BR112020014205A2 - Método e reagente para detecção de câncer renal - Google Patents

Abstract

a presente invenção tem por objeto um método para detectar câncer renal e um reagente que pode ser usado para o método. provê-se um método para detectar câncer renal, o qual inclui medir a quantidade de tfpi2 em uma amostra derivada de um paciente. um anticorpo que reconhece especificamente nt-tfpi2 e tfpi2 intacto está incluído em um reagente para detecção de câncer renal.

Description

MÉTODO PARA DETECÇÃO DE CÂNCER RENAL, E, USOS DE UM

ANTICORPO E DE UM REAGENTE Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a um método e a um reagente para detectar câncer renal no qual um inibidor-2 da via do fator tecidual (TFPI2) é medido. Fundamentos da invenção

[002] A morbidade associada ao câncer renal e do trato urinário, excluindo câncer de bexiga, é estimada em 19,5 por 100.000 pessoas (National Cancer Research Center Cancer Control Information Center, 2013), e tem sido cada vez maior nos últimos anos. O câncer renal apresenta poucos sintomas objetivos e é muitas vezes detectado acidentalmente durante exames médicos e exames físicos, sendo um câncer considerado de difícil detecção precoce.

[003] Via de regra, o câncer renal é tratado por ressecção cirúrgica e, como farmacoterapia, um fármaco com alvo molecular, tal como um inibidor da tirosina quinase (TKI) ou um inibidor de mTOR que inibe a angiogênese, um inibidor de pontos de controle (checkpoint) do sistema imunológico e semelhantes são usados conforme apropriado.

[004] Exemplos de exames de sangue para câncer renal incluem sedimentação — eritrocitária — para quantificar àa velocidade de hemossedimentação, CRP (proteína C reativa) e IAP (Proteína ácida imunossupressora). Todos esses, no entanto, fatores alvos que surgem de uma resposta inflamatória induzida indiretamente pelo câncer, e a sua utilidade como marcadores de tumor não são definitivos. Por esse motivo, a ultrassonografia e a imagem por tomografia computadorizada (TC) e imagem por ressonância magnética (IRM) são, atualmente, os métodos de ensaio mais eficazes. TC, contudo, envolve preocupações acerca da exposição à radiação, e o ônus sobre pacientes causado pelo diagnóstico por imagem não é baixo. Portanto, um método mais simples e menos oneroso para detectar câncer renal por exames de sangue é cobiçado.

[005] O inibidor 2 da via do fator tecidual (TFPI2) é a mesma proteína que a proteína placentária 5 (PP5), e é um inibidor de serina protease derivado de placenta com três domínios inibidores de proteases do tipo Kunitz. Em relação à associação entre TFPI2 e câncer, os presentes inventores, Arakawa et al. esclareceram que TFPI2 é produzido especificamente a partir da linhagem celular do carcinoma de células claras de câncer de ovário e que a expressão gênica aumentada de TFPI2 em tecido de pacientes com câncer de ovário ocorre especificamente apenas em pacientes com carcinoma de células claras (Documento Pantentário 1). Os inventores também verificaram que TFPI2 sanguíneo está significativamente aumentado em indivíduos com carcinoma de células claras em relação a sadios e em casos de endometriose (Documento Pantentário 2, Documento Não Patentário 1). Um método para detecção de carcinoma de células claras do ovário medindo TFPI2 foi também revelado (Documento Pantentário 3, Documento Não Patentário 2).

[006] Em relação à associação entre TFPI2 e câncer renal, sugere-se que a adição de galato de epigalocatequina (ECGC), contido no chá verde, aumenta o nível de expressão de TFPI2 em linhagens celulares de câncer renal humano, suprime a proliferação celular e induz apoptose (Documento Não Patentário 3). No entanto, até o momento, não houve relatos sobre a cinética em sangue de TFPI2 no câncer renal, e não estava claro se TFPI2 poderia ser aplicado para detecção de câncer renal.

DOCUMENTOS DA TÉCNICA ANTERIOR Documentos Patentário

[007] Documento Pantentário 1: Patente Japonesa 5224309 Documento Pantentário 2: Patente Japonesa 6074676 Documento Pantentário 3: WO2016/084912 Documentos Não Patentário

[008] Documento Não Patentário 1: J. Proteome Res., 2013, 12 (10), pp 4340-4350

[009] Documento Não Patentário 2: PloS one 11.10 (2016): e0165609.

[0010] Documento Não Patentário 3: Oncology reports 21.3 (2009): 635-640.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO

[0011] A presente invenção tem por objeto um método para detecção de câncer renal e um reagente que possa ser usado no método.

MEIOS PARA SOLUCIONAR DOS PROBLEMAS

[0012] Os presentes inventores realizaram estudos intensos e verificaram que TFPI2 é secretado em sobrenadantes de cultura de uma pluralidade de linhagens celulares de câncer renal, e que TFPI2 sanguíneo está significativamente aumentado em pacientes com câncer renal, quando comparados a indivíduos sadios, e chegaram à ideia de que TFPI2 pode detectar câncer renal, completando, assim, a presente invenção.

[0013] Ou seja, a presente invenção inclui as modalidades a seguir.

[0014] [1] Um método para detecção de câncer renal, em que o método compreende medir a quantidade de TFPI2 em uma amostra.

[0015] [2] O método de acordo com [1], em que câncer renal é detectado quando a quantidade medida de TFPI2 exceder um valor padrão predeterminado.

[0016] [3] O método de acordo com [1] ou [2], em que a quantidade de TFPI2 é a soma da quantidade de polipeptídeo de TFPI2 processado e a quantidade de TFPI2 intacto.

