ES2622508T3 - Sustitutos de piel con pureza mejorada - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para proporcionar células recolectadas a partir de una capa alimentadora que comprende: a) proporcionar: i) células de producto, en el que dichas células de producto se seleccionan entre un grupo que consiste en queratinocitos primarios y/o inmortalizados, ii) células de capa alimentadora, y iii) un agente que evita la replicación celular; b) tratar dichas células de capa alimentadora con dicho agente que evita la replicación celular; c) ensayar dichas células de capa alimentadora para la replicación con un ensayo de proliferación; d) descartar dichas células de capa alimentadora que presentan una replicación celular; e) cultivar dichas células de producto en dichas células de capa alimentadora; f) separar dichas células de producto y dichas células de capa alimentadora, en el que las células de producto separadas están sustancialmente exentas de células de capa alimentadora residuales, en el que sustancialmente exentas de células de capa alimentadora residuales significa que las células de producto comprenden menos del 0,001 % de células de capa alimentadora en una base de célula de producto/célula de capa alimentadora; g) ensayar dichas células de producto para la presencia de ADN de células de capa alimentadora; h) descartar las células de producto que no están sustancialmente exentas de células de capa alimentadora residuales.

Description

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formas polimórficas predominantes que se distinguen por el aminoácido en el codón 72. Los dos alelos de p53 en las células NIKS son de tipo natural y tienen la secuencia CGC en el codón 72, que codifica una arginina. La otra forma común de p53 tiene una prolina en esta posición. La secuencia completa de p53 en las células NIKS es idéntica a las células progenitoras BC-1-Ep. Rb también se encontró que era de tipo natural en las células NIKS.

El crecimiento independiente del anclaje está altamente correlacionado con la tumorigenicidad in vivo. Por este motivo, se investigaron las características de crecimiento independiente del anclaje de células NIKS en un medio que contiene agar o metilcelulosa. Después de 4 semanas en un medio que contenía agar o metilcelulosa, las células NIKS permanecieron como células individuales. Los ensayos continuaron durante un total de 8 semanas para detectar variantes de crecimiento lento de las células NIKS. No se observó ninguna.

Para determinar la tumorigenicidad de los queratinocitos de BC-1-EP parentales y la estirpe celular de queratinocitos inmortales NIKS, se inyectaron las células en los flancos de ratones desnudos atímicos. La estirpe celular de carcinoma de células escamosas humanas, SCC4, se utilizó como control positivo para la producción de tumores en estos animales. La inyección de las muestras se diseñó de manera tal que los animales recibieron células SCC4 en un flanco y, los queratinocitos BC-1-Ep parentales o las células NIKS en el flanco opuesto. Esta estrategia de inyección eliminó la variación entre animales en la producción tumoral y confirmó que los ratones soportarían el crecimiento vigoroso de células tumorigénicas. Ni los queratinocitos BC-1-EP parentales (pase 6) ni los queratinocitos NIKS (pase 35) produjeron tumores en ratones desnudos atímicos.

Se analizaron células NIKS para la capacidad de experimentar diferenciación tanto en cultivo de superficie como en el cultivo organotípico. Para las células en el cultivo de superficie, se controló un marcador de diferenciación escamosa, la formación de envolturas córneas. En queratinocitos humanos cultivados, las primeras etapas de ensamblaje de envolturas córneas dan como resultado la formación de una estructura inmadura compuesta de involucrina, cistatina-α y otras proteínas, que representan la tercera de las envolturas córneas maduras más interna. Menos del 2 % de los queratinocitos de las células BC-1-Ep adherentes o la estirpe celular NIKS producen envolturas córneas. Este hallazgo es consistente con estudios previos que demuestran que los queratinocitos subconfluentes de crecimiento activo producen menos de 5 % de envolturas córneas. Para determinar si la estirpe celular NIKS es capaz de producir envolturas córneas cuando se induce para diferenciarse, las células se extrajeron del cultivo de superficie y se suspendieron durante 24 horas en un medio fabricado semisólido con metilcelulosa. Muchos aspectos de la diferenciación terminal, incluyendo la expresión diferencial de las queratinas y la formación de envolturas córneas, se pueden activar in vitro por la pérdida de queratinocitos célula-célula y la adhesión célulasustrato. Los queratinocitos NIKS produjeron tantas envolturas córneas, y por lo general, más que los queratinocitos parentales. Estos hallazgos demuestran que los queratinocitos NIKS no son defectuosos en su capacidad para iniciar la formación de esta estructura de diferenciación específica del tipo celular.

Para confirmar que los queratinocitos NIKS pueden experimentar una diferenciación escamosa, las células se cultivaron en un cultivo organotípico. Los cultivos de queratinocitos cultivados en sustratos de plástico y sumergidos en un medio se replican, pero exhiben una diferenciación limitada. Específicamente, los queratinocitos humanos se vuelven confluentes y se someten a una estratificación limitada que produce una lámina que consiste en 3 o más capas de queratinocitos. Por microscopía óptica y electrónica existen diferencias notables entre la arquitectura de las láminas de múltiples capas formadas en el cultivo tisular y la piel humana intacta. Por el contrario, las técnicas de cultivo organotípico permiten el crecimiento y diferenciación de queratinocitos en condiciones similares a in vivo. Específicamente, las células se adhieren a un sustrato fisiológico que consiste en fibroblastos dérmicos incrustados en una base de colágeno fibrilar. El cultivo organotípico se mantiene en la interfase de aire-medio. De esta manera, las células en las láminas superiores se exponen al aire, mientras que las células basales proliferantes permanecen más cercanas al gradiente de nutrientes proporcionados por difusión a través del gel de colágeno. En estas condiciones, se forma una arquitectura tisular correcta. Varias características de una epidermis normal de diferenciación resultan evidentes. En las células parentales y la estirpe celular NIKS, una única capa de células basales cuboidales descansa en la unión de la epidermis y el equivalente dérmico. La morfología redondeada y la relación alta de núcleo a citoplasma es indicativo de una población de queratinocitos que se dividen activamente. En la epidermis humana normal, a medida que las células basales se dividen dan lugar a células hijas que migran de forma ascendente a las capas de diferenciación del tejido. Las células hijas aumentan de tamaño, y se vuelven aplanadas y escamosas. Con el tiempo, estas células se enuclean y forman estructuras queratinizadas córneas. Este proceso de diferenciación normal es evidente en las capas superiores de tanto las células parentales como las células NIKS. La aparición de células escamosas aplanadas es evidente en las capas superiores de los queratinocitos y demuestra que la estratificación se ha producido en los cultivos organotípicos, En la parte más superior de los cultivos organotípicos, las escamas enucleadas se desprenden de la parte superior del cultivo. Hasta la fecha, no se han observado diferencias histológicas en la diferenciación a nivel de microscopio óptico entre los queratinocitos parentales y la estirpe celular de queratinocitos NIKS cultivada en el cultivo organotípico.

