KR20180117918A

KR20180117918A - Mfap5 측정 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 대장암 진단 방법

Info

Publication number: KR20180117918A
Application number: KR1020170051074A
Authority: KR
Inventors: 이철주; 김미정; 염정훈; 주신영; 안희성; 양은경; 이지은; 한기철; 민병소; 한대훈
Original assignee: 한국과학기술연구원; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-20
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2018-10-30

Abstract

본 발명은 대장암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 대장암 진단 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 대장암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 대장암 진단 방법에 따르면, 대장암을 간편하게 진단할 수 있고, 대장암을 높은 정확도 및 특이도로 조기 진단하는데 이용할 수 있다.

Description

MFAP5 측정 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 대장암 진단 방법{Composition or kit comprising MFAP5 measuring agent for diagnosis of colorectal cancer and method for diagnosing colorectal cancer the same}

대장암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 대장암 진단 방법에 관한 것이다.

대장암은 우리나라를 포함한 전 세계적으로 매우 흔하게 발생하는 암이다. 우리 나라에서는 남녀 모두에서 4번째로 흔하게 발생하는 암으로, 암에 의한 사망률도 4번째로 인구 십만 명당 약 7명이 대장암으로 사망하고 있다. 최근 10년 사이 사망률은 약 80% 정도 증가하는 추세에 있다.

대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높지만 최근 결장암의 빈도가 증가하고 있다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 2014년 우리나라에서는 연 217,057건의 암이 발생하였는데, 그 중 대장암은 남녀를 합쳐서 연평균 26,978건 발생하여 전체 암 발생의 12.4%로 3위를 차지하였다. 인구 10만명당 조발생률은 53.1건이다. 또한 1999년 이후 2013년까지 연령표준화발생 추이를 살펴보면 남성의 경우 1.4%, 여성의 경우 5.4% 연간증가율을 나타낸다(2013 국가암등록사업 연례보고서, 2013년).

대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관 및 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생비는 결장암은 여자, 직장암은 남자에서 다소 높게 나타난다.

대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행된다. 수술적 요법, 항암화학요법 및 방사선요법 등의 진보에도 불구하고 특정한 증상이 없이 진행되는 대장암의 특성으로 인해 다른 장기로 전이된 후 진단되어 수술시점을 놓친 경우에는 사망률이 높은 것으로 알려져 있다. 5년 평균생존율은 1기의 경우 90% 이상, 2기의 경우 70% 이상, 3기의 경우 50% 이상이고 4기의 경우에는 5% 이하로 나타나는 것으로 알려져 있어, 대장암을 조기에 발견할 경우 100%에 가까운 완치율을 보이며 조기에 치료할수록 생존율이 현저히 증가하는 것을 알 수 있다. 그러나, 대장암은 일반적으로 특징적인 자각 증상이 없기 때문에 조기 발견에 어려움이 있다. 따라서, 대장암의 조기 진단 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

대장암의 진단은 대장과 관련된 증세를 보이는 환자에 대한 방사선 진단, 분변 잠혈검사(fecal occult blood test), 및 대장내시경에 의해 수행되고 있으며, 필요에 따라 대장내시경검사를 통한 조직검사가 행해진다. 현재 이용 가능한 가장 조기의 검출방법은 분변혈에 대한 시험 또는 내시경 과정을 수반한다. 그러나, 잠혈 기준(guaiac-based)의 분변 검사의 감수성은 26%로, 이는 악성 병변이 있는 74%의 환자가 검출되지 않음을 의미한다(Ahlquist et al., Gastroenterol . Clin . North Am. 26: 41-55, 1997). 대장내시경은 전암성 및 암성 병변의 조기 검출에 대한 최선의 접근법이지만, 상당한 비용뿐만 아니라 환자에게 고통과 위험을 초래할 수 있다는 문제점이 있다(Silvis et al., JAMA 235: 928-930, 1976; Geenen et al., Am. J. Dig. Dis. 20: 231-235, 1975; Anderson et al., J. Natl . Cancer Institute 94: 1126-1133, 2002).

