KR101311718B1

KR101311718B1 - 대장암 진단용 단백질 마커 ｒｐｅ-스폰딘 및 이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단 키트

Info

Publication number: KR101311718B1
Application number: KR1020110066457A
Authority: KR
Inventors: 이철주; 신지혜; 김혜정; 염정훈; 김호근
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2011-07-05
Filing date: 2011-07-05
Publication date: 2013-09-25
Also published as: KR20130005088A

Abstract

본 발명은 RPE-스폰딘 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 RPE-스폰딘 검출 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른, RPE-스폰딘 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 RPE-스폰딘 검출 방법에 의하면, 환자의 혈장을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 생검을 이용하지 않고 혈장을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 대장암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

대장암 진단용 단백질 마커 ＲＰＥ-스폰딘 및 이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단 키트{Protein marker RPE-spondin for colon cancer diagnosis and diagnosis kit for colon cancer using antibodies against the same}

본 발명은 RPE-스폰딘 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 RPE-스폰딘 검출 방법에 관한 것이다.

대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 2008년 우리나라에서는 연 1,788,160건의 암이 발생하였는데, 그 중 대장암은 남녀를 합쳐서 연평균 22,710건 발생하여 전체 암 발생의 12.7%로 3위를 차지하였다. 인구 10만명당 조발생률은 41.8건이다. 또한 1999년 이후 2008년까지 연령표준화발생 추이를 살펴보면 남성의 경우 6.9%, 여성의 경우 5.2% 연간증가율을 나타낸다(2008 국가암등록통계, 중앙암등록본부 발간, 2010년).

대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관 및 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생비는 결장암은 여자, 직장암은 남자에서 다소 높게 나타난다.

대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행된다. 수술적 요법, 항암화학요법 및 방사선요법 등의 진보에도 불구하고 특정한 증상이 없이 진행되는 대장암의 특성으로 인해 다른 장기로 전이된 후 진단되어 수술시점을 놓친 경우에는 사망률이 높은 것으로 알려져 있다. 5년 평균생존율은 1기의 경우 90% 이상, 2기의 경우 70% 이상, 3기의 경우 50% 이상이고 4기의 경우에는 5% 이하로 나타나는 것으로 알려져 있어, 대장암을 조기에 발견하고 치료할수록 생존율이 현저히 증가하는 것을 알 수 있다. 따라서, 대장암의 조기 진단 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

대장암의 진단은 대장과 관련된 증세를 보이는 환자에게 직장 수지검사(rectal digital examination), 분변 잠혈검사(fecal occult blood test) 및 대장조영술에 의해 수행되고 있으며, 필요에 따라 결장경검사를 통한 조직검사가 행해진다. 현재 이용 가능한 가장 조기의 검출방법은 분변혈에 대한 시험 또는 내시경 과정을 수반한다. 그러나, 분변혈이 검출되면 일반적으로 종양 크기가 상당하다. 잠혈 기준(guaiac-based)의 분변 검사의 감수성 역시 26%로, 이는 악성 병변이 있는 74%의 환자가 검출되지 않음을 의미한다(Ahlquist et al., Gastroenterol . Clin . North Am. 26: 41-55, 1997). 전암성 및 암성 병변의 시각화는 조기 검출에 대한 최선의 접근법이지만, 결장내시경은 상당한 비용뿐만 아니라 환자에게 고통과 위험을 초래할 수 있다는 문제점이 있다(Silvis et al., JAMA 235: 928-930, 1976; Geenen et al., Am . J. Dig . Dis. 20: 231-235, 1975; Anderson et al., J. Natl . Cancer Institute 94: 1126-1133, 2002).