Para observar las características más detalladas de los cultivos organotípicos parentales (pase 5) y NIKS (pase 38) y para confirmar las observaciones histológicas, se analizaron las muestras mediante microscopía electrónica. Las células parentales y la estirpe celular de queratinocitos humanos inmortalizados, NIKS, se recolectaron después de 15 días en cultivo organotípico y se seccionaron perpendicularmente a la capa basal para mostrar el grado de estratificación. Las células parentales y la estirpe celular NIKS experimentan una extensa estratificación en cultivo organotípico y forman estructuras que son características de la epidermis humana normal. Se forman abundantes

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desmosomas en cultivos organotípicos de células parentales y la estirpe celular NIKS. Asimismo se observó la formación de una lámina basal y los hemidesmosomas asociados en las capas de queratinocitos basales de las células parentales y la estirpe celular. Los hemidesmosomas son estructuras especializadas que aumentan la adhesión de los queratinocitos a la lámina basal y ayudan a mantener la integridad y la resistencia del tejido. La presencia de estas estructuras fue especialmente evidente en áreas en las que las células parentales o las células NIKS se han unido directamente al soporte poroso. Estos hallazgos son consistentes con los hallazgos ultraestructurales previos que utilizan queratinocitos de prepucio humano cultivados sobre un soporte poroso que contiene fibroblastos. El análisis a nivel de microscopía óptica y de electrones demuestra que la estirpe celular NIKS en un cultivo organotípico puede estratificarse, diferenciarse, y formar estructuras, tales como desmosomas, lámina basal, y hemidesmosomas que se encuentran en la epidermis humana normal.

B. Condiciones de cultivo para crear equivalentes de piel que están sustancialmente exentos de células decapa alimentadora

La presente invención proporciona procedimientos que permiten producir equivalentes de piel que están sustancialmente exentos de células de capa alimentadora residuales. "Sustancialmente exento" significa que los equivalentes de piel comprenden preferentemente menos de 0,001 % células de capa alimentadora en una base celular de producto/células de capa alimentadora. Más preferentemente, los equivalentes de piel comprenderán menos de 0,0001 % células de capa alimentadora en una base celular de producto/células de capa alimentadora. Se utilizan células de capa alimentadora para soportar el crecimiento in vitro de una variedad de células o estirpes celulares que incluyen queratinocitos y células madre. Para cultivar algunas células, en particular a densidad baja o clonal, es necesario el uso de una capa de células menos exigentes para acondicionar el medio. A menudo, las células de la capa alimentadora son irradiadas o tratadas de otro modo para que no proliferen. En algunos casos, la capa alimentadora puede producir factores de crecimiento o citoquinas. Las capas alimentadoras se suelen derivar a partir de fibroblastos murinos. Un inconveniente importante con las capas alimentadoras murinas es la impureza asociada con el ADN murino residual y/o la replicación celular murina en las células cultivadas o en las estirpes celulares. Como resultado, es absolutamente necesario procedimientos destinados a prevenir dichas impurezas en la capa alimentadora murina.

La presente invención proporciona procedimientos destinados a evitar impurezas en la capa alimentadora murina. En particular, la presente invención proporciona procedimientos para generar sustitutos de piel cultivados en capas alimentadoras murinas que no contienen células de capa alimentadora proliferantes. En algunas realizaciones, la presente invención utiliza capas alimentadoras murinas. En realizaciones adicionales, la presente invención utiliza capas alimentadoras 3T3 murinas. En aún realizaciones adicionales, la presente invención utiliza capas alimentadoras 3T3.

Los fibroblastos 3T3 murinos tratados con mitomicina-C para inhibir la proliferación, se han utilizado como capas alimentadoras en el cultivo de queratinocitos humanos in vitro (Watt, F. (1998) en: Cell Biology: A Laboratory Handbook vol. 1, 2ª Ed., Academic Press). Además, las capas alimentadoras que comprenden células 3T3 inactivadas de forma mitótica secretan factores de crecimiento y moléculas de matriz extracelular que potencian el crecimiento de las células epiteliales. En algunas realizaciones de la presente invención, las capas alimentadoras serán tratadas para prevenir la replicación celular. La presente invención no se limita a ningún determinado tipo de agente para prevenir la replicación celular. En realizaciones preferentes, la presente invención utiliza mitomicina-C.

Se contempla que en ciertas realizaciones, la producción de la presente invención implica un procedimiento de cultivo de múltiples etapas. Sin embargo, la presente invención no se limita a ningún procedimiento de cultivo de múltiples etapas particular. En realizaciones preferentes, el procedimiento de cultivo de múltiples etapas conlleva una etapa de inicio, una etapa de expansión, y una etapa de estratificación. En algunas realizaciones, estas etapas se denominan en general como una fase de cultivo sumergido.

Durante la etapa de inicio, las células NIKS se cultivaron en placas en fibroblastos 3T3 murinos inactivados por replicación. En algunas realizaciones, las células NIKS y los fibroblastos 3T3 murinos son criopreservados antes de la etapa de inicio del cultivo. En algunas realizaciones, se utilizan entre 1 x 106 y 15 x 106 células 3T3 inactivadas por replicación. En otras realizaciones, se utilizan entre 5 x 106 y 10 x 106 células 3T3 inactivadas por replicación. Finalmente, en realizaciones preferentes, se utilizan entre 7 x 106 y 8 x 106 células 3T3 inactivadas por replicación (aproximadamente 27.300 células/cm2 en placas de 275 cm2). En algunas realizaciones preferentes, se realizaron pases de células en 50 ml de medio y después se trataron con 120 ml de medio que contiene mitomicina-C durante 4 horas.

