KR101864601B1

KR101864601B1 - 심혈관 질환 조기 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단키트, 및 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법

Info

Publication number: KR101864601B1
Application number: KR1020160153017A
Authority: KR
Inventors: 강민정; 유영숙; 성윤서
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2016-11-17
Filing date: 2016-11-17
Publication date: 2018-06-05
Also published as: KR20180055319A

Abstract

본 발명은 심혈관 질환 조기 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단키트, 및 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 선정한 신규 바이오 마커로서, 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)의 6종의 단백질은 대상자가 급성 심근경색(Acute Myocardial Infarction, AMI), 불안정 협심증(Unstable Angina, UA)과 같은 심혈관 질환을 갖는 경우 이들의 생체시료 내 레벨(수치)이 증가 또는 감소하므로, 그 레벨을 비교하여 간단하면서도 정확하게 심혈관 질환을 진단할 수 있다. 더욱이 기존의 바이오 마커가 심근경색 여부만 진단할 수 있는 것과 달리, 본 발명에서는 심근경색 발명 이전 징후인 불안정 협심증까지 조기 진단할 수 있다. 이는 특이도 80% 이상 및 민감도 90% 이상을 보여 기존의 바이오 마커와 대비하여 경쟁력이 있다.

Description

심혈관 질환 조기 진단용 조성물, 이를 포함하는 진단키트, 및 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법{A composition for early diagnosis of cardiovascular disease, a kif for early diagnosis of cardiovascular disease, and method for information for early diagnosis of cardiovascular disease}

본 발명에서 선정한 신규 바이오 마커로서, 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)의 6종의 단백질은 대상자가 급성 심근경색(Acute Myocardial Infarction, AMI), 불안정 협심증(Unstable Angina, UA)과 같은 심혈관 질환을 갖는 경우 이들의 생체시료 내 레벨(수치)이 증가 또는 감소하므로, 그 레벨을 비교하여 간단하면서도 정확하게 심혈관 질환을 진단할 수 있다. 더욱이 기존의 바이오 마커가 심근경색 여부만 진단할 수 있는 것과 달리, 본 발명에서는 심근경색 발명 이전 징후인 불안정 협심증까지 조기 진단할 수 있다.

심혈관 질환은 우리나라에서 세 번째로 높은 사망률을 기록하고 있는 질병으로 우리나라의 식생활 습관이 서구화 되면서, 고혈압 비만과 같은 만성질환의 발병률이 급속하게 증가하면서, 심혈관 질환의 빈도도 급하게 증가하고 있다. 급성 심근경색은 발병 후 예후가 매우 좋지 않아, 재발 및 사망률이 2번째로 높은 질환으로, 관상동맥 혈류가 막히고, 취약성 경화반이 파열되어 혈전성 폐색으로 증상이 나타난다. 현재, 취약성 경화반(vulnerable plaque)의 진단은 혈관 내심 초음파 방법(intravascular ultrasound)으로 이루어지고 있는데, 이는 비침습적 방법이므로, 조기 진단용 바이오 마커가 발굴된다면, 환자에게 편안한 검사방법으로 위험한 급성심근경색을 예방하거나, 조기에 치료할 수 있는 가능성을 제공할 수 있을 것이다.

본 발명에서는 현재 급성심근경색의 바이오 마커로 사용되고 있는 CK-MB, Myoglobin, Troponin I를 대체할 수 있는 민감하고 특이도가 높은 바이오 마커를 개발하고자 한다. 이에 심혈관 질환을 협심증 단계에서 조기에 진단하는데 정보를 제공할 수 있는 바이오 마커를 선별하는데 역점을 두었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1494882호 대한민국 등록특허공보 제10-2014-0014453호 대한민국 등록특허공보 제2016-0015019호 미국 출원특허공보 제14/580,724호

Thrombosis Research (2009) 123: 556-564. The potential biomarkers for thromboembolism detected by SELDI-TOF-MS. Mei Hong et al. Clinica Chimica Acta (2011) 412: 10861093. Time course proteomic profiling of human myocardial infarction plasma samples: An approach to new biomarker discovery. Vivian Nogueria Silbiger et al. J. Proteomics (2016) 136: 123132. Development of a targeted selected ion monitoring assay for the elucidation of protease induced structural changes in cardiac troponin T. Alexander S. Streng et al.

위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 발명자들은 생체시료에 주단백질인 알부민(Albumin)과, 면역글로불린 G(IgG)를 효율적으로 제거하기 위해 50 ~ 80%의 농도를 갖고 -80℃ ~ -20℃ 온도에서 냉장 보관하여 아세톤 수용액의 온도를 낮춰 만든 70℃ ~ 0℃인 냉장 아세톤 수용액을 이용하여 원심분리하고 상층액이나 펠렛을 취하는 경우 종래의 상업적 키트(ProteExtract^™,ProteoPre^®)와 대비하여 동등 이상으로 주단백질인 알부민과 IgG를 제거하여 특정단백질을 효과적으로 추출할 수 있다는 것을 알게 되었고, 이러한 추출방법을 이용하여 급성 심근경색, 협심증 진단에 유용한 바이오 마커인 특정 단백질을 선정하고, 정산인과 이들의 수치를 비교함으로써 급성 심근경색(Acute Myocardial Infarction, AMI) 또는 심근경색 발명 이전 징후인 불안정 협심증(Unstable Angina, UA)까지 조기 진달할 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 키트를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 심혈관 질환 조기 진단에 필요한 정보 제공방법을 제공하는데 있다.

