JP5097387B2 - 人工皮膚 - Google Patents
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Description
以上の点からも、従来技術では、試験管内で何らかの構造物ができているものの、それが毛包であることは示されておらず、必ずしも毛様構造ができたとは言いがたいといわざるを得ない。特に組織再生技術においては、様々な細胞に分化するという幹細胞を使用するという性質上、分化異常や癌化を防ぐためにも、細胞分化の初期段階において、その方向性が確かめられていることが重要な意味を持つ。
〔1〕 育毛・発毛成分のコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドが導入された毛乳頭細胞と、幹細胞を含むケラチノサイトとが、真皮代替物を足場として培養されていることを特徴とする人工皮膚。
〔2〕 前記育毛・発毛成分が、Wnt5aである〔1〕に記載の人工皮膚。
〔3〕 前記毛乳頭細胞が、不死化毛乳頭細胞である〔1〕または〔2〕に記載の人工皮膚。
〔4〕 前記幹細胞を含むケラチノサイトが、CD200マーカー陽性細胞を7%以上含むケラチノサイトである〔1〕〜〔3〕のいずれか一項に記載の人工皮膚。
〔5〕 前記真皮代替物が、線維芽細胞を含むものである〔1〕〜〔4〕のいずれか一項に記載の人工皮膚。
〔6〕 下記の工程を備えることを特徴とする、人工皮膚の製造方法。
(a)毛乳頭細胞に育毛・発毛成分のコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドを導入する工程、
(b)前記(a)において得られる育毛・発毛成分のコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドが導入された毛乳頭細胞を、幹細胞を含むケラチノサイトと共に真皮代替物を足場として培養する工程。
〔7〕 前記(b)工程において、育毛・発毛成分のコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドが導入されてなる毛乳頭細胞をスフェロイドとして、当該スフェロイドと幹細胞を含むケラチノサイトとを真皮代替物を足場として培養することを特徴とする〔6〕に記載の製造方法。
〔8〕 前記(b)工程において、育毛・発毛成分が導入されてなる毛乳頭細胞を中心に、その外側にケラチノサイトが取り囲むスフェロイドを作製し、当該スフェロイドを真皮代替物を足場として培養することを特徴とする〔6〕に記載の製造方法。
〔9〕 更に(c)上層にケラチノサイトの重層化を誘導する工程を備えることを特徴とする、〔6〕〜〔8〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔10〕 前記(c)工程において、半気相培養により重層化を誘導することを特徴とする、〔9〕に記載の製造方法。
〔11〕 前記育毛・発毛成分が、Wnt5aである〔6〕〜〔10〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔12〕 前記毛乳頭細胞が、不死化毛乳頭細胞である〔6〕〜〔11〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔13〕 前記幹細胞を含むケラチノサイトが、CD200マーカー陽性細胞を7%以上含むケラチノサイトである〔6〕〜〔12〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔14〕 前記真皮代替物が、線維芽細胞を含むものである〔6〕〜〔13〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔15〕 試料のコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドが導入されてなる毛乳頭細胞と、幹細胞を含むケラチノサイトとが、真皮代替物を足場として培養されている人工皮膚を作製し、当該人工皮膚において育毛・発毛効果を確認することを特徴とする、育毛・発毛成分の選抜方法。
〔16〕 前記人工皮膚が、下記の工程により製造されることを特徴とする〔15〕に記載の育毛・発毛成分の選抜方法。
(a)毛乳頭細胞に試料のコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドを導入する工程、
(b)前記(a)において得られる育毛・発毛成分が導入された毛乳頭細胞を、幹細胞を含むケラチノサイトと共に真皮代替物を足場として培養する工程。
また、本発明は、試料の育毛・発毛効果、すなわち、育毛・発毛作用、生体への安全性、経皮吸収性等育毛・発毛成分の評価、選抜(検索、評価を含む)に応用することもできる。よって、本発明は、再生医療をはじめとする医学、美容のほか、生化学、生物学等の生体を取り扱う各分野において有用である。
