KR20160074849A

KR20160074849A - 대장암에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20160074849A
Application number: KR1020140183440A
Authority: KR
Inventors: 안성수; 백정흠; 김세진
Original assignee: 가천대학교 산학협력단; (의료)길의료재단
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2016-06-29
Also published as: KR101702115B1

Abstract

본 발명은 대장암에 대한 신규한 분자 마커로서 아밀로이드 올리고머 형태의 p53을 제안한다. 본 발명의 마커는 혈액 마커로서 대장암을 편리하고, 신속 및 정확하게 진단하는데 이용될 수 있다.

Description

대장암에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도{Novel Biomarker Indicative of Colorectal Cancer and Their Uses}

본 발명은 대장암에 대한 신규 바이오마커(아밀로이드 올리고머 형태의 p53) 및 그의 용도에 관한 것이다.

대장은 입으로 섭취된 음식물의 소화, 흡수가 이루어지는 곳이며, 잉여 음식물이 머무르는 곳이기도 하다. 또한, 이곳에서 수분을 흡수하여 대변이 만들어 지고, 이와 더불어 여러 종류의 많은 세균이 서식하는 곳이기도 하다. 사람의 경우, 대장의 길이는 약 2 m 정도이고, 결장과 직장, 항문으로 구성되어 있다. 대장점막이 있는 곳이면 어디서나 암이 생기지만, 암이 생기기 쉬운 부위는 에스결장과 직장이다.

현재 우리나라에서 대장암 발생률은 매우 현저하게 증가하고 있고, 대장암에 의한 사망은, 남성의 경우 위암, 폐암, 간암에 이어 네 번째를 차지하고 있으며, 여성의 경우 또한 유사하다. 대장암 발생에 영향을 미치는 것으로는 유전인자보다도 환경인자의 비중이 크다고 여겨지고 있는데, 식생활의 급격한 서구화, 특히 동물성 지방이나 단백질의 과다섭취가 원인이라고 인식되고 있다. 그러나, 5% 전후의 대장암은 유전적 소인에 의해 발생한다고 알려져 있다.

대장암은 조기 발견 시 내시경적 절제나 외과적 치료에 의해 완전히 치유될 수 있으며, 진행되어 간이나 폐로 전이(원격전이) 되었더라도 수술이 가능한 시기라면 외과적 치료에 의한 완치를 기대할 수 있다. 그러나, 발견이 늦어지면 폐, 간, 림프 절이나 복막 등 절제하기 어려운 곳으로의 전이가 일어나기 때문에 상기의 경우처럼 외과적 치료를 사용할 수 없다.

이와 같이, 대장암은 조기인 경우라면 거의 100% 가까이 완치되지만, 일반적으로 자각증상이 없기 때문에 무증상인 시기에 발견하는 것이 매우 어렵고, 이에 따라 주기적인 검사가 선행되어야 한다. 대장암의 진단은 대장과 관련된 증세를 보이는 환자에게 직장 수지검사(rectal digital examination), 분변 잠혈검사(fecal occult blood test) 및 대장조영술에 의해 수행되고 있으며, 필요에 따라 결장경 검사를 통한 조직검사가 행해진다.

현재 이용 가능한 가장 조기의 검출방법은 분변혈에 대한 시험 또는 내시경 과정을 수반한다. 그러나, 분변혈이 검출되면 일반적으로 종양 크기가 상당하다. 잠혈 기준(guaiac-based)의 분변 검사의 감수성 역시 26%로, 이는 악성 병변이 있는 74%의 환자가 검출되지 않음을 의미한다(Ahlquist et al., Gastroenterol. Clin. North Am. 26: 41-55, 1997). 전암성 및 암성 병변의 시각화는 조기 검출에 대한 최선의 접근법이지만, 결장 내시경은 상당한 비용뿐만 아니라, 환자에게 고통과 위험을 초래할 수 있다는 문제점이 있다(Anderson et al., J. Natl. Cancer Institute 94: 1126-1133, 2002).