위와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 심혈관 질환 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자로부터 채취한 생체시료로부터 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 함량을 측정하고 정상 대조군과 대비하여 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

본 발명은 생체시료 특히, 혈장에서 80% 이상 존재하는 다량 단백질을 제거하고, 미량의 단백질을 추출한 후, 정상인과 환자군(대상자)의 시료 속에 존재하는 특정 단백질 농도의 증감을 비교하여, 심혈관 질환 조기진단에 유용한 신규 바이오 마커를 발굴하였다.

선별한 6종의 신규 바이오 마커 후보군은 급성 심근경색(Acute Myocardial Infarction, AMI)과 불안정 협심증(Unstable Angina, UA) 환자의 진단에 관한 정보를 제공하는데 유용하게 사용할 수 있을 것이다. 이는 기존 바이오 마커 대비 10% 이상 향상된 특이도 및 민감도를 보여 경쟁력이 있었다.

도 1a는 냉장 아세톤 침전법과 상용키트 ProteoExtract™ Albumin/IgG removal kit를 사용하여 주단백질(알부빈 및 IgG)을 제거한 후 Mascot Search를 통해서 동정한 단백질로서, 상기 두 가지 방법에서 공통적으로 발견된 단백질의 조각 펩타이드 리스트이다.
도 1b는 냉장 아세톤 침전법과 상용키트 ProteoExtract™ Albumin/IgG removal kit를 사용하여 주단백질(알부빈 및 IgG)을 제거한 후 Mascot Search를 통해서 동정한 단백질로서, 상기 방법 중 한 가지 방법으로만 발견된 단백질의 조각 펩타이드 리스트이다.
도 2는 정산인과 환자 시료(대상자)에서 레벨의 증감이 많이 차이나는 단백질을 선정하여 나타낸 단백질의 조각 펩타이드 리스트이다.
도 3a는 정상인과 환자 시료(대상자)에 대해 피브리노겐 베타의 조각펩타이드(m/z=846.39)를 측정한 결과이고, 도 3b는 피브리노겐 베타의 ROC(Receiver Operating Curve) 결과이다.
도 4a는 정상인과 환자 시료(대상자)에 대해 안티트롬빈-III의 조각펩타이드(m/z=924.95)를 측정한 결과이고, 도 4b는 안티트롬빈-III의 ROC(Receiver Operating Curve) 결과이다.
도 5a는 정상인과 환자 시료(대상자)에 대해 옵스큐린의 조각펩타이드(m/z=375.70)를 측정한 결과이고, 도 5b는 옵스큐린의 ROC(Receiver Operating Curve) 결과이다.
도 6a는 정상인과 환자 시료(대상자)에 대해 시냅신-3의 조각펩타이드(m/z=1374.23)를 측정한 결과이고, 도 6b는 시냅신-3의 ROC(Receiver Operating Curve) 결과이다.
도 7a는 정상인과 환자 시료(대상자)에 대해 클러스터린의 조각펩타이드(m/z=697.34)를 측정한 결과이고, 도 7b는 클러스터린의 ROC(Receiver Operating Curve) 결과이다.
도 8a는 정상인과 환자 시료(대상자)에 대해 켈히-라이크 프로테인 42의 조각펩타이드(m/z=531.77)를 측정한 결과이고, 도 8b는 켈히-라이크 프로테인 42의 ROC(Receiver Operating Curve) 결과이다.
도 9는 불안정성 협심증(Unstable Angina, UA) 환자 시료(대상자)를 대상으로, 본 발명에서 선정한 6개의 단백질(바이오 마커)의 함량을 측정한 결과이다.
도 10은 정상인(Healthy Controls), 급성심근경색(AMI), 불안정 협심증(UA) 환자 시료(대상자)를 대상으로, 본 발명에서 선정한 6개의 단백질(바이오 마커)을 함량을 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명의 발명자들은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심분리하여 주단백질인 알부민과 IgG를 제거하거나, 종래의 상업적 키트(ProteExtract^™,ProteoPre^®)을 이용하여 주단백질인 알부민과 IgG를 제거한 후, 생체시료 내에 존재하는 미량의 특정 단백질로 존재하는 바이오 마커 후보군을 발굴하는데 유용한 기술을 보유하고 있다(특허출원 제2016-108525호 참조). 이에 본 발명의 발명자들은 미량의 특정 단백질을 효과적으로 발굴할 수 있는 상기 기술을 이용하여, 정상인과 심혈관 질환 환자(대상자)의 생체시료(특히, 혈장)에서, 미량으로 존재하는 심혈관 질환 조기 진단용 바이오 마커를 발굴하였다.

