CN111656196A - 肾癌的检测方法和检查试剂 - Google Patents

Abstract

课题在于提供检测肾癌的方法及能用于前述方法的试剂。一种检测肾癌的方法，其特征在于，测定患者来源的待检体中的TFPI2量。另外，肾癌的检测试剂中包含特异性识别NT‑TFPI2和完整的TFPI2的抗体。

Description

肾癌的检测方法和检查试剂

技术领域

本发明涉及以组织因子途径抑制剂2(Tissue Factor Pathway Inhibitor 2；TFPI2)作为测定对象的肾癌的检测方法和检测试剂。

背景技术

据统计除膀胱癌之外的肾·泌尿系统癌症的发病率推断每10万人有19.5人(国家癌症研究中心癌症控制信息中心2013年)，近些年一直趋于增加。由于肾癌缺乏自觉症状，因此大多数情况会在体检、综合性健康检查等中偶然发现，被认为是难以在早期发现的癌症。

肾癌的治疗原则上为外科切除，但作为药物疗法而适宜使用了抑制血管新生的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、mTOR抑制剂等分子靶向药、及免疫检查点抑制剂等。

肾癌的血液检查存在对红细胞沉淀速度进行定量的红细胞沉降率、c反应蛋白(CRP：C-reactive protein)及免疫抑制酸性蛋白(IAP：Immunosuppressive AcidicProtein)等。然而，这些均是以由癌症间接诱发的炎症反应所产生的因子作为对象，作为肿瘤标记物的有用性尚未定论。因此，目前超声波检查、基于CT、MRI的图像诊断被认定为最有效的检查方法。然而，CT会担心有放射线暴露，由图像诊断所产生的患者负担绝对不低。因此，迫切期望更简便且通过患者负担少的血液检查进行的肾癌检测方法。

然而，组织因子途径抑制剂2(TFPI2)是与胎盘蛋白5(Placental Protein 5；PP5)相同的蛋白质，是包含3个Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域的胎盘来源丝氨酸蛋白酶抑制剂。对于TFPI2与癌症的相关性，本发明人的荒川等人证实了卵巢癌中由透明细胞癌细胞株特异性产生TFPI2；卵巢癌患者组织中的基因表达仅在透明细胞癌患者中特异性升高(专利文献1)，并发现与健康的人和子宫内膜症例相比，血液中TFPI2在透明细胞癌中显著升高(专利文献2、非专利文献1)。另外，还公开了通过测定TFPI2来检测卵巢透明细胞癌的方法(专利文献3、非专利文献2)。

对于TFPI2与肾癌的相关性，启示出：通过添加绿茶中包含的表没食子儿茶素没食子酸酯(ECGC)而使人肾癌细胞株中的TFPI2表达量增加，抑制细胞增殖并诱导凋亡(非专利文献3)。然而到目前为止，尚未有报道有关TFPI2在肾癌中的血液动力学，尚不清楚TFPI2是否能用于检测肾癌。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5224309号

专利文献2：日本专利第6074676号

专利文献3：国际公开第2016/084912号

非专利文献

非专利文献1：J.Proteome Res.，2013，12(10)，pp 4340-4350

非专利文献2：PloS one 11.10(2016):e0165609.

非专利文献3：Oncology reports 21.3(2009):635-640.

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供肾癌的检测方法及能用于前述方法的试剂。

用于解决问题的方案

本发明人等进行了深入研究，结果发现在多个肾癌细胞株培养上清液中分泌有TFPI2，与健康的人相比，血液中TFPI2在肾癌患者中显著升高，而想到TFPI2能检测出肾癌，完成了本发明。

即，本发明包括以下的方式。

[1]一种检测肾癌的方法，其包括测定待检体中TFPI2量。

[2]根据[1]所述的方法，其中，在前述TFPI2量的测定值超过预设的基准值时，作为检测出肾癌。

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，前述TFPI2量为TFPI2加工多肽量和完整的TFPI2量的总计。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，前述TFPI2量的测定通过使用了与抗原决定簇结合的抗体的抗原抗体反应来进行，所述抗原决定簇在序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内。

