KR101431066B1 - 유방암 진단용 단백질 마커 파이브로넥틴, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암을 진단할 수 있는 단백질 마커인 파이브로넥틴을 다중 반응 모니터링 방법을 통해 혈액 시료에서 검출하는 방법, 파이브로넥틴에 특이적인 항체를 포함하는 유방암 진단키트, 및 항원-항체 결합반응을 이용하여 혈액 내에서 파이브로넥틴을 검출하는 방법에 관한 것이다. MRM법 또는 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료에서 본 발명의 유방암 진단용 단백질 마커인 파이브로넥틴을 검출하는 방법 및 진단 키트는 진단의 민감도 및 정확도가 높을 뿐만 아니라 환자의 혈액을 이용하여 매우 간편하게 유방암을 진단할 수 있어 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유방암 진단용 단백질 마커 파이브로넥틴, 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트{PROTEIN MARKER FIBRONECTIN FOR BREAST CANCER DIAGNOSIS, METHOD OF DETECTING THE SAME, AND DIAGNOSIS KIT FOR BREAST CANCER USING ANTIBODY AGAINST THE SAME}

본 발명은 유방암 진단에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈액에서 유방암 발병 유무를 선택적으로 진단할 수 있는 단백질 마커로서의 파이브로넥틴 및 이의 검출 방법, 및 이를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 유방암 진단키트에 관한 것이다.

유방암의 원인에 대해 명확하게 밝혀진 것은 없지만, 여성 호르몬, 가족력, 과거력, 출산력, 식생활 습관 등의 다양한 인자들이 거론되고 있다. 2005년 통계청의 조사에 의하면, 한국 여성의 유방암 발생은 최근 급격히 증가하여 1998년 자궁경부암을 추월한 이래 2001년 발생한 한국 여성암 환자의 16.1%를 차지하면서 위암을 제치고 여성암 1위가 되었다. 특히, 2002년에는 2001년에 비해 유방암(11.1%)이 가장 급증한 암으로 나타나 저출산, 짧은 수유기간, 이른 초경, 늦은 폐경 등 생리적으로 왕성한 신체적 변화를 겪는 시기의 여성들에서는 여성호르몬의 자극을 받는 횟수의 급격한 증가로 인한 유선조직의 민감도 증가, 식생활의 서구화, 생활환경의 오염 등의 이유로 유방암 발생이 급격하게 증가하고 있다.

이러한 유방암의 발생빈도 및 유방암으로 인한 사망률의 증가는 현재의 서구화 실태로 보아 앞으로도 상당기간 지속될 것으로 예상된다. 유방암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직의 침범 또는 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 대부분이 아무런 증상 없이도 자가검진으로 진단될 수 있다. 따라서, 유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 유방암을 효과적으로 조기에 진단하는 것이 매우 중요하다(Tuli et al., Breast J. 12: 343-348, 2006).

유방암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 복합적으로 사용되고 있는데, 현재까지는 유방암 환자의 70%가 자가진단에 의해서 내원하고 있다. 그러나, 이러한 자가진단 방법은 악성종양과 양성혹을 구분하는 것이 매우 어렵다는 단점이 있다. 그 밖에, 유방암의 진단방법으로 X-선 유방촬영법, 초음파검사법, 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등이 있는데, 최종적으로는 조직검사를 통해 확인하는 것이 중요하다. X-선 유방촬영법은 X-선으로 유방을 찍어 검사하는 방법으로 혹이 양성인지 악성인지를 감별하는데 우수할 뿐만 아니라, 숨어 있는 혹을 발견하는 방법으로서 자가진단으로 혹이 만져지기 이전에 초기의 유방암을 진단하는데 가장 효과적인 방법이다. 그러나, 유방촬영법은 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있다거나 유방이 작고 섬유질이 많은 우리나라 여성에게서는 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 자주 찍으면 오히려 유방암이 유발될 수도 있다는 논란이 있다. 이러한 유방촬영법의 대안으로 초음파검사법이 사용되고 있는데, 초음파검사법은 물혹과 단단한 혹을 구별하는데 효과적이긴 하지만, 악성종양과 양성혹을 감별하는 능력은 떨어진다.

이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 환자의 혈액에서 종양 표지자(marker)의 농도를 측정하여 유방암을 진단하려는 시도가 있었다(Clinton et al., Biomed Sci . Instrum. 39: 408-414, 2003; Rui et al., Proteomics. 3: 433-439, 2003; Soletormos et al., 48: 229-255, 2001). 그러나, 이러한 종양 표지자들의 진단적 또는 예후 인자로서의 가치가 연구되고는 있지만, 아직까지 제한적으로 사용되고 있을 뿐으로 공식적으로 권장되고 있는 유방암 표지자는 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 양이 변하는 마커 단백질을 유방암의 진단에 이용하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 서열번호 1로 제시되는 파이브로넥틴이 정상인에 비하여 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 그 양이 증가하여 존재한다는 사실을 발견하였고, 이러한 파이브로넥틴을 효율적으로 추적하기 위해 다중 반응 모니터링 방법으로 파이브로넥틴을 대표할 수 있는 서열번호 2로 제시되는 펩티드의 발현 정도를 모니터링하여 유방암을 간편하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 혈액내에 존재하는 파이브로넥틴의 유방암 발병 여부에 따른 변화양상을 이용하여 간편하게 유방암을 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유방암 진단용 단백질 마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 파이브로넥틴을 제공한다.