구체적으로, 본 발명은 상기 냉장 아세톤 침전법(특허출원 제2016-108525호) 또는 종래의 상업적 키트(ProteExtract^™,ProteoPre^®)를 이용하여 주단백질 알부민과 면역글로불린 G(Ig G)를 제거하고, 트립신으로 단백질을 분해한 후, 다량의 염을 제거하고 고분해능 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS/MS)로 조각 펩타이드를 분석하였다. 분석하여 얻은 크로마토그램과 매스스펙트로메트리 결과를 Mascot database로 돌려서, 단백질을 동정하고, 정상인과 환자 시료에서 차이가 나게 발현된 단백질의 조각 펩타이드 이온을 정량분석하여, 바이오 마커 후보군을 통계적으로 유의미 한지 분석하였다. 아울러, 액체크로마토그래피로 분리된 검출피크를 고분해능 질량분석기 (LTQ-Orbitrap)를 사용하였으며, LC-MS/MS를 이용 시 MS/MS scan analyzer의 조건을 FTMS를 Ion Trap으로 바꾸거나, Minimum Signal Threshold를 증가시켜 분석하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 급성 심근경색 환자와 정상인의 혈장으로부터 특이적으로 발현 차이를 나타내는 피브리노겐 알파, 베타, 감마(Fibrinogen α, β, γ), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 옵스큐린(Obscurin), 티틴(Titin), 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈 (2-hydroxyacylsphingosine 1-beta-galactosyltransferase), 피에이치-인터렉팅 프로테인(PH-interacting protein), 클러스터린(Clusterin), 징크 핑거 프로테인 736 (Zinc finger protein 736), 안옥타민-2(Anoctamin-2), 시냅신-3(Synapsin-3), 퓨터티브 언캐릭터라이즈드 프로테인 FLJ36797(Putative uncharacterized protein FLJ36797), 트랜스크립션 팩터 25(Transcription factor 25), 유디피-글루코스 6-디하이드로게네이즈(UDP-glucose 6-dehydrogenase), 프리즐드-5(Firizzled-5), 프로버블 트레오닌-티알엔에이 라이게이즈 2(Probable threonine-tRNA ligase 2), 이소펜테닐-다이포스페이트 델타-아이소머레이즈 1(Isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase 1), 아담티에스-라이크 프로테인 3(ADAMTS-like protein 3), 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42) 등의 단백질을 선별하였고(도 1a 및 도 1b), 이들 중 특히 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)이 정상인과 심혈관 질환 환자 사이에서 증감이 두드러지게 차이나는 것을 확인하였다(도 2).

따라서, 본 발명은 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 심혈관 질환의 발병 여부를 확인하거나, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.

상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 체제는 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)에 특이적인 항체일 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 특이적인 단백질 분자를 의미하는 것으로, 단클론항체, 다클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

단클론항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(Kohler 및 Milstein(1976)European journal ogImmunology 6:511-519), 또는 파지 항체 라이브러리(Clarkson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol.,222:58, 1-597, 1991)기술을 이용하여 제조될 수 있다. 다클론항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 또한, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함된다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 심혈관 질환 조기 진단용 조성물을 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 키트에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 심혈관 질환 조기 진단용 마커로서, 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함한다.

바람직한 일예로, 본 발명에서의 키트는 환자 시료 내 상기 6종의 특정 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제 뿐만 아니라, 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 검출 라벨로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

보다 바람직한 양태로, 상기 조성물은 피브리노겐 알파(Fibrinogen α), 피브리노겐 감마(Fibrinogen γ), 티틴(Titin), 안옥타민-2(Anoctamin-2), 아이소펜터닐-다이포스페이트 델타 아이소머레이즈 I(Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase I), 프로버블 트레오닌-티알앤에이 라이게이즈 2(Probable threonine-tRNA ligase 2), 및 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈(2-hydroxyacylsphingosine 1-beta-galactosyltransferase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 심혈관 질환 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자로부터 채취한 생체시료로부터 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 고분해능 액체크로마트그래피-질량분석기를 이용하여 측정하고, 상기 단백질의 함량을 정상 대조군과 대비하여 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함하는 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.

보다 바람직한 양태로, 대상자의 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 옵스큐린(Obscurin), 및 시냅신-3(Synapsin-3) 중 하나 이상의 수치가 정상 대조군에 비하여 높으면 심혈관 질환이 있다고 진단하고, 상기 대상자의 클러스터린(Clusterin), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42) 중 하나 이상의 수치가 정상 대조군에 비하여 낮으면 심혈관 질환이 있다고 진단할 수 있다.

바람직한 일예로, 본 발명은 피브리노겐 알파(Fibrinogen α), 피브리노겐 감마(Fibrinogen γ), 티틴(Titin), 안옥타민-2(Anoctamin-2), 아이소펜터닐-다이포스페이트 델타 아이소머레이즈 I(Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase I), 프로버블 트레오닌-티알앤에이 라이게이즈 2(Probable threonine-tRNA ligase 2), 및 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈(2-hydroxyacylsphingosine 1-beta-galactosyltransferase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 검출하는 것을 더욱 포함할 수 있다. 이때 상기 추가 검출되는 단백질의 수치가 정상 대조군에 비하여 높으면 심혈관 질환이 있다고 진단할 수 있다.