En algunas realizaciones, la cantidad de tiempo permitido para la etapa de inicio del crecimiento celular de NIKS es más de una semana. En realizaciones preferentes, la cantidad de tiempo permitido para el crecimiento celular de NIKS es de una semana o menos. Además, después de la etapa de inicio del crecimiento celular de NIKS en la capa alimentadora, se retira la capa alimentadora. En algunas realizaciones, la capa alimentadora se retira tras menos de un monocapa de la etapa de inicio del crecimiento celular de NIKS. En realizaciones preferentes, la capa alimentadora se retira después de que esté presente un monocapa de la etapa de inicio del crecimiento celular de NIKS.

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El tratamiento con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) elimina selectivamente las capas alimentadoras del cocultivo de queratinocitos eliminando así las células 3T3 inactivadas por replicación tratadas con mitomicina-C no deseadas hasta la compleción de una fase de cultivo en monocapa dado de células NIKS. La presente invención no se limita a un determinado agente disipador de la capa alimentadora de la etapa de inicio. En realizaciones preferentes, EDTA se utiliza como agente disipador de la capa alimentadora de la etapa de inicio.

Durante la fase de expansión, las células NIKS cultivadas durante la etapa de inicio se cultivan en placas en fibroblastos 3T3 murinos inactivados por replicación. En realizaciones preferentes, las células NIKS utilizadas se generan en una etapa de inicio. En algunas realizaciones de la etapa de expansión, se utilizan entre 15 x 106 y 40 x 106 células 3T3 inactivadas por replicación. En otras realizaciones, se utilizan entre 20 x 106 y 25 x 106 células 3T3 inactivadas por replicación. Por último, en realizaciones preferentes, se utilizan entre 24 x 106 y 26 x 106 células 3T3 inactivadas por replicación (aproximadamente 22.700 células/cm 2 en placa de 1.125 cm2).

En algunas realizaciones la cantidad de tiempo permitido para el crecimiento celular de NIKS es más de una semana. En realizaciones preferentes, la cantidad de tiempo permitido para el crecimiento celular de NIKS es de una semana o menos. Además, después del crecimiento de las células NIKS en la capa alimentadora, se retira la capa alimentadora. En algunas realizaciones, la capa alimentadora se retira tras menos de un monocapa de la etapa de expansión del crecimiento celular de NIKS. En realizaciones preferentes, la capa alimentadora se retira después de que esté presente un monocapa de etapa de expansión del crecimiento celular de NIKS. La presente invención no se limita a un determinado agente disipador de la capa alimentadora de la etapa de expansión. En realizaciones preferentes, EDTA se utiliza como agente disipador de la capa alimentadora de la etapa de expansión.

Durante la etapa de estratificación, las células NIKS se cultivan en placas en equivalentes dérmicos. En realizaciones preferentes, las células NIKS son generadas en una etapa de expansión. La presente invención no se limita a un determinado tipo de equivalente dérmico. En realizaciones preferentes, el equivalente dérmico es el tejido del sujeto (por ejemplo, caballo, humano, gato, perro, etc.). En otras realizaciones, el equivalente dérmico puede ser un tejido sintético. Además, en algunas realizaciones, la cantidad de tiempo permitido para la etapa de estratificación del crecimiento es menos de dos semanas. En realizaciones preferentes, la cantidad de tiempo permitido para la etapa de estratificación del crecimiento celular de NIKS es de al menos dos semanas.

La presente invención contempla que un pequeño número de células 3T3 inactivadas por replicación tratadas con mitomicina-C puede permanecer después del tratamiento con EDTA. Como tal, en algunas realizaciones, las células NIKS se ensayan para determinar la cantidad de ADN murino presente en el crecimiento de células NIKS. Las preparaciones de células NIKS que tienen más de una cantidad aceptable de ADN de ratón no se utilizan para la estratificación o para su procesamiento posterior, si ya se ha producido la estratificación. El ensayo de ADN de ratón se puede emplear al concluir la etapa inicial, la etapa de expansión y/o la etapa de estratificación. En realizaciones preferentes, el ensayo de ADN de ratón se emplea al concluir las etapas de inicio, expansión y estratificación (es decir, al concluir la etapa de inmersión). En algunas realizaciones, una cantidad aceptable de ADN murino presente en un producto de células NIKS acabado es inferior a 5 x 104 equivalentes de ADN celular murino/dosis de células NIKS. Un equivalente de ADN celular murino es la cantidad de ADN específico de células de ratón por conjunto de cromosomas haploides. Una dosis de células NIKS es una muestra de 44,2 cm2 de producto de células NIKS acabado. En realizaciones preferentes, una cantidad aceptable de ADN murino presente en un producto de células NIKS acabado es inferior a 1,45 x 104 equivalentes de ADN celular murino por dosis de células NIKS. Además, las células murinas pueden constituir no más del 0,015 % de la población celular total. La Tabla 1 resume varios cálculos de límites de células 3T3 aceptables.

Tabla 1: Cálculo de límites aceptables de células 3T3. Los valores que representan cálculos para el procedimiento del ensayo de liberación del lote "Evaluación de StrataGraft™ para ADN de ratón" limitan además los niveles históricos de ADN de ratón detectados y la detección teórica de no más de 1 equivalente de ADN celular.

Límite del procedimiento de ensayo

Histórico Teórico

Evaluación de

No más de 13,2 No más de 3,3 No más de 1 equivalente

StrataGraft™ para

equivalentes de ADN de equivalentes de ADN de de ADN de célula/0,5 µg

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crecimiento específicos del tipo celular en un cultivo sumergido, en el que dichos requisitos de crecimiento específicos del tipo celular incluyen: 1) exhibición de características morfológicas de queratinocitos humanos normales cuando se cultivan en un medio de crecimiento de queratinocitos convencional en presencia de células alimentadoras 3T3 tratadas con mitomicina-C; 2) dependencia de factor de crecimiento epidérmico para el cultivo en serie; y 3) inhibición del crecimiento por el factor de crecimiento transformante β1.