또한, 본 발명은 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 상기 파이브로넥틴을 선택적으로 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 파이브로넥틴 마커에 특이적인 항체를 포함하는 유방암 진단키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 유방암 단백질 마커로서 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 파이브로넥틴에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료에서 파이브로넥틴을 검출하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 본 발명은 유방암 진단을 위한 단백질 마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 파이브로넥틴을 제공한다.

파이브로넥틴 (Fibronectin; FN1)은 세포와 기질의 접착에 있어서 단백질 부착을 제공하고 세포를 아교질쪽으로 이주하게 하는 기능을 수행 한다 (Morla A. et al., Nature , 367:193-196, 1994). 상기 단백질은 세포의 모양, 운동성, 생장 상태를 인테그린을 매개로 한 신호 전달을 통해 조절하여 암세포의 생장을 조절한다 (Hwangbo C. et al., Cancer Res,, 70:1645-1655, 2010). 또한, 최근 보고에 의하면 종양 세포로부터 분비된 소포체 파이브로넥틴을 다른 종양세포가 흡수함으로서 종양의 생장과 전이를 촉진한다고 알려지고 있다 (Deng Z. et al., Am J Pathol., 2011).

한편, 삼중 사극자 질량분석기 (triple quadrupole mass-spectrometry)를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM)은 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석기술이다. MRM은 이미 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩티드를 동시에 측정하기에 용이하며, 표준품이나 항체가 없이 정상인과 암환자 사이에서 단백질 진단 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩타이드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다 (Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics , 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal . Chem ., 81: 3462-70, 2009).

본 발명자들은 유방암 환자의 혈액에서 특이적으로 그 양이 증가하여 유방암의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 진단 마커를 선발하기 위하여, 80명의 유방암 환자와 80명의 비환자 대조군으로부터 혈액 시료를 얻어 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM)을 통해 정량 분석하였다. 그 결과 파이브로넥틴이 비환자 대조군에 비해 유방암 환자의 혈액에서 발현량이 증가하였고, 이를 통해 유방암 환자를 효과적으로 구분해 낼 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 유방암 진단 마커로 선별된 파이브로넥틴은 지금까지 유방암의 발병 및 진행을 진단할 수 있는 표지로서 사용될 수 있음이 알려지지 않았다. 따라서 파이브로넥틴을 유방암의 진단 마커로 이용하는 것은 본 발명이 최초이다. 또한, 상기 마커 단백질은 혈액에서 검출이 가능하기 때문에 생검(biopsy)을 통하지 않아 환자에게 불편을 초래하지 않으면서 간편한 방법으로 유방암을 진단하는데 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 본 발명은 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링을 통해 혈액 시료에서 상기 파이브로넥틴을 검출하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 방법은

1) 피검자의 혈액 시료 및 대조군 혈액 시료의 단백질을 펩티드 절편으로 만드는 단계;

2) 상기 펩티드 절편을 삼중 사극자 질량분석기에 주입하여 파이브로넥틴을 대표하는 타깃 펩티드에 대해 다중 반응 모니터링을 수행하는 단계;

3) 상기 다중 반응 모니터링 결과를 내부 표준물질에 대한 비율로 표시하는 단계; 및

4) 피검자와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 피검자의 혈액 시료를 채취하고, 상기 파이브로넥틴을 피검자의 혈액 시료에서 MRM법으로 검출하여 비환자 대조군의 검출 결과에 비교하여 파이브로넥틴의 양의 증가 여부를 확인함으로써 유방암의 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 목적상, 타깃 단백질을 MRM 법으로 검출하기위해서는 각 단백질을 대표할 수 있는 특정 펩티드의 선정과 각 펩티드의 MRM 모니터링 타깃인 어미이온/딸이온 쌍의 선정이 선행되어야 한다. 본 발명의 파이브로넥틴을 대표하는 타깃 펩티드는 서열 번호 2의 서열을 가지며, 타깃 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 m/z 555.8과 m/z 821.4이다. 또한 타깃 단백질을 검출하기 위해 MRM법으로 모니터링하는 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 합성하고 MRM 분석시 내부 표준물질로 사용하면 타깃 단백질의 혈액내 절대량도 측정할 수 있어 더욱 정확한 분석 결과를 도출할 수 있다. 본 발명에 있어서 내부 표준물질은 MRM 분석시 일반적으로 사용되는 임의의 내부 표준물질이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 대장균 베타-갈락토시다아제가 사용될 수 있다. 타깃 단백질의 혈액 내 절대량을 측정하기 위해 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 내부 표준물질로서 합성할 경우, 동위 원소로 치환된 아미노산은 리신 (Lysine)이나 아르기닌 (Arginine)이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 합성된 펩티드는 95% 이상 순수 분리된 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 파이브로넥틴을 MRM법을 사용하여 검출하는 방법은 환자의 혈액을 이용하는 새로운 진단도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 항원 항체를 이용하는 기존의 면역 화학적 방법보다 검출하고자 하는 단백질에 대한 선택성이 매우 높고 생검을 이용하지 않고 혈액을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 MRM법을 이용하여 파이브로넥틴을 혈액 시료에서 검출하기 위한 진단 키트를 제공한다. 본 진단 키트는 MRM법을 이용하여 파이브로넥틴을 검출하기 위해 필요한 파이브로넥틴의 타깃 펩티드 및 타깃 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍에 대한 정보를 포함하며, 당분야에서 질량 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다.