상기와 같은 종래의 방법들은 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라, 대장암이 발병하기 이전의 환자들에 대한 조기 진단이 불가능하며, 피검체들에게 불편을 주는 문제점이 있다. 이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로, 대장암을 조기에 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커에 대한 개발이 요구되고 있으며, 이에 따라 환자의 혈장에서 종양 표지자의 농도를 측정하여 대장암을 진단하려는 시도가 이루어지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 등록특허공보 제10-1311718호 대한민국 등록특허공보 제10-1212024호

본 발명자들은 대장암을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 혈액 내 아밀로이드 올리고머 형태의 p53을 검출하는 것으로, 대장암을 조기 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 대장암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 대장암 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 p53 상의 에피토프에 결합하여 인간의 생물학적 시료 내에 존재하는 모노머 형 또는 멀티머 형의 p53을 포획하는 포획 제제; 및 상기 포획 제제가 포획한 멀티머 형의 p53 중 아밀로이드 올리고머에 결합하는 검출 제제를 포함하고, 상기 포획 및 검출 제제는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 대장암을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 혈액 내 아밀로이드 올리고머 형태의 p53을 검출하는 것으로, 대장암을 조기 진단할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 사용된 표현, "대장암 진단용 키트"는 대장암 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "대장암 진단용 키트"는 "대장암 진단용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용 가능하다.

본 명세서에서 사용된 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 대장암의 단계 결정 또는 치료에 대한 반응성 예측)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

대장암은 대장에 생긴 암세포로 이루어진 각종 악성종양을 의미하는데, 본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 채취한 시료로부터 대장암의 발병 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 명세서에서 사용된 용어, "대장암 진단 마커 혹은 대장암 마커"란 대장암을 진단할 수 있는 물질로, 정상인에 비하여 대장암이 발병한 개체에서 감소 양상을 보이는 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 대장암 진단 마커는 멀티머 형의 p53 중 아밀로이드 올리고머 형태의 p53이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "모노머 형(monomer form)의 p53"은 일반적인 단일 분자로서의 p53을 의미하고, 용어 "멀티머 형(multimer form)의 p53"은 모노머 형의 p53이 둘 이상 포함된 p53 복합체를 의미한다. p53은 세포의 이상증식이나 돌연변이가 일어나지 않도록 막아주는 대표적인 암 억제 단백질인데(이의 아미노산 서열은 서열목록 제1서열에 나타내었다), 돌연변이가 발생하면 경우에 따라 모노머 형의 p53이 서로 뭉쳐 다이머(dimer), 테트라머(tetramer) 또는 피브릴(fibril) 등을 형성할 수 있고, 나아가 프리온과 유사한 아밀로이드 올리고머(amyloid oligomer)를 형성할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "아밀로이드 올리고머 또는 아밀로이드 올리고머 형태의 p53"은 p53, 또는 p53과 p53 패밀리에 속하는 p63과 p73이 함께 응집하여 형성한 아밀로이드 형태의 응집체를 의미한다. 구조적으로 불안정한 p53 돌연변이 단백질은 응집(aggregation) 경향이 높아지고, p53 돌연변이 단백질은 단백질의 미스폴딩(misfolding)을 유도할 뿐 아니라, 야생형 p53은 물론 p53 패밀리에 속하는 p63과 p73과도 공동응집(coaggregation)을 유도한다고 보고된바 있다(Xu, Jie, et al. Nature chemical biology 7.5 (2011): 285-295). 또한, 인 비트로에서 돌연변이 p53C(p53 central domain)에 의해 유도된 p53 올리고머는 아밀로이드 올리고머 또는 피브릴 응집체(fibrillar aggregates)에 결합하는 Thioflavin T 결합실험을 통해서 아밀로이드 형태가 증명되었고, 형태가 TEM을 통해 확인된바 있다(MLA Bom, Ana PD Ano, et al. Journal of Biological Chemistry 287.33 (2012): 28152-28162). 또한, p53 올리고머는 야생형 p53의 응집을 유도하는 마치 프리온 단백질과 같은 효과를 가지는 것으로 보고된바 있다.

이러한 아밀로이드 올리고머 형태의 p53은 상업적으로 입수가능한 아밀로이드 올리고머를 인지하는 항체(예컨대, A11 항체)를 사용하여 검출할 수 있다. 상기 아밀로이드 올리고머를 인지하는 항체는, 단백질 또는 펩타이드의 올리고머를 염기서열과 무관하게 인식할 수 있으며, 단백질 또는 펩타이드의 모노머와 피브릴(fibril)은 인식하지 않는다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 대장암 마커(멀티머 형의 p53 중 아밀로이드 올리고머)를 검출하는데 사용될 수 있다.

