JP6074676B2 - 組織因子経路阻害因子２（ｔｆｐｉ２）測定による卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬 - Google Patents

Description

本発明は、検体中の組織因子経路阻害因子２（Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２、ＴＦＰＩ２）測定方法を利用した卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬に関する。

卵巣癌は婦人科悪性腫瘍の中で最も死亡率の高い腫瘍であり、日本における罹患率は１９８８年では女性１０万人に７．４人の罹患率に対し、２０１５年には１０．２人に達すると予測されている。卵巣癌は卵巣表層上皮性の悪性腫瘍が約８５％を占め、さらに組織型により漿液性、類内膜型、粘液性、明細胞、未分化型に分類されている。その中で、明細胞腺癌は欧米人の罹患率が５％程度に対し、日本人の罹患率は２０から３０％と日本人で罹患率が高い傾向が報告されている。卵巣明細胞腺癌は、Ｓｔａｇｅ Ｉ期症例が約半数を占め、またシスプラチンやパクリタキセルなどを用いた化学療法に対する抵抗性を有しており、悪性度が極めて高いのが特徴である。

従来、卵巣癌を検出する方法として、経膣超音波法、ＣＴ、ＭＲＩなどが用いられている。また、全血、血球、血清、血漿などの血液成分から卵巣癌を検出する方法としては、癌抗原１２５（Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ １２５、ＣＡ１２５）を用いた方法が一般に知られている。ＣＡ１２５は、１９８１年にＢａｓｔらがヒト卵巣癌細胞株（ＯＶＣＡ４３３）を免疫原として樹立したモノクローナル抗体（ＯＣ１２５）によって認識される抗原であり、血液成分中にＣＡ１２５を検出すると高い陽性率で卵巣表層上皮性卵巣癌を示す。そのため、卵巣癌のスクリーニング、卵巣癌の治療効果の評価、治療後の経過観察などに有効な検査として広く利用されている（非特許文献１および２）。

しかしながら、卵巣癌全般におけるＣＡ１２５の陽性率は約８０％程度であり、約２０％程度の卵巣癌はＣＡ１２５では判別不可能となっている。また、卵巣癌の各組織型間で比較すると、漿液性癌におけるＣＡ１２５陽性率は９０％以上を示すのに対し、明細胞腺癌におけるＣＡ１２５陽性率は約６５％と極めて低い結果となっている（非特許文献３）。

組織因子経路阻害因子２（Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｐａｔｈｗａｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２、ＴＦＰＩ２）は、胎盤タンパク質５（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５、ＰＰ５）と同一のタンパク質であり、ジスルフィド結合を９箇所有した、３つのタンデムＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼインヒビタードメインを含むセリンプロテアーゼインヒビターである（非特許文献４）。

ＴＦＰＩ２は、プロモーター部ＣｐＧアイランドの過剰メチル化と癌との関連（特許文献１、非特許文献５および６）、卵巣癌と子宮体部明細胞腺癌組織における遺伝子発現の向上（非特許文献７）、卵巣癌のうち明細胞腺癌における遺伝子発現の向上（漿液性癌、粘液性癌、類内膜性癌との比較）（非特許文献８）、胃癌における遺伝子の高発現（特許文献２）等、卵巣癌を含めた癌との関連性が報告されている。またＴＦＰＩ２は、子宮内膜症患者で血中ＴＦＰＩ２量が向上する（特許文献３）、子癇前症および子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）患者では正常妊婦と比較して血中ＴＦＰＩ２量が減少傾向を示す（非特許文献９）等の知見が得られており、婦人科疾患における研究も盛んに進められている。

しかし今日まで、卵巣明細胞腺癌におけるＴＦＰＩ２の血中動態に関する報告はなく、
全血、血球、血清、血漿などの血液成分からＴＦＰＩ２を容易に検出でき、かつ検出結果から卵巣明細胞腺癌の検出に適用できるか不明であった。

ＷＯ２００８／０８４２１９号 特開２００８−１１８９１５号公報 特表２００７−５０６９６５号公報 特開２００９−２４０３００号公報

Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６８，１３３１（１９８１） Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，４，１（１９８９） 日本分子腫瘍マーカー研究会誌，２０，９８（２００５） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１６，９３９（１９９４） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．，１９７，１６（２０１０） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３０，１２０５（２０１０） Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１，６４２２（２００５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２，４７２２（２００２） Ｐｌａｃｅｎｔａ，２８，２２４（２００７）

本発明は、ＣＡ１２５など従来知られている卵巣癌の腫瘍マーカーにおいて陽性率の低かった卵巣明細胞腺癌に対し、より陽性率の高い方法および前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。

そこで本発明者らが、ＴＦＰＩ２を検出する方法を構築し、当該方法を用いて卵巣明細胞腺癌の検出を試みた結果、検出性能は卵巣癌の腫瘍マーカーとして従来知られているＣＡ１２５を用いた検出とほぼ同等であったものの、ＣＡ１２５を用いた検出で陰性と判定された卵巣明細胞腺癌検体に対しては高い陽性率を示した。このことから、本発明者らは、ＴＦＰＩ２を検出する方法と卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを組み合わせることで、卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法単独では陽性率の低かった卵巣明細胞腺癌に対し、その陽性率を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。

上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する：
（１）検体より組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）を検出する方法と、検体より卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを組み合わせて卵巣明細胞腺癌を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌を検出する方法。
（２）卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法を用いて、検体より前記マーカーの検出を行ない、前記検出の結果、陰性と判定された検体に対し、組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）を検出する方法を用いて、検体よりＴＦＰＩ２の検出を行なうことを含む、（１）に記載の方法。
（３）ＴＦＰＩ２を検出する方法がＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法であり、卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法が前記マーカーを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法である、（１）または（２）に記載の方法。
（４）ＴＦＰＩ２を認識する抗体が、ＴＦＰＩ２の全長または部分領域をコードするポリヌクレオチドを動物に免疫して得られる抗体である、（３）に記載の方法。
（５）卵巣癌の腫瘍マーカーが、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）である、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
（６）組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）を認識する抗体を含む検体よりＴＦＰＩ２を検出するための試薬を含む、卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬。
（７）さらに、卵巣癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を含む検体より前記マーカーを検出するための試薬を含む、（６）に記載の試薬。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法は、組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）を検出する方法と、卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを組み合わせることを特徴としている。本発明の検出方法において用いられるＴＦＰＩ２を検出する方法は、卵巣明細胞腺癌検体のうちＣＡ１２５など従来の卵巣癌の腫瘍マーカーでは陰性判定となる検体を、高い確率で検出することができる。そのため本発明の検出方法は、ＣＡ１２５など従来の卵巣癌の腫瘍マーカー単独で卵巣明細胞腺癌検体を検出させた場合と比較し、陽性判定率を向上させることができる。

ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを導入した細胞の（ａ）抗ＦＬＡＧ抗体または（ｂ）陰性対照である抗ＢＮＣ抗体によるＦＡＣＳ解析結果を示した図。（ａ）抗ＦＬＡＧ抗体のみ蛍光強度（Ｃｏｕｎｔ）が右にシフトしていることから、細胞表面上にＦＬＡＧタグが付加したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２が発現していることを示している。 分泌型ＴＦＰＩ２のＥＬＩＳＡ解析結果を示した図。縦軸は吸光度を、横軸はウェルあたりの各溶液の添加量を示す。 分泌型ＴＦＰＩ２のウエスタンブロット解析結果を示した図（写真）。 ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２を用いたＣＥＬＩＳＡ解析による各マウス血清抗体価測定結果を示した図。縦軸は吸光度を示す。 分泌型ＴＦＰＩ２を用いたＥＬＩＳＡ解析による各マウス血清抗体価測定結果を示した図。縦軸は吸光度を示す。 分泌型ＴＦＰＩ２を用いた免疫沈降−ウエスタンブロット解析による各モノクローナル抗体解析結果を示した図（写真）。Ａが分泌型ＴＦＰＩ２溶液、Ｂが分泌型対照タンパク質溶液を示す。 分泌型ＴＦＰＩ２を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ解析による各モノクローナル抗体組み合わせ評価結果を示した図。横軸は吸光度を示す。 各種卵巣癌細胞培養上清の免疫沈降産物をＲｕｂｙ染色した結果を示した図（写真）。ＡからＪに示すバンドについてトリプシン消化および質量分析による同定を行なった。 ＴＦＰＩ２各標準試料を用いたときの検量線を示した図。回帰式はｌｏｇ（Ｒａｔｅ）＝ａｌｏｇ（Ｃｏｎｃ）３＋ｂｌｏｇ（Ｃｏｎｃ）２＋ｃｌｏｇ（Ｃｏｎｃ）＋ｄで示され、表示している検量線の各定数は、ａ＝−０．０１０２０００、ｂ＝０．１５４２５９９、ｃ＝−０．０７４５０００、ｄ＝０．７１４６４１４である。縦軸のＲａｔｅは単位時間当たりの４−メチルウンベリフェロンの生成量［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ）］を示す。 ｓｉＲＮＡ法によるＴＦＰＩ２発現抑制癌細胞の培養上清解析結果を示した図。結果は、平均値（棒グラフ）±標準誤差（エラーバー）で示す。縦軸のＲａｔｅは単位時間当たりの４−メチルウンベリフェロンの生成量［ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ）］を示す。 血清検体解析結果をＢｏｘ Ｐｌｏｔで示した図。（ａ）はＴＦＰＩ２、（ｂ）はＣＡ１２５であり、縦軸は濃度を示す。Ｎｏｒｍａｌ；健常人、Ｅｎｄｏ；子宮内膜症、ＯＶＡ Ｃｌｅａｒ；卵巣明細胞腺癌。 健常人および卵巣明細胞腺癌検体のＲＯＣ曲線を示した図。（ａ）はＴＦＰＩ２、（ｂ）はＣＡ１２５を示す。 卵巣明細胞腺癌検体のうちＣＡ１２５陰性（ＣＡ１２５がカットオフ値未満）検体１３例におけるＴＦＰＩ２測定結果を示した図。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法は、検体より組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）を検出する方法と、検体より卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを組み合わせて卵巣明細胞腺癌を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌を検出する方法である。すなわち、本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法により、検体が採取された被検者における卵巣明細胞腺癌の発症の有無を検査できる。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法において、ＴＦＰＩ２を検出する方法と卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法との組み合わせ方は、特に制限されない。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法における、ＴＦＰＩ２を検出する方法と卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法との組み合わせ方の一例として、
（Ａ）測定対象検体に対し、ＴＦＰＩ２を検出する方法と卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを、同時にまたは別個に行ない、卵巣明細胞腺癌を検出する方法、
（Ｂ）測定対象検体に対し、まずＴＦＰＩ２を検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法で、卵巣明細胞腺癌を検出する方法、
（Ｃ）測定対象検体に対し、まず卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、ＴＦＰＩ２を検出する方法で、卵巣明細胞腺癌を検出する方法、
があげられるが、（Ｂ）または（Ｃ）の方法が、検出の際用いる試薬に無駄が生じなくなる点で好ましい。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法で検出する、卵巣癌の腫瘍マーカーは、従来知られているマーカーから適宜選択すればよく、一例として、癌抗原１２５（Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ １２５、ＣＡ１２５）、癌抗原５４６（ＣＡ５４６）、癌抗原７２−４（ＣＡ７２−４）、癌抗原１３０（ＣＡ１３０）、癌抗原６０２（ＣＡ６０２）、シアリルＴｎ抗原（Ｓｉａｌｙｌ Ｔｎ ａｎｔｉｇｅｎ、ＳＬＮ）、癌関連ガラクトース転移酵素（Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｕｍｏｒ、ＧＡＴ）、リゾホスファチジン酸（ＬｙｓｏＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ Ａｃｉｄ、ＬＰＡ）、ヒト精巣上体タンパク質４（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＨＥ４）が挙げられる。このうち、特に卵巣癌の腫瘍マーカーとして最も汎用されているＣＡ１２５がＴＦＰＩ２との相互補完ができる点で、本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法で使用する卵巣癌の腫瘍マーカーとして好ましい。また、本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法において検出される腫瘍マーカーは、１種のみであってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法における、ＴＦＰＩ２を検出する方法および卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法は特に制限されない。ＴＦＰＩ２を検出する方法としては、ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法が例示できる。卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法としては、例えば、従来用いられている卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する手法が利用でき、卵巣癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法が例示できる。以下、ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用してＴＦＰＩ２を検出する方法およびそれに関連する事項について説明するが、それらの説明は、卵巣癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用して卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法にも準用できる。

ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した、ＴＦＰＩ２を検出する方法の具体例として、
（ａ）標識したＴＦＰＩ２およびＴＦＰＩ２を認識する抗体を用い、標識したＴＦＰＩ２および検体に含まれるＴＦＰＩ２が、ＴＦＰＩ２を認識する抗体に競合的に結合することを利用した競合法、
（ｂ）ＴＦＰＩ２を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体とＴＦＰＩ２との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法、
（ｃ）蛍光標識したＴＦＰＩ２を認識する抗体を用い、当該抗体とＴＦＰＩ２とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法、
（ｄ）エピトープの異なる２つのＴＦＰＩ２を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体とＴＦＰＩ２との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法、
があげられるが、（ｄ）の方法が簡便かつ汎用性が高く、また（ｄ）の方法を利用した試薬および装置に関しては技術が十分確立されている点で好ましい。

ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、ＴＦＰＩ２タンパク質そのもの、ＴＦＰＩ２タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチド、ＴＦＰＩ２タンパク質の全長または部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。なお、免疫原として、ＴＦＰＩ２タンパク質そのもの、またはＴＦＰＩ２タンパク質の部分領域からなるオリゴペプチドを用いると、前記タンパク質または前記オリゴペプチドを調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られたＴＦＰＩ２を認識する抗体が、天然型のＴＦＰＩ２に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、結果として検体中に含まれるＴＦＰＩ２濃度を正確に定量できなくなる可能性がある。一方、免疫原として、ＴＦＰＩ２タンパク質の全長または部分領域をコードするポリヌクレオチドを用いると、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより、免疫された動物の体内で天然型のＴＦＰＩ２タンパク質の全長または部分領域が発現されるため、天然型のＴＦＰＩ２に対し、高い特異性および結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られる。そのため、本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法において、ＴＦＰＩ２の検出をＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いて行なう場合、前記抗体はＴＦＰＩ２の全長または部分領域をコードするポリヌクレオチドを動物に免疫して得られた抗体であると好ましい。ＴＦＰＩ２を認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。

ＴＦＰＩ２を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地によりＴＦＰＩ２を認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体（抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体）を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法で用いる、ＴＦＰＩ２を認識する抗体、例えば、ＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体の選定は、宿主発現系に由来する、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型ＴＦＰＩ２または分泌型ＴＦＰＩ２に対する親和性に基づいて行えばよい。なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫
細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、糖鎖付加といった翻訳後の修飾により、天然型のＴＦＰＩ２に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などがあげられる。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法で用いる、ＴＦＰＩ２を認識する抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で樹立した、ＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿による抗体濃縮後、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、ＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体の精製が可能である。なお、ＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いた抗原抗体反応をサンドイッチ法（前述した（ｄ）の方法）で行なう際に用いる、標識した抗体は、前述した方法で精製したＴＦＰＩ２を認識するモノクローナル抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出試薬は、ＴＦＰＩ２を認識する抗体を含んだＴＦＰＩ２の検出試薬を含む、検体より卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬である。本発明の卵巣明細胞腺癌検出試薬は、さらに、卵巣癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を含んだ卵巣癌の腫瘍マーカーの検出試薬を含んでいてもよい。本発明の卵巣明細胞腺癌検出試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固定化されていてもよい。

ＴＦＰＩ２の検出試薬のうち、前述した（ｄ）のサンドイッチ法の一態様である２ステップサンドイッチ法に利用される試薬について、その具体例を詳細に説明する。

まず、ＴＦＰＩ２の検出試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＴＦＰＩ２を認識する２つの抗体のうち、一方の抗体をイムノプレート、磁性粒子といったＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
（ＩＩ）担体に前記抗体を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。
（ＩＩＩ）（Ｉ）の抗体とは異なるエピトープを認識する他方の抗体を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、ビオチンやアビジンなど、特異的に結合する相手が存在する物質が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などが好ましい。

次に、前述した方法で得られたＴＦＰＩ２の検出試薬を用いて、２ステップサンドイッチ法でＴＦＰＩ２を検出するには、以下の（ＩＶ）から（ＶＩ）に示す方法で行なえばよい。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一
定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＴＦＰＩ２溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＴＦＰＩ２濃度を定量する。

なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した２ステップサンドイッチ法と同様、担体に一方の抗体を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した他方の抗体を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。なお、前述した２ステップサンドイッチ用ＴＦＰＩ２検出試薬、および１ステップサンドイッチ法用ＴＦＰＩ２検出試薬は、必要に応じ凍結乾燥させてもよい。

上記のＴＦＰＩ２の検出試薬に関する説明は、卵巣癌の腫瘍マーカーの検出試薬にも準用できる。卵巣癌の腫瘍マーカーの検出試薬は、上記のＴＦＰＩ２の検出試薬と同様に作製されたものであってもよく、従来市販されているものであってもよい。

検出試薬に含まれる抗体等の試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、検出の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。具体的には、例えば、後述するように検体として２倍希釈した血清や血漿を１００μＬ使用して、サンドイッチ法によりＴＦＰＩ２の測定を行う場合、当該検体１００μＬを抗体と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識抗体量が２ｎｇから２０μｇであってよい。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出試薬は、用手法での検出にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた検出にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた検出は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく検出が可能で、かつ短時間に検体中のＴＦＰＩ２および卵巣癌の腫瘍マーカーの濃度が定量可能であるため、好ましい。

本発明の卵巣明細胞腺癌検出方法および検出試薬の対象検体は、全血、血球、血清、血漿などの血液成分、細胞または組織の抽出液、尿、精漿、脳脊髄液などがあげられるが、血液成分や尿などの体液を検体として用いると、卵巣明細胞腺癌を簡便かつ非侵襲的に検できるため好ましく、検体採取の容易性、他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液成分を検体として用いるのが特に好ましい。検体の希釈倍率は無希釈から１００倍希釈の中から使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよく、例えば、血清や血漿の場合は、２倍希釈した検体を１００μＬ用いればよい。

本発明において、卵巣明細胞腺癌に対するＴＦＰＩ２の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、腫瘍マーカーとの組み合わせの態様や臨床データ等の諸条件に応じて、適宜設定することができる。例えば、具体的には、血清を検体として用いた際のＴＦＰＩ２の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を、２９．８５ｎｇ／ｍＬに設定してもよい。なお、後述するように当該ＴＦＰＩ２の基準値の具体例は本願実施例で発現させたＴＦＰＩ２を標準試料として作成された検量線に基づく値であるため、用いられる標準試料に応じて適宜変更される。ＴＦＰＩ２が基準値以上であれば、卵巣明細胞腺癌陽性と判定できる。

