JP2008532550A - 純度が改良された代用皮膚 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はインビトロ培養代用皮膚に関する。特に、本発明は、培養代用皮膚を開発するための組成物および方法に関する。なお本出願は、その全体が参照により組み入れられる、2005年3月17日に出願した米国仮特許出願第60/662,831号の利益を主張する。
皮膚は人体の最大器官である。皮膚は上皮層および真皮層からなる。上皮は外層であり、より厚い真皮上に位置して真皮から栄養分を受け取っている。これら2層の厚さは、およそ1〜2 mm(0.04〜0.08インチ)である。上皮は、頑丈な保護被膜をもたらす死細胞の外層、および数層の、ケラチノサイトと称される迅速に分裂する細胞からなる。真皮は血管、神経、汗腺、毛包、および脂腺を含む。真皮は主に結合組織からなり、これは主としてタンパク質コラーゲンであり、皮膚に柔軟性を付与しかつ構造支持をもたらしている。コラーゲンを生成する線維芽細胞は、真皮における主要な細胞種である。
本発明はインビトロ培養代用皮膚に関する。特に、本発明は、培養代用皮膚を開発するための組成物および方法に関する。
本明細書で用いる「皮膚等価物」および「代用皮膚」という用語は、いわゆる器官型培養において重層化して扁平上皮となったケラチノサイトのインビトロ由来培養物を指して互換的に用いられる。
本発明はインビトロ培養代用皮膚に関する。特に、本発明は、培養代用皮膚を開発するための組成物および方法に関する。
本発明の方法を用いて代用皮膚を作製できることが意図される。一般に、本発明においては、重層化して扁平上皮となり得る細胞または細胞株の任意の供給源が有用である。したがって本発明は、扁平上皮に分化し得る細胞のいずれか特定の供給源の使用に限定されない。実際に本発明は、初代ケラチノサイトおよび不死化ケラチノサイトを含む、扁平上皮に分化し得る様々な細胞株および供給源の使用を意図する。細胞の供給源には、ヒトおよび屍体ドナーから生検採取されたケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞(Auger et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. - Animal 36:96-103;米国特許第5,968,546号および第5,693,332号、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる)、新生児包皮(Asbill et al., Pharm. Research 17(9): 1092-97 (2000);Meana et al., Burns 24:621-30 (1998);米国特許第4,485,096号;第6,039,760号;および第5,536,656号、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる)、ならびにNM1細胞(Baden, In Vitro Cell. Dev. Biol. 23(3):205-213 (1987))、HaCaT細胞(Boucamp et al., J. cell. Boil. 106:761-771 (1988));およびNIKS細胞(細胞株BC-1-Ep/SL;参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,989,837号;ATCC CRL-12191)などの不死化ケラチノサイト細胞株が含まれる。これらの細胞株はそれぞれ、皮膚等価物を生成する目的で、以下に説明するように培養することができる。
本発明は、残存フィーダー層細胞を実質的に含まない皮膚等価物を提供する。「実質的に含まない」とは、皮膚等価物が、生成物細胞/フィーダー層細胞基礎において0.001%未満のフィーダー層細胞を含むことを意味する。より好ましくは、皮膚等価物は、生成物細胞/フィーダー層細胞基礎において0.0001%未満のフィーダー層細胞を含む。フィーダー層細胞は、ケラチノサイトおよび幹細胞を含む種々の細胞または細胞株のインビトロ増殖を支持するために用いられる。特に低密度またはクローン密度でいくらかの細胞を培養するためには、培地を馴化するために、培養条件が面倒でない細胞の層を使用することが必要である。多くの場合、フィーダー層の細胞は、増殖できないようにするため照射するかまたは別の方法で処理する。場合によっては、フィーダー層は増殖因子またはサイトカインを産生し得る。フィーダー層は、マウス線維芽細胞に由来する場合が多い。マウスフィーダー層に伴う主要な欠点は、増殖細胞または細胞株中の、残存マウスDNAおよび/またはマウス細胞の複製に関連した不純物である。結果として、そのようなマウスフィーダー層不純物を防ぐことを目的とした方法の必要性が大きい。
