KR101977410B1 - 당뇨병에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 당뇨병에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 마커는 혈액 마커로서 당뇨병을 편리하고, 신속 및 정확하게 진단하는데 이용될 수 있다.

Description

당뇨병에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도{Novel Biomarker Indicative of Diabetes and Their Uses}
본 발명은 당뇨병에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.
당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로, 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으키고 소변에서 포도당을 배출하게 된다. 현대에 들어서 식생활의 변화와 운동 부족 등으로 인하여, 인체 고유의 에너지 대사과정에 커다란 변화가 발생하였으며, 이에 따라 당뇨병의 유병률이 증가하는 현상이 나타나고 있다. 국내에서는 당뇨 유병률이 5-10%에 달하는 것으로 알려져 있으며, 지속적인 증가를 보이고 있다.
당뇨병은 제1형과 제2형으로 구분되는데, 제1형 당뇨병은 이전에 '소아 당뇨병'이라고 불렸었으며, 인슐린을 전혀 생산하지 못하는 것이 원인이 되어 발생하는 질환이다. 인슐린이 상대적으로 부족한 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성(insulin resistance; 혈당을 낮추는 인슐린 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하는 것)을 특징으로 한다. 제2형 당뇨는 식생활의 서구화에 따른 고열량, 고지방, 고단백의 식단, 운동 부족 및 스트레스 등 환경적인 요인이 크게 작용하는 것으로 보이지만, 이 외에 특정 유전자의 결함에 의해서도 당뇨병이 생길 수 있으며, 췌장 수술, 감염, 약제에 의해서도 생길 수 있다. 당뇨병의 95% 이상은 제2형 당뇨병이다.
당뇨병을 확정하기 위해서는 요당 측정과 공복 시의 혈당 측정, 경구 또는 정맥주사법에 의한 당부하시험 등을 실시한다. 요당 측정의 경우, 당뇨병이 경증일 때는 식후에만 요당이 나타나고, 또한 신장의 당뇨배출 역치의 저하가 있으면 당뇨병이 아니더라도 요당이 나타나는 신장성(腎臟性) 당뇨도 있으므로, 요당의 증명만으로는 당뇨병의 확정 진단이 어려운 문제가 있다. 공복 시 혈당 측정은 하게도른법으로 아침식사 전 공복 시의 모세관의 혈당값이 140 mg/dℓ 이상이면 당뇨병으로 진단한다. 그러나, 경증의 경우에는 정상 범위 안에 있을 수도 있으므로 당부하 검사를 더 실시할 필요가 있다.
이러한 기존의 당뇨병 진단방법의 단점을 보완하면서 당뇨병을 조기에 정확하게 진단할 수 있는 기술이 요구되며, 이에 따라 당뇨병 진단을 위한 신규의 바이오마커에 대한 개발이 이루어지고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 공개특허 제10-2010-0093562호 (2010.08.25 공개) 대한민국 등록특허 제10-1160153호 (2011.06.16 공개)
본 발명자들은 당뇨병을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 혈액 내 전체 멀티머 형의 아밀린(amylin) 또는 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린을 검출하는 것으로, 당뇨병을 조기 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 당뇨병 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 당뇨병 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아밀린(amylin)의 에피토프에 결합하여 인간의 생물학적 시료 내에 존재하는 모노머 형 또는 멀티머 형의 아밀린을 포획하는 포획 제제; 및 상기 포획 제제가 결합하는 에피토프와 오버래핑 된 에피토프에 결합하거나, 또는 상기 포획 제제가 포획한 멀티머 형의 아밀린 중 아밀로이드 올리고머에 결합하는 검출 제제를 포함하고, 상기 포획 및 검출 제제는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 당뇨병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 당뇨병을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 혈액 내 전체 멀티머 형의 아밀린 또는 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린을 검출하는 것으로, 당뇨병을 조기 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 사용된 표현, "당뇨병 진단용 키트"는 당뇨병 진단용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "당뇨병 진단용 키트"는 "당뇨병 진단용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용 가능하다.
