KR20080092490A - 대장암 진단용 단백질 마커 켈그라눌린 ａ와 켈그라눌린 ｂ및 이들 각각에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장암을 진단할 수 있는 단백질 마커 켈그라눌린(calgranulin) A와 켈그라눌린 B, 및 이들 각각에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트에 관한 것으로, 구체적으로 정상인에 비하여 대장암 환자의 혈장 내에서 그 양이 특이적으로 증가하여 대장암을 진단할 수 있는 단백질 마커로 선별된 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B, 이들 각각을 선택적으로 인식하는 항체를 단독으로 또는 함께 포함하는 대장암 진단키트, 및 항원-항체 결합반응을 이용하여 혈장 내에서 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 대장암 진단용 마커 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트는 진단의 민감도 및 정확도가 높을 뿐만 아니라 환자의 혈장을 이용하여 매우 간편하게 대장암을 진단할 수 있어 대장암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.　

대장암, 진단용 마커, 켈그라눌린 A, 켈그라눌린 B

Description

대장암 진단용 단백질 마커 켈그라눌린 Ａ와 켈그라눌린 Ｂ 및 이들 각각에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트{PROTEIN MARKERS CALGRANULIN A AND GALGRANULIN B FOR COLON CANCER DIAGNOSIS AND DIAGNOSIS KIT FOR COLON CANCER USING ANTIBODIES AGAINST THE SAME}

도　1은 대장암 환자군으로부터 적출한 암조직과 그 주위의 정상조직을 각각 형광으로 표지한 후 이차원 전기영동으로 비교 분석하여 대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가한 두 개의 스팟을 도식화한 결과이고,

도　2는 상기 도 1에서 대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가한 두 개의 스팟 중에서 하나를 트립신으로 처리하여 얻은 다양한 트립틱 펩티드들 중에서 서열번호: 4의 펩티드를 탠덤질량분석기(tandem mass spectrometry)로 분석하여 얻은 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고,

도 3은 상기 도 1의 대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가한 두 개의 스팟 중에서 나머지 하나를 트립신으로 처리하여 얻은 다양한 트립틱 펩티드들 중에서 서열번호: 8의 펩티드를 탠덤질량분석기로 분석하여 얻은 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고,

도 4는 대장암 환자군으로부터 적출한 암조직과 그 주위의 정상조직을 대상으로 정량적 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR; reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하여 mRNA 발현 수준을 비교, 분석한 결과이고,

도 5는 대장암 환자군으로부터 적출한 암조직과 그 주위의 정상조직을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분석한 후 항-켈그라눌린 A 항체 및 항-켈그라눌린 B 항체로 각각 면역블럿팅을 수행한 결과이고,

도 6은 비환자 대조군의 혈장과 대장암 환자군의 혈장을 각각 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분석한 후 항-켈그라눌린 A 항체와 항-켈그라눌린 B 항체로 각각 면역블럿팅을 수행한 결과와 각각의 항원 농도를 그래프로 나타낸 것이고,

도 7은 상기 도 6의 면역블럿팅에 의해 측정된 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 항원 농도의 평균을 통계적으로 처리하여 나타낸 것이고,

도 8은 상기 도 6에서 얻은 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 항원 농도를 수용자-조작 특성(ROC: receiver operating characteristic) 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 혈액에서 대장암 발병유무를 선택적으로 진단할 수 있는 단백질 마커 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B, 및 이들을 각각 특이적으로 인식하는 항체를 단독으로 또는 함께 포함하는 대장암 진단키트에 관한 것이다.

대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 대장암의 발생률은 1995년 이후 2002년까지 420% 증가하여 암 중 발생률 1위를 나타내고 있다(2003 건강보험통계연보, 국민건강보험공단 발간).

대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관 및 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생비는 결장암은 여자, 직장암은 남자에서 다소 높게 나타난다.

대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행된다. 수술적 요법, 항암화학요법 및 방사선요법 등의 진보에도 불구하고 특정한 증상이 없이 진행되는 대장암의 특성으로 인해 다른 장기로 전이된 후 진단되어 수술시점을 놓친 경우에는 사망률이 높은 것으로 알려져 있다. 5년 평균생존율은 1기의 경우 90% 이상, 2기의 경우 70% 이상, 3기의 경우 50% 이상이고 4기의 경우에는 5% 이하로 나타나지만(2004 암정보, 국립암센터 발간), 대장암을 조기에 발견하고 치료할수록 생존율이 현저히 증가하는 것을 알 수 있다. 따라서, 대장암의 조기 진단 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

