JP2000253872A - 新規な卵巣癌細胞株 - Google Patents
新規な卵巣癌細胞株Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】原発腫瘍由来で薬剤耐性を有する細胞株を樹立
し、クローニングする事により、薬剤耐性メカニズムを
検討する材料を獲得すること。 【解決手段】初代培養から無血清培地を用い樹立された
卵巣明細胞腺癌由来の細胞株またはその変異株。
し、クローニングする事により、薬剤耐性メカニズムを
検討する材料を獲得すること。 【解決手段】初代培養から無血清培地を用い樹立された
卵巣明細胞腺癌由来の細胞株またはその変異株。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は卵巣明細胞腺癌の樹
立細胞またはその変異株に関する。さらに、ＥｒｂＢ−
２、ＣＡ１２５等腫瘍マーカーの製造方法、卵巣明細胞
腺癌の持つ自然耐性メカニズムの免疫学的、分子生物学
的検討及び卵巣明細胞腺癌の発生機序の検討におけるこ
の細胞株の使用に関する。
立細胞またはその変異株に関する。さらに、ＥｒｂＢ−
２、ＣＡ１２５等腫瘍マーカーの製造方法、卵巣明細胞
腺癌の持つ自然耐性メカニズムの免疫学的、分子生物学
的検討及び卵巣明細胞腺癌の発生機序の検討におけるこ
の細胞株の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】卵巣明細胞腺癌はそれ自体の持つ自然耐
性が故、化学療法が困難であることが知られている。一
般に薬剤耐性機構は例えばグルタチオンによるシスプラ
チンの解毒作用、Ｐ糖蛋白（ＰＧＰ、ｍｄｒ１）による
ドキソルビシン等の細胞外排泄機構等が知られる。明細
胞腺癌においてもＰ糖蛋白やＭＲＰ（multidrug resist
ance protein）の発現は知られており（藤井ら、第５５
回日本癌学会総会発表要旨、３５０頁、１９９６年）、
これら蛋白の耐性への関与が考えられる。しかし一方、
卵巣癌ではシスプラチンが最も広く化学療法剤として使
用されるが、この薬剤の排泄にはＰ糖蛋白は一般に関与
しないと考えられている。このシスプラチンに対しても
卵巣明細胞腺癌は自然耐性を示し、この機構についての
詳細は未だ明らかとなっていない。薬剤耐性の解明のた
めには、患者検体からの初代培養により細胞株を樹立
し、生化学的、分子生物学的諸性質を解明していくこと
が不可欠と考えられる。
性が故、化学療法が困難であることが知られている。一
般に薬剤耐性機構は例えばグルタチオンによるシスプラ
チンの解毒作用、Ｐ糖蛋白（ＰＧＰ、ｍｄｒ１）による
ドキソルビシン等の細胞外排泄機構等が知られる。明細
胞腺癌においてもＰ糖蛋白やＭＲＰ（multidrug resist
ance protein）の発現は知られており（藤井ら、第５５
回日本癌学会総会発表要旨、３５０頁、１９９６年）、
これら蛋白の耐性への関与が考えられる。しかし一方、
卵巣癌ではシスプラチンが最も広く化学療法剤として使
用されるが、この薬剤の排泄にはＰ糖蛋白は一般に関与
しないと考えられている。このシスプラチンに対しても
卵巣明細胞腺癌は自然耐性を示し、この機構についての
詳細は未だ明らかとなっていない。薬剤耐性の解明のた
めには、患者検体からの初代培養により細胞株を樹立
し、生化学的、分子生物学的諸性質を解明していくこと
が不可欠と考えられる。
【０００３】現在までに卵巣明細胞腺癌患者より細胞株
を樹立した報告はいくつか知られている。ＯＣＣ−１は
卵巣明細胞腺癌患者腹水より樹立した（GYNECOLOGIC ON
COLOGY, 38, 37-45, 1990）。この株についての薬剤耐
性については報告がない。また同様にＲＭＧ−IIも同様
に患者腹水より樹立された細胞株であるが薬剤耐性に関
する報告はない（Jpn. J. Cancer Res., 82(7), 854-86
1, 1991）。ＫＫはやはり患者腹水より樹立された（HUM
ANCELL, 6(4), 279-286, 1993）。この細胞株のシスプ
ラチンに対するＩＣ50は０．９５μＭで弱いながら耐性
を示すと報告されている。またＮＡＫＡＮＯも患者腹水
より樹立された株でシスプラチンに対する耐性が見られ
ると報告されている（第５５回日本癌学会発表要旨、３
５０頁、１９９６年）。ＳＭＯＶ−２は前述の細胞株と
は異なり、原発腫瘍由来の細胞株である（第５７回日本
癌学会発表要旨、５０１頁、１９９８年）。しかしシス
プラチンに対しては耐性を示さないと報告されている。
以上示したごとく、原発腫瘍由来で薬剤耐性を示す卵巣
明細胞腺癌株の報告はなく、自然耐性メカニズム検討の
必要性からこのような株の樹立が求められている。
を樹立した報告はいくつか知られている。ＯＣＣ−１は
卵巣明細胞腺癌患者腹水より樹立した（GYNECOLOGIC ON
COLOGY, 38, 37-45, 1990）。この株についての薬剤耐
性については報告がない。また同様にＲＭＧ−IIも同様
に患者腹水より樹立された細胞株であるが薬剤耐性に関
する報告はない（Jpn. J. Cancer Res., 82(7), 854-86
1, 1991）。ＫＫはやはり患者腹水より樹立された（HUM
ANCELL, 6(4), 279-286, 1993）。この細胞株のシスプ
ラチンに対するＩＣ50は０．９５μＭで弱いながら耐性
を示すと報告されている。またＮＡＫＡＮＯも患者腹水
より樹立された株でシスプラチンに対する耐性が見られ