또한 본 발명에서의 상기 생체시료는 혈장(plasma), 뇨(urine), 객담(sputum), 세럼(serum)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈장이다. 아울러, 본 발명에서의 심혈관 질환은 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 또는 불안정 협심증(Unstable Angina)이다.

따라서, 본 발명에 따른 신규 바이오 마커 후보군로서 피브리노겐 베타, 안티트롬빈, 클러스터린, 옵스큐린, 시냅신-3, 켈히-라이크 프로테인 42인 6종의 단백질은 각각 또는 동시에 측정함으로써, 민감도 90% 이상, 특이도 80% 이상의 높은 예측 적중률을 얻을 수 있는 진단 키트로 제공될 수 있으며(도 3 내지 도 8), 이는 급성 심근경색과 불안정 협심증 진단에 관한 정보를 제공하는데 유용하게 이용될 것이다(도 9 및 도 10).
본 발명의 일 측면에 있어서, 본원발명 단백질의 발현 수준 또는 함량은 본원발명 도 1a, 도 1b 및 도 9에 뒷받침되는 서열을 가진 각 단백질의 펩타이드 조각의 발현 수준을 통해 측정할 수 있다. 단백질에 대응되는 펩타이드 조각은 하기와 같다.
1. 피브리노겐 베타 : 서열목록 1의 펩타이드 조각
2. 안티트롬빈-III(Antithrombin-III) : 서열목록 2의 펩타이드 조각
3. 클러스터린 : 서열목록 3의 펩타이드 조각
4. 옵스큐린(Obscurin) : 서열목록 4의 펩타이드 조각
5. 시냅신-3(Synapsin-3) : 서열목록 5의 펩타이드 조각
6. 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42) : 서열목록 6의 펩타이드 조각
7. 피브리노겐 알파 : 서열목록 7 내지 13 중 어느 하나 이상의 펩타이드 조각
8. 피브리노겐 감파 : 서열목록 14 내지 18 중 어느 하나 이상의 펩타이드 조각
9. 티틴 : 서열목록 19의 펩타이드 조각
10. 안옥타민-2(Anoctamin-2) : 서열목록 20의 펩타이드 조각
11. 아이소펜터닐-다이포스페이트 델타 아이소머레이즈 I(Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase I) : 서열목록 21의 펩타이드 조각
12. 프로버블 트레오닌-티알앤에이 라이게이즈 2(Probable threonine-tRNA ligase 2) : 서열목록 22의 펩타이드 조각
13. 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈(2-hydroxyacylsphingosine 1-beta-galactosyltransferase) : 서열목록 23의 펩타이드 조각

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따른 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질이 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 또는 불안정 협심증(Unstable Angina) 진단 바이오 마커로서의 기능을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

1. 실험대상 선정 및 재료 준비

정상인과 심근경색 환자의 혈장시료 (44 ~ 75세, 남, 여 혼합)를 준비하였다. 정상인 20명, 급성심근경색환자 14명, 불안정 협심증 환자 19명의 혈장에 존재하는 알부민(Albumin)과 면역글로불린G(Immunoglubulin G)를 제거하기 위해 ProteoExtract™ Albumin/IgG removal kit (EMD bioscience, Darm stadt, Germany)를 구입하였다. 아울러, 특허출원 제2016-108525호에 따른 냉장 아세톤 침전법을 수행하기 위해서 아세톤(Duksan Pure Chemicals, Ansan, Korea)을 구입하였다. 트립신 분해에 필요한 암모니아 바이카보네이트(Ammonium bicarbonate), DL-디티오트레이톨(DL-Dithiothreitol), 요오드아세트아미드(Iodoacetamide), 및 트립신(trypsin)은 Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

2. 혈장으로부터 주단백질인 알부민과 IgG의 제거

2-1. 종래의 상업적 키트인 ProteoExtract ™ Albumin/ IgG removal kit 이용하여 알부민과 IgG를 제거

정상인 20명과 심근경색 환자 33명의 혈장 35 μl을 각각 준비하고 ProteoExtract™ Albumin/IgG removal kit에서 제공된 바인딩 버퍼(binding buffer)로 혈장시료를 10배 희석한 후, 컬럼에 주입하여 중력으로 흘러내려가게 하였다. 여기에 바인딩 버퍼(binding buffer) 600 μl씩 2번 주입하여 알부민, 또는 면역글로불린G의 항체에 결합하지 않은 미량의 단백질들을 씻어서 분리하였다. 두 번 추출하여 모아진 샘플은 동결건조기를 이용하여 밤새 말린 후, - 20℃ 냉동고에 넣어 보관하였다.