본 명세서에서 사용된 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 당뇨병의 단계 결정 또는 치료에 대한 반응성 예측)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "당뇨병 진단 마커 혹은 당뇨병 마커"란 당뇨병을 진단할 수 있는 물질로, 정상인에 비하여 당뇨병이 발병한 개체에서 증가 양상을 보이는 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 당뇨병 진단 마커는 멀티머 형의 아밀린(전체 멀티머 형의 아밀린, 또는 멀티머 형의 아밀린 중 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린)이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "모노머 형(monomer form)의 아밀린"은 일반적인 단일 분자로서의 아밀린을 의미하고, 용어 "멀티머 형(multimer form)의 아밀린"은 모노머 형의 아밀린이 둘 이상 포함된 아밀린 복합체를 의미한다. 아밀린은 37개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 호르몬으로, 췌장의 β세포에서 인슐린과 함께 분비된다. 아밀린의 아미노산 서열은 서열목록 제2서열에 나타내었다. 아밀린은 경우에 따라 모노머 형의 아밀린이 서로 뭉쳐 다이머(dimer), 테트라머(tetramer) 또는 피브릴(fibril) 등을 형성할 수 있고, 나아가 프리온과 유사한 아밀로이드 올리고머(amyloid oligomer)를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "아밀로이드 올리고머 또는 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린"은 모노머 형태로 존재하는 아밀린이 서로 응집하여 형성한 올리고머 형태의 아밀린 복합체를 의미한다.
이러한 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린은 상업적으로 입수 가능한 아밀로이드 올리고머를 인지하는 항체(예컨대, A11 항체)를 사용하여 검출할 수 있다. 상기 아밀로이드 올리고머를 인지하는 항체는, 단백질 또는 펩타이드의 올리고머를 염기서열과 무관하게 인식할 수 있으며, 단백질 또는 펩타이드의 모노머와 피브릴(fibril)은 인식하지 않는다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 당뇨병 마커(전체 멀티머 형의 아밀린, 또는 멀티머 형의 아밀린 중 아밀로이드 올리고머)를 검출하는데 사용될 수 있다.
이 경우, 당뇨병 마커의 검출은, (ⅰ) 아밀린 상의 에피토프에 결합하여 모노머 형 또는 멀티머 형의 아밀린을 포획하는 포획 제제(항체 또는 앱타머), 및 상기 포획 제제가 결합하는 에피토프와 오버래핑 된 에피토프에 결합하는 검출 제제(항체 또는 앱타머); 또는 (ⅱ) 아밀린 상의 에피토프에 결합하여 모노머 형 또는 멀티머 형의 아밀린을 포획하는 포획 제제, 및 멀티머 형의 아밀린 중 아밀로이드 올리고머에 결합하는 검출 제제를 이용하여 실시할 수 있다. 전자의 경우에는 생물학적 시료 내에 존재하는 전체 멀티머 형의 아밀린을 검출할 수 있고, 후자의 경우에는 생물학적 시료 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린을 검출할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 본 발명의 마커 또는 상기 마커의 구성 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 새로운 당뇨병 진단 마커가 규명되었으므로, 모노머 형 또는 멀티머 형의 아밀린(마커 단백질 항원)을 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6:511-519, 1976 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 키트는 통상적인 면역분석 방법에 적용되어 당뇨병을 진단하는데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석 방법은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법으로서, 면역분석 포맷은 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 샌드위치 엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있다.
상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 키트가 방사능면역분석 방법에 적용되는 경우, 키트 내의 검출 제제는 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 멀티머 검출 시스템(Multimer Detection System, MDS로 약칭)에 적용되어 당뇨병 마커를 검출하는데 활용될 수 있다. 본 발명의 키트가 MDS에 적용되는 경우, 본 발명의 키트에는 아밀린 상의 에피토프에 결합하여 인간의 생물학적 시료 내에 존재하는 모노머 형 또는 멀티머 형의 아밀린을 포획하는 포획 제제 외에, 검출 제제로서 상기 포획 제제가 결합하는 아밀린 상의 에피토프와 오버래핑 된 에피토프에 결합하는 항체 또는 앱타머가 포함된다.