상기와 같은 종래의 방법들은 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라, 대장암이 발병하기 이전의 환자들에 대한 조기 진단이 불가능하며, 환자들에게 불편을 주는 문제점이 있다. 이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 환자의 혈장에서 종양 표지자(marker)의 농도를 측정하여 대장암을 진단하려는 방법이 시도되고 있다. 현재, 대장암의 진단 확정을 위해서 태아성암항원(carcinoembryonic antigen: CEA), 종양-연관 당단백질을 근거로 한 진단적 혈장 시험만이 대장암 분야에서의 임상에서 이용되고 있다. 하지만 CEA는 대장암의 진행 정도와 치료 효과의 판정에 대한 지표로 사용될 뿐이며, 비-악성 질환을 가진 환자에서도 높게 검출될 수 있다(Herrera et al., Ann. Surg. 183: 5-9, 1976). 또한 초기 대장암 환자 혈청에서 대부분의 경우 낮은 농도의 CEA 수준이 나타나므로 조기진단에 어려움이 있다(Carriquiry et al., Dis . Colon Rectum 42: 921-929, 1999). 또한 대장암 재발 환자에서의 혈청 또는 혈장으로부터 측정된 CEA의 이용은 보조적으로만 가능하며 약 40%의 환자에서는 재발암이 있어도 CEA의 상승이 관찰되지 않아 그 유용성에 논란의 여지가 있다(Martell et al., Int . J. Biol . Markers 13: 145-149, 1998; Moertel et al., JAMA 270: 943-947, 1993). 즉, 혈액 검사를 통해 대장암을 조기에 발견하거나 예측할 수 있는 검증된 바이오 마커는 아직 없는 것으로 알려져 있다.

따라서, 혈액 검사를 통해 대장암을 간편하게 진단할 수 있고, 진단의 정확도 및 특이도가 높은 바이오 마커를 개발할 필요가 있다.

일 양상은 미세원섬유 관련 단백질 5(Microfibrillar associated protein 5: MFAP5) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 MFAP5 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 대장암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 MFAP5 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 미세원섬유 관련 단백질 5(Microfibrillar associated protein 5: MFAP5) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 미세원섬유 관련 단백질 5(mic일 양상은 미세원섬유 관련 단백질 5(Microfibrillar associated protein 5: MFAP5) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 대장암을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 대장암을 가지는 개체에서 증가를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 명세서에서는 본 발명의 대장암을 가지는 개체에서 변화되는 단백질 또는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 미세원섬유 관련 단백질 5(microfibrillar associated protein 5: MFAP5) 단백질은 세포외기질의 미세원섬유의 구성요소인 미세원섬유 관련 당단백질을 암호화하며, 암호화된 단백질은 알파-V-베타-3 인테그린을 통해 미세원섬유에 세포가 부착되는 것을 촉진한다. 상기 MFAP5 단백질은 AAT9, MP25, MAGP2, MAGP-2, 또는 MFAP-5로도 표시될 수 있다. 상기 MFAP5 단백질은 인간에서 GenBank Accession No. NM_003480의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로부터 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 MFAP5 단백질은 인간에서 GenBank Accession No. NP_003471.1의 아미노산 서열 또는 UniProt No. Q13361의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 MFAP5 단백질은 173개의 아미노산으로 이루어진 단백질일 수 있다.

상기 MFAP5 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다. 상기 MFAP5 단백질은 단백질은 MFAP5 동형 단백질일 수 있다. 용어 "동형(isoform)"은 동일한 단백질의 다른 형태를 말한다.

상기 MFAP5 단백질의 단편은 면역원성 단편일 수 있다. 상기 MFAP5 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단편일 수 있다.

상기 발현 수준(expression level)은 단백질 발현 수준일 수 있다. 발현 수준은 시료 중 단백질의 양 또는 농도를 측정함으로써 측정될 수 있다. 발현 수준은 상기한 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

상기 MFAP5 단백질 또는 그의 단편의 양은 전기영동, 면역블롯팅(immunoblotting), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 단백질 칩, 면역침전, 질량 분석, 또는 이들의 조합을 통해 측정할 수 있다.