한편, 파이브로넥틴은 MRM법을 통해서 뿐만 아니라, 항원-항체 결합 반응을 통해서도 혈액 시료에서 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 태양에 따라, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 파이브로넥틴 에 특이적인 항체를 포함하여 혈액 시료에서 파이브로넥틴을 검출하기 위한 유방암 진단시약 및 유방암 진단키트를 제공한다.

파이브로넥틴에 선택적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해서는 파이브로넥틴의 입수가 선행되어야 하며, 이는 서열번호 1의 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전자 재조합을 이용하여 미생물에서 생산할 수 있고, 또는 혈액으로부터 직접 분리하여 준비할 수도 있다.

본 발명의 목적상, 상기 항체는 파이브로넥틴의 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함할 수 있으나, 항원과 보다 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체가 바람직하다.

다클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원(antigen)으로 파이브로넥틴 또는 그의 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 이러한 외부 숙주로는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 예로 들 수 있으며, 면역원은 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 근육내, 복강내 또는 피하주사 등의 방법으로 투여되어 외부 숙주를 면역화시킨다. 면역화된 외부 숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제하여 파이브로넥틴에 특이적인 다클론 항체를 제조할 수 있다.

단클론 항체는 당업자에 알려진 융합(fusion)에 의한 불멸화된 세포주 생성방법(Kohler G. et al., Nature, 256: 495-497, 1975)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법을 간략히 설명하면, 먼저 순수한 파이브로넥틴 또는 그의 단편으로 마우스를 면역시키거나, 이의 펩티드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역시킨다. 면역이 된 마우스로부터 분리한 항체-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마 세포를 생성한다. 이어, 효소면역분석법(ELISA; Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)으로 하이브리도마 세포의 단클론 항체의 생성 여부를 조사하여 양성 클론을 선발하고 이를 배양한 후 항체를 분리, 정제하거나 쥐의 복강에 주입한 후 복수를 채취하여 파이브로넥틴에 특이적인 단클론 항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 파이브로넥틴의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 유방암 진단키트에는 파이브로넥틴을 선택적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 당분야에서 면역학적 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 유방암 진단키트는 파이브로넥틴에 특이적인 항체; 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체(conjugate); 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 유방암 진단키트는 파이브로넥틴 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 유방암 진단키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 유방암을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 검체 및 대조군을 표면에 코팅시킨 96-웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 재조합 단클론 항체 단백질과 반응하는 ELISA를 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.

항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

이차항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.

발색을 유도하기 위한 발색기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 파이브로넥틴의 존재 유무를 검출한다.

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 이차항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산용액(H₂SO₄)이 바람직하게 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명의 또 다른 태양은 유방암 단백질 마커로서 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 파이브로넥틴에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 혈액 시료에서 파이브로넥틴을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 검출방법은 혈액내 단백질을 고정화시키거나 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리시킨 후 PVDF 막으로 전이시키고 파이브로넥틴을 선택적으로 인지하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 결합반응을 통해 파이브로넥틴 의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다. 상기 항원-항체 결합반응으로는 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA), 샌드위치 측정, 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등을 예로 들 수 있다. 시료로서는 혈청, 혈장 또는 혈액을 사용할 수 있고, 혈장이 가장 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 검출방법은,

1) 피검자의 혈액 시료 및 대조군 혈액 시료의 단백질을 고정체에 코팅하거나 고정시키는 단계;

2) 상기 고정체에 파이브로넥틴에 특이적인 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계;

3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합반응물을 이차항체 접합체(conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

4) 피검자 혈액 시료와 대조군 혈액 시료에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 검출방법을 구체적으로 설명하면, 먼저 혈액 시료로부터 혈장단백질을 분자량에 따라 분리한다. 파이브로넥틴은 분자량이 262 kDa이므로 6.5% 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하고, 이로부터 분리된 단백질들을 PVDF 막과 같은 고정체로 전이시켜 고정한다. 이어, 고정된 단백질 항원에 파이브로넥틴에 특이적인 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행한다. 혈액 시료에 파이브로넥틴이 존재한다면, 상기 단백질이 고정된 막에 파이브로넥틴 특이적인 항체가 가해졌을 때 항원-항체 결합반응이 일어나게 된다. 파이브로넥틴과 이에 대한 항체의 결합 정도를 측정하기 위해서, 파이브로넥틴 항체에 친화성을 갖는 이차항체, 예컨대 항-인간 IgG-HRP와 결합시키는 단계를 수행하는데, 이차항체에 접합된 HRP(horseradish peroxidase)가 기질인 ECL(enhanced chemiluminescence)과 반응하여 발색반응을 일으키는지의 여부와 그 정도를 대조군과 비교함으로써 혈액 시료내 유방암 진단 마커인 파이브로넥틴의 존재 여부 및 대조군에 비교한 그 양의 증가 여부를 검출하게 된다.