대장암의 진단은 대장과 관련된 증세를 보이는 환자에게 직장 수지검사(rectal digital examination), 분변 잠혈검사(fecal occult blood test) 및 대 장조영술에 의해 수행되고 있으며, 필요에 따라 결장경검사를 통한 조직검사가 행해진다. 현재 이용가능한 가장 조기의 검출방법은 분변혈에 대한 시험 또는 내시경 과정을 수반한다. 그러나, 분변혈이 검출되기 전까지 전형적으로는 상당한 종양 크기가 존재해야만 한다. 잠혈 기준(guaiac-based)의 분변 검사의 감수성은 26%로 이는 악성 병변이 있는 74%의 환자가 검출되지 않은 채로 있게 됨을 의미한다(Ahlquist et al., Gastroenterol . Clin . North Am. 26: 41-55, 1997). 전암성 및 암성 병변의 시각화는 조기 검출에 대한 최선의 접근법이지만, 결장내시경은 상당한 비용 뿐만 아니라 환자에게 고통과 위험을 초래할 수 있다는 문제점이 있다(Silvis et al., JAMA 235: 928-930, 1976; Geenen et al., Am. J. Dig . Dis. 20: 231-235, 1975; Anderson et al., J. Natl . Cancer Institute 94: 1126-1133, 2002).

상기와 같은 종래의 방법들은 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라, 대장암이 발병하기 이전의 환자들에 대한 조기 진단이 불가능하며, 피검체들에게 불편을 주는 문제점이 있다. 이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 환자의 혈장에서 종양 표지자(marker)의 농도를 측정하여 대장암을 진단하려는 시도가 있었다(Clinton et al., Biomed . Sci . Instrum. 39: 408-414, 2003; Rui et al., Proteomics 3: 433-439, 2003; Soletormos et al., Dan . Med . Bull. 48: 229-255, 2001).

현재, 태아성암항원(CEA), 종양-연관 당단백질을 근거로 한 진단적 혈장 시험만이 대장암 분야에서의 진단 보조에 이용가능하다. CEA는 대장암, 위암, 췌장 암 및 대다수의 유방 암종, 폐 암종 및 두경부 암종을 가진 환자로부터 수득된 조직의 95%에서 증가한다(Goldenberg et al., J. Natl . Cancer Inst .(Bethesda) 57: 11-22, 1976). 상승된 CEA 수준은 또한 비-악성 질환을 가진 환자에서도 보고되었으며, 대장암이 있는 대다수 환자가 혈청에서, 특히 질환의 조기 단계 동안에는 정상적인 CEA 수준을 나타내었다(Carriquiry et al., Dis . Colon Rectum 42: 921-929, 1999; Herrera et al., Ann . Surg. 183: 5-9, 1976; Wanebo et al., N. Engl . J. Med. 299: 48-451, 1978). 검출 재발에서의 혈청 또는 혈장으로부터 측정된 CEA의 이용은 보고상 논란의 여지가 있으며, 아직 널리 적용되지 못하고 있다(Martell et al., Int . J. Biol . Markers 13: 145-149, 1998; Moertel et al., JAMA 270: 943-947, 1993).

한편, S100 칼슘결합 단백질계(S100 calcium binding protein family)는 23개의 서로 다른 구성원들로 이루어져 있는데, 이들은 서로 높은 상동성(homology), 낮은 분자량 및 2개의 칼슘결합 EF-핸드(hand)를 가지며 조직에 따른 특이적 발현 양상을 나타낸다(Donato et al., Microsc . Res . Tech. 60: 540-541, 2003; Heizmann et al., Front . Biosci. 7: 1356-1368, 2002; Marenholz et al., Biochem . Biophys . Res . Commun. 322: 1111-1122, 2004). 이들은 상피 질병(epidermal disease)의 발병에 많은 영향을 미치며, 치료 과정이나 염증유발 질병과 같은 세포의 스트레스 상황에서 그 발현이 크게 증가한다(Eckert et al., J. Invest . Dermatol. 123: 23-33, 2004; Thorey et al., J. Biol . Chem. 276: 35818-35825, 2001).

최근 연구에서는 S100 단백질의 발현 변화와 이들의 기능이 암 발생에서 중요한 역할을 할 것이라 예상되고 있고, 폐, 유방, 식도, 대장, 간과 같은 상피조직암에서 S100 유전자가 밀집되어 있는 염색체 1q21 영역에서 유전자 재배열이 발견되었다(Koon et al., Neoplasia 6: 143-149, 2004; Sy et al., Mod . Pathol. 18: 686~692, 2005; Moinzadeh et al., Brit . J. Cancer 92: 935~941, 2005; Knosel et al., Virchows . Arch. 440: 187~194, 2002; Petersen et al., Brit . J. Cancer 82: 65~73, 2000; Sy et al., Eur . J. Cancer 40: 1082~1094, 2004; Goeze et al., J. Pathol. 196: 8~16, 2002; Jee et al., Anal . Cell . Pathol. 25: 89~93, 2003; Hayashi et al., Oncol . Rep. 14: 1429~1435, 2005).