値は、ロット引き渡し試験法「マウスDNAに関するStrataGraft(商標)の評価」限界、加えて検出されたマウスDNAの歴史的レベルおよび一細胞DNA等価物以下の理論的検出の計算を表す。
本発明の代用皮膚が様々な用途を有することが意図される。これらの用途には、これらに限定されないが、化合物(例えば、刺激物)をスクリーニングするための使用、腫瘍および病原体(例えば、ヒトパピローマウイルス)を培養するための基質、ならびに創傷閉鎖および熱傷治療のための使用が含まれる。これらの用途について以下にさらに詳述する。
本発明の皮膚等価物は、様々なインビトロ試験に用いることができる。特に、皮膚等価物は以下の評価に用いられる:スキンケア製品、薬物代謝、試験化合物に対する細胞応答、創傷治癒、光毒性、皮膚刺激性、皮膚炎症、皮膚腐食性、および細胞障害。皮膚等価物は、6ウェル、24ウェル、および96ウェルプレートを含むがこれらに限定されない様々な試験用形式で提供される。さらに、皮膚等価物を標準的な切離法によって分割した後に検査することもできる。本発明の皮膚等価物は、分化した角質層を有する上皮層および真皮線維芽細胞を含む真皮層の両方を有する。上記の通り、特に好ましい態様において、上皮層は不死化NIKS細胞に由来する。NIKS細胞を含む他の好ましい細胞株は、i) 不死化していること;ii) 非腫瘍形成性であること;iii) 分化を誘導すると角化膜を形成すること;iv) 器官型培養下で正常な扁平上皮分化を起こすこと;およびv) 細胞種特異的な増殖基準を液内培養下で維持することを特徴とし、この際、前記の細胞種特異的な増殖基準には、1) 標準的なケラチノサイト増殖培地中でマイトマイシン-C処理した3T3フィーダー細胞の存在下で培養した際に、正常ヒトケラチノサイトの形態的特徴を示すこと;2) 連続培養のために上皮増殖因子に依存すること;および3) トランスフォーミング増殖因子β1による増殖阻害が含まれる。
本発明の皮膚等価物が、皮膚に自然に生じる腫瘍の培養および試験ならびに皮膚を冒す病原体の培養および試験にも有用であることが意図される。したがって、いくつかの態様においては、本発明の皮膚等価物に悪性細胞を播種することが意図される。非限定的な例として、皮膚等価物に、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,989,837号に記載されている悪性SCC13y細胞を播種して、ヒト扁平上皮癌のモデルを得ることができる。次に、これらの播種された皮膚等価物を用いて、化合物または他の処理戦略(例えば、放射線療法またはトモセラピー)を、自然環境にある腫瘍に対する有効性についてスクリーニングすることができる。したがって、本発明のいくつかの態様は、悪性細胞または腫瘍を含む皮膚等価物および少なくとも1つの試験化合物を提供する段階、皮膚等価物を化合物で処理する段階、ならびに悪性細胞または腫瘍に対する処理の効果を分析する段階を含む方法を提供する。本発明の他の態様においては、悪性細胞または腫瘍を含む皮膚等価物および少なくとも1つの試験療法(例えば、放射線療法または光線療法)を提供する段階、皮膚等価物を療法で処理する段階、ならびに悪性細胞または腫瘍に対する療法の効果を分析する段階を含む方法を提供する。
本発明の皮膚等価物は、創傷閉鎖および熱傷治療の用途に用いられる。熱傷治療および創傷閉鎖への自家移植片および同種移植片の使用は、Myers et al., A. J. Surg. 170(1):75-83 (1995)、ならびに米国特許第5,693,332号;第5,658,331号;および第6,039,760号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様においては、皮膚等価物をDERMAGRAFTなどの代用真皮と共に用いることができる。他の態様においては、ケラチノサイトの標準的な供給源(例えば、NIKS細胞)および移植片を受け取る患者由来のケラチノサイトの両方を用いて、皮膚等価物を生成する。そのため、皮膚等価物は2つの異なる供給源に由来するケラチノサイトを含む。さらなる態様において、皮膚等価物はヒト組織分離株に由来するケラチノサイトを含む。したがって、本発明は、本発明による皮膚等価物および創傷に罹患した患者を提供する段階、ならびに創傷が閉鎖される条件下で患者を皮膚等価物によって治療する段階を含む、熱傷によって生じた創傷を含む創傷閉鎖の方法を提供する。