이 경우, 대장암 마커의 검출은, p53 상의 에피토프에 결합하여 모노머 형 또는 멀티머 형의 p53을 포획하는 포획 제제, 및 멀티머 형의 p53 중 아밀로이드 올리고머에 결합하는 검출 제제를 이용하여 실시할 수 있다. 이 경우 생물학적 시료 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 p53을 검출할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 본 발명의 마커 또는 상기 마커의 구성 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 새로운 대장암 진단 마커가 규명되었으므로, 모노머 형 또는 멀티머 형의 p53(마커 단백질 항원)을 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지,소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6:511-519, 1976 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 키트는 통상적인 면역분석 방법에 적용되어 대장암을 진단하는데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석 방법은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법으로서, 면역분석 포맷은 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 샌드위치 엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있다.

상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 키트가 방사능면역분석 방법에 적용되는 경우, 키트 내의 검출 제제는 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 샌드위치 ELISA에 적용되어 대장암 마커를 검출하는데 활용될 수 있다. 특정예에서, 이러한 샌드위치 ELISA는 (a) 포획 항체로서 p53 상의 에피토프에 결합 가능한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (b) 포획 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; (c) 단계 (b)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 상기 포획 항체가 포획한 멀티머 형의 p53 중 아밀로이드 올리고머에 결합 가능한 검출 항체와 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질, 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자, 바람직하게는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al. Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cellcycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 대장암을 진단할 수 있다. 구체적으로, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 약하게 나오는 경우에는 대장암으로 진단할 수 있고(실시예 2 및 도 2 참조), 염을 처리한 생물학적 시료에서 얻은 마커에 대한 시그널이 염을 처리하지 않은 생물학적 시료에서 얻은 마커에 대한 시그널 보다 약하게 나오는 경우 대장암으로 진단할 수 있다(실시예 2 및 도 3 참조).

상술한 바와 같이, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 예를 들어 본 발명의 키트는 ELISA 키트이다. 이 경우, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 염(예컨대, NaCl, KCl 등)이 처리된 시료이다. 상기 염은 시료에 존재하는 멀티머 형의 p53 중 p53 테트라머의 구조를 분해하는 역할을 하게 된다. 따라서, 상기 염은 p53 테트라머의 구조를 분해하는데 충분한 농도로 시료에 처리될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 멀티머 형의 p53 중 아밀로이드 올리고머의 존재여부 또는 양을 측정하는 단계를 통하여 대장암 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 대장암 마커를 검출하는 방법과 상기 대장암 진단용 키트는 동일한 마커를 사용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명은 대장암을 의사의 소견에 의한 판단이 아니라, 분자 진단 방법으로 판단한다.

본 발명의 마커는 대장암에서 저농도로 존재하는 생체 분자이다. 구체적으로, 본 발명의 마커인 아밀로이드 올리고머 형태의 p53은 염이 처리된 시료에 있어, 정상 시료에 비하여 대장암 환자의 시료에서 적은 양이 존재하고, 또한 염이 처리되지 않은 시료에 비하여 염이 처리된 시료에서 적은 양으로 존재한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다.

특정예에 따르면, 본 발명의 방법은 (a) p53에 대해 결합능이 있고 고상의 매트릭스에 고정화된 포획 항체에 인간으로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)의 결과물에 아밀로이드 올리고머 형태의 p53에 결합하는 검출 항체를 접촉시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 생물학적 시료는 염이 처리된 혈액, 혈장 또는 혈청이다. 이 경우, 단계 (c)에서 검출된 항원-항체 복합체의 양을 정상 시료의 검출 값과 비교하거나, 또는 동일한 피검체로부터 채취한 염이 처리되지 않은 혈액, 혈장 또는 혈청에서의 검출 값과 비교하여 대장암 여부를 판단할 수 있다.

상기 항원-항체 복합체 형성의 검출은 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명에 따르면, 간편하면서도 신속하게 대장암의 발병 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 나온 데이터를 근거로 하여 대장암 치료제를 환자에게 처리할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 대장암에 대한 신규한 분자 마커로서 아밀로이드 올리고머 형태의 p53을 제안한다.