상기와 같은 종래의 방법들은 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라, 대장암이 발병하기 이전의 환자들에 대한 조기 진단이 불가능하며, 피검체들에게 불편을 주는 문제점이 있다. 이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 환자의 혈장에서 종양 표지자(marker)의 농도를 측정하여 대장암을 진단하려는 시도를 하고 있다(Clinton et al., Biomed . Sci . Instrum. 39: 408-414, 2003; Rui et al., Proteomics 3: 433-439, 2003; Soletormos et al., Dan . Med . Bull. 48: 229-255, 2001).

현재, 태아성암항원(CEA), 종양-연관 당단백질을 근거로 한 진단적 혈장 시험만이 대장암 분야에서의 진단 보조에 이용가능하다. 하지만 CEA는 비-악성 질환을 가진 환자에서도 보고되었다(Herrera et al., Ann . Surg. 183: 5-9, 1976). 또한 초기 대장암환자 혈청에서 대부분의 경우 낮은 농도의 CEA 수준을 나타내어 조기진단에 어려움이 있다(Carriquiry et al., Dis . Colon Rectum 42: 921-929, 1999). 대장암 재발 환자에서의 혈청 또는 혈장으로부터 측정된 CEA의 이용은 보고 상 논란의 여지가 있으며, 아직 널리 적용되지 못하고 있다(Martell et al., Int . J. Biol . Markers 13: 145-149, 1998; Moertel et al., JAMA 270: 943-947, 1993).

한편, RPE-스폰딘은 트롬보스폰딘 단백질계(thrombospodin family)로 8번 염색체의 ORF의 84 번째에 위치한 단백질이다. 1 소마토메딘-B(Somatomedin-B) 영역과 1 트롬보스폰딘 타입-1(Trombospondin type-1) 영역을 가지고 있는 점착성 당단백질로 알려져 있다(Schulz HL., Cytogenet Genome Res. 106: 74-81, 2004). 그러나, 세포 외부 지역(extracellular region)에서 존재하는 것 외에, 이들의 역할과 기능에 대해선 보고된 바가 전혀 없다.

일 구체예는 RPE-스폰딘을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 바이오 마커를 제공하는 것이다.

다른 구체예는 RPE-스폰딘 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 대장암 진단 키트를 제공하는 것이다.

또 다른 구체예는 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는데 사용하기 위하여 RPE-스폰딘을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RPE-스폰딘을 유효성분으로 포함하는 대장암 진단용 바이오 마커를 제공한다.

본 발명자들은 대장암에 특이적으로 양적 변화를 나타내는 표지 단백질을 발굴하기 위하여, 대장암 조직과 정상 조직의 단백체의 증감을 확인하고, 혈장으로 이동할 확률이 높은 세포주 분비단백체를 동정한 뒤, 혈장 단백질 마커 후보들을 검색한 결과, RPE-스폰딘를 신규한 대장암 진단용 바이오 마커로 동정하였다.

RPE-스폰딘(RPE-spondin)은 약 37 kD의 분자량을 갖는 트롬보스폰딘 계 단백질 중 하나로서, RPESP, C8orf84, FLJ40021와 동일한 단백질이며, 점착성 당 단백질로 알려져 있으나, 역할과 기능에 대해선 알려진 바가 없다. RPE-스폰딘이 암의 진행과 관련되어 있다고 보고된 연구는 없으며, 특히, 혈액 내에서 상기 단백질이 검출된 전례가 전무한 실정으로, 이들을 대장암의 진단 마커로 이용하는 것은 본 발명이 최초이다. 또한, 상기 단백질은 혈장에서 검출이 가능하기 때문에 생검(biopsy)을 통해서만 진단이 가능하던 기존의 단백질과는 달리 환자에게 불편을 초래하지 않으면서 간편한 방법으로 대장암을 진단하는데 활용될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 RPE-스폰딘은 대장암이 발병된 개체의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 발현이 상대적으로 증가하는 것일 수 있다. 따라서, 정상 개체와 대장암이 발병되거나, 의심되는 개체의 혈액, 혈장 또는 혈청을 채취하여, 하기 설명될 대장암 진단용 키트 및 RPE-스폰딘의 검출 방법에 따라 상기 RPE-스폰딘의 발현양을 비교할 수 있기 때문에, 상기 RPE-스폰딘을 바이오 마커로서 사용할 수 있다. 상기 개체는 예를 들면, 사람 또는 사람을 제외한 포유 동물일 수 있다.

