JP6074676B2 - 組織因子経路阻害因子2(tfpi2)測定による卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
全血、血球、血清、血漿などの血液成分からTFPI2を容易に検出でき、かつ検出結果から卵巣明細胞腺癌の検出に適用できるか不明であった。
(1)検体より組織因子経路阻害因子2(TFPI2)を検出する方法と、検体より卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを組み合わせて卵巣明細胞腺癌を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌を検出する方法。
(2)卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法を用いて、検体より前記マーカーの検出を行ない、前記検出の結果、陰性と判定された検体に対し、組織因子経路阻害因子2(TFPI2)を検出する方法を用いて、検体よりTFPI2の検出を行なうことを含む、(1)に記載の方法。
(3)TFPI2を検出する方法がTFPI2を認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法であり、卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法が前記マーカーを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法である、(1)または(2)に記載の方法。
(4)TFPI2を認識する抗体が、TFPI2の全長または部分領域をコードするポリヌクレオチドを動物に免疫して得られる抗体である、(3)に記載の方法。
(5)卵巣癌の腫瘍マーカーが、癌抗原125(CA125)である、(1)から(4)のいずれかに記載の方法。
(6)組織因子経路阻害因子2(TFPI2)を認識する抗体を含む検体よりTFPI2を検出するための試薬を含む、卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬。
(7)さらに、卵巣癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を含む検体より前記マーカーを検出するための試薬を含む、(6)に記載の試薬。
(A)測定対象検体に対し、TFPI2を検出する方法と卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを、同時にまたは別個に行ない、卵巣明細胞腺癌を検出する方法、
(B)測定対象検体に対し、まずTFPI2を検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法で、卵巣明細胞腺癌を検出する方法、
(C)測定対象検体に対し、まず卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法を適用し、その結果陰性と判定された検体に対して、TFPI2を検出する方法で、卵巣明細胞腺癌を検出する方法、
があげられるが、(B)または(C)の方法が、検出の際用いる試薬に無駄が生じなくなる点で好ましい。
(a)標識したTFPI2およびTFPI2を認識する抗体を用い、標識したTFPI2および検体に含まれるTFPI2が、TFPI2を認識する抗体に競合的に結合することを利用した競合法、
(b)TFPI2を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体とTFPI2との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法、
(c)蛍光標識したTFPI2を認識する抗体を用い、当該抗体とTFPI2とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法、
(d)エピトープの異なる2つのTFPI2を認識する抗体(うち1つは標識した抗体)を用い、当該2つの抗体とTFPI2との3者の複合体を形成させるサンドイッチ法、
があげられるが、(d)の方法が簡便かつ汎用性が高く、また(d)の方法を利用した試薬および装置に関しては技術が十分確立されている点で好ましい。
細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、糖鎖付加といった翻訳後の修飾により、天然型のTFPI2に近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞(HEK)293T細胞株、サル腎臓細胞COS7株、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などがあげられる。