ると報告されている（第５５回日本癌学会発表要旨、３
５０頁、１９９６年）。ＳＭＯＶ−２は前述の細胞株と
は異なり、原発腫瘍由来の細胞株である（第５７回日本
癌学会発表要旨、５０１頁、１９９８年）。しかしシス
プラチンに対しては耐性を示さないと報告されている。
以上示したごとく、原発腫瘍由来で薬剤耐性を示す卵巣
明細胞腺癌株の報告はなく、自然耐性メカニズム検討の
必要性からこのような株の樹立が求められている。
【０００４】ところで、最近乳癌を中心に腫瘍の良性・
悪性判定に用いる腫瘍マーカーとしてＥｒｂＢ−２が注
目されている。ＥｒｂＢ−２は分子量１８５ＫＤａの蛋
白質でＨｅｒ−２、ｎｅｕとも呼ばれている。ＥＧＦ受
容体に類似の構造を持ち、６３２のアミノ酸よりなるＮ
末端の細胞外ドメインは糖鎖を多く含み、リガンドとの
結合能を有する。またこのＮ末端ドメインは切断され、
血清中または培養細胞上清中に放出されることが知られ
ている（Journal of Tumor Marker Oncology, 6,53-72,
1991）。このＥｒｂＢ−２は卵巣癌でも過剰発現し、
新しい予後因子としての可能性が示唆されている（Eur.
J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 71(2), 173-17
9, 1997）。
悪性判定に用いる腫瘍マーカーとしてＥｒｂＢ−２が注
目されている。ＥｒｂＢ−２は分子量１８５ＫＤａの蛋
白質でＨｅｒ−２、ｎｅｕとも呼ばれている。ＥＧＦ受
容体に類似の構造を持ち、６３２のアミノ酸よりなるＮ
末端の細胞外ドメインは糖鎖を多く含み、リガンドとの
結合能を有する。またこのＮ末端ドメインは切断され、
血清中または培養細胞上清中に放出されることが知られ
ている（Journal of Tumor Marker Oncology, 6,53-72,
1991）。このＥｒｂＢ−２は卵巣癌でも過剰発現し、
新しい予後因子としての可能性が示唆されている（Eur.
J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 71(2), 173-17
9, 1997）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前述のように卵巣明細
胞腺癌株は患者腹水より樹立された例が多く、癌の諸性
質を直接反映する原発腫瘍からの樹立報告例は少ない。
また一般に卵巣明細胞腺癌は化学療法剤に対する自然耐
性が知られる。本発明の目的は原発腫瘍由来で薬剤耐性
を有する細胞株を樹立し、クローニングする事により、
薬剤耐性メカニズムを検討する材料を獲得することであ
る。
胞腺癌株は患者腹水より樹立された例が多く、癌の諸性
質を直接反映する原発腫瘍からの樹立報告例は少ない。
また一般に卵巣明細胞腺癌は化学療法剤に対する自然耐
性が知られる。本発明の目的は原発腫瘍由来で薬剤耐性
を有する細胞株を樹立し、クローニングする事により、
薬剤耐性メカニズムを検討する材料を獲得することであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、鋭意研究の結果、原発腫瘍由来で、ＣＡ１２５、上
皮性膜抗原、サイトケラチン、ＥｒｂＢ−２、ＥＧＦ受
容体等の腫瘍マーカーを産生し、シスプラチン、ドキソ
ルビシン等の薬剤に対する薬剤耐性を持ち、さらに初代
培養から無血清培地を用い樹立される卵巣明細胞腺癌株
を見いだすことに成功し、本発明を完成させた。特に初
代培養から無血清培地を用いて卵巣明細胞腺癌株を樹立
した例は初めてである。従って、本発明の第１は初代培
養から無血清培地を用い樹立された卵巣明細胞腺癌由来
の細胞株またはその変異株を提供することである。本発
明の第２は ＥｒｂＢ−２、ＣＡ−１２５、上皮性膜抗
原、サイトケラチンおよびＥＧＦ受容体の群から選ばれ
る腫瘍マーカーを少なくとも一つ産生する卵巣明細胞腺
癌由来の細胞株またはその変異株を提供することであ
る。
に、鋭意研究の結果、原発腫瘍由来で、ＣＡ１２５、上
皮性膜抗原、サイトケラチン、ＥｒｂＢ−２、ＥＧＦ受
容体等の腫瘍マーカーを産生し、シスプラチン、ドキソ
ルビシン等の薬剤に対する薬剤耐性を持ち、さらに初代
培養から無血清培地を用い樹立される卵巣明細胞腺癌株
を見いだすことに成功し、本発明を完成させた。特に初
代培養から無血清培地を用いて卵巣明細胞腺癌株を樹立
した例は初めてである。従って、本発明の第１は初代培
養から無血清培地を用い樹立された卵巣明細胞腺癌由来
の細胞株またはその変異株を提供することである。本発
明の第２は ＥｒｂＢ−２、ＣＡ−１２５、上皮性膜抗
原、サイトケラチンおよびＥＧＦ受容体の群から選ばれ
る腫瘍マーカーを少なくとも一つ産生する卵巣明細胞腺
癌由来の細胞株またはその変異株を提供することであ
る。
【０００７】本発明の第３はシスプラチンおよび／また
はドキソルビシンに耐性を示す卵巣明細胞腺癌由来の細
胞株またはその変異株を提供することである。本発明の
第４は原発腫瘍から樹立された卵巣明細胞腺癌由来の細
胞株またはその変異株を提供することである。本発明の
第５は寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７２３７及びＦＥＲＭ
Ｐ−１７２３８である卵巣明細胞腺癌由来の細胞株ま
たはその変異株を提供することである。本発明の第６は
初代培養から無血清培地を使用し継代を繰り返すことを
特徴とする卵巣明細胞腺癌由来細胞株の樹立方法を提供
することである。本発明の第７は前記細胞株の培養物か