[5]根据[4]所述的方法，其中，前述抗体是识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。

[6]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，使用质谱分析法进行测定。

[7]一种用于检测肾癌的试剂，其包含与抗原决定簇结合的抗体，所述抗原决定簇在序列号1所示的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内。

发明的效果

根据本发明，可提供简便且以高精度检测肾癌的方法及能用于前述方法的试剂。

附图说明

图1是示出细胞株培养上清液中的TFPI2量的图。第1纵轴表示TFPI2测定值，第2纵轴表示细胞数。

图2是用箱形图(Box Plot)示出健康的人组和肾癌患者组中的TFPI2测定值的图。纵轴表示血液中TFPI2量。

图3是示出健康的人组和肾癌组的受试者工作特征(ROC)曲线的图。纵轴表示灵敏度、横轴表示100％-特异性。

图4是用箱形图(Box Plot)示出以组织学恶性程度分类的肾癌组中的TFPI2测定值的图。纵轴表示TFPI2测定值。

图5是示出肾癌肿瘤直径与TFPI2测定值的相关性的图。纵轴表示TFPI2测定值、横轴表示肿瘤直径。

图6是用箱形图(Box Plot)示出以有无转移分类的肾癌组中的TFPI2测定值的图。纵轴表示TFPI2测定值。

图7用箱形图示出实施例7中的TFPI2测定值的图。

图8用箱形图示出实施例8中的TFPI2测定值的图。

图9是示出用于识别实施例8中的健康的人和肾癌患者的ROC曲线解析的结果的图。

具体实施方式

＜1＞本发明的检测肾癌的方法

本发明的第一方式为检测肾癌的方法，其包括测定待检体中TFPI2量。该方法是基于与健康的待检体相比在肾癌的血液等生物体试样中特征性存在TFPI2的方法。待检体中的TFPI2量的测定通常在体外(in vitro)进行。利用该方法，如后述的实施例所示，能够以高灵敏度和特异性检测出肾癌。

需要说明的是，本发明的方法包括直至检测出肾癌的阶段，并不包括有关肾癌诊断的最终判断行为。医生通过参考基于本发明的方法的检测结果等来诊断肾癌或制定治疗方针。

本发明中所测定的TFPI2没有特别限定，例如可以是完整的TFPI2(以下也记为“I-TFPI2”)、TFPI2加工多肽(以下也记为“NT-TFPI2”)或它们两者。

序列号1示出基于人TFPI2的cDNA的氨基酸序列。在序列号1中，从起始蛋氨酸到第22位残基的甘氨酸为止为信号肽。

“完整的TFPI2”是指由序列号1的氨基酸序列的从第23位残基到第235位残基所示的肽。

另外，如专利文献3所述，“NT-TFPI2”是包含位于完整的TFPI2的N末端侧的Kunitz结构域1的肽片段。更具体而言，NT-TFPI2是如下肽：至少包含序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的序列的肽；或者是包含与前述序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的肽。前述同一性优选为90％以上，更优选为95％以上。另外，该多肽可以是由在前述序列中缺失、置换、插入和/或附加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽。需要说明的是，多个是指优选为2个～20个、更优选为2个～10个、进一步优选为2个～5个。另外，在前述序列的两侧还可以具有其它肽片段，但优选不具有识别TFPI2的Kunitz结构域3的抗体的抗原决定簇。

本发明中的患者来源的待检体(被检试样)可列举出全血、血细胞、血清、血浆等血液成分、细胞或组织的提取液、尿、脑脊液等。另外，还可将肾组织活检样品作为检查对象，但在此情况下对活检试样的提取液或培养上清液进行测定。将血液成分、尿等体液用作待检体时，能够简便且非侵入式地进行而优选，若考虑到待检体采集的容易性、与其它检查项目的通用性，而特别优选将血液成分用作待检体。待检体的稀释倍率根据所使用的待检体的种类、状态而从无稀释至100倍稀释中适宜选择。