[0017] [4] O método de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que a quantidade de TFPI2 é medida por uma reação antígeno-anticorpo utilizando um anticorpo que se liga a um determinante antigênico na região do

23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo, histidina ou ao 130º resíduo, cisteína da sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 1.

[0018] [5] O método de acordo com [4], em que o anticorpo é um anticorpo que reconhece o domínio Kunitz 1 de TFPI2.

[0019] [6] O método de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que a medição é realizada com espectrometria de massa.

[0020] [7] Um reagente para detecção de câncer renal, o qual compreende um anticorpo que se liga a um determinante antigênico na região do 23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo, histidina ou ao 130º resíduo, cisteína na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

EFEITO DA INVENÇÃO

[0021] A presente invenção provê um método simples e altamente preciso para detecção de câncer renal e um reagente que pode ser utilizado for o método.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0022] Figura 1: A figura é um diagrama mostrando a quantidade de TFPI2 no sobrenadante de cultura da linhagem celular. A primeira ordenada representa um valor de medição de TFPI2 e a segunda ordenada representa o número de células.

[0023] Figura 2: A figura é um diagrama mostrando valores de medição de TFPI2 em um grupo de indivíduos sadios e um grupo de pacientes com câncer renal em box plot. A ordenada representa a quantidade de TFPI2 no sangue.

[0024] Figura 3: A figura é um diagrama mostrando uma curva característica de operação do receptor (Receiver operating characteristic, ROC) de um grupo de indivíduos sadios e um grupo com câncer renal. À ordenada representa a sensibilidade e a abscissa representa a especificidade 100%.

[0025] Figura 4: A figura é um diagrama mostrando valores de medição de TFPI2 em grupos com câncer renal classificados por grau histológico em diagrama de caixa. A ordenada representa o valor de medição de TFPL2.

[0026] Figura 5: A figura é um diagrama mostrando a correlação entre o diâmetro tumoral do câncer renal e o valor de medição de TFPI2. À ordenada representa o valor de medição de TFPI2 e a abscissa representa o diâmetro do tumor.

[0027] Figura 6: A figura é um diagrama mostrando valores de medição de TFPI2 em um grupo com câncer renal classificado pela presença ou ausência de metástase em diagrama de caixa. A ordenada representa o valor de medição de TFPI2.

[0028] Figura 7: A figura é um diagrama mostrando valores de medição de TFPI2 no Exemplo 7 em diagrama de caixa.

[0029] Figura 8: A figura é um diagrama mostrando valores de medição de TFPI2 no Exemplo 8 em diagrama de caixa.

[0030] Figura 9: A figura é um diagrama mostrando os resultados da análise da curva ROC para discriminação entre indivíduos sadios e pacientes com câncer renal no Exemplo 8.

MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

1. Método para detecção de câncer renal da presente invenção

[0031] Um primeiro aspecto da presente invenção é um método para detecção de câncer renal, o qual inclui medir a quantidade de TFPI2 em uma amostra. Este método baseia-se no fato de que TFPI2 está caracteristicamente presente em uma amostra biológica, tal como sangue, de câncer renal em comparação com uma amostra sadia. A medição da quantidade de TFPI2 em uma amostra é normalmente realizada in vitro. Por esse método, é possível detectar câncer renal com alta sensibilidade e especificidade, como mostrado nos Exemplos descritos abaixo.

[0032] O método da presente invenção inclui até uma etapa de detecção de câncer renal, e não inclui o ato final de determinar o diagnóstico de câncer renal. Um médico diagnostica o câncer renal ou elabora uma política de tratamento por referência a um resultado de detecção e similares pelo método da presente invenção.

[0033] O TFPI2 medido na presente invenção não é especialmente limitado e pode ser, por exemplo, TFPI2 intacto (a seguir, também referido como “I-TFPI2”) e/ou polipeptídeo de TFPI2 processado (a seguir, também referido como “NT-TFPI2”).

[0034] A SEQ ID NO: 1 mostra uma sequência de aminoácidos tendo como base o cDNA de TFPI2 humano. Na SEQ ID NO:1, um peptídeo sinal estende-se desde a metionina inicial até o 22º resíduo, glicina.

[0035] “TFPI2 intacto” significa o peptídeo representado pelo 23º ao 235º resíduo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[0036] “NT-TFPI2” significa um fragmento de peptídeo contendo um domínio Kunitz 1 localizado no lado N-terminal do TFPI2 intacto, como descrito no Documento Pantentário 3. Mais especificamente, NT-TFPI2 é um peptídeo contendo pelo menos uma sequência do 23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo, histidina ou ao 130º resíduo, cisteína da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 ou um peptídeo contendo uma sequência de aminoácidos tendo 80% ou mais de identidade com a sequência descrita acima. De preferência, a identicidade não é inferior a 90%, mais preferivelmente não é inferior a 95%. O polipeptídeo da presente invenção pode ser um polipeptídeo com uma sequência que é a mesma que a sequência acima exceto que um ou diversos aminoácidos são deletados, substituídos, inseridos e/ou adicionados. O termo “diversos” significa preferivelmente 2 a 20, mais preferivelmente 2 a 10, ainda mais preferivelmente 2 a 5. Embora possa também ter outros fragmentos peptídicos em ambos os lados da sequência acima, de preferência, NT-TFPI2 não tem um determinante antigênico para um anticorpo que reconhece o domínio Kunitz 3 de TFPI2.