상기 발현 수준을 측정하는 제제는 단백질 또는 그의 단편의 검출 또는 정량에 사용될 수 있는 물질을 말한다. 상기 제제는 MFAP5 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab' 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 상업적으로 판매되는 MFAP5 단백질에 대한 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.

또한 상기 발현 수준을 측정하는 제제는 폴리뉴클레오티드의 검출 또는 정량에 사용될 수 있는 물질을 말한다. 상기 제제는 MFAP5 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다.

용어 "프라이머(primer)"란 짧은 자유 3'말단 수산화기를 갖는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩티드 등을 포함할 수 있다.

용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

상기 조성물은 대장암 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 MFAP5 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

MFAP5 단백질, MFAP5 단백질의 단편, 발현 수준, 및 발현 수준의 측정은 전술한 바와 같다.

상기 키트는 대장암 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

다른 양상은 대장암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 MFAP5 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암을 진단하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 대장암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 MFAP5 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

용어 "생물학적 시료"는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈소판, 혈청, 복수액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 생물학적 시료가 혈액 또는 혈장일 경우, 채취가 용이한 혈액, 혈장을 검체로 사용하기 때문에 생검을 이용하는 기존의 대장암 진단 방법과 달리 환자에게 부담을 주지 않으면서도 간편하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 대장암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 온전한(intact) 단백질을 포함할 수 있다. 온전한 단백질은 별도의 단백질의 변형 없이 생물학적 시료로부터 분리된 단백질일 수 있다. 온전한 단백질은, 예를 들어 단백질 분해 효소에 의한 단백질 분해 없이, 생물학적 시료로부터 분리된 단백질일 수 있다.

상기 측정하는 단계는 생물학적 시료와, MFAP5 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다. 인큐베이션은 인 비트로(in vitro)에서 수행될 수 있다. 측정 방법은 예를 들어, 면역블로팅(immunoblotting), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 단백질 칩, 면역침전, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료를 질량분석하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료를 질량분석하는 단계는 온전한 단백질을 질량분석하는 것일 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 MFAP5 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.

상기 정상 대조군은 대장암 환자가 아닌 개체, 양성 종양을 갖는 개체, 또는 대장암에 걸릴 위험이 없는 개체로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질 발현 수준보다 높은 경우 대장암으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 대장암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 측정된 MFAP5 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준이 정상 대조군 시료로부터 분리된 시료에서 측정된MFAP5 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준보다 증가한 경우, 상기 개체를 대장암 환자 또는 대장암에 걸릴 확률이 높은 것으로 결정할 수 있다.

상기 방법은 대장암 진단을 위해 정보를 제공하는 방법을 포함한다.

일 양상에 따른 대장암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 대장암 진단 방법에 따르면, 대장암을 간편하게 진단할 수 있고, 대장암을 높은 정확도 및 특이도로 조기 진단하는데 이용할 수 있다.