2-2. 냉장 아세톤 침전법을 이용하여 알부민과 IgG를 제거

농도가 70%인 아세톤을 만들어 -20℃에 보관한 -10℃ 온도를 갖는 차가운 아세톤 수용액을 준비하였다. 정상인 20명과 심근경색 환자 33명의 혈장시료 1.8 ml에 아세톤 수용액 7.2 ml을 넣고 잘 섞은 후, -20℃에 시료를 2시간 동안 보관하였다. 이후, 원심분리기를 이용하여 13000 g, 4℃에서 10분 동안 원심분리를 하였다. 상층액은 따로 분주하였고 펠렛은 아세톤수용액 3.6 ml로 세척하여 같은 조건으로 원심분리를 한 후 분리된 상층액을 첫 번째 분주한 상층액과 혼합하였다. 펠렛은 위의 방법으로 다시 한번 세척하여 분리된 상층액은 첫번째, 두번째 상층액과 혼합하여 기체질소(Sinyang, Seoul, Korea)로 아세톤을 증발시키고 동결건조기(Freeze-Dryer)로 수용액을 밤새 건조하여, 분말상태로 -20℃에 분석 시까지 보관하였다. 펠렛은 상온에서 5 ~ 10분 동안 말린 후, -20℃에서 분석 시까지 보관하였다.

3. 단백질의 트립신 분해

상기 1에서 얻은 시료(알부민, IgG제거 혈장 단백질)와 상기 2-2에서 얻은 시료인 분말상태의 상층액과 펠렛을 각각 50 mM 암모니윰 바이카보네이트 버퍼(ammonium bicarbonate buffer) 100 μl와 1 ml로 녹였다. 500 mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol)을 준비하여 시료에 넣어 최종농도를 20 mM로 만든 후, 60℃에서 한 시간 동안 보관하였다. 이후, 1 M 요오드아세트아미드(Iodoacetamide)를 만들어 최종농도가 40 mM이 되도록 시료에 넣어준 후, 상온에서 30분 동안 어두운 곳에서 보관하였다. 다시 500 mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol)의 최종농도가 10 mM이 되도록 시료에 넣은 후, 트립신(trypsin)을 1:30 비율(트립신: 단백질, w/w)로 처리하여 37℃에서 24시간 동안 보관하였다. 24시간 후에는 트립신 반응을 멈추기 위해 -20℃에 분석 시까지 보관하였다.

4. 염의 제거

상기 3에서 트립신 처리된 시료를 10% 아세토나이트릴 (J.T Baker, Center Valley, PA, USA)로 10배 희석한 후, 14000 g, 4℃에서 5분 동안 원심 분리하여 펠렛을 제거하였다. Oasis®1cc extraction cartridges(Waters corporation, Milford, MA, USA)는 1 ml 메탄올(J.T Baker, Center Valley, PA, USA)과 1 ml 증류수(Millipore, Molsheim, France)를 주입하여 먼저 활성화시켰다. 준비된 시료를 주입하여 천천히 흘러내려가게 한 후, 1 ml 증류수로 두 번 세척하였다. 1 ml 50% 메탄올로 시료를 천천히 추출하여 분주하였다. 추출된 시료는 동결건조기로 밤새 건조하여 분말상태로 -20℃에 분석 시까지 보관하였다.

5. 액체크로마토그래피-질량분석기 (LC-MS/MS)를 이용한 분석

상기 4의 시료인 알부민과 IgG가 제거되고 트립신으로 분해된 혈장시료를 0.2% 포름산(formic acid) (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)가 포함된 증류수 35 μl로 녹인 후, LTQ Orbitrap Velos Pro 질량분석기(Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA)와 연결된 Ultimate 3000 액체크로마토그래피(Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 용매는 0.2% 포름산(formic acid)과 아세토나이트릴 (acetonitrile, ACN)이 포함된 90% 증류수와 0.2% 포름산(formic acid)이 포함된 10% 증류수를 제조하였다. 컬럼 (Aeris widepore 3.6 μm XB-C18, 100 x 1.7 mm)은 SUNGMOON SYSTECH LTD., CO.(Seoul, Korea)에서 구입하여 연결하였고, 두 용매는 0.350 ml/min으로 30분 동안 흘려주었다. 사용된 용매의 조성과 이동속도는 아래 표 1과 같다.

[표 1] LC 분리를 위한 시간에 따른 용매의 조성(%) 및 이동속도(ml/min)

6. Mascot를 이용한 단백질 및 펩타이드 동정

액체크로마토그래피-질량분석기를 통해 검출된 피크는 Mascot (Matrix science Inc. Boston, MA, USA) 프로그램을 이용하여 단백질 동정을 실시하였다. NCBI human data base를 사용하였고, 서로 다른 그룹간의 통계적 처리는 chi-square test를 사용하였고, 정상인과 환자군의 바이오 마커 조각 펩타이드의 측정값을 비교하는 그래프는 Tukey multiple comparison을 사용하였다. 특이도 (specificity), 민감도(sensitivity), 및 ROC(receiver operating curves)는 MedCalc ver 7.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium)를 사용하여 계산하였다. P값은 student’s t-test를 사용하였고, 계산된 P값이 0.05보다 작으면 통계적으로 유의미하다고 판단하였다.