La presente descripción abarca una variedad de ensayos de identificación sistemática. Por ejemplo, el procedimiento de identificación sistemática comprende proporcionar un equivalente de piel y al menos un compuesto o producto de ensayo (por ejemplo, un producto para el cuidado de la piel, tal como una hidratante, cosmético, tinte, o fragancia; los productos pueden estar en cualquier forma, incluyendo, entre otros, cremas, lociones, líquidos y pulverizadores), aplicar el producto o el compuesto de ensayo al equivalente de piel, y analizar el efecto del producto o compuesto de prueba sobre el equivalente de piel. Una amplia variedad de ensayos se utiliza para determinar el efecto del producto o compuesto de ensayo sobre el equivalente de piel. Estos ensayos incluyen, entre otros, ensayos de citotoxicidad por MTT (Gay, The Living Skin Equivalent as an In Vitro Model for Ranking the Toxic Potential of Dermal irritants, Toxic. In vitro (1992)) y ELISA para ensayar la liberación de moduladores inflamatorios (por ejemplo, prostaglandina E2, prostaciclina, e interleucina-1-alfa) y quimioatrayentes. Los ensayos pueden ser dirigidos además a la toxicidad, potencia, o eficacia del compuesto o producto. Adicionalmente, se pueden ensayar el efecto del compuesto o producto en el crecimiento, función de barrera, o resistencia del tejido.

En particular, la presente descripción contempla el uso de los equivalentes de piel para una identificación sistemática de alto rendimiento de compuestos de bibliotecas combinatorias (por ejemplo, bibliotecas que contienen más de 104 compuestos). Las células pueden utilizarse en ensayos de segundos mensajeros que controlan la transducción de señales después de la activación de receptores de la superficie celular o las células se pueden utilizar en ensayos de genes indicadores que controlan las respuestas celulares a nivel de transcripción/traducción o las células se pueden utilizar en ensayos de proliferación celular para controlar la respuesta de crecimiento global/no crecimiento de células a estímulos externos.

En ensayos con segundos mensajeros, los equivalentes de piel se tratan con un compuesto o pluralidad de compuestos (por ejemplo, a partir de una biblioteca combinatoria) y se ensayan para la presencia o ausencia de una respuesta a un segundo mensajero. Las células (por ejemplo, células NIKS) utilizadas para crear los equivalentes de piel se transfectan con un vector de expresión que codifica un receptor de superficie celular recombinante, canal iónico, canales controlados por voltaje o alguna otra proteína de interés que participa en una cascada de señalización. Se contempla que al menos algunos de los compuestos en la biblioteca combinatoria pueden servir como agonistas, antagonistas, activadores o inhibidores de la proteína o proteínas codificadas por los vectores. También se contempla que al menos algunos de los compuestos en la biblioteca combinatoria pueden servir como agonistas, antagonistas, activadores o inhibidores de proteína que actúan aguas arriba o aguas abajo de la proteína codificada por el vector en una vía de transducción de señales.

Los ensayos con segundos mensajeros pueden medir las señales fluorescentes de moléculas indicadoras que responden a cambios intracelulares (por ejemplo, concentración de Ca2+, potencial de membrana, pH, IP3, AMPc, liberación de ácido araquidónico) debido a la estimulación de los receptores de membrana y canales iónicos (por ejemplo, canales iónicos controlados por ligandos) (Denyer y col., Drug Discov. Today 3:323-32 (1998); Gonzales y col., Drug. Discov. Today 4:431-39 (1999)). Ejemplos de moléculas indicadoras incluyen, entre otros, sistemas de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (por ejemplo, Cuo-lípidos y oxonoles, EDAN/DABCYL), indicadores sensibles a calcio (por ejemplo, Fluo-3, FURA 2, INDO 1, y FLUO3/AM, BAPTA AM), indicadores sensibles a cloruros (por ejemplo, SPQ, SPA), indicadores sensibles a potasio (por ejemplo, PBFI), indicadores sensibles a sodio (por ejemplo, SBIF), e indicadores sensibles al pH (por ejemplo, BCECF).

En general, las células que comprenden los equivalentes de piel se cargan con el indicador antes de la exposición al compuesto. Las respuestas de las células huésped al tratamiento con los compuestos se pueden detectar por medio de procedimientos conocidos en la materia, incluyendo, entre otros, microscopía de fluorescencia, microscopía confocal, citometría de flujo, dispositivos microfluídicos, sistemas FLIPR (Schroeder y Neagle, J. Biomol. Screening 1:75-80 (1996)), y sistemas de lecturas de placas. En algunas realizaciones preferentes, la respuesta (por ejemplo, aumento de la intensidad fluorescente) causada por el compuesto de actividad desconocida se compara con la respuesta generada por un agonista conocido y se expresa como el porcentaje de la respuesta máxima del agonista conocido. La respuesta máxima causada por un agonista conocido se define como una respuesta del 100 %. Del mismo modo, la respuesta máxima registrada después de la adición de un agonista a una muestra que contiene un antagonista conocido o de ensayo es inferior de forma detectable a la respuesta del 100 %.

Los equivalentes de piel obtenidos por el procedimiento de la presente invención también son útiles en ensayos de genes indicadores. Los ensayos de genes indicadores implican el uso de células huésped transfectadas con vectores que codifican un ácido nucleico que comprenden elementos de control de transcripción de un gen diana (es decir, un gen que controla la expresión y función biológica de una enfermedad diana o respuesta inflamatoria) cortados y empalmados a una secuencia codificante de un gen indicador. Por lo tanto, la activación del gen diana da lugar a la activación del producto génico indicador. Esto sirve como indicador de una respuesta, tal como respuesta inflamatoria. Por lo tanto, en algunos ejemplos, la construcción génica indicadora comprende la región reguladora 5' (por ejemplo, promotores y/o potenciadores) de un gen que se induce debido a la inflamación o irritación de la piel o

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tejido humano. En consecuencia, la presente descripción proporciona procedimientos para el cierre de heridas, incluyendo heridas causadas por quemaduras, que comprende proporcionar un equivalente de piel y un paciente que tiene una herida y tratar el paciente con el equivalente de piel en condiciones tales que se cierre la herida.