[0037] Exemplos da amostra derivada do paciente (amostra para exame) na presente invenção incluem componentes do sangue, tais como sangue total, células sanguíneas, soro e plasma, extrato celular ou de tecido, urina e líquido cefalorraquidiano. Uma amostra obtida por biópsia do tecido renal pode ser usada como alvo do exame e, nesse caso, a medição é realizada em um extrato da amostra por biópsia ou um sobrenadante de cultura. É preferível utilizar um líquido corporal, como um componente do sangue ou urina como amostra, pois um exame pode ser realizado facilmente e de modo não invasivo, e considerando a facilidade de coletar uma amostra e a versatilidade de outros itens do exame, é especialmente preferível utilizar um componente do sangue como amostra. À razão de diluição da amostra pode ser adequadamente selecionada dentre não diluída até diluída 100 vezes de acordo com o tipo e o estado de uma amostra a ser utilizada.

[0038] O momento de amostragem da amostra na presente invenção não é especialmente limitado. Por exemplo, uma amostra pode ser coletada a qualquer momento desde um período pré-operatório, quando há suspeita de câncer renal devido ao diagnóstico por imagem ou similares, e o exame detalhado ser realizado, até um período de acompanhamento após o diagnóstico definitivo de câncer renal por exame patológico pós-operatório, e qualquer amostra coletada em qualquer estágio, tal como antes e depois do diagnóstico definitivo e antes e depois do início do tratamento pode ser usada no método da presente invenção.

[0039] No método de detecção da presente invenção, é preferível determinar que câncer renal é detectado quando a quantidade de TFPI2 obtida pela medição exceder um valor padrão predefinido (Valor de corte). Aqui, a quantidade de TFPI2 pode ser uma quantidade de TFPI2 intacto, uma quantidade de NT-TFPI2 ou um total de uma quantidade de TFPI2 intacto e uma quantidade de NT-TFPI2, e o total da quantidade de TFPI2 intacto e a quantidade de NT-TFPI2 é mais preferível do ponto de vista de obter tanto uma medição fácil, como sensibilidade e especificidade suficientes.

[0040] O valor padrão utilizado para a determinação pode ser o valor medido ou o valor convertido da concentração. O valor convertido da concentração significa um valor convertido a partir do valor medido com base em uma curva de calibração preparada utilizando TFPI2 como uma amostra padrão.

[0041] O valor padrão (Valor de corte) para determinação de câncer renal pode ser adequadamente definido contra um valor medido que mostre sensibilidade e especificidade ótimas, pela medição em indivíduos sadios e de cânceres renais e analisando a curva característica de operação do receptor (ROC). Por exemplo, o valor padrão de TFPI2 pode ser definido em 219 Pg/mL, no caso de plasma, e 189 pg/mL ou 200 pg/mL no caso de soro, como descrito nos Exemplos abaixo, mas não está limitado aos mesmos.

[0042] A seguir, será descrito um método para medir TFPI2.

[0043] Na presente invenção, a quantidade de NT-TFPI2 ou a quantidade de TFPI2 intacto em uma amostra pode ser medida individualmente, ou os valores podem ser totalizados para obter uma quantidade total. A quantidade total de NT-TFPI2 e TFPI2 intacto em uma amostra pode ser medida com um sistema de medição capaz de medir ao mesmo tempo. Alternativamente, como descrito adiante, a quantidade de NT- TFPI2 pode ser medida indiretamente a partir da quantidade total de ambas as medições e a quantidade medida de TFPI2 intacto sozinho.

[0044] No método da presente invenção, o método para medir a quantidade de NT-TFPI2 e/ou a quantidade de TFPI2 intacto não é limitado. Exemplos do método incluem métodos que utilizam uma reação antígeno- anticorpo, na qual se usa um anticorpo que reconhece NT-TFPI2 e/ou TFPI2 intacto, métodos que utilizam espectrometria de massa.

[0045] (a) Um método de competição utilizando um objeto medidor marcado e um anticorpo que reconhece o objeto medidor, em que este método utiliza a ligação competitiva do objeto medidor marcado e do objeto medidor contido na amostra ao anticorpo.

[0046] (b) Um método que utiliza ressonância plasmônica de superfície, em que a amostra é colocada em contato com um chip no qual um anticorpo que reconhece o objeto medidor é imobilizado, e um sinal dependente da ligação do anticorpo ao objeto medidor é detectado.

[0047] (c) Um imunoensaio de fluorescência por polarização utilizando um anticorpo marcado por fluorescência que reconhece um objeto medidor, em que este imunoensaio utiliza o fenômeno que a ligação do anticorpo ao objeto medidor causa, um aumento no grau de fluorescência por polarização.

[0048] (d) Um método do tipo sanduíche que utiliza dois tipos de anticorpos (um dos quais é um anticorpo marcado) que reconhece o objeto medidor em epítopos diferentes, em que é permitido ocorrer a formação de um complexo das três moléculas, ou seja, os dois anticorpos e o objeto medidor.

[0049] (e) Um método no qual é realizado pré-tratamento pela concentração do objeto medidor na amostra utilizando um anticorpo que reconhece o objeto medidor, e o polipeptídeo na proteína ligada é detectado por um espectrômetro de massa ou semelhantes.

[0050] Embora os métodos (d) e (e) sejam simples e versáteis, o método (d) é preferível para o processamento de um grande número de amostras, uma vez que as tecnologias relacionadas aos reagentes e dispositivos para esse método foram estabelecidas suficientemente.

[0051] Exemplos específicos dos métodos para medir a quantidade de NT-TFPI2 e/ou a quantidade de TFPI2 intacto que utilizam uma reação antígeno-anticorpo incluem os seguintes.

[0052] (A) Um método que utiliza um anticorpo que reconhece ambos, NT-TFPI2 e TFPI2 intacto, em que é medida a quantidade total de

NT-TFPI2 e TFPI2 intacto (sistema de ensaio NT+I-TFPI2). O anticorpo que reconhece ambos, NT-TFPI2 e TFPI2 intacto, é, de preferência, um anticorpo que se liga a um determinante antigênico na região do 23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo, histidina ou ao 130º resíduo, cisteína na TFPI2 sequência de aminoácidos de TFPI2 representada por SEQ ID NO:1. Mais preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo tendo um determinante antigênico no domínio Kunitz 1 de TFPI2. Em casos em que o método sanduíche mencionado acima é usado nesse método, dois tipos de anticorpos para epítopos diferentes são usados como o anticorpo.