(ⅱ) 본 발명의 마커는 혈액 마커로서 대장암을 편리하고, 신속 및 정확하게 진단하는데 이용될 수 있다.

도 1은 염이 처리되지 않은 시료 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 p53을 검출한 결과를 보여준다.
도 2는 염이 처리된 시료 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 p53을 검출한 결과를 보여준다.
도 3은 대장암 환자와 정상인에 있어, 염이 처리되지 않은 혈장과 염이 처리된 혈장 사이의 아밀로이드 올리고머 형태의 p53의 검출량을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 샌드위치 ELISA를 이용한 아밀로이드 올리고머 형태의 p53 검출

1-1. 실험재료

PBS(0.01M, pH 7.4): 포획 항체와 스트렙트아비딘-폴리 HRP 희석용

PBS(0.01M, pH 7.4) + 0.05% Tween: 세척 버퍼

PBS(pH 7.4)에 용해된 1% BSA: 분석 희석액(Assay diluent)

25% BlockAce: 블록킹 버퍼(Blocking Buffer)

2N H₂SO₄: 종결 용액(Stop solution)

1-2. 플레이트 준비

포획 항체(Anti-p53 PAb1801; Abcam, ab28)를 PBS(0.01M, pH 7.4)로 희석한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하여 100 ㎕(1 ㎍/㎖)를 코팅한 다음 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 300 ㎕의 블록킹 용액을 처리한 후 37℃에서 90분 동안 인큐베이션 한 다음 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕).

1-3. 샌드위치 ELISA를 이용한 아밀로이드 올리고머 형태의 p53 검출

표 1에 기재된 80명의 대장암 환자와 15명의 정상인으로부터 혈액 10 ㎖을 항응고제(EDTA tube)를 이용하여 채취하였다. 채혈 후 곧바로 항응고제가 충분히 섞이도록 천천히 혼합하였다. 이후 튜브는 상온에서 보관하고 채혈 후 1시간 이내에 850xg에서 30분간 원심분리 후 혈구와 섞이지 않게 혈장을 분리 하고 1.5 ㎖ 튜브에 분주 후 -80℃ 냉동 보관하였다.

채취한 혈장 샘플을 분석 희석액으로 10배 희석한 후 100 ㎕를 포획 항체가 고정되어 있는 플레이트에 처리하였다. 처리 후, 1시간 동안 상온에서 흔들어주면서(400 rpm) 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 검출 항체(Anti-amyloid antibody A11; Biorbyt, orb152853)를 분석 희석액으로 희석한 후 100 ㎕를 플레이트에 처리하고(400 ng/㎖), 1시간 동안 상온에서 흔들어주면서(400 rpm) 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 스트렙트아비딘-폴리 HRP(Pierce, 21140)를 PBS(0.01M, pH 7.4)로 X20,000배 희석한 다음 플레이트에 처리하고(100 ㎕), 상온에서 30분간 흔들어주면서(400 rpm) 인큐베이션 하였다. TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 100 ㎕를 플레이트에 처리한 후, 20분 동안 37℃에서 인큐베이션 한 다음 종결 용액 50 ㎕로 반응을 종결시켰다. 광학 밀도 값은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 0.1초 간격으로 측정하였다. 모든 통계 분석은 MiniTab 버전14(Minitab Inc.,State College, PA, USA)를 이용하여 통계치를 산출하였다. 결과는 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고, 모든 결과 비교는 paired t-test 및 2-sample t-test를 이용하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.

이와 같이, 정상인과 대장암 환자의 혈액을 이용하여 혈장 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 p53의 양을 아밀로이드 올리고머-특이적 항체(A11 항체)를 이용한 샌드위치 ELISA로 측정하였으며, 실험결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 아밀로이드 올리고머 형태의 p53의 양에 있어, 대장암 환자와 정상인 간에는 유의성 있는 차이가 없었다(도 1).