한편, 파이브로넥틴에 특이적인 항체를 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 혈액 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하면, 한 번의 분석으로 대량의 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 본 발명은 파이브로넥틴에 특이적으로 결합하는 항체가 고형 기질에 집적된 바이오칩을 제공한다. 바이오칩의 고형 기질의 예로는 플라스틱, 유리, 금속, 실리콘 등을 들 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 유방암 진단용 마커 단백질인 파이브로넥틴을 혈액 시료에서 MRM법을 통해 검출하는 방법은 환자의 혈액을 이용하는 새로운 진단도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 항원 항체를 이용하는 기존의 면역 화학적 방법보다 검출하고자 하는 단백질에 대한 선택성이 매우 높고 생검을 이용하지 않고 혈액을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있는 한편, 파이브로넥틴의 항체를 이용한 유방암 진단키트 및 진단 방법 또한 비교적 채취가 용이한 혈액을 시료로 하기 때문에 생검을 대상으로 하는 기존의 유방암 진단방법과는 달리 환자에게 부담을 주지 않고 매우 간편하게 유방암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 유방암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 서열번호 1로 제시된 파이브로넥틴의 트립틱 펩티드중 하나인 서열번호 2의 펩티드를 삼중사극자 질량분석기를 이용한 다중반응 모니터링 법으로 정량 분석한 MRM 크로마토그램을 나타낸 도이다.
도　2a 및 2b는 파이브로넥틴을 80명의 유방암 환자와 80명의 비 환자 대조군에 대해 다중반응 모니터링 법으로 측정한 항원의 농도 (내부표준물질로 사용한 대장균 베타-갈락토시다아제에 대한 비율)를 나타낸 도이다.
a: 상자도표; 및,
b: ROC 곡선.
도　3a 및 3b는 파이브로넥틴을 37명의 1기 유방암 환자와 80명의 비 환자 대조군에 대해 다중반응 모니터링 법으로 측정한 항원의 농도 (내부표준물질로 사용한 대장균 베타-갈락토시다아제에 대한 비율)를 나타낸 도이다.
a: 상자도표; 및,
b: ROC 곡선.
도　4는 유방암 환자군의 혈장 및 혈액과 비환자 대조군의 혈장 및 혈액을 전기영동으로 분석한 후 항-파이브로넥틴 항체로 면역블랏팅을 수행한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 다중 반응 모니터링 ( Multiple Reaction Monitoring ; MRM )법을 이용한 유방암 진단을 위한 파이브로넥틴 단백질의 검출

본 발명자들은 상기 서열번호 1에 제시된 파이브로넥틴 단백질이 혈액에서 유방암의 선택적 진단을 위한 마커로서 사용될 수 있는지를 확인하기 위하여 다음과 같이 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링법을 통해 정량분석하는 방법을 사용하였다 (Anderson L. et al., Mol Cell Proteomics, 5: 375-88, 2006). MRM이란 질량분석기를 이용한 정량에 주로 사용되는 방법으로 관심 있는 어미이온으로부터 생성된 특정 딸이온을 관찰하여 정보를 얻는 방법이다. 예를 들어 m/z 1000을 갖는 여러 개의 어미이온 중 단 한 개의 이온만이 m/z 500의 딸이온을 갖는다면 이러한 이온을 추적하기 위해 m/z 1000을 갖는 어미이온을 선택하여 단편화 시키고 m/z 500의 딸이온을 조사하는 것이 MRM이다.

1.1 시료의 준비

파이브로넥틴 단백질의 유방암 진단 효율성을 확인하기 위해 유방암 환자 80명과 비 환자 대조군 80명으로부터 얻은 혈액 시료에서의 단백질 발현 정도를 확인하고, 통계 처리하여 파이브로넥틴 단백질의 유방암 진단 효율을 확인하였다. 160 명으로부터 얻은 혈액으로부터 각각 200 ㎍의 단백질 시료를 준비하였다. 준비된 각 시료에 10 mM의 디티오트레이톨(Dithiothreitol)을 처리하여 1 시간 반응시켜, 단백질을 펩티드 절편으로 만드는 과정을 방해할 수 있는 단백질내 아미노산중 시스틴의 씨올 (thiol-)잔기간의 결합을 끊어 주었다. 이렇게 끊어준 씨올 결합은 60 mM의 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 처리한 후 빛이 들어오지 않는 곳에서 1시간 동안 반응시켜 씨올 잔기간의 재결합을 막아 주었다. 준비된 단백질 시료에 전체 단백질 200 ㎍의 1/50에 해당하는 양인 4 ㎍의 트립신 20 ㎕ (Promega, USA)을 첨가하고 37℃에서 16시간 동안 처리하여 다수의 펩티드 절편으로 분리하였다. 이렇게 얻은 펩티드 절편은 C18 cartridge를 이용하여 염을 제거함으로써 질량 분석을 위한 최종 시료로 준비하였다.