상기 용어 "오버래핑(overlapped with)"은 검출 제제와 포획 제제가 인식하는 에피토프 서열이 완전히 또는 부분적으로 겹쳐진 것을 의미한다. 이와 같이, MDS에서는 에피토프가 서로 오래래핑 된 포획 제제와 검출 제제를 사용하기 때문에, 검출 제제는 포획 제제에 결합된 모노머 형의 아밀린에는 결합하지 못하지만 멀티머 형의 아밀린에는 결합이 가능하므로 MDS를 통하여 생물학적 시료 내에 존재하는 모노머 형의 아밀린 이외의 모든 멀티머 형의 아밀린을 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 샌드위치 ELISA에 적용되어 당뇨병 마커를 검출하는데 활용될 수 있다. 특정예에서, 이러한 샌드위치 ELISA는 (a) 포획 항체로서 아밀린 상의 에피토프에 결합 가능한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (b) 포획 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; (c) 단계 (b)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 상기 포획 항체가 포획한 멀티머 형의 아밀린 중 아밀로이드 올리고머에 결합 가능한 검출 항체와 반응시키는 단계; 및 (d) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 검출 제제는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질, 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 MDS 및 ELISA에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 포획 제제가 결합하는 에피토프는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자, 바람직하게는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al. Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cellcycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 당뇨병을 진단할 수 있다. 구체적으로, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 당뇨병으로 진단할 수 있다(실시예 1 및 2 참조).
상술한 바와 같이, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 예를 들어 본 발명의 키트는 MDS 또는 ELISA 키트이다. 이 경우, 본 발명의 키트는 MDS 또는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 진단 대상인 당뇨병은 제2형 당뇨병이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 멀티머 형의 아밀린 또는 멀티머 형의 아밀린 중 아밀로이드 올리고머의 존재여부 또는 양을 측정하는 단계를 통하여 당뇨병 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 당뇨병 마커를 검출하는 방법과 상기 당뇨병 진단용 키트는 동일한 마커를 사용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 당뇨병을 의사의 소견에 의한 판단이 아니라, 분자 진단 방법으로 판단한다. 본 발명의 마커는 정상인에 비하여 당뇨 환자에서 고농도로 존재하는 생체 분자이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다.
특정예에 따르면, 본 발명의 방법은 (a) 아밀린에 대해 결합능이 있고 고상의 매트릭스에 고정화된 포획 항체에 인간으로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)의 결과물에 상기 포획 항체가 결합하는 에피토프와 오버래핑 된 에피토프에 결합하는 검출 항체, 또는 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린에 결합하는 검출 항체를 접촉시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 항원-항체 복합체 형성의 검출은 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 마커는 혈액 마커이기 때문에, 본 발명의 마커를 이용하면 간편하면서도 신속하게 당뇨병의 발병 여부를 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 당뇨병에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 마커는 혈액 마커로서 당뇨병을 편리하고, 신속 및 정확하게 진단하는데 이용될 수 있다.
도 1은 MDS(Multimer Detection System)를 이용하여 혈장 내에 존재하는 전체 멀티머 형의 아밀린을 검출한 결과를 보여준다. Minitab을 사용하여 MDS 결과에 대한 개별값 플롯 그래프(Individual value plot graph)를 얻었다. 그래프는 실험을 두 번 진행하여 얻은 각각의 샘플에 대한 2개의 시그널의 평균값으로 도시하였다.