(I)まず、サンドイッチ法で用いる、TFPI2を認識する2つの抗体のうち、一方の抗体をイムノプレート、磁性粒子といったB/F(Bound/Free)分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、2物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
(II)担体に前記抗体を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行ない1次試薬とする。
(III)(I)の抗体とは異なるエピトープを認識する他方の抗体を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を2次試薬として準備する。抗体に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、ビオチンやアビジンなど、特異的に結合する相手が存在する物質が好ましい。また、2次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Tris−HCl緩衝液などが好ましい。
(IV)(II)で作製した1次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度4℃から40℃の範囲で、5分から180分間反応させればよい。
(V)未反応物質をB/F分離により除去し、続いて(III)で作製した2次試薬と一
定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度4℃から40℃の範囲で、5分から180分間反応させればよい。
(VI)未反応物質をB/F分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のTFPI2溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトTFPI2濃度を定量する。
は、血清を検体として用いた際のCA125の基準値(Cutoff値)を、35.75U/mLに設定してもよい。CA125が基準値以上であれば、卵巣明細胞腺癌陽性と判定できる。
DNA免疫にて液性免疫を効果的に誘導するためには、対象抗原タンパク質を膜結合型タンパク質として細胞表面上に局在させるのが好ましい。TFPI2はもともと分泌タンパク質であることから、TFPI2を細胞表面上に局在させるべく、TFPI2のC末端側にGPI(glycosylphosphatidylinositol)アンカーを付加したタンパク質(以下、GPIアンカー型TFPI2)を発現可能なプラスミドベクターを構築した。
(a)GPIアンカー型TFPI2発現プラスミド用プライマー
Forward:
5’−aagacgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca−3’(配列番号1、3’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の148から162番目の配列に相当)
Reverse:
5’−ggcagcatcagtggtgaattcaaattgcttcttccg−3’(配列番号2、3’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の766から780番目の配列に相当)
(3−1)(2)で構築したGPIアンカー型TFPI2発現プラスミドを常法に従い293T細胞株へ導入した。
(3−2)前記発現プラスミドが導入された293T細胞株を、5%CO2インキュベータにて、10%FBS(Fetal Bovine Serum)添加D−MEM培地(和光純薬社製)を用いて、24時間・37℃で培養し、TFPI2を一過性発現させた。(3−3)(3−2)で得られた培養細胞に、FLAGタグと特異的に結合するSIGMA社製マウス抗FLAG M2抗体、または、陰性対照としてFLAGタグとは結合しないマウス抗BNC抗体を添加し、30分静置した。なお、BNCとは、BNP(脳性ナトリウム利尿ペプチド)のC末端側7アミノ酸からなるペプチドである(特開2009−240300号、特許文献4)。
(3−4)静置後、蛍光標識した抗マウスIgG抗体(BECKMAN COULTER社製)を添加し、さらに30分間静置後、FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)解析を行なった。
マウスへの免疫は、実施例1(2)で構築したGPIアンカー型TFPI2発現プラスミドを、DNA量として40μg含むよう調製したPBS溶液100μLを、4匹のC57BL6マウスに免疫することで行なった。初回の免疫から3日後、5日後、7日後、9日後、12日後、14日後、21日後、28日後、35日後に追加免疫し、初回の免疫開始後42日目に採血し抗血清を採取し、それぞれ抗血清A1からA4とした。
抗血清評価用として、GPIアンカー型TFPI2を恒常的に発現可能なチャイニーズハムスター卵巣由来CHO−K1細胞株を以下の方法で作製した。