4. Terapia génica

El equivalente de piel está modificado por ingeniería genética para proporcionar un agente terapéutico a un sujeto. La presente descripción no se limita a la administración de cualquier agente terapéutico particular. De hecho, se contempla que se pueden administrar una variedad de agentes terapéuticos al sujeto, incluyendo, entre otros, enzimas, péptidos, hormonas peptídicas, otras proteínas, ARN ribosómico, ribozimas, y ARN antisentido. Estos agentes terapéuticos se pueden administrar para una variedad de fines, incluyendo, entre otros, el fin de corregir defectos genéticos. En algunos ejemplos preferentes particulares, el agente terapéutico se administra para el fin de detoxificar un paciente con un error de metabolismo hereditario innato (por ejemplo, aninoacidopatías), en el que el injerto sirve como tejido de tipo natural. Se contempla que la administración del agente terapéutico corrige el defecto. En algunos ejemplos, los queratinocitos utilizados para formar el equivalente de piel se transfectan con una construcción de ADN que codifica un agente terapéutico (por ejemplo, insulina, factor de coagulación IX, eritropoyetina, etc.) y el equivalente de piel se injerta en el sujeto. A continuación, el agente terapéutico se administra al torrente sanguíneo del paciente u otros tejidos del injerto. En ejemplos preferentes, el ácido nucleico que codifica el agente terapéutico está unido operativamente a un promotor adecuado. La presente descripción no está limitada al uso de cualquier promotor particular. De hecho, se contempla el uso de una variedad de promotores, incluyendo, entre otros, promotores inducibles, constitutivos, específicos de tejido y específicos de queratinocitos. En algunos ejemplos, el ácido nucleico que codifica el agente terapéutico se introduce directamente en los queratinocitos (es decir, por co-precipitación con fosfato de calcio o mediante la transfección con liposomas). En otros ejemplos preferentes, el ácido nucleico que codifica el agente terapéutico se proporciona como un vector y el vector se introduce en los queratinocitos por procedimientos conocidos en la materia. En algunos ejemplos, el vector es un vector episomal, tal como un plásmido. En otros ejemplos, el vector se integra en el genoma de los queratinocitos. Ejemplos de vectores que se integran incluyen, entre otros, vectores retrovirales, vectores de virus adenoasociados, y vectores transposones.

D. Uso de procedimientos de producción de otros productos sustancialmente exentos de células de capa alimentadora

La presente descripción contempla la producción de una variedad de células, estirpes celulares, o productos derivados de células que están sustancialmente exentos de células de capa alimentadora residuales. En ejemplos preferentes, las células o estirpes celulares cultivadas en capas alimentadoras de 3T3 identificadas sistemáticamente con el ensayo de ADN de ratón y el ensayo de proliferación darán lugar a células cultivadas o estirpes celulares que están sustancialmente exentas de células de capa alimentadora. Las células madre sustancialmente exentas de capas alimentadoras se recolectan. Las células madre no humanas específicas de cualquier organismo se pueden utilizar. El tipo de células madre puede ser células madre adultas (por ejemplo, células madre somáticas) o el tipo de células madre puede ser células madre embrionarias no humanas (por ejemplo, células madre totipotentes).

El procedimiento de aislamiento de células madre en el documento US 5.843.780 puede utilizarse. En tales ejemplos, el medio para el aislamiento de células madre embrionarias no humanas es "medio ES". El medio ES consiste en medio de Eagle modificado de Dulbecco al 80 % (DMEM; formulación de alto contenido en glucosa, sin piruvato, Gibco ERL), con suero bovino fetal al 20 % (SBF; Hyclone), 0,1 mM de β-mercaptoetanol (Sigma), solución madre de aminoácidos no esencial al 1 % (Gibco BRL). Preferentemente, los lotes de suero bovino fetal se compararon mediante el ensayo de eficiencia de cultivo en placa clonal de una estirpe celular ES de ratón de bajo pase (ESjt3), una estirpe celular desarrollada solo para el fin de este ensayo. Los lotes de SBF han de compararse porque se ha descubierto que los lotes varían dramáticamente en su capacidad para apoyar el crecimiento de células embrionarias, pero en cualquier otro procedimiento de ensayo, la competencia de los lotes de SBF para el apoyo de las células embrionarias funcionará como alternativa.

Las células ES de primates se aíslan en una capa confluente de fibroblastos embrionarios murinos en presencia de medio de células ES. Los fibroblastos embrionarios se obtienen preferentemente a partir de fetos de ratones CF1 no consanguíneos de 12 días de edad (Sasco), pero otras cepas se pueden utilizar como alternativa. Las placas de cultivo tisular se tratan preferentemente con gelatina al 0,1 % (tipo I; Sigma).

Para los embriones de mono rhesus, se observan diariamente monos adultos hembras rhesus (de más de cuatro años de edad) que demuestran unos ciclos ováricos normales para la evidencia de sangrado menstrual (día 1 del ciclo = el día del inicio del período). Las muestras de sangre se extraen diariamente durante la fase folicular a partir del día 8 del ciclo menstrual, y las concentraciones séricas de la hormona luteinizante se determinan mediante radioinmunoensayo. La hembra se empareja con un mono rhesus macho de fertilidad probada desde el día 9 del ciclo menstrual hasta 48 horas después del pico de la hormona luteinizante; la ovulación se considera como el día siguiente al aumento de la hormona luteinizante. Los blastocistos expandidos se recogen mediante lavado uterino no quirúrgico a los seis días después de la ovulación. Este procedimiento da como resultado habitualmente la recuperación de un promedio de 0,4 a 0,6 embriones viables por mono rhesus por mes, Seshagiri y col. Am J

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Primatol 29: 81-91, 1993.