本発明において、卵巣明細胞腺癌に対する卵巣癌の腫瘍マーカーの基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）としては、例えば、従来用いられている基準値を採用すればよい。また、卵巣癌の腫瘍マーカーの基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、ＴＦＰＩ２との組み合わせの態様等の諸条件に応じて、適宜変更してもよい。例えば、血清を検体として用いた際のＣＡ１２５の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、一般的に３５Ｕ／ｍＬに設定されている。例えば、具体的に
は、血清を検体として用いた際のＣＡ１２５の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を、３５．７５Ｕ／ｍＬに設定してもよい。ＣＡ１２５が基準値以上であれば、卵巣明細胞腺癌陽性と判定できる。

ＴＦＰＩ２を検出する方法と卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを組み合わせて卵巣明細胞腺癌を検出した結果として卵巣明細胞腺癌が陰性または陽性であるかは、両方法の組み合わせの態様に応じて、ＴＦＰＩ２に基づく卵巣明細胞腺癌の判定結果と卵巣癌の腫瘍マーカーに基づく卵巣明細胞腺癌の判定結果に基づいて判定すればよい。

上記（Ａ）に記載したように、測定対象検体に対し、ＴＦＰＩ２を検出する方法と卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを、同時にまたは別個に行ない、卵巣明細胞腺癌を検出する場合には、例えば、ＴＦＰＩ２と卵巣癌の腫瘍マーカーの両方で卵巣明細胞腺癌陽性と判定された場合に卵巣明細胞腺癌陽性であると判定してもよく、ＴＦＰＩ２と卵巣癌の腫瘍マーカーの少なくとも片方で卵巣明細胞腺癌陽性と判定された場合に卵巣明細胞腺癌陽性であると判定してもよい。これらの内、ＴＦＰＩ２と卵巣癌の腫瘍マーカーの少なくとも片方で卵巣明細胞腺癌陽性と判定された場合に卵巣明細胞腺癌陽性であると判定するのが好ましい。

上記（Ｂ）に記載したように、測定対象検体に対し、まずＴＦＰＩ２を検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法で、卵巣明細胞腺癌を検出する場合には、例えば、ＴＦＰＩ２で卵巣明細胞腺癌陽性と判定された場合、およびＴＦＰＩ２では卵巣明細胞腺癌陰性と判定されたが卵巣癌の腫瘍マーカーでは卵巣明細胞腺癌陽性と判定された場合に、卵巣明細胞腺癌陽性であると判定することができる。

上記（Ｃ）に記載したように、測定対象検体に対し、まず卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、ＴＦＰＩ２を検出する方法で、卵巣明細胞腺癌を検出する場合には、例えば、卵巣癌の腫瘍マーカーで卵巣明細胞腺癌陽性と判定された場合、および卵巣癌の腫瘍マーカーでは卵巣明細胞腺癌陰性と判定されたがＴＦＰＩ２では卵巣明細胞腺癌陽性と判定された場合に、卵巣明細胞腺癌陽性であると判定することができる。

以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１ ＤＮＡ免疫用ベクターの構築
ＤＮＡ免疫にて液性免疫を効果的に誘導するためには、対象抗原タンパク質を膜結合型タンパク質として細胞表面上に局在させるのが好ましい。ＴＦＰＩ２はもともと分泌タンパク質であることから、ＴＦＰＩ２を細胞表面上に局在させるべく、ＴＦＰＩ２のＣ末端側にＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカーを付加したタンパク質（以下、ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２）を発現可能なプラスミドベクターを構築した。

（１）下記（ａ）のプライマーを用いて、ＴＦＰＩ２ ｃＤＮＡの開始コドンおよび終止コドンを除いた全長（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の１４８番目から７８０番目の領域）からなるポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
（ａ）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミド用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ａａｇａｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃａｇｇａｇｃｃａａｃａ−３’（配列番号１、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の１４８から１６２番目の配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ｇｇｃａｇｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｇ−３’（配列番号２、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の７６６から７８０番目の配列に相当）

（２）Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカーのコード領域とＦＬＡＧタグのコード領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコールに従い、（１）で得られたＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を挿入し、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグペプチドが、Ｃ末端側にＧＰＩアンカーがそれぞれ付加されたＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２の発現プラスミドを構築した。

（３）（２）で構築した発現プラスミドに挿入されているポリヌクレオチドにより発現されるＴＦＰＩ２が、想定通り細胞表面に局在していることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（３−１）（２）で構築したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを常法に従い２９３Ｔ細胞株へ導入した。
（３−２）前記発現プラスミドが導入された２９３Ｔ細胞株を、５％ＣＯ₂インキュベータにて、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）添加Ｄ−ＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養し、ＴＦＰＩ２を一過性発現させた。（３−３）（３−２）で得られた培養細胞に、ＦＬＡＧタグと特異的に結合するＳＩＧＭＡ社製マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体、または、陰性対照としてＦＬＡＧタグとは結合しないマウス抗ＢＮＣ抗体を添加し、３０分静置した。なお、ＢＮＣとは、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるペプチドである（特開２００９−２４０３００号、特許文献４）。
（３−４）静置後、蛍光標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を添加し、さらに３０分間静置後、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）解析を行なった。

ＦＡＣＳ解析の結果を図１に示す。解析の結果、陰性対照である抗ＢＮＣ抗体を添加した場合（図１（ｂ））は蛍光標識された細胞によるシグナルの増加、いわゆるシフトが認められなかった。一方、抗ＦＬＡＧ抗体を添加した場合（図１（ａ））は蛍光標識された細胞によるシフトが認められた。本結果より、発現したＦＬＡＧタグペプチドを付加したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２が細胞表面上に局在していることが示された。

実施例２ 免疫および採血
マウスへの免疫は、実施例１（２）で構築したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを、ＤＮＡ量として４０μｇ含むよう調製したＰＢＳ溶液１００μＬを、４匹のＣ５７ＢＬ６マウスに免疫することで行なった。初回の免疫から３日後、５日後、７日後、９日後、１２日後、１４日後、２１日後、２８日後、３５日後に追加免疫し、初回の免疫開始後４２日目に採血し抗血清を採取し、それぞれ抗血清Ａ１からＡ４とした。

実施例３ ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２恒常発現細胞の作製
抗血清評価用として、ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２を恒常的に発現可能なチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を以下の方法で作製した。
（１）実施例１（２）で構築したＴＦＰＩ２発現プラスミドを、常法に従いＣＨＯ−Ｋ１細胞株へ遺伝子導入後、５％ＣＯ₂インキュベータにて、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍｓ Ｆ
１２培地（和光純薬社製）を用いて、２４時間・３７℃で培養した。
（２）培養後、抗生物質Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を２５０μｇ／ｍＬとなるよう添加し、さらに３週間培養した。
（３）抗ＦＬＡＧ抗体を用いてセルソーターによりＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２を恒常的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を獲得した。