(1)実施例1(2)で構築したTFPI2発現プラスミドを、常法に従いCHO−K1細胞株へ遺伝子導入後、5%CO2インキュベータにて、10%FBS添加Hams F
12培地(和光純薬社製)を用いて、24時間・37℃で培養した。
(2)培養後、抗生物質Geneticin溶液(Invitrogen社製)を250μg/mLとなるよう添加し、さらに3週間培養した。
(3)抗FLAG抗体を用いてセルソーターによりGPIアンカー型TFPI2を恒常的に発現するCHO−K1細胞を獲得した。
実施例1(2)で構築したTFPI2発現プラスミドにおいて、挿入したTFPI2遺伝子と、その3’末端側に存在するGPIアンカーのコード領域との間に、BNP(脳性ナトリウム利尿ペプチド)のC末端側7アミノ酸からなるBNCペプチド(特許文献4)をコードするオリゴヌクレオチドをさらに挿入することで、N末端側にFLAGペプチド、C末端側にBNCペプチドがそれぞれ付加され、且つGPIアンカーを有さない分泌型TFPI2を発現可能なプラスミドを調製することができる。具体的調製方法を以下に示す。
(b)分泌型TFPI2発現プラスミド用プライマー
Forward:
5’−aagacgatgacgacaagcttgctcaggagccaaca−3’(配列番号3、3’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の148から162番目の配列に相当)
Reverse:
5’−agcatcagtggtgaattctcattagtggcgacgcagaactttgcaaaattgcttcttccg−3’(配列番号4、3’末端側15塩基はGenBank No.NM_006528の766から780番目の配列に相当)
(3−1)実施例1記載と同様に、(2)で構築した分泌型TFPI2発現プラスミドを293T細胞株へ導入して分泌型TFPI2を一過性発現させ、培養72時間後の培養液を遠心分離し、上清を分泌型TFPI2溶液として回収した。
(3−2)分泌型TFPI2溶液を試料として用いて、(A)酵素免疫測定法(ELISA法)、および(B)ウエスタンブロット法を行った。
(A−1)ウサギ抗FLAGポリクローナル抗体(ROCKLAND社製)を100ng/ウェルになるようカーボネート緩衝液(pH9.8)で希釈し、MaxiSorp96穴プレート(NUNC社製)に固相化した。
(A−2)4℃にて一晩反応後、TBS(Tris−Buffered Saline)
により3回洗浄し、3%ウシ血清アルブミン(BSA;Bovine Serum Albumin)を含むTBS溶液を250μL/ウェルにて各ウェルに添加し、室温で2時間放置した。
(A−3)TBSにより3回洗浄を行ない、分泌型TFPI2溶液、および、陰性対照として発現プラスミドを導入していない293T細胞株の培養上清を、50μL/ウェルにて添加し、室温で1時間放置した。
(A−4)0.5%Tween 20を含むTBS(TBS−T)により3回洗浄を行なった後、1%BSAを含むTBS−T(1%BSA/TBS−T)で1μg/mLになるよう希釈したマウス抗BNCモノクローナル抗体溶液を、50μL/ウェルで添加し、室温で1時間放置した。
(A−5)TBS−Tにより3回洗浄を行なった後、1%BSA/TBS−Tで10000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスイムノグロブリンG−Fc抗体(SIGMA社製)溶液を50μL/ウェルにて添加し、室温で1時間放置した。
(A−6)TBS−Tにより4回洗浄を行ない、TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL社製)を添加後、1mol/Lリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて450nmの吸光値を測定した。
(B−1)(3−1)で得られた分泌型TFPI2溶液、および、陰性対照として発現プラスミドを導入していない293T細胞株の培養上清を、常法に従いSDS−PAGEで展開し、PVDF膜(GEヘルスケア社製)に転写した。
(B−2)5%スキムミルクを含むTBS−T(ブロッキング溶液)を室温で2時間反応することでブロッキング後、ブロッキング溶液にアルカリフォスファターゼ標識抗BNC抗体を1μg/シートにて添加し、4℃で一晩反応させた。
(B−3)TBS−Tで洗浄後、Western Lightning CDP−Star(パーキンエルマー社製)を用い、得られた化学発光を感光フィルムにより検出した。