Para los embriones de tití, los monos tití hembras adultas (mayores de dos años de edad) que demuestran ciclos ováricos regulares se mantienen en grupos familiares, con un macho fértil y hasta cinco descendientes. Los ciclos ováricos son controlados por inyección intramuscular de 0,75 g de cloprostenol, análogo de prostaglandina PGF2α (Estrumate, Mobay Corp., Shawnee, Kansas.) durante la mitad de la fase lútea tardía. Las muestras de sangre se extraen en el día 0 (inmediatamente antes de la inyección de cloprostenol), y en los días 3, 7, 9, 11, y 13. Las concentraciones de progesterona en plasma se determinan por ELISA. El día de la ovulación se considera como el día anterior a una concentración de progesterona en plasma de 10 ng/ml o más. A los ocho días después de la ovulación, los blastocistos expandidos son recuperados por un procedimiento de lavado uterino no quirúrgico, Thomson y col. "Non-surgical uterine stage preimplantation embryo collection from the common marmoset", J Med Primatol, 23: 333-336 (1994). Este procedimiento da lugar a la producción media de 1,0 embriones viables por tití por mes.

La zona pelúcida se extrae de los blastocistos mediante una breve exposición a pronasa (Sigma). Para inmunocirugía, los blastocistos están expuestos a una dilución 1:50 de antisuero de conejo anti-células de bazo de tití (por blastocistos de tití) o a una dilución 1:50 de conejo anti-mono rhesus (por blastocistos de mono rhesus) en DMEM durante 30 minutos, a continuación, se lavaron durante 5 minutos tres veces en DMEM, luego se expusieron a una dilución 1:5 de complemento de cobaya (Gibco) durante 3 minutos.

Tras dos lavados adicionales en DMEM, las células trofectodérmicas lisadas se eliminan de la masa celular interna intacta (MCI) por pipeteo suave, y la MCI se cultivó en placas en fibroblastos embrionarios inactivados de ratón

(3.000 rads de radiación gamma).

Tras 7-21 días, las masas derivadas de la MCI se eliminan de las excrecencias endodérmicas con una micropipeta con observación directa bajo un microscopio estéreo, expuestas a tripsina-EDTA al 0,05 % (Gibco) suplementadas con suero de pollo al 1 % durante 3-5 minutos y suavemente disociadas mediante pipeteado suave a través de una micropipeta pulida con llama.

Las células disociadas se volvieron a cultivar en placas en capas alimentadoras embrionarias en medio ES fresco, y se observaron para la formación de colonias. Las colonias que demuestran una morfología similar a ES se seleccionan individualmente, y se separan de nuevo como se ha descrito previamente. La morfología similar a ES se define como colonias compactas que tienen una alta relación núcleo a citoplasma y unos nucleolos prominentes. Las células ES resultantes se dividen así pues habitualmente por tripsinización breve o exposición a solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (sin calcio o magnesio y con 2 mM de EDTA) cada 1-2 semanas a medida que los cultivos se vuelven densos. Las células de pase temprano también se congelan y almacenan en nitrógeno líquido.

Las estirpes celulares pueden cariotiparse con una técnica de bandeo G convencional (tal como en el Laboratorio de Citogenética de la Universidad de Wisconsin, Laboratorio Estatal de Higiene, que proporciona servicios de cariotipo rutinarios) y se compararon con los cariotipos publicados para las especies de primates.

El aislamiento de las estirpes celulares ES de otras especies de primates seguiría un procedimiento similar, excepto que la tasa de desarrollo a blastocistos puede variar algunos días entre las especies, y la tasa de desarrollo de la MCI cultivada variará entre las especies. Por ejemplo, seis días después de la ovulación, los embriones de mono rhesus se encuentran en la etapa de blastocistos expandidos, mientras que los embriones de tití no llegan a la misma etapa hasta 7-8 días después de la ovulación. Las estirpes celulares ES de rhesus se obtuvieron por primera vez mediante la división de las células derivadas de la MCI a los 7-16 días después de la inmunocirugía; mientras que las células ES de tití se obtuvieron con la división inicial a los 7-10 días después de la inmunocirugía. Debido a que otros primates también varían su tasa de desarrollo, el momento de la recogida de embriones, y el momento de la división inicial de la MCI variarán entre las especies de primates, pero las mismas técnicas y las condiciones de cultivo permitirán el aislamiento de células ES.

La descripción contempla producir una variedad de otras células o estirpes celulares sustancialmente exentas de células de capa alimentaria, incluyendo epitelio estratificado de barrera húmeda (por ejemplo, células epiteliales superficiales, células del epitelio urinario); células epiteliales especializadas en la secreción exocrina (por ejemplo, células de las glándulas salivares, células de las glándulas mamarias, células de las glándulas sudoríparas apocrinas, células mucosas del revestimiento del estómago); células especializadas en la secreción de hormonas (por ejemplo, células secretoras de la glándula pituitaria, células secretoras del intestino y el tracto respiratorio, células secretoras de la glándula tiroides, células secretoras de la glándula adrenal, células secretoras de las gónadas); células epiteliales de absorción intestinal, glándulas exocrinas, y tracto urogenital (por ejemplo, células del borde en cepillo del intestino, células de los conductos estriados de las glándulas exocrinas, células no ciliadas de conductillo eferente); células especializadas en el metabolismo y el almacenamiento (por ejemplo, hepatocitos, células de grasa); células epiteliales que sirven principalmente como función de barrera, revisten el pulmón, intestino, glándulas exocrinas, y el tracto urogenital (por ejemplo, neumocitos tipo 1, células del conducto pancreático, células parietales del glomérulo renal); células epiteliales que revisten cavidades corporales internas cerradas (por ejemplo, células endoteliales vasculares de los vasos linfáticos y sanguíneos, células sinoviales,

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células que revisten el espacio endolinfático del oído, células "endoteliales" de la córnea); células ciliadas con función de propulsión (por ejemplo, células de las vías respiratorias, células de oviducto, revestimiento de células ependimarias de las cavidades cerebrales); células especializadas en la secreción de la matriz extracelular (por ejemplo, células ameloblastos, fibroblastos, pericitos de capilares sanguíneos, condrocitos, osteoblastos); células contráctiles (por ejemplo, células de músculo esquelético, células del músculo cardíaco, células de músculo liso, células mioepiteliales); células de la sangre y del sistema inmunitario (por ejemplo, glóbulos rojos, macrófagos, neutrófilos, linfocitos T, linfocitos B); transductores sensoriales (por ejemplo, fotorreceptores, células ciliadas internas del órgano de Corti, células de las papilas gustativas tipo II); neuronas autónomas (por ejemplo, células colinérgicas, células adrenérgicas, células peptidérgicas); células de apoyo de órganos de los sentidos y de neuronas periféricas (por ejemplo, células pilares internas, células de Hensen, células de Schwann, células gliales entéricas); neuronas y células gliales del sistema nervioso central (por ejemplo, células neuronales en general, astrocitos, oligodendrocitos); células lenticulares (por ejemplo, células epiteliales lenticulares anterior, célula fibrosa lenticular); células de pigmento (por ejemplo, melanocitos, células del epitelio pigmentario de la retina); células germinales (por ejemplo, células oogonio, ovocitos, espermatocitos, espermatogonios); células enfermeras (por ejemplo, células de folículos ováricos, células de Sertoli, células epiteliales del timo).