다른 양상은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RPE-스폰딘 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 대장암 진단 키트를 제공한다.

또 다른 양상은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RPE-스폰딘 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 대장암이 의심되는 개체의 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 생물학적 시료로부터 RPE-스폰딘을 검출하는 단계를 포함하는, 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는데 사용하기 위하여 RPE-스폰딘을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 RPE-스폰딘을 검출하는 방법은 상기 대장암 진단 키트를 이용하는 것이므로, 이하, 함께 설명하도록 한다.

상기 단백질의 단편은 예를 들어, 면역원성 단편일 수 있으며, 이는 상기 바이오마커 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 바이오마커 단백질의 단편을 의미한다. 일 구체예에 따르면, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있으나, 단일클론 항체를 사용하는 것이 가장 바람직하다.

상기 폴리클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유 동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다.

상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 적당량(약 10 ㎍)을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제할 수 있다. 또는, 상기 단일클론 항체는 상업적으로 판매되는 RPE-스폰딘에 대한 항체를 입수하여 사용할 수 있다.

일 구체예에 따른 대장암 진단 키트는 당업자에 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 전형적으로 동결 건조 형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

상기 키트는 예를 들어, 면역분석에 사용될 수 있으며, 상기 RPE-스폰딘 검출 방법은 면역분석에 기초한 방법을 설명한 것이다. 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예를 들어, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 표지된 항체가 RPE-스폰딘을 검출하는 데 이용될 수 있다.

상기 키트가 예를 들어, ELISA 방법을 이용하도록 제작되는 경우, 상기 키트를 이용한 특정 실시예는 (i) 정상인 개체와 대장암이 의심되는 개체의 혈액 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 RPE-스폰딘 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 혈액 시료를 접촉시켜 항원-항체 반응을 유도시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예를 들어, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 겔이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

상기 키트가 예를 들어, 캡처-ELISA 방법을 이용하도록 제작되는 경우, 상기 키트를 이용한 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 RPE-스폰딘 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 대장암이 의심되는 개체의 혈액 시료를 접촉시켜 항원-항체 반응을 유도하는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고, RPE-스폰딘에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 표지로부터 발생하는 시그널을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지를 가질 수 있다. 상기 표지는 화학물질(예를 들어, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질(예를 들어, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵), 형광물질(예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 RPE-스폰딘의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 표지로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

한편, 상기 키트는 RPE-스폰딘 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 마이크로칩 상에 고정시킨 후, 개체로부터 분리된 생물학적 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 마이크로칩 및 자동화된 마이크로어레이 시스템(microarray system)으로 제작되어, 한 번의 분석으로 대량의 시료를 분석할 수도 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 대장 세포 및 대장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, RPE-스폰딘의 검출 대상이 되는 개체의 혈액, 혈장 또는 혈청인 것이 바람직하다.

한편, 상기 RPE-스폰딘 검출 방법은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는 것일 수 있다. 즉, 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 대장암을 진단할 수 있다. 예를 들어, 대장암이 의심되는 개체의 시료(예를 들어, 혈액)에서 RPE-스폰딘에 대한 시그널이 정상 개체의 시료보다 강하게 나오는 경우에는 대장암으로 진단될 수 있다.