1.2 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링 수행

MRM 분석을 위해서는 특정 단백질을 대표할 수 있는 펩티드의 선정과 그 펩티드로부터 단편화를 통해 생성된 딸이온, 즉 타깃 펩티드를 효과적으로 모니터링 할 수 있는 어미이온과 딸이온의 쌍을 먼저 선정해야 한다. 서열번호 1로 제시된 파이브로넥틴 단백질의 컬럼에서의 머무름 시간과, 텐덤 질량분석 스펙트럼을 확인하기위해 상기 단백질을 대표할 수 있는 펩티드를 합성하였다 (JPT Peptide Technologies Gmbh, Germany). 그 결과 파이브로넥틴 단백질을 모니터링 하기 위한 서열번호 2로 제시되는 펩티드를 합성하였고, 합성된 펩티드의 텐덤 질량분석 스펙트럼으로부터 어미이온/딸이온 쌍을 선정하여 표 1에 제시하였다.

타깃단백질	타깃펩티드	MRM transition (m/z)		MRM ratio (cancer/normal)
		어미이온	딸이온	유방암	1기 유방암
파이브로넥틴	STTPDITGYR	555.8	821.4	1.56	1.54
대장균 베타-갈락토시다아제	GDFQFNISR	542.3	636.3	내부표준물질

실시예 1.1에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALO^TM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuant^TM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다 (도 1). 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타-갈락토시다아제 (표 1)의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다. 각 펩티드의 MRM 크로마토그램 면적비를 구함으로써 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 단백질 발현량의 차이를 확인할 수 있었다.

상기 방법으로 측정된 파이브로넥틴 단백질의 농도를 그래프로 도시하였다. 구체적으로, 서열번호 1로 제시된 파이브로넥틴 단백질을 80명의 유방암 환자와 80명의 비 환자 대조군에 대해 정량 분석하여 도 2a에서 나타난 바와 같이 상자도표로 도시한 결과, 상기 마커 단백질이 비환자 대조군에 비해 유방암 환자군에서 1.56배 증가함을 확인하였다. 이를 도 2b에서 나타난 바와 같이 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과, 상기 마커 단백질의 AUC(area under the curve)는 0.7로 나타났다. 또한, 80%의 특이도에서 37.5%의 민감도를 보여 상기 분석이 기존의 유방암 표지 마커에 비해 높은 민감성과 정확성을 갖추고 있음을 알 수 있었다.

더불어, 상기 파이브로넥틴 단백질을 37명의 1기 유방암 환자와 80명의 비 환자 대조군간의 발현량을 비교한 결과, 도 3a에서 상자도표로 도시한 바와 같이 상기 마커 단백질이 비환자 대조군에 비해 1기 유방암 환자군에서 1.54배 증가함을 확인하였다. 이를 도 3b에서 나타난 바와 같이 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과, 상기 마커 단백질의 AUC(area under the curve)는 0.73으로 나타났다. 또한, 80%의 특이도에서 43.24%의 민감도를 보여 상기 분석이 초기 유방암 환자의 진단에 매우 효과적임을 알 수 있었다.

참고로, ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전 범위에 걸친 판정 역치를 연속적으로 변화시켜 수득되는 모든 감수성/특이성 쌍의 그래프로 주로 시험의 정확도를 나타낸다(Zweig et al., Clin. Chem. 39:561-577, 1993).

실시예 2. 면역블랏팅을 이용한 파이브로넥틴의 검출

서열번호 1에 제시된 파이브로넥틴은 면역블랏팅을 통한 혈액에서의 유방암 진단에 사용될 수 있다.

구체적으로, 암 환자군 140명으로 부터 혈장과 혈액을 취하고 비환자 대조군 100명으로부터 혈액을, 다른 비환자 대조군 479명으로부터 혈장을 취하여 혈장 내 단백질량을 정량한다. 준비된 혈장 단백질 시료 각 10 ㎍과 1% SDS가 포함된 완충용액을 섞은 후, 6.5% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 분리된 혈청 단백질을 25 mM 트리스(Tris-HCl), 190 mM 글라이신(glycine) 및 10% 메탄올(methanol)이 포함된 용액 내에서 PVDF 막(Bio-Rad, USA)으로 전이시켰고 전이된 막을 5% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline Tween 20)에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 상기 PVDF 막을 파이브로넥틴 항체(Biohit Oy, Finland)와 4℃에서 16시간 동안 반응시켰고, TBST로 3회 세척한 후 마우스 면역글로불린과 결합하는 마우스 IgG-HRP(Amersham Bioscience, USA)와 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, 상기 PVDF 막을 ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience, USA)과 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 파이브로넥틴 항원의 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 면역 블랏팅 분석 결과를 얻어, 항원-항체 반응을 통한 파이브로넥틴 단백질의 검출을 확인하였다.