도 1a는 종래의 상업적 키트인 ProteoExtract™ Albumin/IgG removal kit와 냉장 아세톤 침전법을 이용하여 얻은 시료에서 공통적으로 발견된 단백질의 조각 펩타이드 리스트이다. 도 1a를 통해, 피브리노겐 알파, 베타, 감마(Fibrinogen α, β, γ), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 옵스큐린(Obscurin), 티틴(Titin), 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈(2-hydroxyacylsphingosine 1-beta-galactosyltransferase), 피에이치-인터렉팅 프로테인(PH-interacting protein)이 정상인에 비해 급성 심근경색 환자에게서 높게 발현되어 있음을 확인하였고, 클러스터린(Clusterin)은 정상인에 비해 급성 심근경색 환자에게서 낮게 발현되어 있음을 확인하였다.

도 1b는 냉장 아세톤 침전법과 상용키트 ProteoExtract™ Albumin/IgG removal kit를 사용하여 주단백질을 제거한 후 Mascot Search를 통해서 동정한 단백질로서, 상기 방법 중 한 가지 방법으로만 발견된 단백질의 조각 펩타이드 리스트이다. 도 1b를 통해, 징크 핑거 프로테인 736(Zinc finger protein 736), 안옥타민-2(Anoctamin-2), 시냅신-3(Synapsin-3), 퓨터티브 언캐릭터라이즈드 프로테인 FLJ36797(Putative uncharacterized protein FLJ36797), 트랜스크립션 팩터 25(Transcription factor 25), 유디피-글루코스 6-디하이드로게네이즈(UDP-glucose 6-dehydrogenase), 프리즐드-5(Firizzled-5), 프로버블 트레오닌-티알엔에이 라이게이즈 2(Probable threonine-tRNA ligase 2), 이소펜테닐-다이포스페이트 델타-아이소머레이즈 1(Isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase 1), 아담티에스-라이크 프로테인 3(ADAMTS-like protein 3)는 정상인에 비해 급성 심근경색 환자에게서 높게 발현되어 있음을 확인하였고, 켈히-라이크 프로테인 42 (Kelch-like protein 42)는 정상인에 비해 급성 심근경색 환자에게서 낮게 발현되어 있음을 확인하였다.

6-1. 바이오 마커 후보군 선정

도 1a과 도 1b의 결과를 바탕으로, 정산인과 환자군의 시료에서 레벨의 증감이 많이 차이나는 단백질을 선정하여 최종적으로 도 2에 나타내었다. 도 2는 정상인과 환자시료에서 차이가 나게 측정된 단백질의 조각 펩타이드의 m/z 값, z값, 측정값의 평균과 표준편차(정상인: n=14, AMI: n=19), 및 P 값을 정리한 것이다. 피브리노겐 베타, 안티트롬빈, 클러스터린, 옵스큐린, 시냅신-3, 켈히-라이크 프로테인 42인 6 가지 단백질의 조각 펩타이드를 측정했을 때, 가장 P값이 크고, 특이도와 민감도가 높은 통계결과를 보여주었다.

구체적으로, 도 3a는 정상인과 환자 시료에 대해 피브리노겐 베타의 조각펩타이드를 측정한 결과이고, 도 3b는 피브리노겐 베타의 ROC(Receiver Operating Curve) 결과이다. 도 4a와 도 4b는 안티트롬빈-III, 도 5a와 도 5b는 옵스큐린(Obscurin), 도 6a와 도 6b는 시냅신-3(Synapsin-3), 도 7a와 도 7b는 클러스터린(Clusterin), 도 8a와 도 8b는 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)의 결과를 각각 나타낸 것이다.

상기 결과를 통해, 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 옵스큐린(Obscurin), 및 시냅신-3(Synapsin-3) 중 하나 이상의 수치가 정상 대조군에 비하여 높으면 심혈관 질환이 있다고 진단하고, 상기 대상자의 클러스터린(Clusterin), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42) 중 하나 이상의 레벨이 정상 대조군에 비하여 낮으면 심혈관 질환이 있다고 진단할 수 있다. 이처럼 본 발명에서 선정한 신규 바이오 마커 후보군은 특이도는 80% 이상이고, 민감도는 90% 이상으로 심혈관 질환을 조기 진단하는데 높은 신뢰성을 보여주고 있다.

6-2. 불안정 협심증 진단

급성 심근경색(AMI) 환자 시료의 마커 후보군인 상기 6개의 조각 펩타이드를 대상으로, 불안정성 협심증 (Unstable Angina, UA) 환자 시료를 측정하였다. 측정결과를 도 9에 나타내었다. 도 9는 측정값 (평균과 표준편차, n=19), 시퀀스, P 값 (UA vs. Control or AMI vs. UA)을 정리한 표이다.

옵스큐린과 시냅신-3는 불안정성 협심증(UA) 환자시료에서도 정상인과 유의미하게 차이나게 발현되므로, 급성 심근경색(AMI)이 발병하기 이전에 급성 심근경색(AMI) 위험군 환자를 확인할 수 있는 조기 진단 바이오 마커로 그 의미가 있음을 알 수 있다.