ら、ＥｒｂＢ−２、ＣＡ−１２５、上皮性膜抗原、サイ
トケラチンおよびＥＧＦ受容体の群から選ばれる腫瘍マ
ーカーの製造方法を提供することである。
はドキソルビシンに耐性を示す卵巣明細胞腺癌由来の細
胞株またはその変異株を提供することである。本発明の
第４は原発腫瘍から樹立された卵巣明細胞腺癌由来の細
胞株またはその変異株を提供することである。本発明の
第５は寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７２３７及びＦＥＲＭ
Ｐ−１７２３８である卵巣明細胞腺癌由来の細胞株ま
たはその変異株を提供することである。本発明の第６は
初代培養から無血清培地を使用し継代を繰り返すことを
特徴とする卵巣明細胞腺癌由来細胞株の樹立方法を提供
することである。本発明の第７は前記細胞株の培養物か
ら、ＥｒｂＢ−２、ＣＡ−１２５、上皮性膜抗原、サイ
トケラチンおよびＥＧＦ受容体の群から選ばれる腫瘍マ
ーカーの製造方法を提供することである。
【０００８】本発明の第８は腫瘍マーカーがＥｒｂＢ−
２である前記腫瘍マーカーの製造方法を提供することで
ある。本発明の第９は前記細胞株を ＥｒｂＢ−２、Ｃ
Ａ−１２５、上皮性膜抗原、サイトケラチンおよびＥＧ
Ｆ受容体の群から選ばれる腫瘍マーカーの陽性コントロ
ールとして使用する方法を提供することである。本発明
の第１０は前記細胞株を用い、シスプラチンおよび／ま
たはドキソルビシンの薬剤耐性機構を分析する方法を提
供することである。
２である前記腫瘍マーカーの製造方法を提供することで
ある。本発明の第９は前記細胞株を ＥｒｂＢ−２、Ｃ
Ａ−１２５、上皮性膜抗原、サイトケラチンおよびＥＧ
Ｆ受容体の群から選ばれる腫瘍マーカーの陽性コントロ
ールとして使用する方法を提供することである。本発明
の第１０は前記細胞株を用い、シスプラチンおよび／ま
たはドキソルビシンの薬剤耐性機構を分析する方法を提
供することである。
【０００９】
【発明の実施の形態】摘出した腫瘍はリン酸緩衝生理食
塩水等で洗浄の後、無血清培地にけん濁し培養用のディ
ッシュもしくはフラスコに移す。ここでいう無血清培地
は例えば無機塩、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、
各種アミノ酸、各種ビタミンを含む市販ほ乳類細胞培養
基本培地にインスリン、トランスフェリン、ＥＧＦ、ヒ
ドロコルチゾン、牛血清アルブミン、亜セレン酸ナトリ
ウム等の培地添加物を添加したものでよい。細胞がディ
ッシュに接着した後、おおよそ３〜４日おきに培地の交
換を行う。細胞が増殖し、ディッシュが細胞でいっぱい
になったら例えばトリプシン−ＥＤＴＡ等の細胞解離剤
により継代を行う。この後はおおよそ１〜２週間毎に継
代を繰り返す。細胞の増殖速度が安定するのを目安とし
て、細胞のクローニングを行う。クローニングは限界希
釈法、カップ法、軟寒天法等いずれの方法でもよい。ク
ローニング後もおよそ１週間に一度継代を繰り返し、１
年以上の継続を持って細胞株の樹立とする。
塩水等で洗浄の後、無血清培地にけん濁し培養用のディ
ッシュもしくはフラスコに移す。ここでいう無血清培地
は例えば無機塩、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、
各種アミノ酸、各種ビタミンを含む市販ほ乳類細胞培養
基本培地にインスリン、トランスフェリン、ＥＧＦ、ヒ
ドロコルチゾン、牛血清アルブミン、亜セレン酸ナトリ
ウム等の培地添加物を添加したものでよい。細胞がディ
ッシュに接着した後、おおよそ３〜４日おきに培地の交
換を行う。細胞が増殖し、ディッシュが細胞でいっぱい
になったら例えばトリプシン−ＥＤＴＡ等の細胞解離剤
により継代を行う。この後はおおよそ１〜２週間毎に継
代を繰り返す。細胞の増殖速度が安定するのを目安とし
て、細胞のクローニングを行う。クローニングは限界希
釈法、カップ法、軟寒天法等いずれの方法でもよい。ク
ローニング後もおよそ１週間に一度継代を繰り返し、１
年以上の継続を持って細胞株の樹立とする。
【００１０】また、本発明の細胞株を用いてＣＡ１２
５、ＥｒｂＢ−２等の腫瘍マーカーを生産することに関
して、初代培養より無血清培地にて培養しているため、
馴化の必要がなく、牛胎児血清を含まないことから培養
上清からの精製が容易である利点を持つ。腫瘍マーカー
の精製方法としては既に公知の、次に記載のいずれかの
方法または組み合わせによる。特異的抗体を利用したイ
ムノアフィニティークロマトグラフィー、その他のアフ
ィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、疎水クロマトグラフィー、等電点クロマトグ
ラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィーである。得られる細胞株は４１〜６０時間の
倍加時間を持って増殖し、染色体数は３倍体領域に分布
する。またＣＡ１２５、サイトケラチン、上皮性膜抗
原、ＥｒｂＢ−２、ＥＧＦ受容体等の腫瘍マーカーを発
現する。またシスプラチン、ドキソルビシン等の薬剤に
対し薬剤耐性を示す。この薬剤耐性を検討する手段とし
ては、例えば多剤耐性関連蛋白質の発現解析、グルタチ
オン・メタロチオネイン濃度の変動測定、薬剤の細胞内
への取り込み量測定がある。
５、ＥｒｂＢ−２等の腫瘍マーカーを生産することに関
して、初代培養より無血清培地にて培養しているため、
馴化の必要がなく、牛胎児血清を含まないことから培養