另外，本发明中的待检体的采集时期没有特别限定。例如，可以是从通过图像诊断等怀疑肾癌而实施精密检查的术前开始到通过术后的病理检查而确诊为肾癌后的经过观察时为止的任意时期，在确诊前后、治疗开始前后等任意阶段采集的待检体均能够供于本发明的方法。

本发明的检测方法中，通过测定而得到的TFPI2量在超过预设的基准值(截止值(Cut off值))时，优选判定为检测出了肾癌。此处，TFPI2量可以是完整的TFPI2量、NT-TFPI2量或完整的TFPI2量和NT-TFPI2量的总计中的任一者，但从兼顾测定的容易度与充分的灵敏度/特异性这两者的观点出发，更优选完整的TFPI2量和NT-TFPI2量的总计。

用于判定的基准值可以是测定值或换算浓度值中的任一者。需要说明的是，换算浓度值是指基于将TFPI2作为标准试样而制作的标准曲线而由测定值换算的值。

判定为肾癌的基准值(截止值(Cut off值))可以适宜设定为通过分别测定健康的人和肾癌并通过受试者工作特征(ROC)曲线解析显示出最佳的灵敏度和特异性的测定值。例如，TFPI2的基准值如后述的实施例所示，血浆的情况，可以设定为219pg/mL，血清的情况，可以设定为189pg/mL或200pg/mL，但不限定于此。

以下对TFPI2的测定方法进行说明。

本发明中，可以单独测定待检体中的NT-TFPI2量或完整的TFPI2量，另外，还可以将该值相加而作为总计量。另外，可以通过能够一次性测定待检体中的NT-TFPI2和完整的TFPI2的总计量的测定系统来测定。或者，如后所述，还可以由基于两者的测定的总计量和完整的TFPI2单独的测定量来间接地测定NT-TFPI2量。

本发明的方法中，测定NT-TFPI2量和/或完整的TFPI2量的方法没有特别限制。例如，可以示例出利用使用识别NT-TFPI2和/或完整的TFPI2的抗体的抗原抗体反应的方法、利用质谱分析法的方法。

(a)使用标记的测定对象和识别测定对象的抗体，利用标记的测定对象和待检体中包含的测定对象与前述抗体竞争性结合的竞争法。

(b)使待检体与固定化有识别测定对象的抗体的芯片接触，检测依赖于该抗体与测定对象的结合的信号的使用了表面等离子共振的方法。

(c)使用识别荧光标记的测定对象的抗体，利用了由于该抗体与测定对象结合而荧光偏光度上升的荧光偏光免疫测定法。

(d)使用表位不同的2种识别测定对象的抗体(其中1种为进行了标记的抗体)，形成该2个抗体与测定对象这3者的复合体的夹心法。

(e)作为前处理通过识别测定对象的抗体将待检体中的测定对象浓缩后，通过质谱分析装置等来检测该结合蛋白的多肽的方法。

(d)、(e)的方法简便且通用性高，在处理多待检体方面，从已充分确立了有关试剂和装置的技术方面考虑，更优选(d)的方法。

利用抗原抗体反应来测定NT-TFPI2量和/或完整的TFPI2量的方法具体可列举出以下的方法。

(A)使用识别NT-TFPI2和完整的TFPI2这两者的抗体，测定NT-TFPI2和完整的TFPI2的总计量的方法(NT+I-TFPI2测定系统)。需要说明的是，识别前述NT-TFPI2和完整的TFPI2这两者的抗体优选为：与序列号1表示的TFPI2氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体，进一步优选为具有针对TFPI2的Kunitz结构域1的抗原识别位点的抗体。另外，在该方法中使用前述夹心法的情况，通常前述抗体使用表位不同的2种。

(B)使用不识别NT-TFPI2而识别完整的TFPI2的抗体，测定完整的TFPI2单独的量的方法(I-TFPI2测定系统)。需要说明的是，不识别前述NT-TFPI2而识别完整的TFPI2的抗体优选为具有针对TFPI2的Kunitz结构域3的抗原识别位点的抗体。另外，在该方法中使用前述夹心法的情况，通常前述抗体使用表位不同的2种抗体，其中至少1种使用不识别NT-TFPI2而识别完整的TFPI2的抗体、另1种可以是不识别NT-TFPI2而识别完整的TFPI2的抗体，或者可以是识别NT-TFPI2和完整的TFPI2这两者的抗体。