[0053] (B) Um método que utiliza um anticorpo que não reconhece NT-TFPI2, mas reconhece TFPI2 intacto, em que é medida a quantidade de TFPI2 intacto sozinho (sistema de ensaio de I-TFPI2). O anticorpo que não reconhece NT-TFPI2, mas reconhece TFPI2 intacto é, de preferência, um anticorpo com um determinante antigênico no domínio Kunitz 3 de TFPLI2. Em casos em que o método sanduíche mencionado acima é usado nesse método, dois tipos de anticorpos para epítopos diferentes são usados como o anticorpo. Pelo menos um destes é um anticorpo que não reconhece NT- TFPI2, mas reconhece TFPI2 intacto, e o outro pode ser ou um anticorpo que não reconhece NT-TFPI2, mas reconhece TFPI2 intacto, ou um anticorpo que reconhece ambos, NT-TFPI2 e TFPL2 intacto.

[0054] (C) Um método no qual a quantidade de TFPI2 intacto sozinho medida no sistema de ensaio de I-TFPI2 de (B) é subtraída da quantidade total de NT-TFPI2 e TFPI2 intacto medida no sistema de ensaio de NT+I-TFPI2 de (A), para calcular a quantidade de NT-TFPI2 sozinho.

[0055] (D) Um método que utiliza um anticorpo que não reconhece TFPI2 intacto, mas reconhece NT-TFPI2, em que é medida a quantidade de NT-TFPI2 sozinho. Exemplos do anticorpo que não reconhece TFPI2 intacto, mas reconhece NT-TFPI2 incluem anticorpos que reconhecem especificamente uma sequência peptídica na porção C-terminal de NT-TFPLI2.

Por exemplo, em casos em que o método sanduíche mencionado acima é utilizado, tal anticorpo é usado como o anticorpo da fase sólida e um anticorpo tendo um sítio de reconhecimento no domínio Kunitz 1 é usado como o anticorpo de detecção.

[0056] No método para detecção de câncer renal da presente invenção, a quantidade de NT-TFPI2 sozinho medido pelo método de (C) ou (D) pode ser utilizada como um critério. No entanto, é possível obter também sensibilidade e especificidade suficientes utilizando a quantidade total de NT- TFPI2 e TFPI2 intacto medida pelo método de (A) como um critério. O último método é preferível do ponto de vista do fato de que o anticorpo pode ser facilmente obtido e de a medição pode ser realizada simplesmente por uma única etapa.

[0057] Um anticorpo que reconhece NT-TFPI2 e/ou TFPI2 intacto pode ser obtido imunizando um animal com um imunógeno, por exemplo, um polipeptídeo NT-TFPI2 ou proteína, um oligopeptídeo composto por uma região parcial do polipeptídeo NT-TFPI2 intacto ou da proteína TFPI2 ou um polinucleotídeo que codifica a região intacta ou parcial do polipeptídeo NT- TFPI2 ou da proteína TFPLI2. A proteína ou o oligopeptídeo ou polipeptídeo pode não refletir a estrutura tridimensional de TFPI2 em um corpo vivo, ou a estrutura do mesmo pode alterar-se durante um processo de preparação. Portanto, um anticorpo obtido pode não ter alta especificidade ou capacidade de ligação ao TFPI2 em um corpo vivo desejado, e mesmo quando um sistema de medição é construído utilizando o presente anticorpo, a concentração de TFPI2 contido em uma amostra como resultado pode não ser quantificada com precisão.

[0058] Por outro lado, quando um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica uma região intacta ou parcial de um polipeptídeo de TFPI2 ou uma proteína intacta de TFPI2 é usado como imunógeno, a região intacta ou parcial do polipeptídeo de TFPI2 ou da proteína TFPI2 intacta é expressa em um animal imunizado, uma resposta imune é gerada e um anticorpo com alta especificidade e capacidade de ligação (ou seja, alta afinidade) ao TFPI2 em uma amostra é obtido, o que for preferível.

[0059] O animal a ser utilizado para a imunização não é limitado, desde que o animal tenha capacidade para produzir anticorpos. O animal pode ser um mamífero que seja normalmente utilizado para imunização, tal como um camundongo, um rato ou um coelho, ou pode ser uma ave tal como uma galinha.

[0060] No sangue, há também TPPII, conhecido como um homólogo de TFPI2. Portanto, o que se deseja é utilizar um anticorpo que não reaja cruzado com TFPII, mas que reconheça especificamente apenas TFPI2.

[0061] Outro aspecto da presente invenção é o uso de um reagente para medir a quantidade de TFPI2 na produção de um reagente para detecção de câncer renal. Aqui, o reagente para medir a quantidade de TFPI2 é, de preferência, um reagente para medir o total da quantidade de polipeptídeo de TFPI2 processado e da quantidade de TFPI2 intacto. O reagente para medir a quantidade de TFPI?2 é, de preferência, um anticorpo que se liga a um determinante antigênico em uma região do 23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo histidina ou ao 130º resíduo cisteína da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1, e mais preferivelmente um anticorpo que reconhece o domínio Kunitz 1 de TFPI2.

[0062] Portanto, pode-se também dizer que a presente invenção seja o uso de um anticorpo que se liga a um determinante antigênico em uma região do 23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo histidina ou ao 130º resíduo, cisteína da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 na produção de um reagente para detecção de câncer renal.