<110> Biomedieng Co., Ltd. <120> PROTEIN MARKER FIBRONECTIN FOR BREAST CANCER DIAGNOSIS, METHOD OF DETECTING THE SAME, AND DIAGNOSIS KIT FOR BREAST CANCER USING ANTIBODY AGAINST THE SAME <130> SDP50346 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2386 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val Gln Cys 1 5 10 15 Leu Gly Thr Ala Val Pro Ser Thr Gly Ala Ser Lys Ser Lys Arg Gln 20 25 30 Ala Gln Gln Met Val Gln Pro Gln Ser Pro Val Ala Val Ser Gln Ser 35 40 45 Lys Pro Gly Cys Tyr Asp Asn Gly Lys His Tyr Gln Ile Asn Gln Gln 50 55 60 Trp Glu Arg Thr Tyr Leu Gly Asn Ala Leu Val Cys Thr Cys Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Ser Arg Gly Phe Asn Cys Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu Glu Thr 85 90 95 Cys Phe Asp Lys Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Arg Val Gly Asp Thr Tyr 100 105 110 Glu Arg Pro Lys Asp Ser Met Ile Trp Asp Cys Thr Cys Ile Gly Ala 115 120 125 Gly Arg Gly Arg Ile Ser Cys Thr Ile Ala Asn Arg Cys His Glu Gly 130 135 140 Gly Gln Ser Tyr Lys Ile Gly Asp Thr Trp Arg Arg Pro His Glu Thr 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Met Leu Glu Cys Val Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu 165 170 175 Trp Thr Cys Lys Pro Ile Ala Glu Lys Cys Phe Asp His Ala Ala Gly 180 185 190 Thr Ser Tyr Val Val Gly Glu Thr Trp Glu Lys Pro Tyr Gln Gly Trp 195 200 205 Met Met Val Asp Cys Thr Cys Leu Gly Glu Gly Ser Gly Arg Ile Thr 210 215 220 Cys Thr Ser Arg Asn Arg Cys Asn Asp Gln Asp Thr Arg Thr Ser Tyr 225 230 235 240 Arg Ile Gly Asp Thr Trp Ser Lys Lys Asp Asn Arg Gly Asn Leu Leu 245 250 255 Gln Cys Ile Cys Thr Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Lys Cys Glu Arg 260 265 270 His Thr Ser Val Gln Thr Thr Ser Ser Gly Ser Gly Pro Phe Thr Asp 275 280 285 Val Arg Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro Pro Pro 290 295 300 Tyr Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val Gly Met 305 310 315 320 Gln Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr Cys Leu 325 330 335 Gly Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr Tyr Gly 340 345 350 Gly Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr Asn Gly 355 360 365 Arg Thr Phe Tyr Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Gln Asp Gly His Leu 370 375 380 Trp Cys Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys Tyr Ser Phe 385 390 395 400 Cys Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly Asn Ser Asn 405 410 415 Gly Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His Asn Tyr Thr 420 425 430 Asp Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp Cys Gly Thr 435 440 445 Thr Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys Pro Met Ala 450 455 460 Ala His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met Tyr Arg Ile 465 470 475 480 Gly Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met Met Arg Cys 485 490 495 Thr Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile Ala Tyr Ser 500 505 510 Gln Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val Asn 515 520 525 Asp Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu Asn Cys Thr 530 535 540 Cys Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro Val Asp Gln 545 550 555 560 Cys Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly Asp Ser Trp 565 570 575 Glu Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys Tyr Gly Arg 580 585 590 Gly Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr Pro Ser Ser 595 600 605 Ser Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser Gln Pro Asn 610 615 620 Ser His Pro Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His Ile Ser Lys 625 630 635 640 Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Lys Asn Ser Val Gly Arg Trp Lys Glu 645 650 655 Ala Thr Ile Pro Gly His Leu Asn Ser Tyr Thr Ile Lys Gly Leu Lys 660 665 670 Pro Gly Val Val Tyr Glu Gly Gln Leu Ile Ser Ile Gln Gln Tyr Gly 675 680 685 His Gln Glu Val Thr Arg Phe Asp Phe Thr Thr Thr Ser Thr Ser Thr 690 695 700 Pro Val Thr Ser Asn Thr Val Thr Gly Glu Thr Thr Pro Phe Ser Pro 705 710 715 720 Leu Val Ala Thr Ser Glu Ser Val Thr Glu Ile Thr Ala Ser Ser Phe 725 730 735 Val Val Ser Trp Val Ser Ala Ser Asp Thr Val Ser Gly Phe Arg Val 740 745 750 Glu Tyr Glu Leu Ser Glu Glu Gly Asp Glu Pro Gln Tyr Leu Asp Leu 755 760 765 Pro Ser Thr Ala Thr Ser Val Asn Ile Pro Asp Leu Leu Pro Gly Arg 770 775 780 Lys Tyr Ile Val Asn Val Tyr Gln Ile Ser Glu Asp Gly Glu Gln Ser 785 790 795 800 Leu Ile Leu Ser Thr Ser Gln Thr Thr Ala Pro Asp Ala Pro Pro Asp 805 810 815 Thr Thr Val Asp Gln Val Asp Asp Thr Ser Ile Val Val Arg Trp Ser 820 825 830 Arg Pro Gln Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Val Tyr Ser Pro Ser 835 840 845 Val Glu Gly Ser Ser Thr Glu Leu Asn Leu Pro Glu Thr Ala Asn Ser 850 855 860 Val Thr Leu Ser Asp Leu Gln Pro Gly Val Gln Tyr Asn Ile Thr Ile 865 870 875 880 Tyr Ala Val Glu Glu Asn Gln Glu Ser Thr Pro Val Val Ile Gln Gln 885 890 895 Glu Thr Thr Gly Thr Pro Arg Ser Asp Thr Val Pro Ser Pro Arg Asp 900 905 910 Leu Gln Phe Val Glu Val Thr Asp Val Lys Val Thr Ile Met Trp Thr 915 920 925 Pro Pro Glu Ser Ala Val Thr Gly Tyr Arg Val Asp Val Ile Pro Val 930 935 940 Asn Leu Pro Gly Glu His Gly Gln Arg Leu Pro Ile Ser Arg Asn Thr 945 950 955 960 Phe Ala Glu Val Thr Gly Leu Ser Pro Gly Val Thr Tyr Tyr Phe Lys 965 970 975 Val Phe Ala Val Ser His Gly Arg Glu Ser Lys Pro Leu Thr Ala Gln 980 985 990 Gln Thr Thr Lys Leu Asp Ala Pro Thr Asn Leu Gln Phe Val Asn Glu 995 1000 1005 Thr Asp Ser Thr Val Leu Val Arg Trp Thr Pro Pro Arg Ala Gln Ile 1010 1015 1020 Thr Gly Tyr Arg Leu Thr Val Gly Leu Thr Arg Arg Gly Gln Pro Arg 1025 1030 1035 1040 Gln Tyr Asn Val Gly Pro Ser Val Ser Lys Tyr Pro Leu Arg Asn Leu 1045 1050 1055 Gln Pro Ala Ser Glu Tyr Thr Val Ser Leu Val Ala Ile Lys Gly Asn 1060 1065 1070 Gln Glu Ser Pro Lys Ala Thr Gly Val Phe Thr Thr Leu Gln Pro Gly 1075 1080 1085 Ser Ser Ile Pro Pro Tyr Asn Thr Glu Val Thr Glu Thr Thr Ile Val 1090 1095 1100 Ile Thr Trp Thr Pro Ala Pro Arg Ile Gly Phe Lys Leu Gly Val Arg 1105 1110 1115 1120 Pro Ser Gln Gly Gly Glu Ala Pro Arg Glu Val Thr Ser Asp Ser Gly 1125 1130 1135 Ser Ile Val Val Ser Gly Leu Thr Pro Gly Val Glu Tyr Val Tyr Thr 1140 1145 1150 Ile Gln Val Leu Arg Asp Gly Gln Glu Arg