(C)通过从利用(A)的NT+I-TFPI2测定系统测定的NT-TFPI2和完整的TFPI2的总计量中减去利用(B)的I-TFPI2测定系统测定的完整的TFPI2单独量，从而计算出NT-TFPI2单独的量的方法。

(D)使用不识别完整的TFPI2而识别NT-TFPI2的抗体，测定NT-TFPI2单独的量的方法。需要说明的是，不识别前述完整的TFPI2而识别NT-TFPI2的抗体例如可列举出特异性识别NT-TFPI2的C末端部分的肽序列的抗体。使用前述夹心法的情况，例如，将该抗体作为固相抗体，将具有针对Kunitz结构域1的识别位点的抗体作为检测抗体。

对于本发明的检测肾癌的方法，可以将利用前述(C)、(D)的方法测定的NT-TFPI2单独的量用于判定的基准，但将利用(A)的方法测定的NT-TFPI2和完整的TFPI2的总计量用于判定的基准也可以得到充分的灵敏度和特异性，而且从抗体的获得容易度、测定为一个阶段而简便方面考虑，更优选后者。

识别NT-TFPI2和/或完整的TFPI2的抗体可以通过将NT-TFPI2多肽或蛋白质、完整的TFPI2多肽或由TFPI2蛋白质的部分区域组成的寡肽、编码NT-TFPI2多肽或TFPI2蛋白质的完整区域或部分区域的多核苷酸等作为免疫原并对动物进行免疫而获得。前述蛋白质或前述寡肽、多肽未反映出生物体内的TFPI2的立体结构或者在制备过程中其结构可能发生变化。因此，得到的抗体可能对期望的生物体内的TFPI2不具有高特异性、结合力，即使使用本抗体来构建测定系统，结果也有可能无法准确地对待检体中包含的TFPI2浓度进行定量。

另一方面，通过使用包含编码TFPI2多肽或完整的TFPI2蛋白质的完整区域或部分区域的多核苷酸的表达载体作为免疫原，从而在免疫动物的体内表达TFPI2多肽或完整的TFPI2蛋白质的完整的或部分区域而引发免疫应答，因此可以得到对待检体中的TFPI2具有高特异性和结合力(即，高亲和性)的抗体，故而更优选。

免疫中使用的动物只要是具有抗体产生能力的动物就没有特别限定，可以是小鼠、大鼠、兔子等通常免疫中使用的哺乳动物，还可以使用鸡等鸟类。

进而，血液中还存在作为TFPI2的同系物而已知的TFPI1。因此，期望的是使用仅特异性识别TFPI2而不与TFPI1交叉的抗体。

本发明的另一方案是测定TFPI2量的试剂在制造用于检测肾癌的试剂中的应用。此处，测定前述TFPI2量的试剂优选为测定TFPI2加工多肽量和完整的TFPI2量的总计的试剂。另外，测定前述TFPI2量的试剂优选为与序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体，更优选为识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。

因此，本发明还可以称为与抗原决定簇结合的抗体在制造用于检测肾癌的试剂中的应用，所述抗原决定簇在序列号1所示的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内。

另外，本发明还可以称为与抗原决定簇结合的抗体在检测肾癌中的应用，所述抗原决定簇在序列号1所示的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内。

识别TFPI2的抗体可以是单克隆抗体，还可以是多克隆抗体，优选为单克隆抗体。

可以从确立了技术的方法中适宜选择来进行产生识别TFPI2的抗体的杂交瘤细胞的树立。作为一个例子，可以通过如下方式树立产生识别TFPI2的单克隆抗体的杂交瘤细胞：从利用前述方法进行了免疫的动物采集B细胞，使前述B细胞与骨髓瘤细胞电融合或在聚乙二醇的存在下融合，通过HAT培养基来选择产生期望的抗体的杂交瘤细胞，利用极限稀释法对所选择的杂交瘤细胞进行单克隆化。