[0063] Pode-se também dizer que a presente invenção seja o uso de um anticorpo que se liga a um determinante antigênico em uma região do 23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo, histidina ou ao 130º resíduo, cisteína da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 na detecção de câncer renal.

[0064] O anticorpo que reconhece TFPI2 pode ser ou um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal. O anticorpo é preferivelmente um anticorpo monoclonal.

[0065] O método de estabelecimento de uma célula de hibridoma que produz um anticorpo que reconhece TFPI2 pode ser adequadamente selecionado dentre métodos cujas técnicas tenham sido estabelecidas. Por exemplo, uma célula de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que reconhece TFPI2 pode ser estabelecida coletando-se células B de um animal imunizado pelo método acima, fundindo as células B com células de mieloma eletricamente ou na presença de polietilenoglicol, selecionando uma célula do hibridoma que produza um anticorpo desejado usando meio HAT e preparando a célula selecionada do hibridoma em um monoclone pelo método de diluição limitante.

[0066] A seleção do anticorpo monoclonal que reconhece TFPI2 usado na presente invenção pode ser realizada com base em afinidade por TFPI2 do tipo com âncora de GPI (glicosilfosfatidilinositol) ou TFPI2 secretório derivado de um sistema de expressão em hospedeiro.

[0067] O hospedeiro não é limitado, e pode ser adequadamente selecionado dentre microrganismos tais como E. coli ou levedura, células de inseto e células de animais que são habitualmente utilizadas para expressão proteica pelos técnicos no assunto. O hospedeiro é, de preferência, uma célula de mamífero, pois permite a expressão de uma proteína tendo uma estrutura semelhante àquela do TFPI2 natural por modificação pós-traducional tal como ligação dissulfeto ou glicosilação. Exemplos da célula de mamífero incluem a linhagem de células 293T derivada de rim embrionário humano (HEK), a linhagem de células COS7 de rim de macaco, células de ovário de hamster chinês (CHO) e células de câncer isoladas de humanos.

[0068] O método de purificação do anticorpo a ser utilizado na presente invenção pode ser adequadamente selecionado dentre métodos cujas técnicas tenham sido estabelecidas. Por exemplo, após a cultura de células do hibridoma que são estabelecidas pelo método acima e que produzem um anticorpo, o sobrenadante de cultura pode ser coletado e o anticorpo pode ser concentrado, se necessário, por precipitação com sulfato de amônio. Depois, utilizando cromatografia por afinidade com um carreador (carrier) ao qual é imobilizada Proteína A, Proteína G, Proteína L, ou similares, e/ou por cromatografia de troca iônica, a purificação do anticorpo é possível.

[0069] O anticorpo marcado, usado para a reação antígeno-anticorpo no método sanduíche descrito acima, pode ser preparado marcando-se um anticorpo purificado pelo método acima com uma enzima, tal como peroxidase ou fosfatase alcalina. A marcação pode também ser realizada utilizando um método cuja técnica tenha sido suficientemente estabelecida.

[0070] O método para medir a quantidade de TFPI2 utilizando espectrometria de massa no método da presente invenção é descrito abaixo concretamente.

[0071] Em casos de uma amostra de sangue, de preferência, uma etapa de pré-tratamento é realizada, removendo-se proteínas principais contidas em grandes quantidades no sangue, tal como albumina, imunoglobulina e transferrina, utilizando Agilent Human 14 ou similares, e realizando um fracionamento adicional por troca iônica, filtração em gel, HPLC de fase reversa e/ou os semelhantes. Alternativamente, apenas TFPI2 pode ser recuperado especificamente por um método imunológico usando um anticorpo anti-TFPLI2.

[0072] A medição pode ser realizada por espectrometria de massa em tandem (MS/MS), cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa in tandem (LC/MS/MS), espectrometria de massa com fonte de ionização e dessorção a laser assistida por matriz - tempo de voo (MALDI-TOF/MS), espectrometria de massa com ionização e dessorção a laser em superfície melhorada (SELDI-MS) ou similares.

2. Reagente para detecção de câncer renal da presente invenção

[0073] Em casos em que o reagente da presente invenção é usado no método sanduíche descrito acima, o reagente preferivelmente contém, como o anticorpo, dois tipos de anticorpos para epítopos diferentes.

[0074] O anticorpo contido no reagente da presente invenção pode ser um anticorpo por si só, um anticorpo marcado ou um anticorpo imobilizado em uma fase sólida.

[0075] O reagente da presente invenção é descrito abaixo concretamente para casos em que é usado para um método sanduíche em duas etapas, o qual é um modo do método sanduíche. No entanto, a presente invenção não se limita ao mesmo.

[0076] O reagente da presente invenção pode ser preparado pelo método descrito no (1) ao (III) seguintes.

[0077] (D) Primeiramente, o Anticorpo 1, um dos dois tipos de anticorpos para epítopos diferentes que reconhecem TFPI2 (a seguir, referidos como “Anticorpo 1” e “Anticorpo 2”), é ligado a um carreador capaz de separação B/F (Ligado/Livre), tal como uma imunoplaca ou partículas magnéticas. O método de ligação pode ser ligação física, por meio de ligação hidrofóbica, ou ligação química usando um reagente de ligação capaz de reticular duas substâncias entre si.

[0078] (ID) Após a ligação do Anticorpo | ao carreador, a superfície do carreador é submetida a tratamento de bloqueio usando albumina sérica bovina, leite desnatado, um agente de bloqueio de imunoensaio disponível comercialmente, ou similares, a fim de prevenir a ligação não específica, para fornecer um reagente primário.