Asp Ala Pro Ile Val Asn 1155 1160 1165 Lys Val Val Thr Pro Leu Ser Pro Pro Thr Asn Leu His Leu Glu Ala 1170 1175 1180 Asn Pro Asp Thr Gly Val Leu Thr Val Ser Trp Glu Arg Ser Thr Thr 1185 1190 1195 1200 Pro Asp Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Thr Thr Thr Pro Thr Asn Gly Gln 1205 1210 1215 Gln Gly Asn Ser Leu Glu Glu Val Val His Ala Asp Gln Ser Ser Cys 1220 1225 1230 Thr Phe Asp Asn Leu Ser Pro Gly Leu Glu Tyr Asn Val Ser Val Tyr 1235 1240 1245 Thr Val Lys Asp Asp Lys Glu Ser Val Pro Ile Ser Asp Thr Ile Ile 1250 1255 1260 Pro Ala Val Pro Pro Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro 1265 1270 1275 1280 Asp Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr 1285 1290 1295 Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala 1300 1305 1310 Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu 1315 1320 1325 Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln 1330 1335 1340 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser 1345 1350 1355 1360 Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val 1365 1370 1375 His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His 1380 1385 1390 His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His 1395 1400 1405 Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr 1410 1415 1420 Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu 1425 1430 1435 1440 Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val 1445 1450 1455 Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala 1460 1465 1470 Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn 1475 1480 1485 Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr 1490 1495 1500 Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala 1505 1510 1515 1520 Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile 1525 1530 1535 Asn Tyr Arg Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Gln Met Gln Val Thr Asp 1540 1545 1550 Val Gln Asp Asn Ser Ile Ser Val Lys Trp Leu Pro Ser Ser Ser Pro 1555 1560 1565 Val Thr Gly Tyr Arg Val Thr Thr Thr Pro Lys Asn Gly Pro Gly Pro 1570 1575 1580 Thr Lys Thr Lys Thr Ala Gly Pro Asp Gln Thr Glu Met Thr Ile Glu 1585 1590 1595 1600 Gly Leu Gln Pro Thr Val Glu Tyr Val Val Ser Val Tyr Ala Gln Asn 1605 1610 1615 Pro Ser Gly Glu Ser Gln Pro Leu Val Gln Thr Ala Val Thr Asn Ile 1620 1625 1630 Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile 1635 1640 1645 Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val 1650 1655 1660 Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile His Glu Leu Phe Pro Ala Pro 1665 1670 1675 1680 Asp Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser 1685 1690 1695 Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln 1700 1705 1710 Pro Leu Ile Gly Thr Gln Ser Thr Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu 1715 1720 1725 Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro 1730 1735 1740 Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu 1745 1750 1755 1760 Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser 1765 1770 1775 Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val 1780 1785 1790 Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val 1795 1800 1805 Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp 1810 1815 1820 Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr 1825 1830 1835 1840 Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro 1845 1850 1855 Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly 1860 1865 1870 Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp 1875 1880 1885 Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp 1890 1895 1900 Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu 1905 1910 1915 1920 Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys 1925 1930 1935 Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg 1940 1945 1950 Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu 1955 1960 1965 Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro 1970 1975 1980 Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu 1985 1990 1995 2000 Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr 2005 2010 2015 Val Gln Lys Thr Pro Phe Val Thr His Pro Gly Tyr Asp Thr Gly Asn 2020 2025 2030 Gly Ile Gln Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gln Gln Pro Ser Val Gly Gln 2035 2040 2045 Gln Met Ile Phe Glu Glu His Gly Phe Arg Arg Thr Thr Pro Pro Thr 2050 2055 2060 Thr Ala Thr Pro Ile Arg His Arg Pro Arg Pro Tyr Pro Pro Asn Val 2065 2070 2075 2080 Gly Glu Glu Ile Gln Ile Gly His Ile Pro Arg Glu Asp Val Asp Tyr 2085 2090 2095 His Leu Tyr Pro His Gly Pro Gly Leu Asn Pro Asn Ala Ser Thr Gly 2100 2105 2110 Gln Glu Ala Leu Ser Gln Thr Thr Ile Ser Trp Ala Pro Phe Gln Asp 2115 2120 2125 Thr Ser Glu Tyr Ile Ile Ser Cys His Pro Val Gly Thr Asp Glu Glu 2130 2135 2140 Pro Leu Gln Phe Arg Val Pro Gly Thr Ser Thr Ser Ala Thr Leu Thr 2145 2150 2155 2160 Gly Leu Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Asn Val Ile Val Glu Ala Leu Lys 2165 2170 2175 Asp Gln Gln Arg His Lys Val Arg Glu Glu Val Val Thr Val Gly Asn 2180 2185 2190 Ser Val Asn Glu Gly Leu Asn Gln Pro Thr Asp Asp Ser Cys Phe Asp 2195 2200 2205 Pro Tyr Thr Val Ser His Tyr Ala Val Gly Asp Glu Trp Glu Arg Met 2210 2215 2220 Ser Glu Ser Gly Phe Lys Leu Leu Cys Gln Cys Leu Gly Phe Gly Ser 2225 2230 2235 2240 Gly His Phe Arg Cys Asp Ser Ser Arg Trp Cys His Asp Asn Gly Val 2245 2250 2255 Asn Tyr Lys Ile Gly Glu Lys Trp Asp Arg Gln Gly Glu Asn Gly Gln 2260 2265 2270 Met Met Ser Cys Thr Cys Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu Phe Lys Cys 2275 2280 2285 Asp Pro His Glu Ala Thr Cys Tyr Asp Asp Gly Lys Thr Tyr His Val 2290 2295 2300 Gly Glu Gln Trp Gln Lys Glu Tyr Leu Gly Ala Ile Cys Ser Cys Thr 2305 2310 2315 2320 Cys Phe Gly Gly Gln Arg Gly Trp Arg Cys Asp Asn Cys Arg Arg Pro 2325 2330 2335 Gly Gly Glu Pro Ser Pro Glu Gly Thr Thr Gly Gln Ser Tyr Asn Gln 2340 2345 2350 Tyr Ser Gln Arg Tyr His Gln Arg Thr Asn Thr Asn Val Asn Cys Pro 2355 2360 2365 Ile Glu Cys Phe Met Pro Leu Asp Val Gln Ala Asp Arg Glu Asp Ser 2370 2375 2380 Arg Glu 2385 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Thr Thr Pro Asp Ile Thr Gly Tyr Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Gly Asp Phe Gln Phe Asn Ile Ser Arg 1 5