本发明中使用的识别TFPI2的单克隆抗体的选定可以基于针对源自宿主表达系统的糖基化磷酯酰肌醇(GPI：glycosylphosphatidylinositol)锚定型TFPI2或分泌型TFPI2的亲和性来进行。

需要说明的是，作为前述宿主，没有特别限定，本领域技术人员从在蛋白质的表达中通常使用的大肠杆菌、酵母等微生物细胞、昆虫细胞、动物细胞中适宜选择即可，但优选使用通过二硫键或糖链附加这样的翻译后修饰而能够表达具有与天然型的TFPI2近似的结构的蛋白质的哺乳细胞作为宿主。作为哺乳细胞的一个例子，可列举出目前使用的人胚肾脏来源细胞(HEK)293T细胞株、猴肾脏细胞COS7株、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或由人分离的癌细胞等。

本发明中使用的抗体的纯化从确立了技术的方法中适宜选择即可。作为一个例子，对利用前述方法树立的产生抗体的杂交瘤细胞进行培养后，回收该培养上清液，根据需要进行通过硫酸铵沉淀的抗体浓缩后，通过使用了固定化有蛋白A、蛋白G或蛋白L等的载体的亲和色谱法和/或离子交换层析法而能够进行抗体的纯化。

需要说明的是，对于在利用前述夹心法进行抗原抗体反应时使用的标记的抗体，利用过氧化酶、碱性磷酸酶等酶对利用前述方法而纯化的抗体进行标记即可，该标记也可以使用确立了技术的方法。

本发明的方法中，以下对利用质谱分析法来测定TFPI2量的方法进行具体地说明。

待检体为血液的情况，作为前处理工序，优选：通过Agilent Human 14等去除血液中富含的卵清蛋白、免疫球蛋白、运铁蛋白等主要蛋白后，利用离子交换、凝胶过滤或反相HPLC等进行进一步分级。或者，还可以通过使用了抗TFPI2抗体的免疫方法而仅特异性回收TFPI2。

测定可以通过串联质谱分析(MS/MS)、液相色谱·串联质谱分析(LC/MS/MS)、基质辅助激光解吸电离化飞行时间型质谱分析(matrix assisted laser desorptionionization time-of-flight mass spectrometry、MALDI-TOF/MS)、表面增强激光解吸电离质谱分析(surface enhanced laser desorption ionization mass spectrometry、SELDI-MS)等进行。

＜2＞本发明的用于检测肾癌的试剂

将本发明的试剂用于前述夹心法的情况，优选包含表位不同的2种抗体作为前述抗体。

本发明的试剂中包含的抗体可以是抗体本身，还可以经标记，还可以固定化于固相中。

本发明的试剂中，以下对作为前述夹心法的一个方式的用于2步夹心法的情况进行具体地说明。但是，本发明不限定于此。

首先，本发明的试剂可以利用以下的(I)至(III)所示的方法来制作。

(I)首先，使夹心法中使用的、识别TFPI2且表位不同的2种抗体(以下称为“抗体1”和“抗体2”)中的抗体1与免疫板、磁性颗粒等能进行B/F(结合/游离)分离的载体结合。结合方法可以是利用了疏水键的物理性结合，还可以是利用了能使2种物质间交联的连接试剂等的化学性结合。

(II)使载体与前述抗体1结合后，为了避免非特异性结合，用牛血清卵清蛋白、脱脂乳、市售的免疫分析用封闭剂等对载体表面进行封闭处理而制成1次试剂。

(III)标记另一抗体2，准备包含得到的标记抗体的溶液作为2次试剂。作为对抗体2进行标记的物质，优选过氧化酶、碱性磷酸酶这样的酶、荧光物质、化学发光物质、放射性同位素等能通过检测装置进行检测的物质、或针对生物素的亲和素等存在特异性结合的对象的物质等。另外，作为2次试剂的溶液，优选可良好地进行抗原抗体反应的缓冲液、例如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。以此方式制作的本发明的试剂还可以根据需要进行冷冻干燥。

