する遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤を含む、高危険群IPMNの選別診断用組成物。
(29)前記IPMNマーカーは、LRG1、CA19−9、TTR、C1RおよびKLKB1からなる群より選択された1種マーカーとCLUを含む組み合わせマーカーである(28)に記載の組成物。
(30)前記IPMNマーカーは、LRG1、CA19−9、TTR、C1RおよびKLKB1からなる群より選択された2種のマーカーとLRG1を含む組み合わせマーカーである(28)に記載の組成物。
(31)前記LRG1蛋白質はNCPI Accession No:NP_443204.1のアミノ酸配列を含み、前記TTR蛋白質はNCPI Accession No:NP_000362.1のアミノ酸配列を含み、前記C1R蛋白質はNCPI Accession No:NP_001724.3のアミノ酸配列を含み、前記CLU蛋白質はNCPI Accession No:NP_001822.3のアミノ酸配列を含み、前記KLKB1蛋白質はNCPI Accession No:NP_000883.2アミノ酸配列を含む(26)乃至(30)のうちのいずれか一に記載の組成物。
(32)前記蛋白質の発現水準を測定する製剤が、前記蛋白質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、PNA(peptide nucleic acid)またはアプタマー(aptamer)を含む(23)または(28)に記載の組成物。
(33)前記mRNAの発現水準を測定する製剤が、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含む(23)または(28)に記載の組成物。
(34)(26)乃至(30)のうちのいずれか一による組成物を含む、高危険群IPMNの選別診断用キット。
(35)前記キットが、RT−PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)キット、DNAチップキット、ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)キット、蛋白質チップキット、ラピッド(rapid)キットまたはMRM(Multiple reaction monitoring)キットである(34)に記載の高危険群IPMNの選別診断用キット。
(36)対象の試料に対して、(26)乃至(30)のうちのいずれか一による高危険群IPMNの選別診断用組成物による膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm、IPMN)マーカー蛋白質の発現水準またはこれを暗号化する遺伝子のmRNA発現水準をそれぞれ測定する段階、
前記測定されたマーカーの発現水準を、対照群マーカーの発現水準と比較する段階、および
前記マーカー発現水準の比較結果を用いて前記対象の高危険IPMN有無を決定する段階を含む、
高危険群IPMNを診断する方法。
(37)前記マーカーの発現水準を測定する段階以前に、対象がIPMNを有するか否かを確認する段階を追加的に含む(36)に記載の方法。
(38)前記確認する段階は、画像診断法、組織検査法または遺伝子マーカーを用いた方法によって行われる(37)に記載の方法。
(39)前記対象は、外科的切除術によってIPMN組織が除去された患者である(36)に記載の方法。
(40)前記対照群は、正常群、IPMNと膵管腺癌腫を除いた膵臓疾患を有する患者、または低危険IPMNを有する対象である(36)に記載の方法。
(41)前記高危険群IPMNは、高異形成(High grade dysplasia)と侵襲型(invasive type)のIPMNを含む(36)に記載の方法。
(42)前記方法は、対象の高危険IPMNと決定された場合、外科的切除術または薬物投与の処置段階遂行する段階を追加的に含む(36)に記載の方法。
(43)前記方法は、対象の低危険IPMNと決定された場合、薬物投与または予後モニタリングを遂行する段階を追加的に含む(38)に記載の方法。
(44)前記高危険IPMNの決定段階は、
前記マーカーの発現水準を比較した結果、測定対象の試料での(a)CA19−9および(b)LRG1発現水準が対照群での発現水準より高く、測定対象の試料での(c)TTR、CLU、およびKLKB1発現水準が正常対照群での発現水準より低いか、測定対象の試料でのC1Rの発現水準が正常対照群での発現水準より高い場合、対象の高危険IPMNと決定する(36)に記載の方法。
(45)前記高危険IPMNは、IPMN由来膵管腺癌腫を含む(36)に記載の方法。
(46)前記試料が、血液、血清または血漿であることを特徴とする、(36)に記載の方法。
(47)前記マーカーの発現水準測定が、該当蛋白質にそれぞれ特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、PNA(peptide nucleic acid)またはアプタマー(aptamer)を用いることを特徴とする(36)に記載の方法。
(48)前記マーカーの発現水準測定または比較が、
蛋白質チップ分析、免疫測定法、リガンドバインディングアッセイ、MALDI−TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)分析、SELDI−TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)分析、放射免疫測定、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、補体結合分析法、二次元電気泳動分析、液体クロマトグラフィー−質量分析(liquid chromatography−Mass Spectrometry、LC−MS)、LC−MS/MS(liquid chromatography−Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)、ウエスタンブロット法およびELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)からなる群より選択されるものを用いて行われることを特徴とする(36)に記載の方法。
(49)前記mRNA発現水準測定が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、競合的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ(RPA)、ノーザンブロッティングまたはDNAチップによって行われることを特徴とする(36)に記載の方法。
Claims (21)
- 3種以上の膵臓癌診断マーカーを含み、対象の試料での前記マーカー蛋白質またはこれを暗号化する遺伝子のmRNAの発現水準を測定する製剤を含む、膵臓癌診断用組成物であって、
前記試料が対象から分離された血液、血清または血漿であり、
前記3種以上の膵臓癌診断マーカーは、(c)TTR(Transthyretin、ATTR、Prealbumin、TBPA);C1R(Complement C1r subcomponent precursor)、CLU(Clusterin preproprotein)およびKLKB1(Plasma Kallikrein protein)からなる群より選択された一つ以上、(a)CA19−9(carbohydrate antigen 19−9)および(b)LRG1(Leucine−rich alpha−2−glycoprotein 1、LRG)を含む、