実施例４ 分泌型ＴＦＰＩ２発現プラスミドの構築
実施例１（２）で構築したＴＦＰＩ２発現プラスミドにおいて、挿入したＴＦＰＩ２遺伝子と、その３’末端側に存在するＧＰＩアンカーのコード領域との間に、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるＢＮＣペプチド（特許文献４）をコードするオリゴヌクレオチドをさらに挿入することで、Ｎ末端側にＦＬＡＧペプチド、Ｃ末端側にＢＮＣペプチドがそれぞれ付加され、且つＧＰＩアンカーを有さない分泌型ＴＦＰＩ２を発現可能なプラスミドを調製することができる。具体的調製方法を以下に示す。

（１）下記（ｂ）のプライマーを用いて、ＴＦＰＩ２ ｃＤＮＡの開始コドンおよび終止コドンを除いた全長（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の１４８番目から７８０番目の領域）の３’末端側にＢＮＣペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加したポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により増幅した。
（ｂ）分泌型ＴＦＰＩ２発現プラスミド用プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：
５’−ａａｇａｃｇａｔｇａｃｇａｃａａｇｃｔｔｇｃｔｃａｇｇａｇｃｃａａｃａ−３’（配列番号３、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の１４８から１６２番目の配列に相当）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：
５’−ａｇｃａｔｃａｇｔｇｇｔｇａａｔｔｃｔｃａｔｔａｇｔｇｇｃｇａｃｇｃａｇａａｃｔｔｔｇｃａａａａｔｔｇｃｔｔｃｔｔｃｃｇ−３’（配列番号４、３’末端側１５塩基はＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＭ＿００６５２８の７６６から７８０番目の配列に相当）

（２）Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカー領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコールに従い、（１）のＲＴ−ＰＣＲ増幅産物を挿入し、分泌型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを構築した。

（３）プラスミドｐＦＬＡＧ１に挿入したポリヌクレオチドにより発現される分泌型ＴＦＰＩ２において、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端側にＢＮＣタグが付加されていることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（３−１）実施例１記載と同様に、（２）で構築した分泌型ＴＦＰＩ２発現プラスミドを２９３Ｔ細胞株へ導入して分泌型ＴＦＰＩ２を一過性発現させ、培養７２時間後の培養液を遠心分離し、上清を分泌型ＴＦＰＩ２溶液として回収した。
（３−２）分泌型ＴＦＰＩ２溶液を試料として用いて、（Ａ）酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、および（Ｂ）ウエスタンブロット法を行った。

（Ａ）ＥＬＩＳＡ法
（Ａ−１）ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を１００ｎｇ／ウェルになるようカーボネート緩衝液（ｐＨ９．８）で希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製）に固相化した。
（Ａ−２）４℃にて一晩反応後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）
により３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳ溶液を２５０μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、室温で２時間放置した。
（Ａ−３）ＴＢＳにより３回洗浄を行ない、分泌型ＴＦＰＩ２溶液、および、陰性対照として発現プラスミドを導入していない２９３Ｔ細胞株の培養上清を、５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（Ａ−４）０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）により３回洗浄を行なった後、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ（１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ）で１μｇ／ｍＬになるよう希釈したマウス抗ＢＮＣモノクローナル抗体溶液を、５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間放置した。
（Ａ−５）ＴＢＳ−Ｔにより３回洗浄を行なった後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ−Ｆｃ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（Ａ−６）ＴＢＳ−Ｔにより４回洗浄を行ない、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光値を測定した。

（Ｂ）ウエスタンブロット法
（Ｂ−１）（３−１）で得られた分泌型ＴＦＰＩ２溶液、および、陰性対照として発現プラスミドを導入していない２９３Ｔ細胞株の培養上清を、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア社製）に転写した。
（Ｂ−２）５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ（ブロッキング溶液）を室温で２時間反応することでブロッキング後、ブロッキング溶液にアルカリフォスファターゼ標識抗ＢＮＣ抗体を１μｇ／シートにて添加し、４℃で一晩反応させた。
（Ｂ−３）ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（パーキンエルマー社製）を用い、得られた化学発光を感光フィルムにより検出した。

ＥＬＩＳＡ法での解析結果を図２に示す。分泌型ＴＦＰＩ２溶液（分泌型ＴＦＰＩ２培養上清）では、陰性対照（２９３Ｔ培養上清）と比較して明瞭な添加量依存的なシグナルが認められ、分泌型ＴＦＰＩ２が培養上清中に産生されていることが示された。

ウエスタンブロット法での解析結果を図３に示す。分泌型ＴＦＰＩ２溶液（分泌型ＴＦＰＩ２培養上清）では、分子量約３５ｋＤａ付近に明瞭なバンドが検出され、本法でも分泌型ＴＦＰＩ２が培養上清中に産生されていることが示された。

実施例５ マウス抗血清の評価
実施例２で採取したマウス抗血清を、実施例３で作製したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用いた細胞酵素免疫測定法（ＣＥＬＩＳＡ）、および実施例４で得られた分泌型ＴＦＰＩ２溶液を用いたＥＬＩＳＡにより解析した。なお、特異性の検討の為、ＴＦＰＩ２とは異なるタンパク質をＧＰＩアンカー型（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端側にＧＰＩアンカーを有する）および分泌型（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端側にＢＮＣタグを有する）でそれぞれ発現する発現プラスミドを、公知の遺伝子配列に基づいて上述したＴＦＰＩ２発現プラスミドと同様に構築し、２９３Ｔ細胞株やＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入して利用した。以下、当該ＴＦＰＩ２とは異なるタンパク質を、対照タンパク質ともいう。

（１）ＣＥＬＩＳＡ解析
（１−１）９６ウェルプレートに、実施例３で作製したＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞、および陰性対照細胞として前記対照タンパク質をＧＰＩアンカー型で
発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１ウェルあたり５×１０⁴細胞で添加し、１０％ＦＢＳ添加Ｈａｍｓ Ｆ１２培地（和光純薬社製）を用いて、５％ＣＯ₂インキュベータにて、２４時間・３７℃で培養した。
（１−２）ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２発現細胞に対して２００から１６２００倍希釈した抗血清（Ａ１からＡ４）またはマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を、陰性対照細胞に対して２００倍希釈した抗血清（Ａ１からＡ４）またはマウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を、それぞれ１次抗体として添加し、室温にて１時間反応させた。
（１−３）反応後プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ−Ｆｃ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を２次抗体として添加し、室温にて１時間反応させた。
（１−４）反応後プレートを洗浄し、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光値を測定した。