上清からの精製が容易である利点を持つ。腫瘍マーカー
の精製方法としては既に公知の、次に記載のいずれかの
方法または組み合わせによる。特異的抗体を利用したイ
ムノアフィニティークロマトグラフィー、その他のアフ
ィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、疎水クロマトグラフィー、等電点クロマトグ
ラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィーである。得られる細胞株は４１〜６０時間の
倍加時間を持って増殖し、染色体数は３倍体領域に分布
する。またＣＡ１２５、サイトケラチン、上皮性膜抗
原、ＥｒｂＢ−２、ＥＧＦ受容体等の腫瘍マーカーを発
現する。またシスプラチン、ドキソルビシン等の薬剤に
対し薬剤耐性を示す。この薬剤耐性を検討する手段とし
ては、例えば多剤耐性関連蛋白質の発現解析、グルタチ
オン・メタロチオネイン濃度の変動測定、薬剤の細胞内
への取り込み量測定がある。
【００１１】
【発明の効果】前述細胞株の樹立により、卵巣明細胞腺
癌の抗癌剤に対する自然耐性機構の解明が期待され、よ
り有効な治療法の開発につながる。また腫瘍マーカーの
安定的な供給により、診断精度の向上、迅速化につなが
る。
癌の抗癌剤に対する自然耐性機構の解明が期待され、よ
り有効な治療法の開発につながる。また腫瘍マーカーの
安定的な供給により、診断精度の向上、迅速化につなが
る。
【００１２】
【実施例】以下実施例により、詳しく本発明を説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ ヒト卵巣腫瘍の採取と初代培養 卵巣明細胞腺癌患者の摘出卵巣より、腫瘍組織片を無菌
的に複数採取した。組織片はリン酸緩衝生理食塩水を含
むシャーレ中で５回洗浄し、ＧＩＢＣＯ社製ＤＭＥ／Ｆ
１２ １：１ Ｍｉｘｔｕｒｅ（カタログ番号 １１３
３０）中で血管を多く含む部分をハサミで除き、さらに
メスで細片化した。１００μｍのナイロン製メッシュで
濾過した後、濾液を１５ｍｌポリスチレン製チューブへ
移し約２０分間静置、沈さをさらにＤＭＥ／Ｆ１２
１：１ Ｍｉｘｔｕｒｅ中に浮遊させ同様に１５ｍｌポ
リスチレン製チューブへ移し約２０分間静置した後、沈
さを回収、下記組成よりなる無血清培地中に浮遊させ、
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ／Ｆ１２ １：１ Ｍｉ
ｘｔｕｒｅにより表面処理したファルコン社製初代培養
用ＰＲＩＭＡＲＩＡ６０ｍｍディッシュに入れ、３７
℃、５％CO2の存在下で培養を開始した。約５０日後
０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液により
培養用ディッシュからはがし継代した。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ ヒト卵巣腫瘍の採取と初代培養 卵巣明細胞腺癌患者の摘出卵巣より、腫瘍組織片を無菌
的に複数採取した。組織片はリン酸緩衝生理食塩水を含
むシャーレ中で５回洗浄し、ＧＩＢＣＯ社製ＤＭＥ／Ｆ
１２ １：１ Ｍｉｘｔｕｒｅ（カタログ番号 １１３
３０）中で血管を多く含む部分をハサミで除き、さらに
メスで細片化した。１００μｍのナイロン製メッシュで
濾過した後、濾液を１５ｍｌポリスチレン製チューブへ
移し約２０分間静置、沈さをさらにＤＭＥ／Ｆ１２
１：１ Ｍｉｘｔｕｒｅ中に浮遊させ同様に１５ｍｌポ
リスチレン製チューブへ移し約２０分間静置した後、沈
さを回収、下記組成よりなる無血清培地中に浮遊させ、
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥ／Ｆ１２ １：１ Ｍｉ
ｘｔｕｒｅにより表面処理したファルコン社製初代培養
用ＰＲＩＭＡＲＩＡ６０ｍｍディッシュに入れ、３７
℃、５％CO2の存在下で培養を開始した。約５０日後
０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液により
培養用ディッシュからはがし継代した。
【００１３】基本培地組成 ＧＩＢＣＯ社製Ｄ−ＭＥＭ
／Ｆ１２ １：１ Ｍｉｘｔｕｒｅに対し １０μｇ／ｍｌ インスリン １０μｇ／ｍｌ トランスフェリン ２ｎｇ／ｍｌ 上皮細胞増殖因子 ５０ｎＭ ヒドロコルチゾン １ｍｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン ２５ｎＭ 亜セレン酸ナトリウム 上記成分を各濃度となるように添加したもの。
／Ｆ１２ １：１ Ｍｉｘｔｕｒｅに対し １０μｇ／ｍｌ インスリン １０μｇ／ｍｌ トランスフェリン ２ｎｇ／ｍｌ 上皮細胞増殖因子 ５０ｎＭ ヒドロコルチゾン １ｍｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン ２５ｎＭ 亜セレン酸ナトリウム 上記成分を各濃度となるように添加したもの。
【００１４】実施例２ 細胞株の樹立とクローニング 実施例１で得た卵巣腫瘍由来細胞を前述培地で１〜２週
間に一度継代して２７代、約１０ヶ月培養した後、ＩＷ
ＡＫＩ社製クローニングリングを用いたカップ法により
細胞のクローニングを行った。さらに１週間に１度継代
して４０代以上、約１２ヶ月培養し２種のクローン（Ｊ
ＡＯＶ−２０−７及びＪＡＯＶ−２０−１１）を得た。
ＪＡＯＶ−２０−７及びＪＡＯＶ−２０−１１は、本
発明者らによって平成１１年２月２４日に通商産業省生