需要说明的是，1步夹心法的情况，与前述(I)～(II)同样地制作使抗体1与载体结合并进行了封闭处理的试剂，在前述抗体固定化载体中进一步添加包含标记的抗体2的缓冲液而制作试剂即可。

其次，使用利用前述方法得到的试剂，在利用2步夹心法检测、测定TFPI2时，利用以下的(IV)至(VI)所示的方法进行即可。

(IV)使(II)中制作的1次试剂和待检体在一定温度下接触一定时间。反应条件在温度4℃至40℃的范围内进行5分钟至180分钟反应即可。

(V)通过B/F分离去除未反应物质，接着在一定温度下与(III)中制作的2次试剂接触一定时间，形成夹心复合体。反应条件在温度4℃至40℃的范围内进行5分钟至180分钟反应即可。

(VI)通过B/F分离去除未反应物质，对标记抗体的标记物质进行定量，通过将已知浓度的TFPI2溶液作为标准而制作的标准曲线，对待检体中的人TFPI2进行定量。

本发明的试剂中包含的抗体等试剂成分的量根据待检体量、待检体的种类、试剂的种类、测定的方法等各条件进行适宜设定即可。具体而言，例如，如后所述使用血清、血浆20μL作为待检体，在利用夹心法进行TFPI2量的测定时，相对于使该待检体20μL与抗体反应的反应体系，与载体结合的抗体量可以为100ng至1000μg，标记抗体量可以为2ng至20μg。

本发明的试剂可以用于利用手动方法的测定，还可以用于使用自动免疫诊断装置的测定。特别是使用了自动免疫诊断装置的测定能够在不受到待检体中包含的内源性测定干扰因素、竞争酶的影响的情况下进行测定，且能够在短时间内对待检体中的TFPI2进行定量，故而优选。

本发明的检测肾癌的方法可以用于治疗肾癌的方法。

即，根据本发明，提供一种治疗被检体中的肾癌的方法，所述方法包括如下工序：

(i)对被检体进行TFPI2量的测定值超过预设的基准值的鉴定的工序；及

(ii)对鉴定为TFPI2量的测定值超过预设的基准值的前述被检体实施治疗的工序。

在治疗前述肾癌的方法的优选的方式中，前述TFPI2量为TFPI2加工多肽量和完整的TFPI2量的总计。

另外，在前述工序(i)的鉴定中，TFPI2量的测定优选通过使用了与抗原决定簇结合的抗体的抗原抗体反应来进行，所述抗原决定簇在序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内。前述抗体更优选为识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。

另外，前述工序(i)的鉴定中，TFPI2量的测定可以使用质谱分析法进行。

作为前述工序(ii)的治疗，可列举出外科切除、药物疗法、放射线疗法等，作为前述药物可列举出酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、免疫检查点抑制剂等，没有特别限定。

实施例

以下为了对本发明进行具体地说明而示出实施例，但这些实施例是示出本发明的一个例子，本发明不限定于实施例。

＜实施例1＞TFPI2测定试剂的制备

依据专利文献3的方法，使用利用DNA免疫法而得到的TFPI2抗体如下所述制备TFPI2测定试剂。

(1)使抗TFPI2单克隆抗体(TS-TF04)以成为100ng/载体的方式在室温下一个昼夜物理性吸附于水不溶性铁氧体载体上，然后用包含1％BSA的100mM Tris缓冲液(pH8.0)进行53℃、4小时封闭，由此制备了抗TFPI2抗体固定化载体。

(2)对于抗TFPI2单克隆抗体(TS-TF01)，使用碱性磷酸酶标记试剂盒(同仁化学株式会社制)制备了碱性磷酸酶标记抗TFPI2抗体。

(3)在磁力透过性的容器(容量1.2mL)中加入(1)中制备的12个抗体固定化载体后，添加包含(2)中制备的碱性磷酸酶标记抗体1μg/mL的缓冲液(包含3％BSA的Tris缓冲液、pH8.0)100μL，实施冷冻干燥，由此制作了TFPI2测定试剂。需要说明的是，制作的TFPI2测定试剂在氮气填充下实施密闭封印密封，直至测定在4℃下保管。