일 구체예에 따른, RPE-스폰딘 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 RPE-스폰딘 검출 방법에 의하면, 환자의 혈장을 이용하는 새로운 면역학적 진단 도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 생검을 이용하지 않고 혈장을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 대장암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 대장암 3기 환자 3명을 수술 후 적출한 암 조직과 동일한 수술 부위에서 암세포가 없는 정상 조직의 단백체를 탠덤 질량 분석기를 이용해 상대 정량 하는 mTRAQ과 ICAT실험에서 동정된 조직 단백체 개수와 세포주 분비 단백체에서 동정된 단백체 개수를 밴다이어그램으로 나타낸 것으로, 이 중에서 세포주 분비 단백체에서만 동정된 325개의 단백체를 HUMAN PROTEIN ATLAS(HPA)에서 조직 내 증감을 예상하였다는 것을 나타낸 도면이다.
도 2는 대장암 세포주(HCT-8, HCT-116) 분비단백체로부터 얻은 다양한 트립틱 펩티드들 중에서 탠덤 질량 분석기로 분석하여 RPE-스폰딘을 동정한 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도　3는 상기 도 2에서 동정된 결과를 토대로 HUMAN PROTEIN ATLAS(HPA)에서 RPE-스폰딘을 검색하여 얻은 정상 대장 조직의 면역조직화학염색법 이미지(A)와 대장암 조직의 면역조직화학염색법 이미지(B)를 나타낸 것이다.
도 4는 대장암 세포주(HCT-8, HCT-116)의 세포용해액과 분비 단백체를 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동한 후 항-RPE-스폰딘 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과이다.
도 5는 비환자(정상) 대조군의 혈장과 췌장염, 담관 결석 등 대장 관련 질환 환자군, 대장 선암 환자군, 병기별 대장암 환자군의 혈장을 각각 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동한 후 항-RPE-스폰딘 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 상기 도 5의 면역블롯팅에 의해 측정된 RPE-스폰딘 항원 농도의 평균을 각 병기별(A), 비환자(정상) 대조군과 대장암 환자군별(B)로 통계 처리하여 나타낸 것이다.
도 7은 상기 도 6의 B에서 얻은 RPE-스폰딘의 항원 농도를 현재 상용화된 마커인 태아성암항원(CEA)와 비교하여 수용자-조작 특성(ROC: receiver operating characteristic) 그래프로 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 대장암 세포주 분비 단백체 동정과 면역블롯팅을 이용한 세포주 분비 단백체 내에서의 RPE-스폰딘의 검출

실시예 1-1: 대장암 세포주 분비 단백체의 수득

대장암 조직 내에서 증감을 나타내는 단백질 중 혈장에서 검출되는 마커 후보 물질을 선별하기 위해 대장암 세포주 분비 단백체를 수득하였다. 대장암 세포주로는 HCT-8과 HCT-116를 선정하였다. 전자의 경우 림프절 전이나 다른 장기 전이가 일어나지 않은 대장암 세포주이고, 후자의 경우 림프절 전이와 다른 장이 전이가 진행된 대장암 세포주이다. 상기의 세포주를 각각 40개의 플레이트에 배양하여 대장암 세포가 약 70% 성장하였을 때, 혈청이 없는 배지(serum-free media, SFM)로 여러 차례 세척해준 후, 세포주 분비 단백체의 양을 고려해 HCT-8은 12시간, HCT-116은 10시간 혈청이 없는 배지로 37℃, 5% CO₂에서 배양하여 CM(conditioned media)를 얻고, 시료 속에 포함된 단백질 분해효소에 의한 시료의 분해를 저해하기 위해 단백질 분해효소 저해제로 2 mM의 페닐메탄 술포닐플루오라이드(phenylmethane sulfonylfluoride, PMSF)와 1 mM EDTA를 첨가하였다. 일부 함께 수득된 세포를 제거하기 위해, 4℃에서 10분 동안 400 × g로 원심 분획하여 상층액만 취하고, 이 시료를 0.2 ㎛ 실린지 필터(Milipore 사)를 이용하여 남아있는 잔해를 걸러주었다. 이후, 10 kD이상의 단백질을 수득할 수 있는 Amicon-Ultra 15 필터(Milipore 사)를 이용하여 4℃에서 4000 × g로 원심 분획하며 시료를 고농축하였다. 상기의 시료가 250 ㎕로 농축되면, 8 M 우레아, 75 mM NaCl, 50 mM Tris가 포함된 단백질 분해 완충용액(pH 8.2)으로 단백질 녹이고, 아세톤으로 침전시킨 후, 상기의 완충용액으로 다시 녹여내었다.