6-3. 정산인과의 비교

본 발명에서 선정한 상기 6개의 심혈관 질환 바이오 마커 후보군 단백질의 조각 펩타이드의 측정값을 비교하여 도 10에 나타내었다. 도 10을 보면, 정상인 (Healthy Controls)에 비해, 급성심근경색(AMI), 불안정 협심증(UA) 환자군에서 유의미하게 증가되었는지를 보여준다.

따라서, 본 발명에 따른 신규 바이오 마커 후보군인 피브리노겐 베타, 안티트롬빈, 클러스터린, 옵스큐린, 시냅신-3, 켈히-라이크 프로테인 42인 6종의 단백질은 각각 또는 동시에 측정함으로써, 민감도 90% 이상, 특이도 80% 이상의 높은 예측 적중률을 얻을 수 있는 진단 키트로 제공될 수 있으며, 이는 급성 심근경색과 불안정 협심증 진단에 관한 정보를 제공하는데 유용하게 이용될 것이다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A composition for early diagnosis of cardiovascular disease, a kif for early diagnosis of cardiovascular disease, and method for information for early diagnosis of cardiovascular disease <130> K08610_DP-2016-0593 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen beta <400> 1 Met Gly Pro Thr Glu Leu Leu Ile Glu Met Glu Asp Trp Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Antithrombin-III <400> 2 Glu Gln Leu Gln Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Clusterin <400> 3 Ala Ser Ser Ile Ile Asp Glu Leu Glu Phe Gln Asp Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Obscurin <400> 4 Phe Ile Glu Asp Val Lys 1 5 <210> 5 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Synapsin-3 <400> 5 Arg Leu Ser Asp Ser Ser Phe Met Ala Asn Leu Pro Asn Gly Tyr Met 1 5 10 15 Thr Asp Leu Gln Arg Pro Asp Ser Ser Thr Ser Ser Pro Ala Ser Pro 20 25 30 Ala Met Glu Arg Arg 35 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Kelch-like protein 42 <400> 6 Ser Ala Glu Glu Met Val Gln Ile Arg 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen alpha <400> 7 Leu Glu Val Asp Ile Asp Ile Lys 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen alpha <400> 8 Asn Ser Leu Phe Glu Tyr Gln Lys 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen alpha <400> 9 Ala Leu Thr Asp Met Pro Gln Met Arg 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen alpha <400> 10 Gly Ser Glu Ser Gly Ile Phe Thr Asn Thr Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen alpha <400> 11 Gly Leu Ile Asp Glu Val Asn Gln Asp Phe Thr Asn Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen alpha <400> 12 Glu Ser Ser Ser His His Pro Gly Ile Ala Glu Phe Pro Ser Arg 1 5 10 15 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen alpha <400> 13 His Arg His Pro Asp Glu Ala Ala Phe Phe Asp Thr Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15 Lys <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen gamma <400> 14 Leu Asp Gly Ser Val Asp Phe Lys 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen gamma <400> 15 Met Leu Glu Glu Ile Met Lys 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen gamma <400> 16 Asp Thr Val Gln Ile His Asp Ile Thr Gly Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen gamma <400> 17 Tyr Glu Ala Ser Ile Leu Thr His Asp Ser Ser Ile Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Fibrinogen gamma <400> 18 Tyr Leu Gln Glu Ile Tyr Asn Ser Asn Asn Gln Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Titin <400> 19 Ile Val Val Pro Leu Lys 1 5 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Anoctamin-2 <400> 20 Met Lys Asn Leu Ser Tyr Pro Phe Ser Arg Glu Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase I <400> 21 Gln Gln Val Gln Leu Leu Ala Glu Met Cys Ile Leu Ile Asp Glu Asn 1 5 10 15 Asp Asn Lys <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of Probable threonine-tRNA ligase 2 <400> 22 Met Asn Pro Gly Asp Gly Ala Phe Tyr Gly Pro Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment of 2-hydroxyacylsphingosine 1-beta-galactosyltransferase <400> 23 Tyr Asn Leu Leu Pro Glu Lys 1 5