さらなる態様においては、皮膚等価物を操作して対象に治療薬を提供する。本発明は、任意の特定の治療薬の送達に限定されない。実際に、酵素、ペプチド、ペプチドホルモン、他のタンパク質、リボソームRNA、リボザイム、およびアンチセンスRNAを含むがこれらに限定されない種々の治療薬を対象に送達し得ることが意図される。これらの治療薬は、遺伝的欠陥を修正する目的を含むがこれらに限定されない種々の目的で送達することができる。いくつかの特に好ましい態様においては、移植片が野生型組織として役立つような遺伝性先天性代謝異常(例えば、アミノ酸代謝異常症)の患者を解毒する目的で、治療薬を送達する。治療薬の送達によって欠陥が修正されることが意図される。いくつかの態様においては、皮膚等価物の形成に用いるケラチノサイトに、治療薬(例えば、インスリン、凝固第IX因子、エリスロポエチンなど)をコードするDNA構築物をトランスフェクションし、皮膚等価物を対象に移植する。次いで、治療薬が移植片から患者の血流または他の組織に送達される。好ましい態様においては、治療薬をコードする核酸を適切なプロモーターと機能的に連結させる。本発明は任意の特定のプロモーターの使用に限定されない。実際に、誘導性、構成的、組織特異的、およびケラチノサイト特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない種々のプロモーターの使用が意図される。いくつかの態様においては、治療薬をコードする核酸をケラチノサイトに直接導入する(すなわち、リン酸カルシウム共沈法またはリポソームトランスフェクション法による)。他の好ましい態様においては、治療薬をコードする核酸をベクターとして提供し、このベクターを当技術分野で公知の方法によりケラチノサイトに導入する。いくつかの態様において、ベクターはプラスミドなどのエピソームベクターである。他の態様では、ベクターはケラチノサイトのゲノム中に組み込まれる。組込みベクターの例には、これらに限定されないが、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびトランスポゾンベクターが含まれる。
本発明は、残存フィーダー層細胞を実質的に含まない種々の細胞、細胞株、または細胞由来生成物の生成を意図する。好ましい態様において、マウスDNAアッセイ法および増殖アッセイ法でスクリーニングした3T3フィーダー層上で増殖させた細胞または細胞株は、フィーダー層細胞を実質的に含まない培養細胞または細胞株となる。本発明のいくつかの好ましい態様では、フィーダー層を実質的に含まない幹細胞を回収する。本発明は特定の幹細胞に限定されない。任意の生物に由来する特定の幹細胞を使用することができる。いくつかの好ましい態様において、幹細胞種は成人幹細胞(例えば、体性幹細胞)であってよい。他の好ましい態様において、幹細胞種は胚性幹細胞(例えば、全能性幹細胞)であってよい。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を示しさらに説明するために提供するものであり、その範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
マウスプライマーST051およびST052を用いたマウス特異的DNAの検出
本実施例では、マウスプライマーST051およびST052を用いたマウス特異的DNAの検出について記載する。PCR鋳型として使用するため、マウス細胞(3T3)および正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)からゲノムDNAを単離した。マウスゲノムDNAに特異的な285塩基対(bp)生成物が増幅されるように、PCRプライマーST051
およびST052
を設計した(MacGregor, H.C. and Varley, J.M. (1988). 「Working with Animal Chromosomes」2nd ed., Wiley, New York)。
対照PCRプライマーST047およびST035を用いたヒト特異的DNAの検出
本実施例では、ヒトゲノムDNAから500 bpの特異的生成物を増幅するための第2のプライマーセット(ST047
およびST035