[0079] (III) Após marcação do outro anticorpo, o Anticorpo 2, uma solução contendo o anticorpo marcado obtido é fornecida como um reagente secundário. Exemplos preferidos da substância com a qual é marcado o

Anticorpo 2 incluem enzimas tais como peroxidase e fosfatase alcalina; substâncias detectáveis com dispositivos de detecção, tais como substâncias fluorescentes, substâncias quimioluminescente e radioisótopos; e substâncias às quais se liga especificamente outra molécula. Exemplos da solução para o reagente secundário incluem tampões com os quais a reação antígeno- anticorpo pode ser realizada favoravelmente, tais como tampão fosfato e tampão Tris-HCl. O reagente assim preparado da presente invenção pode ser liofilizado, se necessário.

[0080] Em caos de um método sanduíche em uma etapa, a ligação do Anticorpo | ao carreador e tratamento de bloqueio subsequente podem ser realizados da mesma maneira que em (1) e (II) para preparar um carreador com anticorpo imobilizado, e um tampão contendo um Anticorpo 2 marcado pode ser ainda adicionado ao carreador com o anticorpo imobilizado, para fornecer um reagente.

[0081] Para medição de TFPI2 por um método sanduíche em duas etapas usando reagentes obtidos pelo método descrito acima, o método descrito no (IV) ao (VI) seguintes pode ser realizado.

[0082] (IV) O reagente primário preparado em (II) é colocado em contato com uma amostra por um período de tempo predeterminado a uma temperatura constante. Em termos das condições de reação, a reação pode ser realizada a uma temperatura dentro da faixa de 4ºC a 40ºC por 5 minutos a 180 minutos.

[0083] (V) Substâncias não reagidas são removidas por separação B/F e, a seguir, o reagente secundário preparado em (III) é colocado em contato com o produto resultante da reação por um período de tempo predeterminado a uma temperatura constante para permitir a formação de um complexo do tipo sanduíche. Em termos das condições de reação, a reação pode ser realizada a uma temperatura dentro da faixa de 4ºC a 40ºC por 5 minutos a 180 minutos.

[0084] (VD Substâncias não reagidas são removidas por separação B/F, e a substância marcadora do anticorpo marcado é quantificada. Com base em uma curva de calibração preparada utilizando uma solução de TFPI2 com uma concentração conhecida como uma amostra padrão, o TFPI2 humano na amostra é quantificado.

[0085] A quantidade de cada componente do reagente, tal como o anticorpo contido no agente, pode ser adequadamente definida dependendo de condições tais como a quantidade da amostra, o tipo da amostra, o tipo do reagente e o método de medição. Mais especificamente, por exemplo, em casos em que a quantidade de TFPI2 é medida como descrito abaixo por um método sanduíche usando 20 uL de soro ou plasma como amostra, a quantidade do anticorpo a ser ligada ao carreador pode ser 100 ng a 1000 ug, e a quantidade do anticorpo marcado pode ser 2 ng a 20 ug pelo sistema de reação no qual 20 uL da amostra são reagidos com os anticorpos.

[0086] O reagente da presente invenção é aplicável à medição manual ou medição usando um dispositivo imunodiagnóstico automático. A medição usando um dispositivo imunodiagnóstico automático é especialmente preferível, uma vez que permite a medição sem a influência de fatores endógenos inibidores da medição e sem a competição com enzimas contidas na amostra, além de permitir a quantificação rápida da concentração de TFPL2.

[0087] O método para detecção de câncer renal da presente invenção pode ser aplicado ao método para tratamento de câncer renal.

[0088] Ou seja, de acordo com a presente invenção, é provido um método para tratar câncer renal em um indivíduo em teste, incluindo: (1) uma etapa na qual um indivíduo em teste é identificado como aquele no qual um valor medido da quantidade de TFPI2 excede um valor padrão predefinido; (11) uma etapa na qual é fornecido um tratamento ao indivíduo em teste identificado como tendo uma quantidade medida de TFPI2 acima de um valor padrão predefinido.

[0089] Em um aspecto preferido do método para tratamento de câncer renal, a quantidade de TFPI2 é a soma da quantidade de polipeptídeo de TFPI2 processado e a quantidade de TFPI2 intacto.

[0090] Na identificação da etapa (1), a quantidade de TFPI2 é preferivelmente medida por uma reação antígeno-anticorpo utilizando um anticorpo que se liga a um determinante antigênico na região do 23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo, histidina ou ao 130º resíduo, cisteína da sequência de aminoácidos de SEQ ID No:l. Mais preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo que reconhece o domínio Kunitz 1 de TFPI2.

[0091] Na identificação da etapa (1), a medição da quantidade de TFPI2 pode ser realizada por espectrometria de massa.

[0092] Exemplos do tratamento da etapa (1i) incluem ressecção cirúrgica, farmacoterapia e radioterapia, e exemplos do fármaco incluem inibidores da tirosina quinase, inibidores de mTOR e inibidores de checkpoints do sistema imunológico, mas estes não são especialmente limitados.

EXEMPLOS

[0093] Abaixo, são mostrados exemplos para descrição concreta da presente invenção. No entanto, esses exemplos mostram simplesmente exemplos da presente invenção, e a presente invenção não é limitada pelos Exemplos. Exemplo 1. Preparação do reagente para medição de TFPI2

[0094] De acordo com o método do Documento Pantentário 3, preparou-se um reagente para medição de TFPI2 utilizando um anticorpo contra TFPI2 obtido pelos métodos de imunização com DNA como segue.

[0095] (1) A adsorção física de um anticorpo monoclonal anti-TFPI2 (TS-TFO4) a carreadors de ferrita insolúveis em água foi permitida à temperatura ambiente por um dia e uma noite, de tal modo que a adsorção ocorreu a 100 ng/carreador, e o bloqueio foi então realizado com tampão Tris 100 mM (pH 8,0) suplementado com BSA 1% a 53ºC por 4 horas, para preparar carreadors com anticorpo anti-TFPI2 imobilizado.