실시예 1-2: 액체 상태에서의 펩티드 절편화(in-solution digestion) 및 분획

상기의 대장암 세포주 분비 단백체를 액체 상태에서 다수의 펩티드 절편으로 분해하기 위해, 먼저 5 mM이 되도록 DTT를 첨가하여 56℃에서 25분 동안 반응시켜 이황화 결합을 환원시켰다. 이후, 알킬화를 위해 14 mM가 되도록 아이오도아세트아미드(iodoacetamide, IAA)를 가하여 암조건의 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이 후, 절편화 시에 우레아의 농도를 1.6 M 이하로 낮춰주기 위해, 25 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.2)으로 5배 희석하고, 1 mM이 되도록 CaCl₂ 용액을 첨가하였다. 펩티드 절편화는 시퀀싱이 가능한 수준의 트립신(Promega 사)으로 단백질과 트립신의 질량 비율이 200:1이 되도록 첨가한 후, 37℃에서 16시간 동안 처리하고, 0.4%가 되도록 TFA 용액을 가하여 pH 2.0 이하로 산성화시켜 펩티드 절편으로 분리하였다. 더 많은 단백체를 동정하기 위해 OFFGEL(Agilent 사)를 통해 등전점에 따라 펩티드 절편을 13가지 분획으로 나누어, C₁₈ SPE 카트리지(Waters 사)로 염을 제거한 후, 진공상태로 건조시켰다.

실시예 1-3: 액체 크로마토그래피와 탠덤 질량 분석

질량분석기를 이용해 상기 시료의 단백체를 프로파일링하였다. 건조된 상기의 시료를 0.4% 아세트산 용액으로 녹여 약 1 ㎍의 양으로 분주하고, 역상 MAGIC C18aq 컬럼(15 ㎝ ×75 ㎛, Eksigent MDLC system 사)에 300 nl/min의 유입량으로 주입하였다. 상기의 컬럼은 사용하기 전에 95% 완충용액 A(물에 용해한 0.1% 포름산 용액), 5% 완충용액 B(아세토니트릴에 용해한 0.1% 포름산 용액)으로 평형시켰고, 시료를 분석하기 전에 농도 구배 조건에 적응시키기 위해 여러 번 농도 구배 과정을 거쳤다. OFFGEL을 이용해 분획을 나눈 펩티드 시료는 95분 동안 10%에서 40%까지 일정한 속도로 점진적 농도 구배가 일어나는 완충용액 B로 용출하였고, 분획하지 않은 전량시료는 45분 동안 상기와 같은 조건으로 용출하였다.

HPLC 장치와 결합되어 있는 LTQ XL 질량분석기(Thermo Scientific 사)의 분사 전압은 1.9 kV, 캐필러리 온도는 250 ℃로 지정하였다. MS 스펙트라는 300-2000 m/z에 해당하는 전체 질량 범위를 스캔하였다. MS/MS 스펙트라는 미리 조사된 어미이온의 전체 스캔이 수행될 때 동시에 상위 3위의 감도를 가지는 스펙트라를 파악하고, 해당 어미이온을 포집하여 딸이온의 스펙트라를 얻는 것이다. 데이터에 근거한 수득이 진행되는 동안 전하상태가 매치되지 않는 어미이온은 버려지게 된다. 또한 조직시료의 경우, 1가의 전하상태를 가지는 어미이온 역시 MS/MS 스캔에서 배재되었다. 데이터는 Xcalibur software v2.0.7를 사용하여 얻었다.