実施例2で採取したマウス抗血清を、実施例3で作製したGPIアンカー型TFPI2発現CHO−K1細胞を用いた細胞酵素免疫測定法(CELISA)、および実施例4で得られた分泌型TFPI2溶液を用いたELISAにより解析した。なお、特異性の検討の為、TFPI2とは異なるタンパク質をGPIアンカー型(N末端側にFLAGタグ、C末端側にGPIアンカーを有する)および分泌型(N末端側にFLAGタグ、C末端側にBNCタグを有する)でそれぞれ発現する発現プラスミドを、公知の遺伝子配列に基づいて上述したTFPI2発現プラスミドと同様に構築し、293T細胞株やCHO−K1細胞に導入して利用した。以下、当該TFPI2とは異なるタンパク質を、対照タンパク質ともいう。
(1−1)96ウェルプレートに、実施例3で作製したGPIアンカー型TFPI2発現CHO−K1細胞、および陰性対照細胞として前記対照タンパク質をGPIアンカー型で
発現するCHO−K1細胞を、1ウェルあたり5×104細胞で添加し、10%FBS添加Hams F12培地(和光純薬社製)を用いて、5%CO2インキュベータにて、24時間・37℃で培養した。
(1−2)GPIアンカー型TFPI2発現細胞に対して200から16200倍希釈した抗血清(A1からA4)またはマウス抗FLAG M2抗体(SIGMA社製)を、陰性対照細胞に対して200倍希釈した抗血清(A1からA4)またはマウス抗FLAG M2抗体(SIGMA社製)を、それぞれ1次抗体として添加し、室温にて1時間反応させた。
(1−3)反応後プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスイムノグロブリンG−Fc抗体(SIGMA社製)を2次抗体として添加し、室温にて1時間反応させた。
(1−4)反応後プレートを洗浄し、TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL社製)を添加後、1mol/Lリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて450nmの吸光値を測定した。
陰性対照として前記対照タンパク質を分泌型で発現する293T細胞株の培養上清(以下、分泌型対照タンパク質溶液ともいう)を用いた他は、実施例4(A)と同様な方法で各マウス抗血清を評価した。
TFPI2に対する抗体を産生可能なハイブリドーマを以下の方法により樹立した。
(1)実施例2でDNA免疫して得られたマウスから、鼠頚ならびに腋下リンパ節を採取し、リンパ細胞を回収した。
(2)回収したリンパ細胞とマウスミエローマ細胞株SP2/0とで、ポリエチレングリコール存在下で常法に従い細胞融合を実施した。
(3)10%FBS添加HAT(Sigma−Aldrich社製)/E−RDF培地(極東製薬社製)で約10日間培養することで抗体産生細胞ハイブリドーマを選択した。
(4)選択した抗体産生細胞ハイブリドーマの培養上清を、実施例5(1)に記載のCELISAおよび実施例4(A)に記載のELISAに供し、TFPI2に対する抗体を産生可能なハイブリドーマのスクリーニングを行った。
(5)スクリーニングにより選択されたウェル中の細胞を限界希釈法によりモノクローナル化を行ない、10%FBS添加HT(Sigma−Aldrich社製)/E−RDF培地から10%FBS添加E−RDF培地に馴化培養し、最終的に3種類のハイブリドーマを樹立した。
実施例6で樹立した3種類のハイブリドーマから、以下の方法により、TFPI2に対するモノクローナル抗体(抗TFPI2モノクローナル抗体)を調製し、酵素標識を行なった。
(1)実施例6で樹立したハイブリドーマ培養上清500mLを50%硫安で分画し、TBS(Tris−Buffered Saline;10mM Tris−HCl+150mM NaCl(pH7.4))により透析後、HiTrap Protein G HP(GEヘルスケア社製)を用いて、以下の方法によりモノクローナル抗体の精製を行なった。
(1−1)前記カラムをあらかじめPBS(Phosphate Buffer Saline;10mM リン酸+150mM NaCl(pH7.4))にて緩衝液置換した後、ハイブリドーマ培養上清を流速10mL/minで通過させた。
(1−2)カラム容量の5倍以上のPBSにより十分カラムを洗浄することで、未結合タンパク質の除去を行なった。この際、カラムを通過した緩衝液のOD280による吸光度が0.01以下になったことを確認することで、未結合タンパク質が残存していないと判断した。
(1−3)カラム洗浄後、溶出液(100mM グリシン(pH2.5))により結合抗体を溶出させた。なお、溶出抗体は速やかに1/10容量の1M Tris(pH8.0)を添加し、中性にするとともに、TBSによる速やかな透析を行なった。
(2)(1)で得られた精製モノクローナル抗体の一部を、抗体性能評価用にAlkaline Phosphatase Labeling Kit−NH2およびPeroxidase Labeling Kit−NH2(同仁化学社製)により酵素標識を行なった。
実施例7で得られた3種類のモノクローナル抗体を以下の方法により性能評価した。