도 2는 샌드위치 ELISA를 이용하여 혈장 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린을 검출한 결과를 보여준다. Minitab을 사용하여 샌드위치 ELISA 결과에 대한 개별값 플롯 그래프를 얻었다. 그래프는 실험을 두 번 진행하여 얻은 각각의 샘플에 대한 2개의 시그널의 평균값으로 도시하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. MDS(Multimer Detection System)를 이용한 혈장 내 전체 멀티머 형의 아밀린 검출
1-1. 실험재료
탄산염-중탄산염(Carbonate-bicarbonate): 포획 항체 희석용
PBS(0.01M, pH7.4): 혈장 및 스트렙타비딘-폴리 HRP 희석용
PBS(0.01M, pH 7.4) + 0.05% Tween: 세척 버퍼
25% BlockAce : 블록킹 버퍼(Blocking Buffer)
2N H2SO4: 종결 용액(Stop solution)
1-2. 플레이트 준비
포획 항체(Anti-amylin amide pAb; Peninsula Laboratories International, Inc., T-4157.0400)를 탄산염-중탄산염으로 희석한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하여 100 ㎕(1 ㎍/㎖)를 코팅한 다음 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 300 ㎕의 블록킹 용액을 처리한 후 37℃에서 90분 동안 인큐베이션 한 다음 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕).
1-3. MDS를 이용한 혈장 내 전체 멀티머 형의 아밀린 검출
9명의 제2형 당뇨병 환자와, 대조군으로 사용하기 위한 5명의 정상인으로부터 혈액을 채취하였다. 구체적으로, 당뇨 환자 9명과 정상인 5명으로부터 혈액 10 ㎖을 항응고제(Heparin tube)를 이용하여 채취하였다. 채혈 후 곧바로 항응고제가 충분히 섞이도록 천천히 혼합하였다. 이후 튜브는 상온에서 보관하고, 채혈 후 1시간 이내에 850xg에서 30분간 원심분리 후 혈구와 섞이지 않게 혈장을 분리 하고, 1.5 ㎖ 튜브에 분주 후 -80℃ 냉동 보관하였다.
혈장 샘플을 PBS(0.01M, pH 7.4)로 2배 희석한 후 100 ㎕를 포획 항체가 고정되어 있는 플레이트에 처리하였다. 처리 후, 2시간 동안 25℃에서 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 포획 항체와 동일한 검출 항체(biotinylated anti-amylin amide pAb; Peninsula Laboratories International, Inc., T-4157.0400)를 PBS(0.01M, pH 7.4)로 희석한 후 100 ㎕를 플레이트에 처리하고(100 ng/㎖), 1시간 반 동안 25℃에서 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 스트렙타비딘-폴리 HRP(Pierce, 21140)를 PBS(0.01M, pH 7.4)로 X10,000배 희석한 다음 플레이트에 처리하고(100 ㎕), 25℃에서 30분간 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 이후, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) 100 ㎕를 플레이트에 처리한 후, 20분 동안 37℃에서 인큐베이션 한 다음 종결 용액 50 ㎕로 반응을 종결시켰다. 광학 밀도 값은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 0.1초 간격으로 측정하였다.
모든 통계 분석은 Student's t-test in MiniTab version 14(Minitab Inc., State College, PA, USA)를 이용하여 통계치를 산출하였고, 결과는 평균과 표준편차로 나타내었으다. 결과 비교를 위하여 two sample t-test를 이용하였다.
이상과 같이 정상인과 당뇨병 환자의 혈액을 이용하여 혈장 내에 존재하는 전체 멀티머 형의 아밀린의 양을 MDS 법으로 측정하였으며, 실험결과는 도 1에 나타내었다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 당뇨병 환자의 혈액에서는 정상인에 비하여 많은 양의 전체 멀티머 형의 아밀린이 검출되었다(도 1). 이러한 결과는, 혈액 내에 존재하는 전체 멀티머 형의 아밀린의 양을 측정하여 당뇨병을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 의미한다.