도 1a는 정상군, 대장암 환자, 비대장암(위암, 폐암, 갑상선암, 유방암) 환자의 혈장 시료에서 동정된 혈장 단백체 개수를 나타낸 막대그래프이다.
도 1b는 동정된 혈장 단백체가 Plasma Proteome Database(PPD)에 보고됐는지 여부를 비교한 벤다이어그램이다.
도 2는 동정된 혈장 단백체를 Perseus 분석 프로그램에서 비대장암 환자(정상군, 비대장암 환자군) 대조군과 대장암 환자군 사이의 T-검정 결과를 나타낸 그래프이다.
도　3은 트립신에 의해 분해된 펩티드들을 탠덤 질량 분석기로 분석하여 미세원섬유 관련 단백질 5를 동정한 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 비대장암 환자(정상군, 비대장암 환자군) 대조군(N)과 대장암 환자군(C) 유래의 풀링(pooling)한 혈장 및 혈장 내 상위 12개 고농도 단백질을 제거한 혈장 단백체를 각각 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동한 후 항-미세원섬유 관련 단백질 5 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 정상군의 혈장과 병기별 대장암 환자(1-4기)군의 혈장 단백체를 각각 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동한 후 항-미세원섬유 관련 단백질 5 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과를 나타낸 이미지이다 (GH: 성인병 및 성인병 관련 암을 갖고 있지 않은 정상군. PH: 성인병을 갖지만 성인병 관련 암을 갖고 있지 않은 정상군. C1: 대장암 1기 환자군. C2: 대장암 2기 환자군. C3: 대장암 3기 환자군. C4: 대장암 4기 환자군).
도 6a는 도 5에 나타낸 면역블롯팅에 의해 측정된 미세원섬유 관련 단백질 5 항원 농도의 평균을 각 환자 및 대장암 환자의 병기별로 나타낸 그래프이다.
도 6b는 도 5에 나타낸 면역블롯팅에 의해 측정된 미세원섬유 관련 단백질 5 항원 농도의 평균을 정상군과 대장암 환자군별로 통계 처리하여 나타낸 박스 플롯이다.
도 7은 도 6b에서 얻은 미세원섬유 관련 단백질 5의 항원 농도를 수용자-조작 특성(receiver operating characteristic: ROC) 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 대장암 환자의 혈장 단백질 중 차등 발현된 단백질의 확인

1-1. 혈장 단백체의 동정

혈장 내에서 증감을 나타내는 단백질을 대장암 특이적 혈장 단백질 마커 후보 물질로 선별하기 위해 다음과 같은 군에 대해 혈장 시료를 수집하였다: ① 성인병 및 성인병 관련 암을 갖고 있지 않은 정상군(63명), ② 성인병을 갖지만 성인병 관련 암을 갖고 있지 않은 정상군(28명), ③ 대장암 1기 환자군(48명), ④ 대장암 2기 환자군(48명), ⑤ 대장암 3기 환자군(64명), ⑥ 대장암 4기 환자군(27명), ⑦ 비대장암(위암) 환자군(10명), ⑧ 비대장암(폐암) 환자군(10명), ⑨ 비대장암(갑상선암) 환자군(10명), ⑩ 비대장암(유방암 0기-2기) 환자군(36명), ⑪ 비대장암(유방암 3기) 환자군(6명). 이와 같은 총 11개 군에 대하여 풀링(pooling)한 혈장 시료 내에 포함된 단백질 분해효소에 의한 시료의 분해를 저해하기 위해, 100mM 인산염완충식염수(phosphate-buffered saline: PBS)에 녹인 단백질 분해효소 저해제를 첨가하였다. 각 시료 당 일정량의 분주액은 사용하기 전까지 -80℃에 보관하고, 사용 시 4℃에서 10분 동안 12,000 × g로 원심 분획하여 남아있는 잔해를 제거한 상층액만 취하였다. 이후, 혈장 내 상위 12개에 해당하는 고농도 단백질을 제거하기 위해 디플리션 스핀 컬럼(Thermo Scientific 사)을 이용하여 각 컬럼 당 10 ㎕의 혈장 시료를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 3 kD이상의 단백질을 수득할 수 있는 Amicon-Ultra 0.5 필터(Milipore 사)를 이용하여 상온에서 14,000 × g로 원심 분획하며 시료를 고농축하였다. 상기의 시료가 50 ㎕로 농축되면, 8 M 우레아, 75 mM NaCl, 50 mM Tris가 포함된 단백질 분해 완충용액(pH 8.2)으로 단백질의 완충용액 상태를 바꾸고, BCA(bichinchominic acid)법에 의한 단백질 정량을 통해 총 150 ㎍ 을 정량하여 사용하였다.