(1−1)抗マウスIgG抗体が固定化された磁性微粒子Dynabeads Sheep Anti−Mouse IgG(Invitrogen社製)に対し、実施例7で得られた精製モノクローナル抗体を添加後、未反応の抗体をTBS−Tにより洗浄することで、抗TFPI2抗体固定化磁性微粒子を調製した。
(1−2)FBS(Fetal Bovine Serum)を実施例4記載の分泌型TFPI2溶液、または実施例5(2)記載の分泌型対照タンパク質溶液に添加して擬似血清サンプルを作製し、上記磁性微粒子と室温にて2時間反応させた。反応後、磁石により磁性微粒子を集積し、TBS−Tにて洗浄後、磁性微粒子に吸着して回収されたタンパク質を実施例4(B)に記載のウェスタンブロット法により解析した。
(2−1)96穴イムノプレート(NUNC)に、各精製モノクローナル抗体またはFLAG抗体(陰性対照)をそれぞれ2μg/mLを含むTBS溶液を、50μL/ウェルにて添加し、4℃一晩放置することで抗体をプレートに結合させた。
(2−2)ブロッキング後、FBSを実施例4で得られた分泌型TFPI2溶液に添加して作製した擬似血清試料を添加した。
(2−3)室温で1時間反応後、TBS−Tにより4回洗浄し、3種類のペルオキシダーゼ標識コンジュゲート抗体を含む1%BSA/TBS−T溶液を100ng/ウェルにて添加した。
(2−4)室温で1時間放置後、TBS−Tにより6回洗浄し、TMB基質(KPL社製)を添加後、450nmの吸光値を測定することで、サンドイッチELISAが構築可能なモノクローナル抗体の組み合わせを評価した。
実施例7で得られた3種類のモノクローナル抗体のうち、サンドイッチELISA用抗体として好ましいTF1−4LD1およびTF1−6LD2を用いた免疫沈降法により、これらの抗体と特異的に結合する各種卵巣癌細胞培養上清中のタンパク質を以下の方法により選別および同定した。なお、卵巣癌細胞として、漿液性卵巣癌細胞由来のOVSAHO、粘液性卵巣癌細胞由来のMCAS、明細胞性卵巣癌(卵巣明細胞腺癌)細胞由来のOVISEおよびOVMANA、の4種類を用いた。
(1)前記癌細胞を、10%ウシ胎児血清を含むRPMI1640培地(ナカライテスク社製)にて100%コンフルエント状態で3日間培養した。
(2)培養上清を遠心後、得られた上清2mLに対し、実施例8に記載の方法で調製したTF1−4LD1固定化磁性微粒子またはTF1−6LD2固定化磁性微粒子を添加し、室温で1時間撹拌して反応させた。
(3)PBST−NP40(0.1% Tween 20と1% NP40を含むPBS)で2回洗浄後、界面活性剤を含まないPBSで3回洗浄した。
(4)磁性微粒子に吸着して回収されたタンパク質と、陰性対照として抗体固定化磁性微粒子のみを、SDS−PAGEで展開した。なおこれらのサンプルは、電気泳動上でIgG軽鎖とTFPI2を確実に分離させるため、還元処理せずにSDS−PAGEを行ない、分離したタンパク質をRuby染色(インビトロジェン社製)により染色した。
(5)染色された計10種類のバンド(TF1−4LD1:図8のAからGに記載のバンド、TF1−6LD2:図8のHからJに記載のバンド)を切り出し、ジチオスレイトールおよびヨードアセトアミドを用いて還元アルキル化後、トリプシンによるゲル内消化を実施した。
(6)トリプシン消化により生成したペプチド断片を、C18逆相カラムを用いた1DナノLCシステム(Ultimate3000、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)により分離し、LTQオービトラップ質量分析計(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)によりMS/MS測定を行なった。得られたデータはProtein Discoverer 1.3ソフトウェア(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて解析し、Swiss−Protデータベース上のアミノ酸配列に対して検索をかけてタンパク質を同定した。
(1)水不溶性フェライト担体に、抗TFPI2モノクローナル抗体(TF1−4LD1)を、100ng/担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後1%BSAを含む100mMトリス緩衝液(pH8.0)にて40℃・4時間ブロッキングを行なうことで、抗TFPI2抗体固定化担体を調製した。
(2)抗TFPI2モノクローナル抗体(TF1−6LD2)に実施例7記載のアルカリフォスファターゼを標識することで、抗TFPI2標識抗体を調製した。
(3)磁力透過性の容器(容量1.2mL)に(1)で調製した12個の抗体固定化担体を入れた後、(2)で調製した標識抗体を0.5μg/mL含む緩衝液(3%BSAを含むトリス緩衝液、pH8.0)50μLを容器に添加し、凍結乾燥を実施することで、TFPI2測定試薬を作製した。なお、作製したTFPI2測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで4℃で保管した。