命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１７２３７、ＦＥＲＭ Ｐ−１７２３８として寄託さ
れた。
間に一度継代して２７代、約１０ヶ月培養した後、ＩＷ
ＡＫＩ社製クローニングリングを用いたカップ法により
細胞のクローニングを行った。さらに１週間に１度継代
して４０代以上、約１２ヶ月培養し２種のクローン（Ｊ
ＡＯＶ−２０−７及びＪＡＯＶ−２０−１１）を得た。
ＪＡＯＶ−２０−７及びＪＡＯＶ−２０−１１は、本
発明者らによって平成１１年２月２４日に通商産業省生
命工学工業技術研究所にそれぞれ寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１７２３７、ＦＥＲＭ Ｐ−１７２３８として寄託さ
れた。
【００１５】実施例３ 本発明のヒト細胞株の性質 （１）増殖性 実施例２で得たＪＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−
１１について、経時的に細胞数を測定した。２５ｃｍ2
のコーニング社製フラスコに２．５×１０5個の細胞を
播種し、３日目より毎日細胞数を測定した（図１）。そ
の結果倍加時間はＪＡＯＶ−２０−７が４１時間、ＪＡ
ＯＶ−２０−１１が６０時間であった。 （２）染色体 実施例２で得たＪＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−
１１について培養中の培養液に最終濃度０．１μｇ／ｍ
ｌのコルセミドを加え３７℃、２時間の処理を行った。
０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液により
細胞を回収し、７５ｍＭ ＫＣｌによる低調処理を２０
分間行い、その後酢酸１：エタノール３のカルノイ氏液
で固定した。染色体標本は通常の空気乾燥法にて作成し
トリプシン−ギムザ染色法にて染色した後顕微鏡観察し
た。その結果染色体数はともに３倍体領域を中心に分布
した（図２）。
１１について、経時的に細胞数を測定した。２５ｃｍ2
のコーニング社製フラスコに２．５×１０5個の細胞を
播種し、３日目より毎日細胞数を測定した（図１）。そ
の結果倍加時間はＪＡＯＶ−２０−７が４１時間、ＪＡ
ＯＶ−２０−１１が６０時間であった。 （２）染色体 実施例２で得たＪＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−
１１について培養中の培養液に最終濃度０．１μｇ／ｍ
ｌのコルセミドを加え３７℃、２時間の処理を行った。
０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ溶液により
細胞を回収し、７５ｍＭ ＫＣｌによる低調処理を２０
分間行い、その後酢酸１：エタノール３のカルノイ氏液
で固定した。染色体標本は通常の空気乾燥法にて作成し
トリプシン−ギムザ染色法にて染色した後顕微鏡観察し
た。その結果染色体数はともに３倍体領域を中心に分布
した（図２）。
【００１６】（３）腫瘍マーカー染色 実施例２で得たＪＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−
１１をファルコン社製ＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅｓ ８
ｗｅｌｌの１ｗｅｌｌに対し１．４×１０4個播種し、
４〜５日間培養、４％パラホルムアルデヒドにより固定
した後、ＺＹＭＥＤ社製Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ ＳＰ
ＫＩＴを用いて免疫組織染色を行った。抗体はＣＡ１２
５（ＺＹＭＥＤ社ＺＹ−ＯＶ５）、ＣＡ１９−９（同Ｚ
Ｙ−ＣＯ９）、ＣＥＡ（同Ｃｏｌ−１）、サイトケラチ
ン（同ＡＥ１／ＡＥ３）、上皮性膜抗原（同ＺＣＥ１１
３）、ＥｒｂＢ−２（オンコジーンリサーチプロダクツ
社Ａｂ−２）、ＥＧＦ受容体（同Ａｂ−１）をそれぞれ
用いた。陰性コントロールとして非免疫のマウスＩｇＧ
（ＺＹＭＥＤ社）を用いた。その結果を表１に示す。Ｊ
ＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−１１はともにＣＡ
１２５、 サイトケラチン、上皮性膜抗原、ＥｒｂＢ−
２、ＥＧＦ受容体陽性であった。
１１をファルコン社製ＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅｓ ８
ｗｅｌｌの１ｗｅｌｌに対し１．４×１０4個播種し、
４〜５日間培養、４％パラホルムアルデヒドにより固定
した後、ＺＹＭＥＤ社製Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ ＳＰ
ＫＩＴを用いて免疫組織染色を行った。抗体はＣＡ１２
５（ＺＹＭＥＤ社ＺＹ−ＯＶ５）、ＣＡ１９−９（同Ｚ
Ｙ−ＣＯ９）、ＣＥＡ（同Ｃｏｌ−１）、サイトケラチ
ン（同ＡＥ１／ＡＥ３）、上皮性膜抗原（同ＺＣＥ１１
３）、ＥｒｂＢ−２（オンコジーンリサーチプロダクツ
社Ａｂ−２）、ＥＧＦ受容体（同Ａｂ−１）をそれぞれ
用いた。陰性コントロールとして非免疫のマウスＩｇＧ
（ＺＹＭＥＤ社）を用いた。その結果を表１に示す。Ｊ
ＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−１１はともにＣＡ
１２５、 サイトケラチン、上皮性膜抗原、ＥｒｂＢ−