[0096] (2) Um anticorpo anti-TFPI2 marcado com fosfatase alcalina foi preparado com anticorpo monoclonais anti-TFPI2 (TS-TFO1) usando um kit para marcação com fosfatase alcalina (fabricado pelos Dojindo Laboratories).

[0097] (3) Em cada um dos recipientes permeáveis à força magnética (volume, 1,2 mL), foram colocados 12 carreadors com anticorpo imobilizado, preparados em (1), e 100 uL de um tampão (tampão Tris suplementado com BSA 3%, pH 8,0) suplementado com 1 ug/mL de um anticorpo marcado com fosfatase alcalina, preparado em (2), foram adicionados ao mesmo, seguido por liofilização, para preparar um reagente para ensaio de TFPI2. Os reagentes preparados para ensaio de TFPI2 foram hermeticamente fechados e lacrados sob gás nitrogênio e armazenados a 4ºC até o ensaio. Exemplo 2. Avaliação de sobrenadantes de cultura celular incluindo de câncer renal

[0098] Células T 293 de rim fetal humano, como células normais, e células CAKII, ACHN e 786-O0, como células de câncer renal, foram cultivadas a 37ºC por 3 dias de acordo com um método convencional, e o número de células foi medido após a coleta de vários sobrenadantes de cultura. O meio de cultura sozinho e 20 uL de sobrenadantes de cultura foram avaliados com o reagente para medição de TFPI2 preparado no Exemplo 1. Como dispositivo para avaliação, usou-se um dispositivo inteiramente automático para imunoensaios de enzimas AIA-2000 (fabricado pela Tosoh Corporation; número de fabricação/notificação de comercialização, 13B3X90002000009). A medição de TFPI2 pelo dispositivo inteiramente automático para imunoensaios de enzimas AIA-2000 foi realizada pelo procedimento a seguir.

[0099] (1) 20 uL de uma amostra e 80 uL de um diluente contendo um tensoativo foram dispensados em um recipiente no qual estava armazenado um reagente para ensaio de TFPI2, preparado no Exemplo 1; (2) uma reação antígeno-anticorpo foi realizada a uma temperatura constante de 37ºC por 10 minutes; (3) lavagem realizada oito vezes com um tampão contendo um tensoativo após a separação B/F; e (4) 4-metilumbeliferil-fosfato adicionado ao recipiente, uma concentração de 4-metilumbeliferona, produzida pela fosfatase alcalina por unidade de tempo, foi fornecida como o valor medido (intensidade de TFPI2, nmol/(Ls)).

[00100] O resultado da avaliação é mostrado na Figura 1. TFPI2 mostrou claramente um valor alto nos sobrenadantes de cultura dos três tipos de células de câncer renal células quando comparadas com as células 293T, e foi revelado que as células de câncer renal secretaram TFPI2 nos sobrenadantes de cultura. Exemplo 3. Avaliação de amostras clínicas

[00101] As amostras clínicas usadas nos Exemplos seguintes são mostradas na Tabela 1. O plasma de vinte e um casos de câncer renal foi coletado pelo Departamento de Urologia da Universidade da Cidade de Yokohama sob o mesmo protocolo, os quais foram fornecidos com consentimento esclarecido e a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade da Cidade de Yokohama. O plasma de quarenta e nove casos de indivíduos sadios foi adquirido da BizComJapan, Inc.

[00102] As amostras clínicas foram medidas pelo método descrito no Exemplo 2, uma curva de calibração foi preparada usando uma proteína recombinante de TFPI2 disponível comercialmente (TechnoPro, Inc. TechnoPro R&D, Company), como padrão de referência, e a concentração de

TFPI2 na amostra foi calculada. Tabela 1 Número de casos Idade mediana (desvio padrão) Sadios 49 58 (3) Câncer renal 21 65 (11) 70

[00103] O BoxPlot do resultado da medição de TFPI2 é mostrado na Figura 2. Foi revelado que TFPI2 mostrou um valor alto com diferença estatisticamente significante em indivíduos com câncer renal quando comparados aos sadios (Teste U de Mann-Whitney, p < 0,0001).

[00104] O resultado da análise ROC é mostrado na Figura 3. A área sob a curva (AUC) foi 0,8552, indicando que TFPI2 apresentou desempenho favorável para detecção de câncer renal. O valor máximo do Índice de Youden foi definido como o valor de corte para TFPI2 com base no Índice de Youden ((sensibilidade + especificidade) - 100). quando o valor de corte de TFPI2 foi definido em 219 pg/mL, a sensibilidade foi 85,71% e a especificidade, 75,5%, mostrando que o desempenho para detecção de câncer renal foi favorável. Exemplo 4. Associação entre grau histológico e TFPI2

[00105] Os grupos de espécimes de câncer renal foram classificados por grau histológico (grau: G), e o BoxPlot do valor de medição de TFPI2 de cada grupo é mostrado na Figura 4. TFPI2 não foi significativamente diferente entre o grau 2 baixo e os graus 3 e 4 altos. Esses resultados sugerem que TFPI2 não se associou com grau histológico e que a expressão de TFPI2 foi melhorada mesmo no estágio inicial de câncer renal. Exemplo 5. Análise de correlação de diâmetro tumoral e TFPI2

[00106] O resultado da análise de correlação entre diâmetro tumoral do câncer renal e TFPI2 é mostrado na Figura 5. Houve uma baixa correlação positiva entre TFPI2 e diâmetro do tumor, mas nenhuma diferença estatisticamente significante (Coeficiente de correlação de postos de Spearman, r = 0,27, p = 0,2365).