)の使用について記載する。本実施例では、マウスおよび対照PCRプライマーセットについての最適なプライマー-温度アニーリング条件の系統的評価および同定についても記載する。
皮膚培養生検試料を用いたPCR
本実施例では、STRATAGRAFT(Stratatech Corp.、ウィスコンシン州、マディソン)生検試料からのゲノムDNAの単離、ならびにそれに続く実施例1および2に記載したPCRアッセイ法におけるそのゲノムDNA鋳型供給源としての評価について記載する。同様のSTRATAGRAFTよりプールした(MacGreagor, H.C. (1988), Working with Animal Chromosomes, 2nd Ed., Wiley, New York)生検パンチから全ゲノムDNAを単離し、対照プライマーST047およびST035を用いるPCR増幅の鋳型として使用した。
マウス特異的DNA検出限界の評価
本実施例では、全ヒトゲノムDNA 0.5μgを含むPCR反応物における、このアッセイ法のマウス特異的DNA検出限界の評価について記載する。
アッセイ法のばらつきおよび再現性
本実施例では、以下の事項におけるアッセイ法のばらつきおよび再現性の検討について記載する:
1) 同じSTRATAGRAFT試料による複数の生検DNA調製物。
2) 同じ作製バッチによる複数のSTRATAGRAFT試料。
3) 異なる作製操作者による同じSTRATAGRAFTバッチからの複数の試料。
マウス細胞の力価測定
本実施例では、既知数のマウス3T3細胞を所定数のNHDF細胞に添加することによる、マウスDNA等価物を用いて以前に計算された検出限界の確証について記載する。一定数のNHDF細胞に、マウス細胞をその割合を減少させつつ添加していった。これらの細胞集団からゲノムDNAを単離し、次いでPCR解析に供した。混合細胞集団によるPCR生成物の強度を、既知量のマウスゲノムDNAとヒトゲノムDNAを混合して得られた強度と比較した。
マウス特異的プライマーの交差反応性
本実施例では、非マウス試料において非マウスDNAがマウス特異的プライマーにより検出されなかったことを実証する。
増殖3T3細胞を検出するための最適数のマイトマイシン-C処理3T3線維芽細胞/cm2の決定
本実施例では、最適数のマイトマイシン-C処理3T3線維芽細胞/cm2を決定するために用いた実験について記載する。STRATAGRAFTの作製過程では、NIKS開始時に約7.5×106個のマイトマイシン-C処理複製不活化3T3細胞を使用し、NIKS拡大時に約25×106個のマイトマイシン-C処理複製不活化3T3細胞を使用する。マイトマイシン-C処理複製不活化3T3フィーダー層は、BR14のように22,700個細胞/cm2〜BR13のように27,300個細胞/cm2の細胞密度でプレーティングする。増殖3T3細胞を検出するための最適数のマイトマイシン-C処理3T3線維芽細胞/cm2を決定するため、3,130個細胞/cm2、7,810個細胞/cm2、15,630個細胞/cm2、および31,250個細胞/cm2という4つの異なる細胞密度に関して、96ウェルプレートを用いて検討した。これらの密度は、1,000個、2500個、5000個、および10,000個のマイトマイシン-C処理3T3線維芽細胞/ウェル(0.32 cm2/ウェル)に相当する。
3T3増殖検出感度の決定
本実施例では、3T3線維芽細胞の増殖検出感度がいかにして決定されるかについて記載する。増殖3T3検出の感度を決定するため、以前に確立された最適細胞密度を用いて、図3に記載する通りにさらなる実験を行った。この評価では、指定数の公知の複製可能な増殖3T3線維芽細胞(マイトマイシン-Cで一度も処理していない)を、凍結保存マイトマイシン-C処理3T3線維芽細胞のいくつかの調製物に由来する指定数のマイトマイシン-C処理3T3細胞/cm2に対して播種した。本実験には、マイトマイシン-C処理3T3細胞の非存在下における複製可能な3T3増殖のレベルを決定するための対照培養物も含めた。不完全な複製不活化に起因して起こり得る3T3増殖のバックグラウンドレベルを規制するため、マイトマイシン-C処理3T3細胞のみの培養物もプレーティングした。本試験では、凍結保存マイトマイシン-C処理3T3細胞の3つの別個のバッチを使用した。
3T3増殖陽性ウェルの数(バックグラウンド3T3増殖レベルに関して調整)と、試験した各バッチに対して添加した増殖性3T3細胞の理論数との比較。
試験法のパラメータの確立:凍結保存マイトマイシン-C処理3T3バッチにおける増殖検出