Claims (23)

1) 피검자의 혈액 시료 및 대조군 혈액 시료의 단백질을 펩티드 절편으로 만드는 단계;
2) 상기 펩티드 절편을 삼중 사극자 질량분석기에 주입하여 파이브로넥틴을 대표하는 서열 번호 2의 서열을 가지며, 타깃 펩티드의 어미이온과 딸이온은 각각 m/z 555.8과 m/z 821.4인 타깃 펩티드에 대해 다중 반응 모니터링을 수행하는 단계;
3) 상기 다중 반응 모니터링 결과를 내부 표준물질에 대한 비율로 표시하는 단계; 및
4) 피검자와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring)을 통해 혈액 시료에서 서열 번호 1의 서열을 갖는 파이브로넥틴을 선택적으로 검출하는 방법.

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제1항에 있어서, 내부 표준물질로서 대장균 베타-갈락토시다아제가 사용되며 대장균 베타-갈락토시다아제를 대표하는 타깃 펩티드는 서열 번호 3의 서열을 가지며 어미이온과 딸이온은 각각 m/z 542.3과 m/z 636.3인 것을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 시료는 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.

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상기 제1항의 검출방법을 이용하여 혈액 시료에서 파이브로넥틴을 검출하기 위해 필요한 파이브로넥틴의 타깃 펩티드 및 타깃 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍에 대한 정보를 포함하는 유방암 진단 키트.

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