또한, S100 칼슘 결합 단백질계에서 켈그라눌린 A(S100A8)와 켈그라눌린 B(S100A9)의 유전자 발현은 동일한 패턴을 보이는데, 대장암, 폐암, 소화기암, 대장암, 췌장암, 전립선암에서는 이들의 유전자 발현양이 크게 증가하는 반면, 식도암에서는 그 발현양이 감소하였다(El-Rifai et al., Cancer Res. 62: 6823~6826, 2002; Seth et al., Anticancer Res. 23: 2043~2051, 2003; Arai et al., Oncol . Rep. 8: 591~596, 2001; Luo et al., Oncogene 23: 1291~1299, 2004; Stulik et al., Electrophoresis 20: 1047~1054, 1999; Shen et al., Cancer Res. 64: 9018~9026, 2004; Cross et al., Histopathology 46: 256~269, 2005; Carlsson et al., Int . J. Oncol. 27: 1473~1481, 2005; Hermani et al., Clin . Cancer Res. 11: 5146~5152, 2005). 하지만, 조직 내에서 이들 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B의 단백질 발현양에 대한 연구는 미비하며, 특히 암과 관련하여 혈액에서의 변화 연구는 아직까지 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구를 계속하던 중, 대장암 환자로부터 얻어진 생물학적 검체 시료 내에서 특이하게 변화하는 단백질을 발굴하고 이를 대장암의 조기 진단에 이용하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B 단백질이 비환자 대조군에 비하여 대장암 환자의 혈장에서 특이적으로 그 양이 증가하여 존재한다는 사실을 발견하고, 이의 항체를 이용한 면역화학적 방법으로 대장암을 간편하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 혈장 내 존재하는 켈그라눌린 A나 켈그라눌린 B를 이용하여 간편하게 대장암을 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 켈그라눌린 A와 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 켈그라눌린 B의 대장암 진단용 단백질 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B 단백질 마커를 각각 선택적으로 인식하는 항체를 단독으로 또는 함께 포함하는 대장암 진단키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 검체에서 항원-항체 결합반응을 통해 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B 단백질 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 본 발명은 대장암 진단을 위한 단백질 마커로서 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 켈그라눌린 A와 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 켈그라눌린 B 단백질 마커를 제공한다.

본 발명은 대장암 특이적인 양적 변화를 나타내는 표지 단백질을 선발하기 위하여, 대장암 환자를 수술한 후 적출한 암조직과 동일한 수술 부위에서 암세포가 없는 정상조직의 단백질체를 DIGE(Difference In Gel Electrophoresis) 이차원 전기영동(Two-dimensional electrophoresis)을 이용하여 비교, 분석하였다(Alfonso et al., Proteomics 5: 2602-2611, 2005; Friedman et al., Proteomics 4: 793-811, 2004; Katayama et al., Surg . Today 36: 1085-1093, 2006; Tan et al., J. Proteome Res. 5: 1098-1106, 2006). DIGE는 기존의 이차원 전기영동의 단점을 보완한 새로운 프로테오믹스 기법으로, 서로 다른 형광 색호 라벨을 각각의 시료에 표지한 후 표지된 시료를 서로 혼합하여 동일한 IEF(isoelectricfocusing)와 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동법으로 등전점과 질량에 따라 분리한다. 이는 하나의 겔에서 두 종류 시료의 동시분석을 가능하게 함으로써 기존의 이차원 전기영동의 단점으로 지목되었던 겔간의 편차와 통계적 처리의 어려움을 보완한 것이다. 분리된 단백질은 컴퓨터 프로그램으로 비교, 분석하고 정상조직과 비교하여 특이적으로 변화가 있는 단백질 스팟을 선별한다. 선별된 단백질을 동정하기 위하여 이를 트립신으로 처리하여 다수의 펩티드 절편으로 분리한 다음, 각 절편과 그 절편으로부터 유래한 딸이온의 질량을 탠덤질량분석기로 측정하고 컴퓨터 분석 프로그램을 사 용하여 데이터베이스를 검색한다. 그 결과, 대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가한 것으로 검출된 서열번호: 1 내지 6의 아미노산 서열을 갖는 트립틱 펩티드들은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖고 등전점이 6.7, 분자량이 11 kDa인 켈그라눌린 A인 것으로 동정되고, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 트립틱 펩티드는 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖고 등전점이 5.3, 분자량이 13 kDa인 켈그라눌린 B인 것으로 동정된다(도 1 내지 3 참조).