本実施例では、凍結保存マイトマイシン-C処理3T3バッチにおける増殖検出周囲のパラメータを確立するために用いた実験について記載する。作製における使用に関してマイトマイシン-C処理3T3細胞のバッチを認可するには、完全な有糸分裂不活化が確証されねばならない。「3T3増殖非検出」(同意された試験の検出限界内)という基準が、この試験法の唯一許容される基準である。検出を確実にするには、さらなる時間を充てて、元の培養維持時間を3週間から全部で5週間にまで延長する。
Claims (32)
- 以下の段階を含む、フィーダー層から回収された細胞を提供する方法:
a) 生成物細胞、フィーダー層細胞、および細胞複製を防ぐ薬剤を提供する段階;
b) 細胞複製を防ぐ該薬剤で該フィーダー層細胞を処理する段階;
c) 該フィーダー層細胞を複製に関して分析する段階;
d) 該生成物細胞を該フィーダー層細胞上で培養する段階;
e) 該生成物細胞と該フィーダー層細胞を分離する段階;
f) 該生成物細胞をフィーダー層細胞DNAの存在に関して分析する段階。 - 生成物細胞が重層化して扁平上皮となり得る、請求項1記載の方法。
- 生成物細胞が、初代ケラチノサイトおよび/または不死化ケラチノサイトからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- ケラチノサイトがNIKS細胞である、請求項3記載の方法。
- フィーダー層が増殖因子および細胞外基質分子を提供する、請求項1記載の方法。
- フィーダー層がマウス線維芽細胞である、請求項1記載の方法。
- マウス線維芽細胞が3T3細胞である、請求項6記載の方法。
- 薬剤がマイトマイシン-Cである、請求項1記載の方法。
- 生成物細胞とフィーダー層細胞を分離する段階がEDTAにより達成される、請求項1記載の方法。
- フィーダー層細胞を複製に関して分析する段階が増殖アッセイ法により達成される、請求項1記載の方法。
- フィーダー層細胞が複製マウス細胞を実質的に含まない、請求項10記載の方法。
- 細胞複製を示すフィーダー層細胞が廃棄される、請求項1記載の方法。
- 生成物細胞をフィーダー層細胞DNAの存在に関して分析する段階がマウスDNA PCRアッセイ法により達成される、請求項1記載の方法。
- 約1.0×104を超えるフィーダー層細胞DNA等価物を含むフィーダー層から回収された生成物細胞が廃棄される、請求項1記載の方法。
- フィーダー層から回収された生成物細胞が全細胞中に約0.015%未満のフィーダー細胞DNA等価物を含む、請求項1記載の方法。
- 生成物細胞が幹細胞である、請求項1記載の方法。
- 生成物細胞が哺乳類細胞からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 細胞複製を示すフィーダー層細胞が廃棄される、請求項1記載の方法。
- 生成物中に生成物細胞を組み入れる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 生成物が残存フィーダー層細胞を実質的に含まない、請求項19記載の方法。
- 請求項20記載の方法により生成された生成物細胞。
- 請求項1記載の方法により生成された生成物。
- 皮膚等価物中に生成物細胞を組み入れる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 皮膚等価物が残存フィーダー層細胞を実質的に含まない、請求項23記載の方法。
- フィーダー層とのインインビトロ培養に由来する重層ケラチノサイト細胞を含む皮膚等価組成物であって、皮膚等価物が残存フィーダー層細胞を実質的に含まない、皮膚等価組成物。
- ケラチノサイト細胞がNIKS細胞である、請求項25記載の皮膚等価組成物。
- フィーダー層がマウス線維芽細胞である、請求項25記載の皮膚等価組成物。
- マウス線維芽細胞が3T3細胞である、請求項27記載の皮膚等価組成物。
- フィーダー層がマイトマイシン-Cで処理される、請求項25記載の皮膚等価組成物。
- 皮膚等価物がEDTAによってフィーダー層から分離される、請求項25記載の皮膚等価組成物。
- フィーダー層が複製フィーダー細胞を実質的に含まない、請求項25記載の皮膚等価組成物。
- 皮膚等価物が全細胞集団中に0.015%未満のフィーダー細胞DNA等価物を含む、請求項25記載の皮膚等価組成物。
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