PARTE EXPERIMENTAL

Los siguientes ejemplos se proporcionan a efectos de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención.

En la divulgación experimental siguiente, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); µM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); µmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); µg (microgramos); ng (nanogramos); 1 o l (litros); ml (mililitros); µl (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); µm (micrómetros); nm (nanómetros); C (grados centígrados); U (unidades), mU (miliunidades); min. (minutos); s (segundos); % (por ciento); kb (kilobase); pb (par de bases); PCR (reacción en cadena de la polimerasa); ASB (albúmina de suero bovino).

Ejemplo 1

Detección de ADN específico de ratón utilizando cebadores de ratón ST051 y ST052

Este ejemplo describe la detección de ADN específico de ratón utilizando los cebadores de ratón ST051 y ST052. Se aisló ADN genómico de ratón (3T3) y células de fibroblastos dérmicos humanos normales (FDHN) para su uso como plantillas de PCR. Se diseñaron cebadores de PCR ST051 (5'-GAATTCACTATGAAAGTCAGATTAGATC-3', SEQ ID NO: 1) y ST052 (5'-GAATTCCATAACCATTACAGTTGGCCAACC-3'; SEQ ID NO: 2) para amplificar un producto de 285 pares de bases (pb) específico para ADN genómico de ratón (MacGregor, H.C. y Varley, J.M. (1988). "Working with Animal Chromosomes", 2ª ed., Wiley, Nueva York).

Las reacciones de PCR contenían ADN genómico de célula de ratón (3T3) (123 ng/reacción) o ADN genómico de célula humana (FDHN) (100 ng/reacción). Después de la desnaturalización a 95 ºC durante 4 minutos, las muestras se sometieron a lo siguiente durante 35 ciclos: desnaturalización a 94 ºC durante 1 minuto, hibridación a 50 ºC durante 1 minuto, extensión a 72 ºC durante 2 minutos. Se siguió una extensión final a 72 ºC durante 7 minutos por una retención de 4 ºC.

El producto de 285 pb se amplificó adecuadamente cuando se ensayó ADN genómico de ratón (3T3) con cebadores de ADN específico de ratón ST051 y ST052. Al mismo tiempo, no se detectó ningún producto de PCR en la muestra de ADN genómico de célula humana (FDHN) cuando se analizó con cebadores de ADN específicos de ratón.

Ejemplo 2

Detección de ADN específico de humano utilizando cebadores de PCR de control ST047 y ST035

Este ejemplo describe el uso de un segundo conjunto de cebadores (ST047 (5’-GCCCGGCCCCTCTTGTCCCC-3’; SEQ ID NO: 3) y ST035 (5’-GAGCCGGGGTCATCCGGTG-3’; SEQ ID NO: 4) para amplificar un producto específico de 500 pb de ADN genómico humano. Este ejemplo describe asimismo la evaluación sistemática y la identificación de las condiciones óptimas de la hibridación del cebador a la plantilla para conjuntos de cebadores de PCR tanto de ratón como de control.

Las reacciones de PCR contenían cualquier ADN genómico humano (Promega, Madison, WI) (0,5 μg/reacción), ADN genómico de célula de ratón (3T3) (250 pg/reacción) o adición de ADN genómico humano (Promega) (0,5 μg/reacción) + ADN genómico de célula de ratón (3T3) (250 pg/reacción). Después de la desnaturalización a 95 ºC durante 5 minutos, las muestras se sometieron a lo siguiente durante 30 ciclos: desnaturalización a 94 ºC durante 1 minuto, condiciones de hibridación que oscilan entre 50 ºC-70 ºC durante 1 minuto, extensión a 72 ºC durante 2 minutos. Se siguió una extensión final a 72 ºC durante 7 minutos por una retención de 4 ºC.

Los cebadores ST047 y ST035 sirven como un conjunto cebador de PCR de control utilizado para verificar la integridad de la plantilla de ADN genómico por su capacidad de amplificación por PCR. Estos cebadores de control

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Tabla 3: Resultados de la detección utilizando ADN de ratón aislado adicionado

Cantidad de ADN genómico de ratón adicionado en 0,5 µg de ADN genómico humano

Equivalentes celulares aproximados Resultado de PCR

250 pg

36 Detectado

125 pg

18 Detectado

62,5 pg

9 Detectado

12,5 pg

2 Detectado

6,25 pg

1 No detectado

3,125 pg

0,5 No detectado

0 (sin ADN de ratón)

0 No detectado

Ejemplo 7

Reactividad cruzada de cebadores específicos de ratón

Este ejemplo demuestra que no se detectó ADN de no ratón con cebadores específicos de ratón en muestras de no ratón.

Las plantillas de ADN genómico para las reacciones de PCR eran una de las siguientes: ADN genómico humano (Promega) (0,5 μg/reacción); ADN genómico humano (Clontech) (0,5 μg/reacción); ADN genómico de rata (Clontech) (0,5 μg/reacción); ADN genómico de rata (Stratatech) (0,5 μg/reacción); ADN genómico de ratón (Clontech) (0,5 μg/reacción); ADN genómico de célula de ratón (3T3) (0,5 μg/reacción); ADN genómico de célula de ratón (3T3) (250 pg/reacción); ADN genómico de ratón (Clontech) (250 pg/reacción); ADN genómico de STRATAGRAFT A (0,5 μg/reacción); ADN genómico de STRATAGRAFT B (0,5 μg/reacción); control negativo (sin ADN).