本発明において使用することのできる毛乳頭細胞やケラチノサイト(表皮角化細胞)は、哺乳動物のものであればよく、特に、マウス、ラット等の実験動物、ヒトなどに由来するものが好ましい。また、動物の月齢、性別も特に問わないほか、採取部位についても毛乳頭細胞やケラチノサイトが存在する部位であれば特に問わない。以下は、各細胞としてヒト由来のものを用いた場合について示すが、他の動物由来の細胞についても、ヒゲなど毛包を材料として、当分野の研究者に一般的に良く知られている方法にて確保することが可能である。
このような不死化した毛乳頭細胞の作製は、具体的には例えば、特開平11−89565号公報や分子生物学研究のための培養細胞実験法(黒木登志夫、許 南浩、千田和広 編)第11章 変異細胞と不死化細胞の分離 (2)HPV、SV40による不死化 (安本 茂)羊土社 p191−200 1995年発行の記載に基づき行うことができる。
(a)毛乳頭細胞に育毛・発毛成分のコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドを導入する工程、
(b)前記(a)において得られる育毛・発毛成分のコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドが導入された毛乳頭細胞を、幹細胞を含むケラチノサイトと共に真皮代替物を足場として培養する工程。
1、新生児マウス由来ケラチノサイト(KC)の初代培養
C57Bl/6新生仔(出生後24時間)の背部皮膚を採取した。これを0.25%トリプシン−EDTA(GIBCO:インビトロジェン)中で、4℃、一夜反応させた。血清により反応を停止させた後、実体顕微鏡下で表皮と真皮を分離した。真皮部分をHuMedia−KG2(クラボウ)中に移し、ピペッティングした。そのまま同培地中で3日間培養を行った。得られたケラチノサイトは、CD200陽性細胞を11.2%含んでいた。
Wnt5a遺伝子情報(NM_003392 Homo sapiens wingless−type MMTV integration site family,member 5A (WNT5A),mRNA)はNCBIより入手した。本情報から、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質コード領域を含む塩基部分(配列番号1に記載の塩基配列中塩基番号316−1662の部分)を以下の通り、クローニングした。
完成したベクターは、それぞれ、pSIW5a、pCIW5aと命名した。
初代培養したヒト頭皮由来毛乳頭細胞(Lot.1389、47歳男性由来)は東洋紡績株式会社から購入した。不死化毛乳頭細胞の作製は成書(分子生物学研究のための培養細胞実験法(黒木登志夫、許 南浩、千田和広 編)第11章 変異細胞と不死化細胞の分離 (2)HPV、SV40による不死化(安本 茂)羊土社 p191−200 1995年発行)を参考にして行った。4型コラーゲンにより、コートした60mmディッシュに、3.7×105cellの細胞を播種した。24時間後におよそ70%コンフルエントとなったところで、FuGENE6(ロシュ・ダイアグノティクス)により2.5μgのSV40 ori-mutant DNA(財団法人ヒューマンサイエンス事業財団より入手)の導入を行った。約1ヶ月間に渡り、継代培養を繰り返す事で、不死化細胞の確保を行った。本毛乳頭細胞の性質を把握するため、当業界では一般的な手法による蛍光免疫染色法によりバーシカン〔1次抗体:抗バーシカン抗体(Affinity Bioreagents)200倍希釈、2次抗体:anti−rabbit Ig Fluorescein linked whole antibody(from donkey)(アマシャム・ファルマシア)500倍希釈〕、および男性ホルモン受容体〔1次抗体:抗Androgen receptor(Affinity Bioreagents)200倍希釈、2次抗体:anti−rabbit Ig Fluorescein linked whole antibody(from donkey)(アマシャム・ファルマシア)500倍希釈〕がいずれも発現することを確認した。バーシカンの発現は、本細胞に毛包誘導する能力があることが期待される結果であり、また、男性ホルモン受容体の発現は、本細胞が男性ホルモンに対する感受性を有する可能性を期待させる結果であった。
Wnt5a発現ベクター(pSIW5aならびにpCIW5a)を、前記3で得られた不死化毛乳頭細胞に導入した。すなわち、FuGENE6(ロシュ・ダイアグノティクス)により、遺伝子導入を行った。60mmの培養用シャーレ(住友ベークライト製)に、3.0x105cellsの不死化毛乳頭細胞を播種した。24時間後、FuGENE6により、2μgの当該ベクターの導入を行った。導入効率を確認するために、蛍光免疫染色法により、Wnt5aを検出した(1次抗体Wnt5a(C−16)(サンタクルーズ):1/20希釈、2次抗体:bovine anti−goat IgG−FITC:1/500希釈)。
Wnt5a導入毛乳頭細胞をスフェロイド状にしてコラーゲンに混合し、その後にケラチノサイトを播いて、3次元混合培養を行った。
本実施例の結果は、Wnt5aが毛乳頭細胞の毛包誘導能を亢進した結果であると考えることができる。