1-2. 액체 상태에서의 펩티드 절편화 (in-solution digestion) 및 분획

상기 1-1에서 준비한 혈장 단백체를 액체 상태에서 다수의 펩티드 절편으로 분해하기 위해, 먼저 5 mM이 되도록 TCEP를 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 이황화 결합을 환원시켰다. 이후, 알킬화를 위해 15 mM이 되도록 아이오도아세트아미드(iodoacetamide, IAA)를 가하여 암조건의 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 절편화시 우레아의 농도를 1M 이하로 낮춰주기 위해, 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.2)으로 용액을 10배 희석하였다. 펩티드 절편화는 시퀀싱이 가능한 수준의 혼합된 트립신/라이스-시(tripsin/lys-c, Promega 사)로 단백질과 효소의 질량 비율이 25:1이 되도록 첨가한 후, 37℃에서 16시간 동안 처리하고, 0.5%(v/v) TFA 용액을 가하여 pH 2.0 이하로 산성화시켜 펩티드 절편으로 분리하였다. 분리한 펩티드 절편을 C18 macrospin 스핀 컬럼(Harvard Apparatus 사)으로 염을 제거한 후, 진공상태로 건조시켰다. 더 많은 단백체 동정 및 시료의 복잡성을 줄이기 위해 건조된 상기의 시료에 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate, pH 10) 용액을 이용해 약 150 ㎍의 양으로 분주하고, 높은 pH에 따라 역상 XBridge BEH130 C18 컬럼(250 ㎜ × 4.5 ㎛, Waters 사)에 0.5 ml/분의 유입량으로 펩티드 절편을 12개로 분획하였다. 분획한 12개의 펩티드 시료는 진공상태로 건조시킨 후, 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.

1-3. 액체 크로마토그래피와 탠덤 질량 분석

시료의 단백체를 프로파일링하기 위해, 탠덤 질량 분석기(tandem mass spectrometry)를 이용하였다. 구체적으로, 건조된 상기 1-2의 펩티드 시료를 0.4%(v/v) 아세트산 용액으로 녹여 약 1 ㎍의 양으로 분주하고, 역상 C18 컬럼(20 ㎝ ×75 ㎛, 직접 제작)에 300 nl/분의 유입량으로 주입하였다. 상기의 컬럼은 사용하기 전에 95% 완충용액 A(물에 용해한 0.1% 포름산 용액), 5% 완충용액 B(아세토니트릴에 용해한 0.1% 포름산 용액)로 평형화시켰고, 시료를 분석하기 전에 농도 구배 조건에 적응시키기 위해 여러 번 농도 구배 과정을 거쳤다. 높은 pH를 이용해 분획을 나눈 펩티드 시료는 200분 동안 5%부터 40%까지 일정한 속도로 점진적 농도 구배가 일어나는 완충용액 B로 용출하였다.

HPLC 장치와 결합되어 있는 Q Exactive quadrupole 질량분석기(Thermo Scientific 사)의 분사 전압은 2.5 kV, 모세관(capillary)의 온도는 300 ℃로 지정하였다. MS 스펙트럼은 350-1800 m/z에 해당하는 전체 질량 범위를 스캔하였다. MS/MS 스펙트럼은 미리 조사된 어미이온의 전체 스캔이 수행될 때 동시에 상위 12위의 감도를 가지는 스펙트럼을 파악하고, 해당 어미이온을 포집하여 딸이온의 스펙트럼을 파악하고, 데이터에 근거한 수득이 진행되는 동안 전하상태가 매치되지 않는 어미이온은 버려지게 된다. 데이터는 Xcalibur software v2.2 SP1을 사용하여 얻었다.

질량분석을 통해 얻어진 MS/MS 스펙트럼을 MaxQuant(version 1.5.3.30, Andromeda search engine)를 사용해 약 548,000개의 단백질 엔트리를 가지는 Human UniprotKB SwissProt database(versions 2015-03-04, http://www.uniprot.org)와 각종 효소나 케라틴 등의 단백질 엔트리가 결합된 데이터베이스에 대하여 검색하였다. 고정된 수식화로는 시스테인 잔기에 +57.021464 Da과 변동가능한 수식화로 메티오닌의 산화로 인한 +15.9949 Da, N 말단의 아세틸화로 인한 -89.029920 Da을 지정하였다. 최소 7개의 아미노산을 갖는 길이와 최대 2개의 미절단 개수를 갖는 펩티드를 허용하고, 이러한 펩티드와 단백질의 오류 발견률(false discovery rate: FDR)은 0.01로 허용하였다. MS의 질량 편차는 7 ppm, MS/MS의 질량 편차는 20 ppm이었다. 비표지 정량법에 의한 강도 값을 결정할 때, 두 시료 간의 한 단백질을 비교하기 위해서 최소 1개의 펩티드가 있어야 비교가 가능한 것으로 지정하였다.