Claims

안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하며,
상기 안티트롬빈-III 단백질의 발현 수준은 서열번호 2 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 시냅신-3 단백질의 발현 수준은 서열번호 5 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 켈히-라이크 프로테인 42 단백질의 발현 수준은 서열번호 6 펩타이드 조각의 발현 수준인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심분리하여 주단백질인 알부민과 IgG를 제거하여 추출된 시료로부터 선별된 것인 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 생체시료는 혈장(plasma), 뇨(urine), 객담(sputum), 세럼(serum)인 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 특이적인 항체인 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론항체인 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 피브리노겐 알파(Fibrinogen α), 피브리노겐 감마(Fibrinogen γ), 티틴(Titin), 안옥타민-2(Anoctamin-2), 아이소펜터닐-다이포스페이트 델타 아이소머레이즈 I(Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase I), 프로버블 트레오닌-티알앤에이 라이게이즈 2(Probable threonine-tRNA ligase 2), 및 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈(2-hydroxyacylsphingosine 1-beta-galactosyltransferase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하며,
상기 피브리노겐 베타 단백질의 발현 수준은 서열번호 1 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 클러스터린 단백질의 발현 수준은 서열번호 3 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 옵스큐린 단백질의 발현 수준은 서열번호 4 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 피브리노겐 알파의 발현 수준은 서열번호 7 내지 서열번호 13의 펩타이드 조각 중 어느 하나 이상의 발현 수준이며,
상기 피브리노겐 감마의 발현 수준은 서열번호 14 내지 서열번호 18의 펩타이드 조각 중 어느 하나 이상의 발현 수준이며,
상기 티틴 단백질의 발현 수준은 서열번호 19 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 안옥타민-2 단백질의 발현 수준은 서열번호 20 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 아이소펜터닐-다이포스페이트 델타 아이소머레이즈 I 단백질의 발현 수준은 서열번호 21 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 프로버블 트레오닌-티알앤에이 라이게이즈 2 단백질의 발현 수준은 서열번호 22 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈 단백질의 발현 수준은 서열번호 23 펩타이드 조각의 발현 수준인, 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 또는 불안정 협심증(Unstable Angina)인 심혈관 질환 조기 진단용 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 심혈관 질환 조기 진단용 키트.
심혈관 질환 조기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
대상자로부터 채취한 생체시료로부터 안티트롬빈-III(Antithrombin-III), 시냅신-3(Synapsin-3), 및 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 함량을 측정하고 정상 대조군과 대비하여 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 포함하며,
상기 안티트롬빈-III 단백질의 함량은 서열번호 2 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 시냅신-3 단백질의 함량은 서열번호 5 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 켈히-라이크 프로테인 42 단백질의 함량은 서열번호 6 펩타이드 조각의 발현 수준인, 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법.
제 9 항에 있어서,
상기 대상자의 생체시료 내에 안티트롬빈-III(Antithrombin-III) 및 시냅신-3(Synapsin-3) 중 하나 이상의 수치가 정상 대조군에 비하여 높으면 심혈관 질환이 있다고 진단하고,
상기 대상자의 생체시료 내에 켈히-라이크 프로테인 42(Kelch-like protein 42)의 수치가 정상 대조군에 비하여 낮으면 심혈관 질환이 있다고 진단하는 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단백질은 생체시료에 50 ~ 80%의 농도의 -70℃ ~ 0℃ 온도를 갖는 냉장 아세톤 수용액을 넣고 원심분리하여 주단백질인 알부민과 IgG를 제거하여 추출된 시료로부터 선별된 것인 심혈관 질환 조기진단을 위한 정보 제공방법.
제 11 항에 있어서, 생체시료는 혈장(plasma), 뇨(urine), 객담(sputum), 세럼(serum)인 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법.
제 9 항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 또는 불안정 협심증(Unstable Angina)인 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단백질은 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 클러스터린(Clusterin), 옵스큐린(Obscurin), 피브리노겐 알파(Fibrinogen α), 피브리노겐 감마(Fibrinogen γ), 티틴(Titin), 안옥타민-2(Anoctamin-2), 아이소펜터닐-다이포스페이트 델타 아이소머레이즈 I(Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase I), 프로버블 트레오닌-티알앤에이 라이게이즈 2 Probable threonine-tRNA ligase 2), 및 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈(2-hydroxyacylsphingosine 1-beta-galactosyltransferase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함하며,
상기 피브리노겐 베타 단백질의 함량은 서열번호 1 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 클러스터린 단백질의 함량은 서열번호 3 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 옵스큐린 단백질의 함량은 서열번호 4 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 피브리노겐 알파의 함량은 서열번호 7 내지 서열번호 13의 펩타이드 조각 중 어느 하나 이상의 발현 수준이며,
상기 피브리노겐 감마의 함량은 서열번호 14 내지 서열번호 18의 펩타이드 조각 중 어느 하나 이상의 발현 수준이며,
상기 티틴 단백질의 함량은 서열번호 19 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 안옥타민-2 단백질의 함량은 서열번호 20 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 아이소펜터닐-다이포스페이트 델타 아이소머레이즈 I 단백질의 함량은 서열번호 21 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 프로버블 트레오닌-티알앤에이 라이게이즈 2 단백질의 함량은 서열번호 22 펩타이드 조각의 발현 수준이며,
상기 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈 단백질의 함량은 서열번호 23 펩타이드 조각의 발현 수준인, 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법.
제 14 항에 있어서, 상기 피브리노겐 베타(Fibrinogen β), 옵스큐린(Obscurin), 피브리노겐 알파(Fibrinogen α), 피브리노겐 감마(Fibrinogen γ), 티틴(Titin), 안옥타민-2(Anoctamin-2), 아이소펜터닐-다이포스페이트 델타 아이소머레이즈 I(Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase I), 프로버블 트레오닌-티알앤에이 라이게이즈 2(Probable threonine-tRNA ligase 2), 및 2-하이드록시아실스핑고신 1 베타-갈락토실트랜스퍼레이즈(2-hydroxyacylsphingosine 1-beta-galactosyltransferase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 수치가 정상 대조군에 비하여 높으면 심혈관 질환이 있다고 진단하는 심혈관 질환 조기 진단을 위한 정보 제공방법.