실시예 1-4: 데이터베이스 검색과 데이터 분석

탠덤 질량 분석기를 이용한 데이터는 Bioworks software(v3.2)의 Extract-msn program(v3)으로 하기의 매개변수를 통해 만들었다. 매개변수는 minimum ion count threshold를 15로, minimum intensity를 100으로 지정하였다. 이때, 배지에 남은 소량의 소의 혈청도 포함되었을 것이라 예상하여, 상기의 MS/MS 스펙트라는 SEQUEST(TurboSequest version 27, revision 12)를 사용해 약 80,000개의 단백질 엔트리를 가지는 Human International Protein Index database(IPI, versions 3.57, European Bioinformatics Institute, http://www.ebi.ac.uk/IPI)와 약 30,000개의 단백질 엔트리를 가지는 Bovine International Protein Index database(IPI, versions 3.42, European Bioinformatics Institute, http://www.ebi.ac.uk/IPI)가 결합된 database에 대하여 검색하였다. 이때, 옵션은 enzyme은 트립신, MS/MS의 mass tolerance는 3.0 Da, MS의 mass tolerance는 0.5 Da이었다. 고정된 수식화로는 시스테인 잔기에 45.9877 Da과 변동가능한 수식화로 메티오닌의 산화로 인한 +15.9949 Da을 지정하였다.

분비 단백체의 펩티드 동정은 Trans-Proteomic Pipeline(TPP, version 4.0, http://www.proteomecenter.org)를 이용하였다. 트립신 제한과 'monoisotopic masses' 옵션을 가한 pepXML 모듈을 입력하여 Sequest 검색 결과를 도출하였다. Peptide-Prophet은 'accurate mass binning' 옵션을 추가하고, probability가 0.5 이상인 것, Protein-Prophet은 probability가 0.95 이상인 것을 최종자료로 취하였다.

상기의 과정을 통해 총 1,155개의 단백체을 동정하였고, 이중 사람의 분비 단백체는 946개, 소의 혈청 단백체는 209개가 동정되었다. 상기 분비 단백체 946개를 SignalP, SecretomeP, TMHMM 프로그램을 이용하여 실제 세포에서 분비하는 단백체를 평균 61.4%(780개)로 예상할 수 있었다. 상기의 단백체 중 621개는 ICAT과 mTRAQ으로 조직 내 증감을 알 수 있으면서, 세포주 분비 단백체에서도 동정되었다. 도 2는 상기 과정에서 세포주 분비 단백체가 각각 트립신에 의해 절단된 펩티드들 중 탠덤 질량 분석 스펙트럼 결과를 나타낸 것으로, 이로부터 질량 분석기에 의해 동정된 단백질이 RPE-스폰딘임을 확인할 수 있었고, signalP 프로그램을 통하여 소포체와 골지체를 통하여 분비되는 classical secreted protein 임을 확인 할 수 있었다.

실시예 2: 대장암 조직 내에서 RPE-스폰딘의 in silico 정량 비교

HUMAN PROTEIN ATLAS(HPA)는 46가지 다른 부위의 정상 조직과 20가지 다른 암 조직의 면역조직화학염색법 자료를 모아놓은 데이터베이스이다. ICAT과 mTRAQ으로 조직 내 증감을 알 수 없는 325개의 세포주 분비 단백체(도 1)는 HPA를 이용해 조직 내 증감을 예상하였다.