상기의 과정을 통해 총 1,111개의 정량 가능한 단백질을 동정하였고 이를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

도 1a에 나타낸 바와 같이, 성인병 및 성인병 관련 암을 갖고 있지 않은 정상군의 혈장 단백질은 899개, 성인병을 갖지만 성인병 관련 암을 갖고 있지 않은 정상군의 혈장 단백질은 929개, 대장암 1기 환자군의 혈장 단백질은 925개, 대장암 2기 환자군의 혈장 단백질은 937개, 대장암 3기 환자군의 혈장 단백질은 981개, 대장암 4기 환자군의 혈장 단백질은 936개, 비대장암(위암) 환자군의 혈장 단백질은 1002개, 비대장암(폐암) 환자군의 혈장 단백질은 984개, 비대장암(갑상선암) 환자군의 혈장 단백질은 949개, 비대장암(유방암 0기 내지 2기) 환자군의 혈장 단백질은 1008개, 비대장암(유방암 3기) 환자군의 혈장 단백질은 963개가 동정되었다.

상기 동정된 혈장 단백질이 PPD(Plasma Proteome Database)에 보고된 것인지 여부를 확인하여 도 1b에 나타내었다.

도 1b에 나타낸 바와 같이, 상기 동정된 혈장 단백질 중 90%는 이미 PPD에 보고되었고 나머지 10%는 아직 보고되지 않은 혈장 단백체임을 확인하였다.

또한, MaxQuant 프로그램을 이용하여 비표지 정량법으로 동정된 혈장 단백질 1,111개 중 정상군 대비 대장암 환자군의 혈장 내에서 발현 차이가 나는 단백질을 동정하기 위해, Perseus(version 1.5.3.2) 프로그램으로 생물정보학 분석을 수행하였다. 구체적으로, 비대장암 환자(정상군, 비대장암 환자군) 대조군과 대장암(1기 내지 4기) 환자군 간의 T-검정을 위해 Benjamini-Hochberg FDR은 0.05로 허용하여 최종 자료로 취하였고, T-검정 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 유의미한 단백질은 38개였고, 이 중에서 비표지 정량법에 의한 강도 비율이 2배 이상 증가하거나 감소하는 단백질은 19개였다. 상기 19개의 단백질 중 대장암 환자군의 혈장 내에서 2배 이상 증가하는 단백질 5개와 16배 이상 감소하는 단백질 3개를 마커 후보 물질로 선정하였다. 이 중 미세원섬유 관련 단백질 5는 비대장암 환자군 대비 대장암 환자군에서 약 2.6배 증가하는 것을 확인하였다.

선정된 8개의 마커 후보 물질에 대한 사전 검증 실험으로 풀링한 혈장을 이용한 면역블롯팅(실시예 3) 결과, 3개의 단백질을 제외한 5개의 단백질만이 선택적으로 인식하는 항체를 이용한 면역블롯팅 분석으로 대장암 혈장 단백질에 존재함을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 질량 분석 결과를 기반으로 한 비표지 정량법의 강도 비율이 양의 상관관계를 보이는지 여부를 확인하여 본 마커 후보 물질을 선정하였다. 상기의 과정을 통해, 미세원섬유 관련 단백질 5를 비대장암 환자군와 대장암 환자군을 구별할 수 있는 단백질 마커 후보 물질로 선정하였다.

또한, 정상군과 상기 암 환자의 혈장 단백질로부터 얻은 다양한 트립신에 의해 분해된 펩티드들 중에서 탠덤 질량 분석기로 분석하여 미세원섬유 관련 단백질 5를 동정한 스펙트럼 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 질량 분석기에 의해 동정된 단백질이 미세원섬유 관련 단백질 5임을 확인하였다.