대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가하는 것으로 확인된 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 mRNA 및 단백질 발현수준을 역전사-중합효소 연쇄반응과 면역블롯팅을 수행하여 조직 내에서 검사한다. 그 결과, 대장암 조직에서 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 mRNA 발현이 유의성 있게 증가할 뿐만 아니라, 이들 각각을 선택적으로 인식하는 항체를 이용하여 측정한 단백질의 농도 역시 대장암 조직에서 특이적으로 증가함을 확인한다(도 4 및 5 참조).

상기와 같이 대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가하는 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B가 혈액을 대상으로 하는 분석에도 유용하게 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 면역블롯팅을 이용하여 혈장 내 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 농도를 검출한다.

먼저, 대장암 환자의 혈장과 비환자의 혈장을 각각 따로 모아 대장암 환자군과 비환자 대조군 혈장 시료를 준비한다. 사람의 혈장에는 소수의 단백질이 혈장 내 단백질 농도의 대부분을 차지하기 때문에, 소량의 대다수 단백질을 동정하기 위해서는 먼저 상대적으로 양이 많은 단백질을 제거해야 한다(Anderson NL. et al., Mol . Cell . Proteomics, 1: 845-867, 2002; Somiari RI. et al., J. Chromatogr . B Analyt . Technol . Biomed . Life Sci ., 815: 215-225, 2005). 준비된 대장암 환자군과 비환자 대조군의 혈장 시료로부터 상대적으로 양이 많은 단백질, 예컨대 알부민, 면역글로불린 A, 면역글로불린 G, 헵토글로빈(heptoglobin), 트랜스페린(trasnferrin), 트립신 저해제(trypsin inhibitor) 등을 제거하기 위해 다중 친화 컬럼(multiple affinity column)을 이용하여 액체 크로마토그래피를 수행한다. 상기 컬럼에 결합하지 않은 단백질 구획을 자외선 흡광도 280 ㎚로 추적하여 모으고 컬럼에 결합한 단백질들을 제거한다. 이와 같이 상대적으로 양이 많은 6종의 단백질들이 대부분 제거된 혈장 단백질 구획을 모아 농축한 후 SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행한다. 분리된 혈장 단백질을 PVDF 막으로 전이시키고 이를 각각 항-켈그라눌린 A 항체 또는 항-켈그라눌린 B 항체와 반응시킨 후 일차항체의 종(species)에 따른 이차 항체 면역글로불린 G와 결합하는 같은 종의 IgG-HRP와 반응시킨다. 그 뒤, 상기 PVDF 막을 발색기질과 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B 항원의 농도를 측정한다.

그 결과, 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B 단백질은 대장암 조직에서와 동일한 발현 양상을 나타내는데, 비환자 대조군의 혈장에 비하여 대장암 환자의 혈장에서 켈그라눌린 A는 2.5배 증가하고, 켈그라눌린 B는 3.3배로 현저히 증가한다(도 6 및 7 참조). 또한, 이러한 결과는 민감성과 정확성을 갖춘 ROC 그래프에서도 확인된다(도 8 참조). 상기 결과들로부터 혈장 내에 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B를 선택적으로 인식하는 항체를 사용하여 각 항원의 농도를 측정하고 이를 비환자 대조 군과 비교하여 상대적으로 증가한 값을 나타내는 피시험자를 대장암 환자로 진단할 수 있음을 확인한다.

켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B가 세포 내에서 암의 진행과 관련하여 발현양의 변화가 보고되고, 중요한 역할을 하는 것이 밝혀진 것과는 대조적으로 혈액 내에서 이들의 역할은 아직까지 전무한 실정으로, 이들을 대장암의 진단 마커로 이용하는 것은 본 발명이 최초이다. 또한, 상기 단백질은 혈장에서 검출이 가능하기 때문에 생검(biopsy)을 통해서만 진단이 가능하던 기존의 단백질과는 달리 환자에게 불편을 초래하지 않으면서 간편한 방법으로 대장암을 진단하는데 활용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 피검자의 혈장 시료를 채취하고, 피검자의 혈장 시료에 함유된 상기 대장암 진단 마커인 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B를 선택적으로 인식하는 항체를 단독으로 또는 함께 이용하여 검출함으로써 대장암의 발병 여부를 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B를 선택적으로 인식하는 항체를 이용한 대장암의 발병 확인방법은 환자의 혈장을 이용하는 새로운 면역학적 진단도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 생검을 이용하지 않고 혈장을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 대장암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 대장암 진단 마커인 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B에 선택적으로 결합하는 항체를 단독으로 또는 함께 포함하는 대장암 진단키트를 제공한다.

켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B 마커 단백질에 선택적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해서는 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B의 입수가 선행되어야 하며, 이는 서열번호: 7의 켈그라눌린 A와 서열번호: 9의 켈그라눌린 B 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전자 재조합을 이용하여 미생물에서 생산할 수 있고, 또는 혈장으로부터 직접 분리하여 준비할 수도 있다.

본 발명의 목적상, 상기 항체는 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B의 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함할 수 있으나, 항원과 보다 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체가 바람직하다.

다클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원(antigen)으로 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B 마커 단백질 또는 그의 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 이러한 외부 숙주로는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 예로 들 수 있으며, 면역원은 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 근육내, 복강내 또는 피하주사 등의 방법으로 투여되어 외부 숙주를 면역화시킨다. 면역화된 외부 숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제하여 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B에 특이적인 다클론 항체를 제조할 수 있다.

단클론 항체는 당업자에 알려진 융합(fusion)에 의한 불멸화된 세포주 생성방법(Koeher and Milstein, Nature 256: 495, 1975)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법을 간략히 설명하면, 먼저 순수한 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B 마커 단 백질 또는 그의 단편으로 마우스를 면역화시키거나, 이의 펩티드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨다. 면역화된 마우스로부터 분리한 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마 세포를 생성한다. 이어, 효소면역분석법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)으로 하이브리도마 세포의 단클론 항체의 생성 여부를 조사하여 양성 클론을 선발하고 이를 배양한 후 항체를 분리, 정제하거나 마우스의 복강에 주입한 후 복수를 채취하여 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B 각각에 특이적인 단클론 항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B 단백질의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 대장암 진단키트에는 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B를 각각 선택적으로 인식하는 항체뿐만 아니라 당분야에서 면역학적 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대장암 진단키트는 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B 단백질에 특이적인 항체; 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체(conjugate); 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용 액; 세척액; 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 대장암 진단키트는 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 대장암 진단키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 대장암을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 검체 및 대조군을 표면에 코팅시킨 96-웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 재조합 단클론 항체 단백질과 반응하는 효소면역분석법을 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.

항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 나이트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

이차항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.

발색을 유도하기 위한 발색기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 이차항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산용액(H₂SO₄)이 바람직하게 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 검체에서 대장암 진단용 마커 단백질인 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B를 항원-항체 결합반응을 이용하여 검출하는 방법을 제공한다.

상기 검출방법은 혈장 내 단백질을 고정화시키거나 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리시킨 후 PVDF 막으로 전이시키고 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B를 각각 선택적으로 인식하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 결합반응을 통해 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B 단백질의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다. 상기 항원-항체 결합반응으로는 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA), 샌드위치 측정, 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등을 예로 들 수 있다. 검체로서는 혈청 또는 혈장을 사용할 수 있고, 혈장이 더 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 검출방법은,

1) 검체 및 대조군의 단백질을 고정체에 코팅시키는 단계;

2) 상기 고정체에 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B에 특이적인 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계;

3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합반응물을 이차항체 접합체(conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

4) 검체와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 검출방법을 구체적으로 설명하면, 먼저 검체로부터 혈장단백질을 분자량에 따라 분리한다. 켈그라눌린 A 및 켈그라눌린 B는 분자량이 대략 10 kDa 내외 이므로 15% 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하고, 이로부터 분리된 단백질들을 PVDF 막과 같은 고정체로 전이시켜 고정한다. 이어, 고정된 단백질 항원에 켈그라눌린 A에 특이적인 항체나 켈그라눌린 B에 특이적인 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행한다. 검체에 켈그라눌린 A나 켈그라눌린 B 단백질이 존재한다면, 상기 단백질이 고정된 막에 항체가 가해졌을 때 항원-항체 결합반 응이 일어나게 된다. 켈그라눌린 A와 이에 대한 항체, 그리고 켈그라눌린 B와 이에 대한 항체의 결합 정도를 측정하기 위해서, 각 항체에 친화성을 갖는 이차항체와 결합시키는 단계를 수행하는데, 이차항체에 접합된 HRP(horseradish peroxidase)가 기질인 ECL(enhanced chemiluminescence)과 반응하여 발색반응을 일으키는지의 여부와 그 정도를 대조군과 비교함으로써 검체 시료내 대장암 진단 마커인 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B 단백질의 존재 여부를 검출하게 된다.