（２）ＥＬＩＳＡ解析
陰性対照として前記対照タンパク質を分泌型で発現する２９３Ｔ細胞株の培養上清（以下、分泌型対照タンパク質溶液ともいう）を用いた他は、実施例４（Ａ）と同様な方法で各マウス抗血清を評価した。

ＣＥＬＩＳＡ解析の結果を図４に示す。陰性対照細胞の場合は、いずれの抗血清を用いてもシグナルがほとんど認められなかった。一方、ＴＦＰＩ２発現細胞の場合は、抗血清の希釈率に応じた明瞭なシグナルが認められた。本結果より実施例２で実施したＤＮＡ免疫により特異性の高い抗血清が得られたことが示された。

ＥＬＩＳＡ解析の結果を図５に示す。ＣＥＬＩＳＡの結果同様、抗血清（Ａ１からＡ４）を用いた場合は、ＴＦＰＩ２に対してのみ明瞭なシグナルが認められ、本法でも実施例２で実施したＤＮＡ免疫により特異性の高い抗血清が得られたことが示された。

図４および５の結果をまとめると、実施例２で得られたマウス抗血清は、ＧＰＩアンカー型ＴＦＰＩ２および分泌型ＴＦＰＩ２のいずれに対しても特異性の高い抗血清であることがわかる。

実施例６ ハイブリドーマの樹立
ＴＦＰＩ２に対する抗体を産生可能なハイブリドーマを以下の方法により樹立した。
（１）実施例２でＤＮＡ免疫して得られたマウスから、鼠頚ならびに腋下リンパ節を採取し、リンパ細胞を回収した。
（２）回収したリンパ細胞とマウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０とで、ポリエチレングリコール存在下で常法に従い細胞融合を実施した。
（３）１０％ＦＢＳ添加ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）／Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬社製）で約１０日間培養することで抗体産生細胞ハイブリドーマを選択した。
（４）選択した抗体産生細胞ハイブリドーマの培養上清を、実施例５（１）に記載のＣＥＬＩＳＡおよび実施例４（Ａ）に記載のＥＬＩＳＡに供し、ＴＦＰＩ２に対する抗体を産生可能なハイブリドーマのスクリーニングを行った。
（５）スクリーニングにより選択されたウェル中の細胞を限界希釈法によりモノクローナル化を行ない、１０％ＦＢＳ添加ＨＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）／Ｅ−ＲＤＦ培地から１０％ＦＢＳ添加Ｅ−ＲＤＦ培地に馴化培養し、最終的に３種類のハイブリドーマを樹立した。

実施例７ モノクローナル抗体調製と酵素標識
実施例６で樹立した３種類のハイブリドーマから、以下の方法により、ＴＦＰＩ２に対するモノクローナル抗体（抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体）を調製し、酵素標識を行なった。
（１）実施例６で樹立したハイブリドーマ培養上清５００ｍＬを５０％硫安で分画し、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））により透析後、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、以下の方法によりモノクローナル抗体の精製を行なった。
（１−１）前記カラムをあらかじめＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ；１０ｍＭ リン酸＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））にて緩衝液置換した後、ハイブリドーマ培養上清を流速１０ｍＬ／ｍｉｎで通過させた。
（１−２）カラム容量の５倍以上のＰＢＳにより十分カラムを洗浄することで、未結合タンパク質の除去を行なった。この際、カラムを通過した緩衝液のＯＤ₂₈₀による吸光度が０．０１以下になったことを確認することで、未結合タンパク質が残存していないと判断した。
（１−３）カラム洗浄後、溶出液（１００ｍＭ グリシン（ｐＨ２．５））により結合抗体を溶出させた。なお、溶出抗体は速やかに１／１０容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加し、中性にするとともに、ＴＢＳによる速やかな透析を行なった。
（２）（１）で得られた精製モノクローナル抗体の一部を、抗体性能評価用にＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２およびＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学社製）により酵素標識を行なった。

実施例８ モノクローナル抗体の性能評価
実施例７で得られた３種類のモノクローナル抗体を以下の方法により性能評価した。

（１）免疫沈降−ウエスタンブロット法（ＩＰ−ＷＢ法）
（１−１）抗マウスＩｇＧ抗体が固定化された磁性微粒子Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｓｈｅｅｐ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に対し、実施例７で得られた精製モノクローナル抗体を添加後、未反応の抗体をＴＢＳ−Ｔにより洗浄することで、抗ＴＦＰＩ２抗体固定化磁性微粒子を調製した。
（１−２）ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）を実施例４記載の分泌型ＴＦＰＩ２溶液、または実施例５（２）記載の分泌型対照タンパク質溶液に添加して擬似血清サンプルを作製し、上記磁性微粒子と室温にて２時間反応させた。反応後、磁石により磁性微粒子を集積し、ＴＢＳ−Ｔにて洗浄後、磁性微粒子に吸着して回収されたタンパク質を実施例４（Ｂ）に記載のウェスタンブロット法により解析した。

（２）ＥＬＩＳＡ法
（２−１）９６穴イムノプレート（ＮＵＮＣ）に、各精製モノクローナル抗体またはＦＬＡＧ抗体（陰性対照）をそれぞれ２μｇ／ｍＬを含むＴＢＳ溶液を、５０μＬ／ウェルにて添加し、４℃一晩放置することで抗体をプレートに結合させた。
（２−２）ブロッキング後、ＦＢＳを実施例４で得られた分泌型ＴＦＰＩ２溶液に添加して作製した擬似血清試料を添加した。
（２−３）室温で１時間反応後、ＴＢＳ−Ｔにより４回洗浄し、３種類のペルオキシダーゼ標識コンジュゲート抗体を含む１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液を１００ｎｇ／ウェルにて添加した。
（２−４）室温で１時間放置後、ＴＢＳ−Ｔにより６回洗浄し、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ社製）を添加後、４５０ｎｍの吸光値を測定することで、サンドイッチＥＬＩＳＡが構築可能なモノクローナル抗体の組み合わせを評価した。