실시예 2: 미세원섬유 관련 단백질 5의 차등 발현 검증

2-1. 풀링한 혈장 단백체에서의 검증

비대장암 환자(정상군, 비대장암 환자군) 대조군과 대장암(1기부터 4기) 환자군의 풀링한 혈장 단백체에서의 미세원섬유 관련 단백질 5의 발현수준을 면역블롯팅으로 확인하였다.

미세원섬유 관련 단백질 5에 대한 면역블롯팅은 비대장암 환자 대조군 163명과 대장암 환자군 187명의 전체 풀링한 혈장 시료와 실시예 1-1에서 나타낸 바와 같이 혈장 내 상위 12개 고농도 단백질을 제거한 풀링한 혈장 시료를 대상으로 수행하였다. 각각의 시료는 10 ㎍, 50 ㎍으로 준비하여 15%의 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동을 수행하여 검체에 포함된 단백질을 분자량에 따라 분리하였다. 분리된 단백질을 50 mM Tris-HCl, 130 mM 글리신, 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올이 포함된 완충용액 내에서 90 V, 300 mA의 조건에서 PVDF 멤브레인으로 전이시키고, 전이된 멤브레인을 5% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline Tween 20)에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PVDF 멤브레인에 미세원섬유 관련 단백질 5에 대한 항체(1:250, Atlas Antibodies 사)를 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 3회 세척하였고, 항-미세원섬유 관련 단백질 5의 레빗 면역글로불린과 결합하는 레빗 IgG-HRP(1:3000, Cell Signaling 사)로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 다시 TBST로 3회 세척하였다. 이어서, 상기 PVDF 멤브레인을 ECL(chemiluminescence substrate, Bio-rad 사)와 반응시킨 후, DAVINCH-Chemi(DAVINCH 사)를 이용하여 1분 동안 화학 발광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하였다. 측정 결과를 도 4에 나타내었다(N: 비대장암 환자 대조군, C: 대장암 환자군, Whole: 특별한 처리를 하지 않은 혈장 시료, Depleted: 혈장 내 상위 12개의 고농도 단백질을 제거한 혈장 시료).

도 4에서 나타낸 바와 같이, 미세원섬유 관련 단백질 5를 선택적으로 인식하는 항체를 이용한 면역블롯팅 분석을 통해 미세원섬유 관련 단백질 5가 대장암 환자군의 풀링한 혈장 단백질에 존재함을 확인하였다.

2-2. 혈장 내에서의 검증

대장암 환자의 혈장은 병기별로 준비하였고(1기는 13명, 2기는 12명, 3기는 12명, 4기는 13명), 30명의 정상군 혈장을 수집하였다. 각 시료의 혈장 1 ㎕에 8M 우레아, 75 mM NaCl, 50 mM Tris가 포함된 단백질 분해 완충용액(pH 8.2), 그리고 1M Tris, 50% 글리세롤, 10% SDS, 1% 브로모페놀 블루, 베타-메르캅토에탄올, 및 DTT가 포함된 샘플 버퍼를 섞은 후, 환자별로 동일 부피 10 ㎕씩 분주하여 단백질 시료를 각각 준비하였다.

상기와 같이 준비된 혈장 단백질 시료 10 ㎕를 15% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 분리된 혈장 단백질을 50 mM Tris-HCl, 130 mM 글리신, 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올이 포함된 완충용액 내에서 90 V, 250 mA의 조건에서 PVDF 멤브레인으로 전이시키고, 전이된 멤브레인을 5% 탈지분유가 함유된 TBST에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PVDF 멤브레인에 미세원섬유 관련 단백질 5에 대한 항체(1:250, Atlas Antibodies 사)를 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 3회 세척하였고, 항-미세원섬유 관련 단백질 5의 레빗 면역글로불린과 결합하는 레빗 IgG-HRP(1:3000, Cell Signaling 사)로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 다시 TBST로 3회 세척하였다. 이어서, 상기 PVDF 멤브레인을 ECL(chemiluminescence, Bio-rad 사)과 반응시킨 후, DAVINCH-Chemi(DAVINCH 사)를 이용하여 1분 동안 화학 발광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하고 결과를 도 5에 나타내었다(각 웰 당 1μl의 혈장 시료).