＜实施例2＞包括肾癌在内的各种细胞培养上清液的评价

依据常规方法在37℃下将作为正常细胞的人胚肾来源的293T细胞、作为肾癌细胞的CAKI1、ACHN和786-O细胞培养3天，回收各种培养上清液后对细胞数计数。用实施例1中制备的TFPI2测定试剂评价了仅培养基和各种培养上清液20μL。评价用装置使用全自动酶免疫分析装置AIA-2000(东曹株式会社制：制造销售登记号码13B3X90002000009)。通过全自动酶免疫分析装置AIA-2000的TFPI2的测定按以下的步骤进行。

(1)将包含样品20μL和表面活性剂的稀释液80μL自动分注在收纳有实施例1制作的TFPI2测定试剂的容器中，

(2)在37℃恒温下进行10分钟的抗原抗体反应，

(3)进行B/F分离后，用包含表面活性剂的缓冲液进行8次清洗，

(4)添加4-甲基伞形酮磷酸盐，

将每单位时间的由碱性磷酸酶产生的4-甲基伞形酮的浓度作为测定值(TFPI2强度、nmol/(L·s))。

将评价结果示于图1。与293T细胞相比，TFPI2在3种肾癌细胞培养上清液中明显显示出高值，明确了肾癌细胞在培养上清液中分泌有TFPI2。

＜实施例3＞临床待检体的评价

将以下的实施例中使用的临床待检体示于表1。肾癌血浆21例是从横滨市立大学泌尿器官科以相同方案中收集的待检体，获得知情同意的许可和横滨市立大学伦理委员会的许可而提供。健康的人血浆49例从BizCom Japan,Inc.购买。

利用实施例2记载的方法测定临床待检体，将市售TFPI2重组蛋白(R&D公司)作为标准品制作标准曲线，计算出待检体中的TFPI2浓度。

[表1]

将TFPI2测定结果的BoxPlot示于图2。证实了：与健康的人相比，TFPI2在肾癌中统计学上具有显著差异且显示出高值(曼-惠特尼U检验、p＜0.0001)。

将ROC解析结果示于图3。曲线下面积(AUC)为0.8552，TFPI2显示出具有良好的肾癌检测性能。进而，基于Youden Index((灵敏度+特异性)-100)将Youden Index最大值设为TFPI2截止值(Cut off值)。将TFPI2的截止值设为219pg/mL时，灵敏度为85.7％、特异性为75.5％，显示出具有良好的肾癌检测性能。

＜实施例4＞组织学恶性程度与TFPI2的相关性

用组织学恶性程度(级别：G)对肾癌待检体组进行分类，将各组的TFPI2测定值的BoxPlot示于图4。TFPI2为低级别的级别2与为高级别的3和4之间未观察到显著差异。根据本结果，TFPI2与组织学恶性程度无相关性，启示出即使是肾癌的初期，TFPI2的表达也有所提高。

＜实施例5＞肿瘤直径与TFPI2的相关性解析

将对肾癌肿瘤直径与TFPI2的相关性进行解析的结果示于图5。虽然TFPI2与肿瘤直径观察到较低的正相关性，但未观察到统计学上的显著差异(斯皮尔曼等级相关系数(Spearman's rank correlation coefficient)、r＝0.27、p＝0.2365)。

＜实施例6＞癌转移与TFPI2的相关性

用有无转移将肾癌待检体组分为2组，将各组的TFPI2测定值的BoxPlot示于图6。2组之间的TFPI2测定值未观察到统计学的显著差异(曼-惠特尼U检验、p＝0.5906)，未观察到TFPI2与转移存在明显的相关性。