상기의 325개의 단백질 중 HPA v6.0에 보고된 단백질은 199개였으며, 이 중에서 분비될 가능성이 높은 세포질과 세포막에 존재하는 단백질은 185개이었다. 상기 185개의 단백질 중 조직염색이 50% 이상 되어 참고 자료로 사용할 가치가 있는 단백질은 151개였다. 이중, 대장(colon) 정상 조직의 염색 점수가 음(negative)이거나 약(weak)인 경우가 32개, 다시 대장암(colon cancer) 조직의 염색 점수가 중(moderate)이거나 강(strong)인 경우는 18개 단백질에 해당하였다. 그 중에서도 대장암에서 특이적인 경우가 9가지 였고, 이 9가지 중에서 이미 Plasma Proteom Database(PPD)에 보고된 3가지의 단백질을 제외하고, 기존에 논문을 통해 보고된 경우와 항체의 사용여부를 따져 본 마커 후보 물질을 선정하였다. 상기의 과정을 통해, RPE-스폰딘을 정상인과 대장암 환자를 구별할 수 있는 단백질 마커 후보 물질로 선정하였다.

도 3의 A, B는 각각 HPA에 보고된 정상 대장 조직 및 대장암 조직의 RPE-스폰딘 면역조직화학염색법 이미지이다. 두 그림을 비교해보면, 정상 조직에서는 염색 점수가 약(weak)인데 반해, 대장암 조직에서는 12가지 조직에서 염색점수가 6가지 조직에서는 강(strong), 3가지 조직에서는 중(moderate), 2가지 조직에서는 약(weak)를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 면역블롯팅을 이용한 세포주 분비 단백체에서의 RPE-스폰딘의 검출

대장암 세포주의 세포 용해액(cell lysate)과 세포주 분비 단백체(secretome)에서의 RPE-스폰딘 발현수준을 면역블롯팅을 수행하여 대장암 세포주 및 세포주 분비단백체 내에서 검사하였다.

RPE-스폰딘에 대한 면역블롯팅은 대장암 세포주인 HCT-8과 HCT-116의 세포용해액과 세포주 분비 단백체 시료를 대상으로 수행하였다. 12%의 SDS 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동을 수행하여 검체에 포함된 단백질을 분자량에 따라 분리하였다. 분리된 단백질을 50 mM Tris-HCl, 130 mM 글리신, 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올이 포함된 완충용액 내에서 90 V, 300 mA의 조건에서 PVDF 멤브레인으로 전이시키고, 전이된 멤브레인을 5% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline Tween 20)에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PVDF 멤브레인에 RPE-스폰딘에 대한 항체(1:1000, Abnova 사)를 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 3회 세척하였고, 항-RPE-스폰딘의 마우스 면역글로불린과 결합하는 마우스 IgG-HRP(1:4000, GE Healthcare 사)로 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 다시 TBST로 3회 세척하였다. 이어서, 상기 PVDF 멤브레인을 ECLplus(enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience 사)와 반응시킨 후, X-ray 필름에 3 내지 5초 동안 감광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하였다.

도 4에서 나타낸 바와 같이, RPE-스폰딘를 선택적으로 인식하는 항체를 이용한 면역블롯팅 분석을 통해 대장암 세포주의 세포 용해액 및 세포주 분비단백체에 존재함을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 면역블롯팅을 이용한 혈장 내 RPE-스폰딘의 검출

실시예 4-1: 혈장 수득

대장암 환자의 혈장은 병기별(I기는 14명, II기는 16명, III기는 19명, IV기는 22명)로 준비하였고, 20명의 비환자대조군의 혈장을 수집하였다. 또한 암 이외에 11개의 아데노마(adenoma) 혈장과 췌장염, 담관 결석 등 대장 관련 질환을 앓고 있는 12명의 환자 혈장을 준비하였다. 각각 혈장을 40 ㎕씩 취하고, 혈장 단백질의 대부분을 차지하는 6종의 단백질인 알부민, 면역글로불린 A, 면역글로불린 G, 트랜스페린, 트립신 저해제 및 헵토글리빈을 제거하기 위해서 MARS(multiple affinity removal system, Agilent 사) 컬럼을 장착한 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 컬럼에 결합하지 않는 단백질 구획을 자외선 흡광도 280 ㎚로 추적하여 모으고, 컬럼에 결합한 단백질들을 제거하였다. 이와 같이 6종의 단백질이 대부분 제거된 구획을 모아 3 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질만을 농축하여 환자군에 따른 혈장 단백질 시료를 각각 준비하였다.