도 5에서 나타낸 바와 같이, 미세원섬유 관련 단백질 5를 선택적으로 인식하는 항체를 이용한 면역블롯팅 분석을 통해 미세원섬유 관련 단백질 5가 대장암 혈장 단백체에 존재함을 확인할 수 있었다.

또한, 정상군과 대장암 환자군의 혈장을 전기영동으로 분석한 후, 항-미세원섬유 관련 단백질 5 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과와 항원 농도를 그래프로 나타낸 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.

도 6a는 면역블롯팅에 의해 측정된 각 환자군별 항원 농도의 평균을 통계처리한 것이고, 도 6b는 정상군과 대장암 환자군의 항원 농도의 평균을 통계처리하여 나타낸 것이다(P<0.0001). 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 미세원섬유 관련 단백질 5는 정상군의 혈장에 비하여 대장암 환자의 혈장에서 약 5.3배 증가함을 확인하였다.

또한, 상기 도 6에서 측정된 항원의 농도를 수용자-조작 특성(receiver operating characteristic: ROC) 그래프로 도 7에 나타내었다. ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전 범위에 걸친 판정 역치를 연속적으로 변화시켜 수득되는 모든 감수성/특이성 쌍의 그래프로 주로 시험의 정확도를 나타낸 것이다.

도 7에 나타낸 바와 같이, ROC 그래프에 미세원섬유 관련 단백질 5의 곡선하 면적(area under the curve: AUC)은 0.865(P<0.001)이므로, 상기 분석이 민감성과 정확성을 갖추고 있음을 확인하였다.

따라서, 혈장 내에 미세원섬유 관련 단백질 5를 대장암 진단의 민감도와 특이도가 우수한 마커로 활용할 수 있다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Composition or kit comprising MFAP5 measuring agent for diagnosis of colorectal cancer and method for diagnosing colorectal cancer the same <130> PN117326 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 173 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Leu Leu Gly Pro Lys Val Leu Leu Phe Leu Ala Ala Phe Ile 1 5 10 15 Ile Thr Ser Asp Trp Ile Pro Leu Gly Val Asn Ser Gln Arg Gly Asp 20 25 30 Asp Val Thr Gln Ala Thr Pro Glu Thr Phe Thr Glu Asp Pro Asn Leu 35 40 45 Val Asn Asp Pro Ala Thr Asp Glu Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Asp 50 55 60 Ile Ala Pro Ser Thr Asp Asp Leu Ala Ser Leu Ser Glu Lys Asn Thr 65 70 75 80 Thr Ala Glu Cys Trp Asp Glu Lys Phe Thr Cys Thr Arg Leu Tyr Ser 85 90 95 Val His Arg Pro Val Lys Gln Cys Ile His Gln Leu Cys Phe Thr Ser 100 105 110 Leu Arg Arg Met Tyr Ile Val Asn Lys Glu Ile Cys Ser Arg Leu Val 115 120 125 Cys Lys Glu His Glu Ala Met Lys Asp Glu Leu Cys Arg Gln Met Ala 130 135 140 Gly Leu Pro Pro Arg Arg Leu Arg Arg Ser Asn Tyr Phe Arg Leu Pro 145 150 155 160 Pro Cys Glu Asn Val Asp Leu Gln Arg Pro Asn Gly Leu 165 170

Claims

미세원섬유 관련 단백질 5(microfibrillar associated protein 5: MFAP5) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 MFAP5 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제제는 MFAP5 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인 대장암 진단용 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인 것인 대장암 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제제는 MFAP5 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것인 대장암 진단용 조성물.
MFAP5 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트.
대장암이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 MFAP5 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 대장암을 진단하는 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈소판, 혈청, 복수액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료와, MFAP5 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 생물학적 시료를 질량분석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 10에 있어서, 상기 생물학적 시료를 질량분석하는 단계는 온전한 단백질을 질량분석하는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 측정된 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질 발현 수준보다 높은 경우 대장암으로 판단하는 단계를 포함하는 방법.