実施例1にて作製したWnt5A導入不死化毛乳頭細胞とケラチノサイトとを用いて、以下のように中心に毛乳頭細胞、外側にケラチノサイトを用いたスフェロイドにして包埋する方法で3次元混合培養を行った。
実施例1と同様に、pSIW5aならびにpCIW5aベクターのそれぞれを用いて、Wnt5a発現不死化毛乳頭細胞を作製した。スフェロイド作製のために、スミロンセルタイト スフェロイド(住友ベークライト)に、1ウェルあたり5.0×103cellsのWnt5a導入不死化毛乳頭細胞を播種した。翌日にスフェロイドが形成されているのを確認後、さらにヒト新生仔包皮由来ケラチノサイト(クラボウ)を、5.0×103cells/ウェルずつ追加した。培地はHuMedia−KG2:DMEM=1:1の基礎培地に、5%FBSを添加したものを使用した。このように作製した毛乳頭細胞とケラチノサイトからなるスフェロイド(二重スフェロイド)を、あらかじめ作製しておいた収縮コラーゲンゲル上に播種し、固定のためにコラーゲンを重層し、更にその上から、ヒト新生仔包皮由来ケラチノサイトを3.0×105cells播種した。培地は、5%FBS含有DMEMに、HuMedia−KG2の添加剤〔インシュリン、hEGF、ハイドロコーチゾン、抗菌剤(ゲンタマイシン、アンフォテリシン)、BPE〕を添加したものを使用し、半気相培養法により1週間培養した。
確認のための免疫染色法については、前述の方法と同様に行った。
ヒト表皮ケラチノサイト(クラボウ:継代数 P=4)を、HuMedia−KG2(クラボウ)を用いて、I型コラーゲンでコートしたφ60mmディッシュ上で培養した後、トリプシンを用いて細胞を回収した。回収した細胞は、1.0×107cells/mlになるように、PBS(pH7.4)+20mM グルコース+1%牛血清アルブミンからなる緩衝液(PBS/BSA)で希釈した。この細胞懸濁液100μl(=1.0×108cells)に対し、10μlのPE結合CD200抗体(セロテック)を添加し、よく混ぜ、30分間室温で暗所静置した。その後、20mlのPBS/BSAを添加し、よく混ぜ、400×gで5分間の遠心操作により回収し、200μlのPBS/BSAで再懸濁を行った。本細胞懸濁液の一部を、Fluorescence activated cell sorter:BD FACSCaliburHG フローサイトメーター(BD)に供した。得られた各細胞数、およびCD200陽性細胞率の結果を、表1に示す。
Claims (12)
- Wnt5aのコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドが導入された毛乳頭細胞と、幹細胞を含むケラチノサイトとが、真皮代替物を足場として培養されていることを特徴とする人工皮膚。
- 前記毛乳頭細胞が、不死化毛乳頭細胞である請求項1に記載の人工皮膚。
- 前記幹細胞を含むケラチノサイトが、CD200マーカー陽性細胞を7%以上含むケラチノサイトである請求項1または2に記載の人工皮膚。
- 前記真皮代替物が、線維芽細胞を含むものである請求項1〜3のいずれか一項に記載の人工皮膚。
- 下記の工程を備えることを特徴とする、人工皮膚の製造方法。
(a)毛乳頭細胞にWnt5aのコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドを導入する工程、
(b)前記(a)において得られるWnt5aのコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドが導入された毛乳頭細胞を、幹細胞を含むケラチノサイトと共に真皮代替物を足場として培養する工程。 - 前記(b)工程において、Wnt5aのコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドが導入されてなる毛乳頭細胞をスフェロイドとして、当該スフェロイドと幹細胞を含むケラチノサイトとを真皮代替物を足場として培養することを特徴とする請求項5に記載の製造方法。
- 前記(b)工程において、Wnt5aが導入されてなる毛乳頭細胞を中心に、その外側にケラチノサイトが取り囲むスフェロイドを作製し、当該スフェロイドを真皮代替物を足場として培養することを特徴とする請求項5に記載の製造方法。
- 更に(c)上層にケラチノサイトの重層化を誘導する工程を備えることを特徴とする、請求項5〜7のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記(c)工程において、半気相培養により重層化を誘導することを特徴とする、請求項8に記載の製造方法。
- 前記毛乳頭細胞が、不死化毛乳頭細胞である請求項5〜9のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記幹細胞を含むケラチノサイトが、CD200マーカー陽性細胞を7%以上含むケラチノサイトである請求項5〜10のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記真皮代替物が、線維芽細胞を含むものである請求項5〜11のいずれか一項に記載の製造方法。
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