ＩＰ−ＷＢ法の解析結果を図６に示す。Ａが分泌型ＴＦＰＩ２溶液、Ｂが分泌型対照タンパク質溶液を示す。モノクローナル抗体を用いた場合、分泌型ＴＦＰＩ２溶液では分子量約３５ｋＤａ付近に明瞭なバンドが検出されたのに対し、分泌型対照タンパク質溶液ではバンドが検出されておらず、実施例７で得られた３種類のモノクローナル抗体はいずれも分泌型ＴＦＰＩ２を特異的に認識していることを確認した。また、ＴＦ１−４ＬＤ１、ＴＦ１−６ＬＤ２、ＴＦ４−８ＬＤ３の順で親和性が高いことが示された。

ＥＬＩＳＡ法の解析結果を図７に示す。ＴＦ１−４ＬＤ１固相抗体とＴＦ１−６ＬＤ２検出抗体の組み合わせが特に高感度であり、サンドイッチＥＬＩＳＡの構築に好ましく利用できることを見出した。

実施例９ 質量分析法によるモノクローナル抗体結合タンパク質の同定
実施例７で得られた３種類のモノクローナル抗体のうち、サンドイッチＥＬＩＳＡ用抗体として好ましいＴＦ１−４ＬＤ１およびＴＦ１−６ＬＤ２を用いた免疫沈降法により、これらの抗体と特異的に結合する各種卵巣癌細胞培養上清中のタンパク質を以下の方法により選別および同定した。なお、卵巣癌細胞として、漿液性卵巣癌細胞由来のＯＶＳＡＨＯ、粘液性卵巣癌細胞由来のＭＣＡＳ、明細胞性卵巣癌（卵巣明細胞腺癌）細胞由来のＯＶＩＳＥおよびＯＶＭＡＮＡ、の４種類を用いた。
（１）前記癌細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク社製）にて１００％コンフルエント状態で３日間培養した。
（２）培養上清を遠心後、得られた上清２ｍＬに対し、実施例８に記載の方法で調製したＴＦ１−４ＬＤ１固定化磁性微粒子またはＴＦ１−６ＬＤ２固定化磁性微粒子を添加し、室温で１時間撹拌して反応させた。
（３）ＰＢＳＴ−ＮＰ４０（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０と１％ ＮＰ４０を含むＰＢＳ）で２回洗浄後、界面活性剤を含まないＰＢＳで３回洗浄した。
（４）磁性微粒子に吸着して回収されたタンパク質と、陰性対照として抗体固定化磁性微粒子のみを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した。なおこれらのサンプルは、電気泳動上でＩｇＧ軽鎖とＴＦＰＩ２を確実に分離させるため、還元処理せずにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、分離したタンパク質をＲｕｂｙ染色（インビトロジェン社製）により染色した。
（５）染色された計１０種類のバンド（ＴＦ１−４ＬＤ１：図８のＡからＧに記載のバンド、ＴＦ１−６ＬＤ２：図８のＨからＪに記載のバンド）を切り出し、ジチオスレイトールおよびヨードアセトアミドを用いて還元アルキル化後、トリプシンによるゲル内消化を実施した。
（６）トリプシン消化により生成したペプチド断片を、Ｃ１８逆相カラムを用いた１ＤナノＬＣシステム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）により分離し、ＬＴＱオービトラップ質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）によりＭＳ／ＭＳ測定を行なった。得られたデータはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．３ソフトウェア（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて解析し、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース上のアミノ酸配列に対して検索をかけてタンパク質を同定した。

Ｒｕｂｙ染色した結果を図８に、同定タンパク質を表１に示す。ＴＦ１−４ＬＤ１抗体およびＴＦ１−６ＬＤ２抗体双方において、粘液性（ＭＣＡＳ）および漿液性（ＯＶＳＡＨＯ）卵巣癌細胞培養上清では３０ｋＤａ付近に染色バンドが認められない一方、明細胞性卵巣癌（ＯＶＩＳＥ、ＯＶＭＡＮＡ）培養上清では３０ｋＤａ付近に明瞭な染色バンドが認められた（図８）。また、質量分析の結果、ペプチド断片はいずれもＴＦＰＩ２の一部と同一であり、１０種類の染色バンド（図８のＡからＪに記載のバンド）は全てＴＦＰＩ２に由来することが示された（表１）。以上の結果から、前記２種類の抗体は明細胞性卵巣癌細胞から産生されたＴＦＰＩ２タンパクを特異的に認識していること、およびＴＦＰＩ２が明細胞性卵巣癌細胞で特異的に産生されていることが示された。

実施例１０ ＴＦＰＩ２測定試薬の調製
（１）水不溶性フェライト担体に、抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＦ１−４ＬＤ１）を、１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて４０℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＴＦＰＩ２抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ＴＦＰＩ２モノクローナル抗体（ＴＦ１−６ＬＤ２）に実施例７記載のアルカリフォスファターゼを標識することで、抗ＴＦＰＩ２標識抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製した標識抗体を０．５μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）５０μＬを容器に添加し、凍結乾燥を実施することで、ＴＦＰＩ２測定試薬を作製した。なお、作製したＴＦＰＩ２測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。

実施例１１ ＴＦＰＩ２測定試薬の評価
一定濃度のＴＦＰＩ２を含む標準試料および検体を、実施例１０で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を用いて測定することで前記試薬を評価した。

評価用装置は全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００（東ソー社製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００２）を用いた。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００による測定は、
（１）標準試料または検体５０μＬと界面活性剤を含む希釈液５０μＬを、実施例１０で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４−メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加する、
ことで行い、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４−メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。

評価に用いた標準試料は、実施例４で得られた分泌型ＴＦＰＩ２溶液にＦＢＳを添加することで調製しており、ＴＦＰＩ２を０ｎｇ／ｍＬ、６．２ｎｇ／ｍＬ、１８．５ｎｇ／ｍＬ、５５．６ｎｇ／ｍＬ、１６６．７ｎｇ／ｍＬ、５００．０ｎｇ／ｍＬ、それぞれ含
んだ試料を調製した。なお、当該ＴＦＰＩ２濃度は暫定であり絶対濃度ではないが、当該標準試料による検量線を基に、全ての検体が濃度換算されることから、検体間の相対的な濃度比較は可能である。

標準試料（ＴＦＰＩ２濃度０ｎｇ／ｍＬおよび５００ｎｇ／ｍＬ）、ウサギ血清ならびに明細胞性卵巣癌細胞（ＯＶＩＳＥ）培養上清の測定値を表２に示す。いずれの試料も変動係数が１０％以下を示しており、実施例１０で作製したＴＦＰＩ２測定試薬にて得られる結果が信頼し得る結果であることが証明された。また、標準試料から作成した検量線を図９に示す。本検量線およびＴＦＰＩ２濃度０ｎｇ／ｍＬの標準試料の（平均値＋２×標準偏差）より算出した最小検出感度は０．３ｎｇ／ｍＬであった。