２、ＥＧＦ受容体陽性であった。
【００１７】
【表１】
【００１８】実施例４ 本発明細胞株による物質生産 実施例２で得たＪＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−
１１について７．５×１０5個を７５ｃｍ2のフラスコに
播種し前述基本培地１５ｍｌ中で培養開始、１、３、
７、１１日目に、培養上清と、０．２５％トリプシン−
０．０５％ＥＤＴＡにより細胞を回収した。培地の交換
は３日目、７日目にそれぞれ全量を廃棄し、リン酸緩衝
生理食塩水で軽く洗浄の後、新鮮な基本培地を添加し
た。回収した細胞は１．０×１０5個に対し１０μｌの
下記組成よりなる緩衝液を添加した。 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４） １０ｍｇ／ｍｌ ＥＤＴＡ ５０ｍＭ ＮａＦ １μｇ／ｍｌ ロイペプチン １μｇ／ｍｌ ペプスタチン １ｍＭ ＰＭＳＦ
１１について７．５×１０5個を７５ｃｍ2のフラスコに
播種し前述基本培地１５ｍｌ中で培養開始、１、３、
７、１１日目に、培養上清と、０．２５％トリプシン−
０．０５％ＥＤＴＡにより細胞を回収した。培地の交換
は３日目、７日目にそれぞれ全量を廃棄し、リン酸緩衝
生理食塩水で軽く洗浄の後、新鮮な基本培地を添加し
た。回収した細胞は１．０×１０5個に対し１０μｌの
下記組成よりなる緩衝液を添加した。 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４） １０ｍｇ／ｍｌ ＥＤＴＡ ５０ｍＭ ＮａＦ １μｇ／ｍｌ ロイペプチン １μｇ／ｍｌ ペプスタチン １ｍＭ ＰＭＳＦ
【００１９】添加後ミキサーで攪拌し、３０秒間超音波
処理を行った。以下の実験はオンコジーンリサーチプロ
ダクツ社製ＥｒｂＢ−２測定キット（Ｈｕｍａｎ ｎｅ
ｕ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）の使用説
明書に従い行った。超音波処理を行った細胞に１／５量
のＡｎｔｉｇｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｔ
を添加５分間ミキサーで攪拌後１５，０００回転で遠心
分離し、上清を回収した。回収した上清の一部はＰｉｅ
ｒｃｅ社ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットに
より蛋白濃度定量を行い、残りをＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌ
ｕｅｎｔにより２５０倍に希釈しＥｒｂＢ−２測定に使
用した。培養上清は同様に１０倍に希釈して測定に使用
した。ＥｒｂＢ−２含有量はＪＡＯＶ−２０−７よりも
ＪＡＯＶ−２０−１１が高く、培養１１日目の濃度は
５．９ＨＮＵ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。この値
はＥｒｂＢ−２を中程度産生する乳癌細胞株ＭＣＦ−７
と同程度である。なお培地中にも可溶性のＥｒｂＢ−２
を分泌する。細胞の増殖に伴い、培地中のＥｒｂＢ−２
濃度は増加する。これについてもＪＡＯＶ−２０−７よ
りもＪＡＯＶ−２０−１１が高く、培養開始１１日目の
濃度は６２０ＨＮＵ／ｍｌとなった（図３）。
処理を行った。以下の実験はオンコジーンリサーチプロ
ダクツ社製ＥｒｂＢ−２測定キット（Ｈｕｍａｎ ｎｅ
ｕ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）の使用説
明書に従い行った。超音波処理を行った細胞に１／５量
のＡｎｔｉｇｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｔ
を添加５分間ミキサーで攪拌後１５，０００回転で遠心
分離し、上清を回収した。回収した上清の一部はＰｉｅ
ｒｃｅ社ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットに
より蛋白濃度定量を行い、残りをＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌ
ｕｅｎｔにより２５０倍に希釈しＥｒｂＢ−２測定に使
用した。培養上清は同様に１０倍に希釈して測定に使用
した。ＥｒｂＢ−２含有量はＪＡＯＶ−２０−７よりも
ＪＡＯＶ−２０−１１が高く、培養１１日目の濃度は
５．９ＨＮＵ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。この値
はＥｒｂＢ−２を中程度産生する乳癌細胞株ＭＣＦ−７
と同程度である。なお培地中にも可溶性のＥｒｂＢ−２
を分泌する。細胞の増殖に伴い、培地中のＥｒｂＢ−２
濃度は増加する。これについてもＪＡＯＶ−２０−７よ
りもＪＡＯＶ−２０−１１が高く、培養開始１１日目の
濃度は６２０ＨＮＵ／ｍｌとなった（図３）。
【００２０】実施例５ 本発明細胞株の薬剤耐性 実施例２で得たＪＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−
１１について２ｍｌの前述基本培地に懸濁、１．０×１
０3個をコーニング社製６０ｍｍ培養用ディッシュに播
種し、翌日後述の薬剤を添加、１時間の後、薬剤を含む
基本培地を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水によ
り軽く洗浄し前述基本培地２ｍｌを添加した。１０〜１