실시예 2. 염 처리한 혈장 샘플 내 아밀로이드 올리고머 형태의 p53 검출

2-1. 실험재료

PBS(0.01M, pH 7.4): 포획 항체와 스트렙트아비딘-폴리 HRP 희석용

PBS(0.01M, pH7.4) + 0.05% Tween: 세척 버퍼

PBS(1370 mM NaCl, 27 mM KCl, pH 7.4)에 용해된 1% BSA: 고염 버퍼(High Salt buffer)

PBS(pH 7.4)에 용해된 1% BSA: 분석 희석액(Assay diluent)

25% BlockAce: 블록킹 버퍼(Blocking Buffer)

2N H₂SO₄: 종결 용액(Stop solution)

2-2. 플레이트 준비

2-3. 고염 처리한 혈장 샘플 내 아밀로이드 올리고머 형태의 p53 검출

표 1에 기재된 80명의 대장암 환자와 15명의 정상인으로부터 채취한 혈장 샘플을 실시예 1과 달리 고염 버퍼로 10배 희석한 후 100 ㎕를 포획 항체가 고정되어 있는 플레이트에 처리하였다. 처리 후, 1시간 동안 상온에서 흔들어주면서(400 rpm) 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 검출 항체(Anti-amyloid antibody A11; Biorbyt, orb152853)를 분석 희석액으로 희석한 후 100 ㎕를 플레이트에 처리하고(400 ng/㎖), 1시간 동안 상온에서 흔들어주면서(400 rpm) 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 스트렙트아비딘-폴리 HRP(Pierce, 21140)를 PBS(0.01M, pH 7.4)로 X20,000배 희석한 다음 플레이트에 처리하고(100 ㎕), 상온에서 30분간 흔들어주면서(400 rpm) 인큐베이션 하였다. TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 100 ㎕를 플레이트에 처리한 후, 20분 동안 37℃에서 인큐베이션 한 다음 종결 용액 50 ㎕로 반응을 종결시켰다. 광학 밀도 값은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 0.1초 간격으로 측정하였다. 통계 분석은 실시예 1과 같이 실시하였다.

이와 같이, 정상인과 대장암 환자의 혈액을 이용하여 고염 처리한 혈장 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 p53의 양을 아밀로이드 올리고머-특이적 항체(A11 항체)를 이용한 샌드위치 ELISA로 측정하였으며, 실험결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 대장암 환자의 염 처리된 혈액에서는 정상인에 비하여 현저히 적은 양의 아밀로이드 올리고머 형태의 p53이 검출되었다(도 2). 이러한 결과는, 염이 처리된 혈액 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 p53의 양을 측정하여 대장암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 의미한다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 대장암 환자의 경우에는 염이 처리된 혈액에서 검출된 아밀로이드 올리고머 형태의 p53의 양이 염이 처리되지 않은 혈액에서 검출된 양보다 유의성 있게 적었으나, 정상인의 경우에는 염 처리에 따른 유의성 있는 차이가 없었다(도 3). 이러한 결과는, 염이 처리된 시료에서 검출한 아밀로이드 올리고머 형태의 p53의 양을 염이 처리되지 않은 시료에서 검출한 양과 비교함으로써 대장암을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 의미한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Gachon University of Medicne and Science Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Biomarker Indicative of Colorectal Cancer and Their Uses <130> PN140626 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Asp Glu Ala 50 55 60 Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala 65 70 75 80 Pro Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser 85 90 95 Ser Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu 100 105 110 Gly Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser 115 120 125 Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val 130 135 140 Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala 145 150 155 160 Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg 165 170 175 Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro 180 185 190 Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp 195 200 205 Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro 210 215 220 Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn 225 230 235 240 Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile 245 250 255 Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu 260 265 270 Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Arg Arg Thr Glu Lys Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390

Claims

p53 상의 에피토프에 결합하여 인간의 생물학적 시료 내에 존재하는 모노머 형 또는 멀티머 형의 p53을 포획하는 포획 제제; 및 상기 포획 제제가 포획한 멀티머 형의 p53 중 아밀로이드 올리고머에 결합하는 검출 제제를 포함하고, 상기 포획 및 검출 제제는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 키트.
대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 멀티머 형의 p53 중 아밀로이드 올리고머의 존재여부 또는 양을 측정하는 단계를 통하여 대장암 마커를 검출하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 방법은 (a) p53에 대해 결합능이 있고 고상의 매트릭스에 고정화된 포획 항체에 인간으로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)의 결과물에 아밀로이드 올리고머 형태의 p53에 결합하는 검출 항체를 접촉시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 염이 처리된 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.