한편, 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B에 특이적인 항체를 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 검체 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하면, 한 번의 분석으로 대량의 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 대장암 특이적 진단 마커로서 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 동정

본 발명자들은 대장암 특이적인 양적 변화를 나타내는 표지 단백질을 선발하기 위하여, 6명의 대장암 환자를 수술한 후 적출한 암조직과 동일한 수술 부위에서 암세포가 없는 정상조직의 단백질체를 DIGE 이차원 전기영동법으로 분리하였다. 분리된 단백질은 디사이더(Decyder) 컴퓨터 프로그램으로 비교, 분석하고 정상조직 에 비하여 암조직에서 특이적으로 변화가 있는 단백질 스팟을 선별하였다(도 1). 선별된 단백질을 동정하기 위해 이를 트립신(10 ng/㎕)으로 37℃에서 12시간 동안 처리하여 다수의 펩티드 절편으로 분리한 다음, 각 절편과 그 절편으로부터 유래한 딸이온의 질량을 탠덤질량분석기로 측정하고, 컴퓨터 분석 프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 서열번호: 1 내지 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 6개의 트립틱 펩티드들(tryptic peptides)은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖고 등전점이 6.7, 분자량이 11 kDa인 켈그라눌린 A 단백질로 동정되었다. 또한, 상기 과정에서 서열번호: 8로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 트립틱 펩티드는 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖고 등전점이 5.3, 분자량이 13 kDa인 켈그라눌린 B 단백질인 것으로 확인되었다.

도 2 및 3은 상기 과정에서 각각 트립신에 의해 절단된 펩티드들 중의 하나인 서열번호: 4의 트립틱 펩티드와 서열번호: 8의 트립틱 펩티드에 대한 탠덤질량분석 스펙트럼 결과를 나타낸 것으로, 이로부터 질량분석기에 의해 동정된 스팟에 해당하는 단백질이 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B임을 확인할 수 있다.

실시예 2: 역전사 -중합효소 연쇄반응( RT - PCR )과 면역블롯팅을 이용한 조직 내 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 검출

대장암 특이적으로 양적 변화를 나타내는 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 mRNA 및 단백질 발현수준을 역전사-중합효소 연쇄반응과 면역블롯팅을 수행하여 조직 내에서 검사하였다. 역전사-중합효소 연쇄반응은 11명의 대장암 환자로부터 적 출한 암조직과 그 주위의 정상조직에서 mRNA를 추출한 후 그 양을 측정하였다.

간략히 설명하면, 먼저 1 ㎍의 총 RNA를 무작위 헥사머(random hexamer, Invitrogen사) 및 M-MLV 역전사효소(reverse transcriptase, Invitrogen사)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 cDNA를 합성한 후, 최종 합성된 cDNA 용액의 부피를 50 ㎕가 되도록 맞추었다. 2 ㎕의 cDNA 용액을 주형으로 하여 총 20 ㎕가 되도록 1.5 mM MgCl₂, 각 20 μM의 켈그라눌린 A에 대한 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 10 및 11) 또는 켈그라눌린 B에 대한 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 12 및 13), 10 mM dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP, 1× PCR 완충용액, 및 1U 중합효소(AmpliTaq Gold with GeneAmp polymerase, Applied Biosystems사)를 첨가하여 PCR 반응을 실시하였다. 이때, 각각의 PCR 반응용액에 RNA의 양질에 대한 내부 대조군으로서 2 내지 10 μM의 β-액틴(actin)에 대한 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 14 및 15)를 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 10분간 예비변성 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초의 반응을 25회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 30초 증폭하였다. 반응이 종결된 후, PCR 산물을 에티듐 브로마이드(etidium bromide)가 첨가된 1.5 내지 2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 정량한 후 β-액틴의 PCR 산물의 양과 비교하여 유전자의 발현 정도를 평가하였다.

켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B에 대한 면역블롯팅은 실시예 1의 DIGE 이차 전기영동법에 사용된 6개 시료를 대상으로 수행하였다. 15% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동을 수행하여 검체에 들어 있는 단백질을 분자량에 따라 분리하였다. 분리된 단백질을 50 mM 트리스(Tris-HCl), 130 mM 글리신(glycine), 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올(methanol)이 포함된 용액 내에서 PVDF 막으로 전이시키고 전이된 막을 5% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline Tween 20)에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기와 같은 과정으로 PVDF 막을 두 장 준비한 후, 각각의 PVDF 막에 켈그라눌린 A에 대한 항체(1:20, Acris사)와 켈그라눌린 B에 대한 항체(1:400, SANTA CRUZ사)를 따로 따로 4℃에서 12시간 동안 반응시키고 TBST로 3회 세척한 후 켈그라눌린 A는 마우스 면역글로불린과 결합하는 마우스 IgG-HRP(1:4000, GE Healthcare사)와 켈그라눌린 B는 고트 면역글로불린과 결합하는 고트 IgG-HRP(1:4000, SANTA CRUZ사)로 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, 상기 PVDF 막을 ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience사)과 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하였다.

도 4는 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 mRNA 발현량이 대장암 조직에서 특이적으로 증가하는 양상을 보여주는 RT-PCR 결과이고, 도 5는 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B를 선택적으로 인식하는 항체를 이용한 면역블롯팅 분석에서 각 단백질의 농도가 대장암 특이적으로 증가함을 보여주는 것이다.

실시예 3: 면역블롯팅을 이용한 혈장 내 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B의 검출

대장암 환자군 10명 및 비환자 대조군 12명으로부터 각각 혈장을 30 ㎕씩 취하고 혈장 단백질의 대부분을 차지하는 6종의 단백질인 알부민, 면역글로불린 A, 면역글로불린 G, 트랜스페린, 트립신 저해제 및 헵토글리빈을 제거하기 위해서 MARS(multiple affinity removal system, Agilent사) 컬럼을 장착한 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 컬럼에 결합하지 않는 단백질 구획을 자외선 흡광도 280 ㎚로 추적하여 모으고 컬럼에 결합한 단백질들을 제거하였다. 이와 같이 6종의 단백질이 대부분 제거된 구획을 모아 3 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질들만을 농축하여 대장암 환자군 및 비환자 대조군의 혈장 단백질 시료를 준비하였다. 이와 같이 준비된 혈장 단백질 시료 각 5 ㎍과 1% SDS가 포함된 완충용액을 혼합한 후 15% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 분리된 혈장 단백질을 50 mM 트리스(Tris-HCl), 130 mM 글리신(glycine), 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올(methanol)이 포함된 용액 내에서 PVDF 막으로 전이시키고 전이된 막을 5% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline Tween 20)에서 1시간 동안 반응시켰다.

이렇게 PVDF 막을 두 장 준비한 후, 각각의 PVDF 막에 켈그라눌린 A에 대한 항체(1:20, Acris사)와 켈그라눌린 B에 대한 항체(1:400, SANTA CRUZ사)를 따로 따로 4℃에서 12시간 동안 반응시키고 TBST로 3회 세척한 후 켈그라눌린 A는 마우스 면역글로불린과 결합하는 마우스 IgG-HRP(1:4000, GE Healthcare사)와 켈그라눌린 B는 고트 면역글로불린과 결합하는 고트 IgG-HRP(1:4000, SANTA CRUZ사)로 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, 상기 PVDF 막을 ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience사)과 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하였다.