実施例１２ ｓｉＲＮＡ法によるＴＦＰＩ２発現抑制癌細胞の培養上清解析
実施例１０で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を用いて、ｓｉＲＮＡによりＴＦＰＩ２タンパク質発現を抑制した明細胞性卵巣癌細胞（ＯＶＭＡＮＡ、ＯＶＳＡＹＯ）培養上清を測定した。本実施例では、ＴＦＰＩ２抑制用ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＴＦＰＩ２−１（配列番号５）およびｓｉＴＦＰＩ２−２（配列番号６）を対象にＢＬＯＣＫ−ｉＴ ＲＮＡｉ
Ｄｅｓｉｇｎｅｒツールを用いて設計しＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に委託して合成した２種類のｓｉＲＮＡを用いた。また、陰性対照ｓｉＣｏｎｔｒｏｌとしてステルスＲＮＡｉネガティブコントロールＬｏ（インビトロジェン社製）を用いた。
（１）各明細胞性卵巣癌細胞をｓｉＲＮＡ導入前日に６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで培養し、培養上清を調製した。
（２）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉ ＭＡＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により各試験区３連でｓｉＲＮＡを導入した。
（３）導入２４時間後に培地を交換し、交換４８時間後の培養上清を回収した。遠心後、各上清を実施例１０記載のＴＦＰＩ２測定試薬で測定した。

ＴＦＰＩ２測定結果を図１０に示す。ＯＶＭＡＮＡおよびＯＶＳＡＹＯ培養上清の双方において、陰性対照であるｓｉＣｏｎｔｒｏｌ区と比較して、ＴＦＰＩ２抑制用ｓｉＲＮＡｉ区ではいずれも有意にシグナルが低減したことから、実施例１０で作製したＴＦＰＩ２測定試薬は癌細胞から産生されるＴＦＰＩ２を正確に測定可能なことが示された。

実施例１３ 卵巣明細胞腺癌検体の測定
実施例１０で作製したＴＦＰＩ２測定試薬を用いて卵巣明細胞腺癌検体を測定した。なお、本実施例で使用した検体は、健常人検体（ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン、Ｔｈｙｒｏｉ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）低値検体）７９例（内訳：ＳＬＲ社購入検体３０例、Ｔｒｉｎａ社購入検体４９例）、卵巣子宮内膜症検体３０例（ＰＲＯＭＥＤＤＸ社購入検体）および卵巣明細胞腺癌検体５０例（内訳：ＳＬＲ社購入検体３０例、ＮＯＶＡ社購入検体２０例）であり、いずれの検体もインフォームドコンセント承諾済と記載された欧米人血清検体である。

全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ−１８００（東ソー社製）を評価用装置とし、前述した健常人検体７９例、卵巣子宮内膜症検体３０例、および卵巣明細胞腺癌検体５０例を、実施例１０で作製したＴＦＰＩ２測定試薬およびＣＡ１２５測定試薬（東ソー社製、承認番号２０７００ＡＭＺ００５０４０００）を用いて測定した。

ＴＦＰＩ２測定値およびＣＡ１２５測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を図１１に示す。各群のＴＦＰＩ２測定値およびＣＡ１２５測定値における最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５パーセンタイル、最大値、９５％信頼区間における濃度範囲を表３および４に示す。ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５双方とも、卵巣明細胞腺癌検体群にて健常群と比較して有意差＜０．０００１をもって高値を示した。

ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５の健常人群および卵巣明細胞腺癌群間における受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析の結果を図１２に、ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ曲線下面積）および有意差検定におけるＰ値を表５に示す。卵巣明細胞腺癌群における測定値と健常人群における測定値との有意差は、いずれもｐ＜０．０００１を示し、ＴＦＰＩ２およびＣＡ１２５が卵巣明細胞腺癌の検出に有用であることが示された。また、ＡＵＣはＴＦＰＩ２とＣＡ１２５との間でほぼ同等の数値となった。

次に、ＴＦＰＩ２の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を２９．８５ｎｇ／ｍＬ、ＣＡ１２５の基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を３５．７５Ｕ／ｍＬとそれぞれ設定した場合の感度および特異性を表６に示す。ＴＦＰＩ２はＣＡ１２５と比較し、特異度ではやや劣るものの、感度では若干優れた結果となった。

卵巣明細胞腺癌検体のうち、ＣＡ１２５が基準値（３５．７５Ｕ／ｍＬ）以下（陰性判定）の検体１３例について、ＴＦＰＩ２を測定した結果を図１３に示す。１３例中１１例（８４．６％）でＴＦＰＩ２の基準値である２９．８５ｎｇ／ｍＬを超えており、陽性と判定することが可能となった。

以上をまとめると、ＴＦＰＩ２は、従来から知られている卵巣癌の血清診断マーカーであるＣＡ１２５とほぼ同等の感度および特異度を有し、かつ、これまでＣＡ１２５で検出できなかった（陰性判定となった）卵巣明細胞腺癌検体も検出可能であることが分かる。

Claims (7)

1. 検体より組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）を検出する方法と、検体より卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを組み合わせて卵巣明細胞腺癌を検出することを含み、前記検体は体液である、卵巣明細胞腺癌を検出する方法。
2. 卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法を用いて、検体より前記マーカーの検出を行ない、前記検出の結果、陰性と判定された検体に対し、組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）を検出する方法を用いて、検体よりＴＦＰＩ２の検出を行なうことを含む、請求項１に記載の方法。
3. ＴＦＰＩ２を検出する方法がＴＦＰＩ２を認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法であり、卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法が前記マーカーを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法である、請求項１または２に記載の方法。
4. ＴＦＰＩ２を認識する抗体が、ＴＦＰＩ２の全長または部分領域をコードするポリヌクレオチドを動物に免疫して得られる抗体である、請求項３に記載の方法。
5. 卵巣癌の腫瘍マーカーが、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 組織因子経路阻害因子２（ＴＦＰＩ２）を認識する抗体を含む検体よりＴＦＰＩ２を検出するための試薬を含み、前記検体は体液である、卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬。
7. さらに、卵巣癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を含む検体より前記マーカーを検出するための試薬を含む、請求項６に記載の試薬。