一定濃度のTFPI2を含む標準試料および検体を、実施例10で作製したTFPI2測定試薬を用いて測定することで前記試薬を評価した。
(1)標準試料または検体50μLと界面活性剤を含む希釈液50μLを、実施例10で作製したTFPI2測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
(2)37℃恒温下で10分間の抗原抗体反応を行ない、
(3)界面活性剤を含む緩衝液にて8回の洗浄を行ない、
(4)4−メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加する、
ことで行い、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる4−メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値(nmol/(L・s))とした。
んだ試料を調製した。なお、当該TFPI2濃度は暫定であり絶対濃度ではないが、当該標準試料による検量線を基に、全ての検体が濃度換算されることから、検体間の相対的な濃度比較は可能である。
実施例10で作製したTFPI2測定試薬を用いて、siRNAによりTFPI2タンパク質発現を抑制した明細胞性卵巣癌細胞(OVMANA、OVSAYO)培養上清を測定した。本実施例では、TFPI2抑制用siRNAとして、siTFPI2−1(配列番号5)およびsiTFPI2−2(配列番号6)を対象にBLOCK−iT RNAi
Designerツールを用いて設計しInvitrogen社に委託して合成した2種類のsiRNAを用いた。また、陰性対照siControlとしてステルスRNAiネガティブコントロールLo(インビトロジェン社製)を用いた。
(1)各明細胞性卵巣癌細胞をsiRNA導入前日に6well plateで培養し、培養上清を調製した。
(2)Lipofectamine RNAi MAX Reagent(Invitrogen社製)により各試験区3連でsiRNAを導入した。
(3)導入24時間後に培地を交換し、交換48時間後の培養上清を回収した。遠心後、各上清を実施例10記載のTFPI2測定試薬で測定した。
実施例10で作製したTFPI2測定試薬を用いて卵巣明細胞腺癌検体を測定した。なお、本実施例で使用した検体は、健常人検体(TSH(甲状腺刺激ホルモン、Thyroi Stimulating Hormone)低値検体)79例(内訳:SLR社購入検体30例、Trina社購入検体49例)、卵巣子宮内膜症検体30例(PROMEDDX社購入検体)および卵巣明細胞腺癌検体50例(内訳:SLR社購入検体30例、NOVA社購入検体20例)であり、いずれの検体もインフォームドコンセント承諾済と記載された欧米人血清検体である。
Claims (7)
- 検体より組織因子経路阻害因子2(TFPI2)を検出する方法と、検体より卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法とを組み合わせて卵巣明細胞腺癌を検出することを含み、前記検体は体液である、卵巣明細胞腺癌を検出する方法。
- 卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法を用いて、検体より前記マーカーの検出を行ない、前記検出の結果、陰性と判定された検体に対し、組織因子経路阻害因子2(TFPI2)を検出する方法を用いて、検体よりTFPI2の検出を行なうことを含む、請求項1に記載の方法。
- TFPI2を検出する方法がTFPI2を認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法であり、卵巣癌の腫瘍マーカーを検出する方法が前記マーカーを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を利用した方法である、請求項1または2に記載の方法。
- TFPI2を認識する抗体が、TFPI2の全長または部分領域をコードするポリヌクレオチドを動物に免疫して得られる抗体である、請求項3に記載の方法。
- 卵巣癌の腫瘍マーカーが、癌抗原125(CA125)である、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 組織因子経路阻害因子2(TFPI2)を認識する抗体を含む検体よりTFPI2を検出するための試薬を含み、前記検体は体液である、卵巣明細胞腺癌を検出するための試薬。
- さらに、卵巣癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を含む検体より前記マーカーを検出するための試薬を含む、請求項6に記載の試薬。
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