도 6은 상기와 같이 비환자 대조군의 혈장과 대장암 환자군의 혈장을 전기영 동으로 분석한 후 항-켈그라눌린 A 및 항-켈그라눌린 B 항체로 각각 면역블럿팅을 수행한 결과와 각각의 항원 농도를 그래프로 나타낸 것이다. 면역블럿팅을 수행한 두 겔간의 편차를 줄이고자, 비환자 대조군 10명의 혈장을 동일 농도씩 혼합한 대조군혼합물과 대장암 환자군 10명의 혈장을 동일 농도씩 혼합한 대장암혼합물을 첨가하여 면역블럿팅 결과의 신뢰도를 높였다. 도 7은 상기 도 6의 면역블럿팅에 의해 측정된 항원 농도의 평균을 통계처리 하여 나타낸 것이고, 도 8은 상기 도 6에서 측정된 항원의 농도를 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 나타낸 것이다. ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전 범위에 걸친 판정 역치를 연속적으로 변화시켜 수득되는 모든 감수성/특이성 쌍의 그래프로 주로 시험의 정확도를 나타낸다(Zweig et al., Clin . Chem. 39: 561-577, 1993). ROC 그래프에서 켈그라눌린 A의 AUC(area under the curve)는 0.836으로, 켈그라눌린 B의 AUC는 0.784로, 상기 분석이 민감성과 정확성을 갖추고 있음을 알 수 있다. 상기 결과로부터 혈장 내에 켈그라눌린 A와 켈그라눌린 B를 선택적으로 인식하는 항체를 사용하여 각 항원의 농도를 측정하고 이를 비환자 대조군과 비교함으로써 상대적으로 증가한 켈그라눌린 A 또는 켈그라눌린 B 단백질의 농도를 나타내는 피시험자를 대장암 환자로 진단할 수 있음을 확인하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 대장암 진단용 마커 단백질 및 이의 항체를 이용한 대장암 진단키트는 비교적 채취가 용이한 혈장을 검체로 하기 때문 에 생검을 대상으로 하는 기존의 대장암 진단방법과는 달리 환자에게 부담을 주지않고 매우 간편하게 대장암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 대장암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> PROTEIN MARKERS CALGRANULIN A AND GALGRANULIN B FOR COLON CANCER DIAGNOSIS AND DIAGNOSIS KIT FOR COLON CANCER USING ANTIBODIES AGAINST THE SAME <130> KC071049 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 1 Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 2 Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 3 Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 4 Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr His Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 5 Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 6 Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys 1 5 <210> 7 <211> 93 <212> PRT <213> human calgranulin A <400> 7 Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu Asn Ser Ile Ile Asp Val Tyr 1 5 10 15 His Lys Tyr Ser Leu Ile Lys Gly Asn Phe His Ala Val Tyr Arg Asp 20 25 30 Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Thr Glu Cys Pro Gln Tyr Ile Arg Lys 35 40 45 Lys Gly Ala Asp Val Trp Phe Lys Glu Leu Asp Ile Asn Thr Asp Gly 50 55 60 Ala Val Asn Phe Gln Glu Phe Leu Ile Leu Val Ile Lys Met Gly Val 65 70 75 80 Ala Ala His Lys Lys Ser His Glu Glu Ser His Lys Glu 85 90 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 8 Asn Ile Glu Thr Ile Ile Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human calgranulin B <400> 9 Met Thr Cys Lys Met Ser Gln Leu Glu Arg Asn Ile Glu Thr Ile Ile 1 5 10 15 Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys Leu Gly His Pro Asp Thr Leu 20 25 30 Asn Gln Gly Glu Phe Lys Glu Leu Val Arg Lys Asp Leu Gln Asn Phe 35 40 45 Leu Lys Lys Glu Asn Lys Asn Glu Lys Val Ile Glu His Ile Met Glu 50 55 60 Asp Leu Asp Thr Asn Ala Asp Lys Gln Leu Ser Phe Glu Glu Phe Ile 65 70 75 80 Met Leu Met Ala Arg Leu Thr Trp Ala Ser His Glu Lys Met His Glu 85 90 95 Gly Asp Glu Gly Pro Gly His His His Lys Pro Gly Leu Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Pro <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for calgranulin A <400> 10 agacctggtg gggcaagt 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for calgranulin A <400> 11 acgcccatct ttatcaccag 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for calgranulin B <400> 12 ctcggctttg ggacagagt 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for calgranulin B <400> 13 gtcaccctcg tgcatcttct 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for beta-actin <400> 14 acagagtact tgcgctcagg ag 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-actin <400> 15 tgtatgcctc tggtcgtacc ac 22

Claims (12)

1. 대장암 진단용 단백질 마커인 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 켈그라눌린 A 및 서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 켈그라눌린 B에 각각 특이적인 항체를 단독으로 또는 함께 포함하는 대장암 진단키트.
2. 제1항에 있어서,

   상기 항체가 다클론 항체 또는 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 대장암 진단키트.
3. 제2항에 있어서,

   기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체; 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암 진단키트.
4. 제3항에 있어서,

   이차항체 접합체의 표지체가 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
5. 제3항에 있어서,

   발색기질이 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
6. 검체로부터 항원-항체 결합반응을 이용하여 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B 단백질 마커를 검출하는 방법.
7. 제6항에 있어서,

   1) 검체 및 대조군의 단백질을 고정체에 코팅시키는 단계;

   2) 상기 고정체에 켈그라눌린 A 및/또는 켈그라눌린 B에 특이적인 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계;

   3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합반응물을 이차항체 접합체(conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

   4) 검체와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서,

   단계 1)의 검체가 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항에 있어서,

   단계 1)의 고정체가 나이트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글래스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제9항에 있어서,

    단계 2)의 상기 항원-항체 결합반응이 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제7항에 있어서,

    단계 3)의 이차항체 접합체의 표지체가 HRP, 염기성 탈인산화효소, 콜로이드 골드, 형광물질 및 색소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제7항에 있어서,

    단계 3)의 발색기질이 TMB, ABTS 및 OPD로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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