실시예 2. 샌드위치 ELISA를 이용한 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린 검출
2-1. 실험재료
탄산염-중탄산염(Carbonate-bicarbonate): 포획 항체 희석용
PBS(0.01M, pH7.4): 혈장 및 스트렙타비딘-폴리 HRP 희석용
PBS(0.01M, pH 7.4) + 0.05% Tween: 세척 버퍼
25% BlockAce : 블록킹 버퍼(Blocking Buffer)
2N H2SO4: 종결 용액(Stop solution)
2-2. 플레이트 준비
포획 항체(Anti-amylin amide pAb; Peninsula Laboratories International, Inc., T-4157.0400)를 탄산염-중탄산염으로 희석한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하여 100 ㎕(1 ㎍/㎖)를 코팅한 다음 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 300 ㎕의 블록킹 용액을 처리한 후 37℃에서 90분 동안 인큐베이션 한 다음 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕).
2-3. 샌드위치 ELISA를 이용한 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린 검출
실시예 1에서 설명한 바와 같이 채취한 혈장 샘플을 PBS(0.01M, pH 7.4)로 2배 희석한 후 100 ㎕를 포획 항체가 고정되어 있는 플레이트에 처리하였다. 처리 후, 2시간 동안 25℃에서 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 검출 항체(biotinylated anti-amyloid antibody A11; Biorbyt, orb152853)를 PBS(0.01M, pH 7.4)로 희석한 후 100 ㎕를 플레이트에 처리하고(100 ng/㎖), 1시간 반 동안 25℃에서 인큐베이션 하였다. 이후, 세척 버퍼로 3번 세척하였다(300 ㎕). 스트렙타비딘-폴리 HRP(Pierce, 21140)를 PBS(0.01M, pH 7.4)로 X10,000배 희석한 다음 플레이트에 처리하고(100 ㎕), 25℃에서 30분간 인큐베이션 하였다. 이후, TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 100 ㎕를 플레이트에 처리한 후, 20분 동안 37℃에서 인큐베이션 한 다음 종결 용액 50 ㎕로 반응을 종결시켰다. 광학 밀도 값은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 0.1초 간격으로 측정하였다.
모든 통계 분석은 Student's t-test in MiniTab version 14 (Minitab Inc., State College, PA, USA)를 이용하였고, 결과는 평균과 표준편차로 나타내었다. 결과 비교를 위하여, two sample t-test를 이용하였다.
이상과 같이, 정상인과 당뇨병 환자의 혈액을 이용하여 혈장 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린의 양을 아밀로이드 올리고머-특이적 항체(A11 항체)를 이용한 샌드위치 ELISA로 측정하였으며, 실험결과는 도 2에 나타내었다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 당뇨병 환자의 혈액에서는 정상인에 비하여 많은 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린이 검출되었다(도 2). 이러한 결과는, 혈액 내에 존재하는 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린의 양을 측정하여 당뇨병을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 의미한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Gachon University of Medicine and Science Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Biomarker Indicative of Diabetes and Their Uses <130> PN150196D <150> KR 10-2015-0072096 <151> 2015-05-22 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope of amylin <400> 1 Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> human amylin <400> 2 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35

Claims (4)

  1. 아밀린(amylin)에 결합하여 인간의 생물학적 시료 내에 존재하는 모노머 형 또는 멀티머 형의 아밀린을 포획하는 포획 제제로서의 항체; 및
    상기 포획 제제가 포획한 멀티머 형의 아밀린 중 아밀로이드 올리고머에 결합하는 검출 제제로서 A11 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 진단용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 키트.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 다음의 단계를 포함하는 당뇨병 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 멀티머 형의 아밀린 중 아밀로이드 올리고머의 존재여부 또는 양을 측정하는 단계를 통하여 당뇨병 마커를 검출하는 방법:
    (a) 아밀린에 대해 결합능이 있고, 고상의 매트릭스에 고정화된 포획 항체에 인간으로부터 분리된 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)의 결과물에 아밀로이드 올리고머 형태의 아밀린에 결합하는 검출 항체로서 A11 항체를 접촉시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계.
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