４日間培養の後、ホルマリンにより細胞を固定、クリス
タルバイオレットにより染色された細胞コロニーをカウ
ントした。使用した薬剤はシスプラチン（ブリストル・
マイヤーズ・スクイブ社製商品名ブリプラチン）、ドキ
ソルビシン（シグマ社）である。薬剤の濃度はシスプラ
チンが１、２、５、１０、２０、５０μＭ、ドキソルビ
シンが０．０３、０．１、０．３、１、３、１０μＭで
ある。コントロールのコロニー形成数に対し、半分のコ
ロニーを形成する薬剤濃度をＩＣ50値とすると、シスプ
ラチンのＩＣ50はＪＡＯＶ−２０−７が２１μＭ、ＪＡ
ＯＶ−２０−１１が２７μＭ、ドキソルビシンのＩＣ50
はＪＡＯＶ−２０−７が６．１μＭ、ＪＡＯＶ−２０−
１１が１．９μＭであった（図４）。これらの値はＪＡ
ＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−１１が明細胞癌の持
つ多剤耐性（自然耐性）を有することを示すものであ
る。
１１について２ｍｌの前述基本培地に懸濁、１．０×１
０3個をコーニング社製６０ｍｍ培養用ディッシュに播
種し、翌日後述の薬剤を添加、１時間の後、薬剤を含む
基本培地を除去し、２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水によ
り軽く洗浄し前述基本培地２ｍｌを添加した。１０〜１
４日間培養の後、ホルマリンにより細胞を固定、クリス
タルバイオレットにより染色された細胞コロニーをカウ
ントした。使用した薬剤はシスプラチン（ブリストル・
マイヤーズ・スクイブ社製商品名ブリプラチン）、ドキ
ソルビシン（シグマ社）である。薬剤の濃度はシスプラ
チンが１、２、５、１０、２０、５０μＭ、ドキソルビ
シンが０．０３、０．１、０．３、１、３、１０μＭで
ある。コントロールのコロニー形成数に対し、半分のコ
ロニーを形成する薬剤濃度をＩＣ50値とすると、シスプ
ラチンのＩＣ50はＪＡＯＶ−２０−７が２１μＭ、ＪＡ
ＯＶ−２０−１１が２７μＭ、ドキソルビシンのＩＣ50
はＪＡＯＶ−２０−７が６．１μＭ、ＪＡＯＶ−２０−
１１が１．９μＭであった（図４）。これらの値はＪＡ
ＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−１１が明細胞癌の持
つ多剤耐性（自然耐性）を有することを示すものであ
る。
【００２１】実施例６ 多剤耐性関連蛋白質の発現 実施例２で得たＪＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−
１１を実施例３（３）記載の免疫染色法によりＰＧＰ
（P Glycoprotein）、ＭＲＰ（multidrug resistance p
rotein）、ＬＲＰ（lung resistance protein）の発現
解析を行った。抗体はＰＧＰ（ＳＡＮＢＩＯ ＢＶ社Ｊ
ＳＢ−１）、ＭＲＰ（同ＭＲＰｍ６）、ＬＲＰ（同ＬＲ
Ｐ−５６）を用いた。陰性コントロールとして非免疫の
マウスＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ社）を用いた。結果を表2に
示す。ＪＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−１１はと
もにＬＲＰのみ発現が見られた。
１１を実施例３（３）記載の免疫染色法によりＰＧＰ
（P Glycoprotein）、ＭＲＰ（multidrug resistance p
rotein）、ＬＲＰ（lung resistance protein）の発現
解析を行った。抗体はＰＧＰ（ＳＡＮＢＩＯ ＢＶ社Ｊ
ＳＢ−１）、ＭＲＰ（同ＭＲＰｍ６）、ＬＲＰ（同ＬＲ
Ｐ−５６）を用いた。陰性コントロールとして非免疫の
マウスＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ社）を用いた。結果を表2に
示す。ＪＡＯＶ−２０−７、ＪＡＯＶ−２０−１１はと
もにＬＲＰのみ発現が見られた。
【００２２】
【表２】
【図１】 ＪＡＯＶ−２０−７及びＪＡＯＶ−２０−１
１の増殖曲線を示すグラフ。
１の増殖曲線を示すグラフ。
【図２】 ＪＡＯＶ−２０−７及びＪＡＯＶ−２０−１
１の染色体数の分布を示すグラフ。
１の染色体数の分布を示すグラフ。
【図３】 ＪＡＯＶ−２０−７及びＪＡＯＶ−２０−１
１の細胞数および培養上清中、細胞中のＥｒｂＢ−２含
量を示すグラフ。
１の細胞数および培養上清中、細胞中のＥｒｂＢ−２含
量を示すグラフ。
【図４】 ＪＡＯＶ−２０−７及びＪＡＯＶ−２０−１
１のシスプラチン、ドキソルビシンに対する耐性をそれ
ぞれの薬剤濃度でのコロニー形成率で示すグラフ。
１のシスプラチン、ドキソルビシンに対する耐性をそれ
ぞれの薬剤濃度でのコロニー形成率で示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 礒西 成治 東京都杉並区成田西３−５−７ (72)発明者 岡本 愛光 東京都杉並区井草４−５−２ Ｆターム(参考） 4B065 AA93X AC14 AC15 AC16 AC20 BA21 BA30 BB01 BC01 CA24 CA46 4H045 AA10 AA20 AA30 CA41 DA86 EA51 FA72
Claims (10)
- 【請求項１】 初代培養から無血清培地を用い樹立され
た卵巣明細胞腺癌由来の細胞株またはその変異株。 - 【請求項２】 ＥｒｂＢ−２、ＣＡ−１２５、上皮性膜