Exemplo 6. Associação entre metástase de câncer e TFPI2

[00107] O grupo de amostras de câncer renal foi classificado em dois grupos dependendo da presença ou ausência de metástase, e o BoxPlot dos valores de medição de TFPI2 de cada grupo é mostrado na Figura 6. Nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada nos valores de medição de TFPI2 entre os dois grupos (Teste U de Mann-Whitney, p = 0,5906), e não houve relação nítida entre TFPI2 e metástase. Exemplo 7. Cálculo do valor padrão de TFPI2 e referência de intervalo em japoneses sadios

[00108] 102 soros de indivíduos sadios do sexo masculino estavam em amostras coletadas de voluntários internos com consentimento esclarecido, e 120 soros de indivíduos sadios do sexo feminino foram fornecidos na Universidade da Cidade de Yokohama com consentimento esclarecido e a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade da Cidade de Yokohama. TFPI2 foi medido pelo método descrito no Exemplo 3, e uma faixa do valor padrão para indivíduos sadios foi calculada de acordo com o valor padrão para TFPI2 em indivíduos sadios (por exemplo, valor mediano + 2 DP) e diretriz EP28-A3 do CLSI.

[00109] O BoxPlot o resultado da medição de TFPI2 é mostrado na Figura 7, e o valor padrão e intervalo de referência calculados a partir de indivíduos sadios, são mostrados na Tabela 2. Como resultado desse estudo, não houve diferença entre os sexos nos valores de medição de TFPI2 em japoneses sadios, e o valor padrão de TFPI2 calculado a partir da mediana + 2 DP de indivíduos sadios foi 200 pg/mL. Tabela 2 TFPI (pg/mL [LL | Masculino | Feminino | Masculino+ feminino | | Valor padrão (mediana+2DP) | 197 [ 198 | 39

[LL | Masculino | Feminino | Masculino+ feminino | Exemplo 8. Avaliação de amostras clínicas

[00110] Amostras do soro de 52 casos de câncer renal (carcinoma de células claras: 40 cases, carcinoma papilar: 4 cases, outro câncer renal: 8 casos) foram coletadas pelo mesmo protocolo no Departamento de Urologia da Universidade da Cidade de Yokohama, e foram fornecidas com consentimento esclarecido e a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade da Cidade de Yokohama.

[00111] TFPI2 foi medido pelo método descrito no Exemplo 3, e o desempenho para detecção de câncer renal foi avaliado usando o valor de medição de TFPI2 de um indivíduo sadio descrito no Exemplo 7.

[00112] A Figura 8 mostra o valor de medição de TFPI2 em BoxPlot. TFPI2 tendeu a apresentar um valor alto em carcinoma de células claras e carcinoma papilar no tipo histológico de câncer renal, e também mostrou um valor alto em alguns dos tipos histológicos classificados em outros tipos.

[00113] A Figura 9 é um resultado da análise de curva ROC quando indivíduos sadios e pacientes com câncer renal foram comparados. A área sob a curva (AUC) foi 0,79, indicando que TFPI2 teve desempenho favorável para detecção de câncer renal. Quando um valor máximo do Índice de Youden de 189 pg/mL foi usado como um valor padrão com base no Índice de Youden ((sensibilidade + especificidade) - 100), o desempenho na discriminação entre pacientes com câncer renal e indivíduos sadios foi 59,6% de sensibilidade e 94,6% de especificidade

[00114] A partir dos resultados acima, demonstrou-se que TFPI2 teve desempenho favorável para detecção de câncer renal ao definir um valor padrão adequado no soro, como no plasma, descrito no Exemplo 3.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00115] A presente invenção provê um método para detecção de um paciente com câncer renal por um exame de sangue que é simples e

24 / 24 relativamente pouco oneroso para o paciente.

Prevê-se que contribua para o tratamento médico do câncer renal, o qual não possui um marcador tumoral eficaz e depende do diagnóstico por imagem, e é consideravelmente útil em termos industriais.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para detecção de câncer renal, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende medir a quantidade de TFPI2 em uma amostra in vitro.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que câncer renal é detectado quando a dita quantidade medida de TFPI2 excede um valor padrão predeterminado.

3. Método de acordo com a reivindicação | ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita quantidade de TFPI2 é a soma da quantidade de polipeptídeo de TFPI2 processado e a quantidade de TFPI2 intacto.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dita quantidade de TFPI2 é medida por uma reação antígeno-anticorpo utilizando um anticorpo que se liga a um determinante antigênico na região do 23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo, histidina ou ao 130º resíduo, cisteína da sequência de aminoácidos de SEQ ID No:1.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo que reconhece o domínio Kunitz 1 de TFPL2.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a medição é realizada com espectrometria de massa.

7. Uso de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que que se liga a um determinante antigênico na região do 23º resíduo, ácido aspártico. ao 131º resíduo, histidina ou ao 130º resíduo, cisteína na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 na produção de um reagente para detecção de câncer renal.

8. Uso de um reagente, caracterizado pelo fato de ser para medir a quantidade de TFPI2 em uma amostra na produção de um reagente para detecção de câncer renal.

9. Uso de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o câncer renal é detectado quando a dita quantidade medida de TFPI2 excede um valor padrão predeterminado.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a dita quantidade de TFPI2 é a soma da quantidade de polipeptídeo de TFPI2 processado e a quantidade de TFPI2 intacto.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a dita quantidade de TFPI2 é medida por um antígeno-anticorpo utilizando um anticorpo que se liga a um determinante antigênico na região do 23º resíduo, ácido aspártico, ao 131º resíduo, histidina ou ao 130º resíduo, cisteína da sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 1.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo que reconhece o domínio Kunitz 1 de TFPLI2.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a medida é realizada usando espectrometria de massa.