실시예 4-2: 면역블롯팅을 이용한 혈장 내 RPE-스폰딘의 검출

상기와 같이 준비된 혈장 단백질 시료 각 6 ㎍과 1% SDS가 포함된 완충용액을 혼합한 후, 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 분리된 혈장 단백질을 50 mM Tris-HCl, 130 mM 글리신, 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올이 포함된 완충용액 내에서 90 V, 250 mA의 조건에서 PVDF 멤브레인으로 전이시키고, 전이된 멤브레인을 5% 탈지분유가 함유된 TBST에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PVDF 멤브레인에 RPE-스폰딘에 대한 항체(1:1000, Abnova 사)를 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 다음, TBST로 3회 세척하였고, 항-RPE-스폰딘의 마우스 면역글로불린과 결합하는 마우스 IgG-HRP(1:4000, GE Healthcare 사)로 25℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 다시 TBST로 3회 세척하였다. 이어서, 상기 PVDF 멤브레인을 ECLplus(enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience 사)와 반응시킨 후, X-ray 필름에 3 내지 5초 동안 감광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하였다.

도 5는 상기와 같이 비환자 대조군의 혈장과 대장암 환자군의 혈장을 전기영동으로 분석한 후, 항-RPE-스폰딘 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과와 항원 농도를 그래프로 나타낸 것이다. 그 결과, RPE-스폰딘는 비환자 대조군의 혈장에 비하여 대장암 환자의 혈장에서 약 4.3배 증가함을 확인할 수 있었다. 도 7은 상기 도 6의 면역블롯팅에 의해 측정된 각 환자군별 항원 농도의 평균을 통계처리(A)한 것이며, 비교하기 쉽도록 비환자 대조군과 대장암 환자군의 항원 농도의 평균을 통계처리(B)하여 나타내었다.

실시예 4-3: 효소면역분석법(ELISA)을 이용한 혈장 내 태아성암항원(CEA)의 검출

혈장 내 태아성암항원(CEA)의 농도 검출은 상업적으로 이용 가능한 효소면역분석법(ELISA) 키트(Roche Diagnostics 사)를 사용하였고, 제조사의 프로토콜에 따라 실험하였다.

도 7은 상기 도 6에서 측정된 항원의 농도와 효소면역분석법(ELISA)을 이용한 혈장 내 태아성암항원(CEA)의 농도를 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 나타낸 것이다. ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전 범위에 걸친 판정 역치를 연속적으로 변화시켜 수득되는 모든 감수성/특이성 쌍의 그래프로 주로 시험의 정확도를 나타낸 것이다(Zweig et al., Clin . Chem. 39: 561-577, 1993). ROC 그래프에서 태아성암항원(CEA)의 AUC(area under the curve)는 0.818(SE 0.0498)인데 비해, RPE-스폰딘의 AUC(area under the curve)는 0.900 (SE 0.0491)로 상기 분석이 민감성과 정확성을 갖추고 있음을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 혈장 내에 RPE-스폰딘 선택적으로 인식하는 항체를 사용하여 각 항원의 농도를 측정하고 이를 비환자 대조군과 비교함으로써 상대적으로 증가한 RPE-스폰딘의 농도를 나타내는 피시험자를 대장암 환자로 진단할 수 있음을 확인하였다.

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서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RPE-스폰딘 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 대장암 진단 키트.
제3항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체 또는 폴리클론 항체인 것인 키트.
서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RPE-스폰딘 또는 상기 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 대장암이 의심되는 개체의 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및
상기 생물학적 시료로부터 RPE-스폰딘을 검출하는 단계를 포함하는, 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하는데 사용하기 위하여 RPE-스폰딘을 검출하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 대장 세포 및 대장 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체 또는 폴리클론 항체인 것인 방법.