抗原、サイトケラチンおよびＥＧＦ受容体の群から選ば
れる腫瘍マーカーを少なくとも一つ産生する請求項１記
載の卵巣明細胞腺癌由来の細胞株またはその変異株。 - 【請求項３】 シスプラチンおよび／またはドキソルビ
シンに耐性を示す請求項１記載の卵巣明細胞腺癌由来の
細胞株またはその変異株。 - 【請求項４】 原発腫瘍から樹立された請求項１記載の
卵巣明細胞腺癌由来の細胞株またはその変異株。 - 【請求項５】 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７２３７及び
ＦＥＲＭ Ｐ−１７２３８である請求項１記載の卵巣明
細胞腺癌由来の細胞株またはその変異株。 - 【請求項６】 初代培養から無血清培地を使用し継代を
繰り返すことを特徴とする卵巣明細胞腺癌由来の細胞株
の樹立方法。 - 【請求項７】 請求項１に記載の細胞株の培養物から、
ＥｒｂＢ−２、ＣＡ−１２５、上皮性膜抗原、サイトケ
ラチンおよびＥＧＦ受容体の群から選ばれる腫瘍マーカ
ーを製造する方法。 - 【請求項８】 腫瘍マーカーがＥｒｂＢ−２である請求
項７の製造方法。 - 【請求項９】 請求項１に記載の細胞株を ＥｒｂＢ−
２、ＣＡ−１２５、上皮性膜抗原、サイトケラチンおよ
びＥＧＦ受容体の群から選ばれる腫瘍マーカーの陽性コ
ントロールとして使用する方法。 - 【請求項１０】 請求項１に記載の細胞株を用い、シス
プラチンおよび／またはドキソルビシンの薬剤耐性機構
を分析する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11060963A JP2000253872A (ja) | 1999-03-09 | 1999-03-09 | 新規な卵巣癌細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11060963A JP2000253872A (ja) | 1999-03-09 | 1999-03-09 | 新規な卵巣癌細胞株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000253872A true JP2000253872A (ja) | 2000-09-19 |
Family
ID=13157588
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11060963A Pending JP2000253872A (ja) | 1999-03-09 | 1999-03-09 | 新規な卵巣癌細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000253872A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005024419A1 (ja) * | 2003-09-08 | 2005-03-17 | Shionogi Co., Ltd. | 簡易疾患診断およびテーラーメイド治療 |
| CN1317386C (zh) * | 2004-12-15 | 2007-05-23 | 上海市胸科医院 | 一种具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株及其建立方法 |
| JP2013061321A (ja) * | 2011-08-19 | 2013-04-04 | Yokohama City Univ | 組織因子経路阻害因子２（ｔｆｐｉ２）測定による卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬 |
| WO2024001509A1 (zh) * | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 浙江大学医学院附属妇产科医院 | 人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株及用途 |
-
1999
- 1999-03-09 JP JP11060963A patent/JP2000253872A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005024419A1 (ja) * | 2003-09-08 | 2005-03-17 | Shionogi Co., Ltd. | 簡易疾患診断およびテーラーメイド治療 |
| CN1317386C (zh) * | 2004-12-15 | 2007-05-23 | 上海市胸科医院 | 一种具有骨转移高潜能的肺腺癌细胞株及其建立方法 |
| JP2013061321A (ja) * | 2011-08-19 | 2013-04-04 | Yokohama City Univ | 組織因子経路阻害因子２（ｔｆｐｉ２）測定による卵巣明細胞腺癌の検査方法および検査薬 |
| WO2024001509A1 (zh) * | 2022-06-29 | 2024-01-04 | 浙江大学医学院附属妇产科医院 | 人卵巢癌耐尼拉帕利细胞株及用途 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060119 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081125 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090414 |