膵臓癌診断用組成物。 - 前記膵臓癌診断は、正常群と区別して膵臓癌を選別的に検出するか、多様な癌のうちの膵臓癌を選別的に検出するか、CA19−9の数値が37U/ml未満である膵臓癌を検出することである請求項1に記載の組成物。
- 前記膵臓癌は、膵管腺癌腫または高危険群膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm、IPMN)である請求項1に記載の組成物。
- 前記膵管腺癌腫は、1期または2期の膵管腺癌腫である請求項3に記載の組成物。
- 膵管腺癌腫は、IPMN由来したものではない請求項3に記載の組成物。
- 前記LRG1蛋白質はNCPI Accession No:NP_443204.1のアミノ酸配列を含み、前記TTR蛋白質はNCPI Accession No:NP_000362.1のアミノ酸配列を含み、前記C1R蛋白質はNCPI Accession No:NP_001724.3のアミノ酸配列を含み、前記CLU蛋白質はNCPI Accession No:NP_001822.3のアミノ酸配列を含み、前記KLKB1蛋白質はNCPI Accession No:NP_000883.2アミノ酸配列を含む請求項1に記載の組成物。
- 前記マーカー蛋白質の発現水準を測定する製剤が前記蛋白質に特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、PNA(peptide nucleic acid)またはアプタマー(aptamer)を含むことを特徴とする、請求項1に記載の膵臓癌診断用組成物。
- 前記マーカーmRNAの発現水準を測定する製剤が前記遺伝子に特異的に結合するプライマー、プローブまたはアンチセンスヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項1に記載の膵臓癌診断用組成物。
- 請求項1乃至8のうちのいずれか一項による組成物を含む、膵臓癌診断用キット。
- 前記キットがRT−PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)キット、DNAチップキット、ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)キット、蛋白質チップキット、ラピッド(rapid)キットまたはMRM(Multiple reaction monitoring)キットであることを特徴とする、請求項9に記載の膵臓癌診断用キット。
- 対象の試料での少なくとも3種以上の膵臓癌マーカー蛋白質の発現水準またはこれを暗号化する遺伝子のmRNA発現水準を測定する段階、および
前記対象の膵臓癌発病危険性を決定するために、前記測定された各マーカーの発現水準を、それぞれ正常対照群試料から得られたマーカーの発現水準と比較する段階を含み、
前記少なくとも3種以上の膵臓癌マーカーは、(c)TTR(Transthyretin、ATTR、Prealbumin、TBPA);C1R(Complement C1r subcomponent precursor)、CLU(Clusterin preproprotein)およびKLKB1(Plasma Kallikrein protein)からなる群より選択された一つ以上のマーカー、(a)CA19−9(carbohydrate antigen 19−9)および(b)LRG1(Leucine−rich alpha−2−glycoprotein 1、LRG)を含む膵臓癌診断用マーカーであり、
前記試料が対象から分離された血液、血清または血漿である、
膵臓癌の診断の情報を提供する方法。 - 前記比較する段階において、測定対象の試料での(a)CA19−9および(b)LRG1発現水準がそれぞれ正常対照群での発現水準より高く、測定対象の試料での(c)TTR、CLU、およびKLKB1発現水準が正常対照群での発現水準より低いか、測定対象の試料でのC1Rの発現水準が正常対照群での発現水準より高い場合、膵臓癌と決定するために、前記マーカーの発現水準を比較する、請求項11に記載の膵臓癌の診断の情報を提供する方法。
- 前記マーカーの発現水準測定が該当蛋白質にそれぞれ特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、PNA(peptide nucleic acid)またはアプタマー(aptamer)を用いることである、請求項11に記載の膵臓癌の診断の情報を提供する方法。
- 前記マーカーの発現水準測定または比較が、蛋白質チップ分析、免疫測定法、リガンドバインディングアッセイ、MALDI−TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)分析、SELDI−TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)分析、放射免疫測定、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、補体結合分析法、二次元電気泳動分析、液体クロマトグラフィー−質量分析(liquid chromatography−Mass Spectrometry、LC−MS)、LC−MS/MS(liquid chromatography−Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)、ウエスタンブロット法およびELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)からなる群より選択されるものを用いて行われる、請求項11に記載の膵臓癌の診断の情報を提供する方法。
- 前記mRNA発現水準測定が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、競合的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ(RPA)、ノーザンブロッティングまたはDNAチップによって行われる、請求項11に記載の膵臓癌の診断の情報を提供する方法。
- 前記対象は膵管腺癌腫(PDAC)可能性を有する対象である請求項11に記載の方法。
- 前記膵管腺癌腫は、IPMN由来の膵管腺癌腫である請求項17に記載の方法。
- 前記膵臓癌診断は、正常群および癌以外の膵臓関連疾患と区別して膵臓癌を選別的に検出するか、多様な癌のうちの膵臓癌を選別的に検出するか、CA19−9の数値が37U/ml未満である膵臓癌を検出することである請求項11に記載の方法。
- 前記膵臓癌診断は、膵臓炎および胆嚢炎からなる群れより選択された1種以上の膵臓関連疾患から膵臓癌を選別的に検出することである請求項19に記載の方法。
- 前記膵臓癌は、膵管腺癌腫または高危険群膵管内乳頭粘液性腫瘍(Intraductal papillary mucinous neoplasm、IPMN)である請求項11に記載の方法。
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