＜实施例7＞日本健康的人中的TFPI2基准值和参考基准范围的计算

健康男性血清102例是获得知情同意许可而收集的公司内志愿者的待检体，健康女性血清120例由横滨市大获得知情同意的许可和横滨市立大学伦理委员会的许可而提供。利用实施例3记载的方法测定TFPI2，依据TFPI2的健康的人基准值(例为中央值+2SD)和CLSI准则EP28-A3计算出健康的人参考基准范围。

将TFPI2测定结果的BoxPlot示于图7，将由健康的人计算出的基准值和参考基准范围示于表2。本研究的结果是，日本健康的人在TFPI2测定值上没有差异，由健康的人的中央值+2SD计算出的TFPI2的基准值为200pg/mL。

[表2]

＜实施例8＞临床待检体的评价

肾癌血清52例(透明细胞癌：40例、乳头状癌：4例、其它肾癌：8例)是从横滨市立大学泌尿器官科以相同方案收集的待检体，获得知情同意的许可和横滨市立大学伦理委员会的许可而提供。

利用实施例3记载的方法测定TFPI2，使用实施例7记载的健康的人TFPI2测定值评价了肾癌检测性能。

图8是通过BoxPlot示出TFPI2测定值的结果。TFPI2在肾癌组织型中透明细胞癌和乳头状癌中显示出高值倾向，在其它所区分的一部分组织型中也显示出高值。

图9是对健康的人和肾癌患者进行比较时的ROC曲线解析结果。曲线下面积(AUC)为0.79，TFPI2显示出具有良好的肾癌检测性能。基于Youden Index((灵敏度+特异性)-100)，以作为Youden Index最大值的189pg/mL作为基准值时，肾癌患者与健康的人的识别性能是：灵敏度为59.6％，特异性为94.6％。

根据以上的结果，与实施例3所示的血浆同样地，对于血清也通过设定适合的基准值，从而TFPI2显示出具有良好的肾癌检测性能。

产业上的可利用性

根据本发明，可提供通过简便且患者负担相对较少的血液检查检测肾癌患者的方法。该方法可期待贡献于不存在有效的肿瘤标记物而依赖于图像诊断的肾癌诊疗，在产业上是非常有用的。

序列表

<110> 公立大学法人横滨市立大学（Public University Corporation YokohamaCity University）

东曹株式会社（TOSOH corporation）

<120> 肾癌的检测方法和检查试剂

<130> 2170172-8633

<150> JP2018-004737

<151> 2018-01-16

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 1

Met Asp Pro Ala Arg Pro Leu Gly Leu Ser Ile Leu Leu Leu Phe Leu

1 5 10 15

Thr Glu Ala Ala Leu Gly Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn

20 25 30

Ala Glu Ile Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu

35 40 45

Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe

50 55 60

Leu Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu

65 70 75 80

Ala Cys Asp Asp Ala Cys Trp Arg Ile Glu Lys Val Pro Lys Val Cys

85 90 95

Arg Leu Gln Val Ser Val Asp Asp Gln Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys

100 105 110

Tyr Phe Phe Asn Leu Ser Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly

115 120 125

Gly Cys His Arg Asn Arg Ile Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr

130 135 140

Cys Met Gly Phe Cys Ala Pro Lys Lys Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser

145 150 155 160

Pro Lys Asp Glu Gly Leu Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe

165 170 175

Asn Pro Arg Tyr Arg Thr Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly

180 185 190

Gly Asn Asp Asn Asn Phe Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys

195 200 205

Ala Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala

210 215 220

Ser Arg Ile Arg Lys Ile Arg Lys Lys Gln Phe

225 230 235

Claims (7)

1.一种检测肾癌的方法，其包括测定待检体中TFPI2量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述TFPI2量的测定值超过预设的基准值时，作为检测出肾癌。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述TFPI2量是TFPI2加工多肽量和完整的TFPI2量的总计。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述TFPI2量的测定通过使用了与抗原决定簇结合的抗体的抗原抗体反应来进行，所述抗原决定簇在序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述抗体是识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，使用质谱分析法进行测定。

7.一种用于检测肾癌的试剂，其包含与抗原决定簇结合的抗体，所述抗原决定簇在序列号1所示的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内。

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