Después de la desnaturalización a 95 ºC durante 5 minutos, las muestras se sometieron a lo siguiente durante 30 ciclos: desnaturalización a 94 ºC durante 1 minuto, hibridación a 61 ºC durante 1 minuto, extensión a 72 ºC durante 2 minutos. Se siguió una extensión final a 72 ºC durante 7 minutos por una retención de 4 ºC.

Los cebadores específicos de ratón ST051 y ST052 demostraron la ausencia de reactividad cruzada o amplificación no específica de secuencias de ADN genómico de rata y humano. Por lo tanto, estos cebadores son específicos para secuencias de ADN genómico de ratón.

Ejemplo 8

Determinación del número óptimo de fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C por cm2 para la detección de células 3T3 proliferantes.

Este ejemplo describe los experimentos utilizados para determinar el número óptimo de fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C por cm2. Durante la producción de STRATAGRAFT, se utilizaron aproximadamente 7,5 x 106 células 3T3 tratadas con mitomicina-C inactivadas por replicación durante la iniciación de NIKS y se utilizaron aproximadamente 25 x 106 células de 3T3 tratadas con mitomicina-C inactivadas por replicación durante la expansión de NIKS. 3T3 de capas alimentadoras tratadas con mitomicina-C inactivadas por replicación se cultivaron en placas a una densidad celular que oscila entre 22.700 células/cm2 según BR14 y 27.300 células/cm2 según BR13. Para determinar el número óptimo de fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C por cm2 para la detección de células 3T3 proliferantes, se examinaron cuatro densidades celulares diferentes de 3.130 células/cm2, 7.810 células/cm2, 15.630 células/cm2 y 31.250 células/cm2 utilizando placas de 96 pocillos. Estas densidades corresponden a 1.000, 2.500, 5.000 y 10.000 fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C por pocillo (0,32 cm2/pocillo).

Para determinar qué densidad celular sería el mejor soporte de proliferación y posterior detección de cualquier fibroblasto de ratón 3T3 capaz de replicación, se combinaron células 3T3 proliferantes no tratadas (células nunca tratadas con mitomicina-C) con fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C en combinaciones específicas como se muestra en la Figura 1. Se utilizaron cinco placas de 96 pocillos, un total de 153,6 cm2 por densidad celular ensayada, cada una de estas placas de 96 pocillos contenía 25 células 3T3 proliferantes, no tratadas, diluidas en la medida en que cada pocillo tenía aproximadamente una de cada cuatro posibilidades de contener un único fibroblasto de ratón 3T3 capaz de replicación.

En este análisis también se incluyó un control tanto para la dilución apropiada de fibroblastos 3T3 competentes para

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replicación como para el nivel de proliferación de 3T3 en ausencia de fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C. A tal fin, se utilizaron cinco placas de 96 pocillos que contenían únicamente 25 células 3T3 proliferantes, no tratadas. Las células 3T3 proliferantes se diluyeron en la medida en que cada pocillo de las placas de control tenía aproximadamente una de cada cuatro posibilidades de contener un único fibroblasto de ratón 3T3 capaz de replicación.

Se mantuvieron cultivos de células 3T3M1 proliferantes, competentes para replicación, una variante resistente a la tioguanina de la línea 3T3 de fibroblastos de ratón suizo, como se ha descrito previamente (Allen Hoffman, B.L. y Rheinwald, J.G. (1994) 81 Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 7802-7806) en el medio de cultivo compuesto por el medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero fetal de ternera al 10 %. Las células 3T3 criopreservadas tratadas con mitomicina-C se prepararon de acuerdo con el protocolo de Stratatech BR10. En todos los experimentos, se eliminó el medio agotado y se reemplazó con 200 μl de medio fresco por pocillo cada semana durante la incubación. El examen microscópico para verificar una distribución celular uniforme se completó tras la primera semana de incubación. Se completó asimismo un examen riguroso para detectar cualquier evidencia de contaminación bacteriana a lo largo del curso del cultivo. El área de la superficie limitada para el crecimiento celular en el formato de placa de 96 pocillos (0,32 cm2/pocillo) facilitó la orientación durante el examen microscópico y la migración 3T3 proliferativa restringida.

Tras tres semanas de incubación, las muestras se fijaron durante 30 minutos en formalina al 10 % y se tiñeron durante la noche con una solución azul de metileno al 0,2 %. El azul de metileno tiñe compuestos celulares basófilos, principalmente ácidos nucleicos, tanto en células 3T3 competentes para replicación como en células 3T3 incompetentes para replicación (Scragg, M.A. y Ferreira, L.R. (1991) 198:1 Anal. Biochem. 80-85). Las placas teñidas se lavaron extensamente con agua para eliminar el exceso de azul de metileno y se dejaron secar al aire.

Cada pocillo teñido con azul de metileno se examinó tanto visualmente como microscópicamente para detectar cualquier evidencia de proliferación de 3T3. La tinción permite una rápida identificación de las células y ayuda al examen microscópico de la morfología celular. La morfología celular de una célula 3T3 que se prolifera activamente es muy diferente de la de una célula 3T3 tratada con mitomicina-C inactivada para replicación facilitando la distinción clara entre estos dos estados. Las células 3T3 proliferantes están asociadas a colonias y son de apariencia pequeña y fusiforme. Por el contrario, las células 3T3 tratadas con mitomicina-C inactivadas para replicación son grandes y de apariencia plana. En base a la identificación microscópica y a la clasificación por la apariencia morfológica, cada pocillo se registró individualmente como positivo o negativo para la proliferación de 3T3.

Se completaron dos réplicas del ensayo comparando la detección de la proliferación de 3T3 dentro de un fondo de cuatro densidades diferentes de fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C (1.000, 2.500, 5.000 y 10.000 células por pocillo) con la detección de proliferación de 3T3 en un fondo de control de 0 fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C por pocillo (0,32 cm2/pocillo). Al igual que se diseñó, se utilizaron cinco placas de 96 pocillos por densidad celular ensayada, cada una de estas placas de 96 pocillos contenía 25 células 3T3 proliferantes, no tratadas, diluidas en la medida en que cada pocillo tenía aproximadamente una de cada cuatro posibilidades de contener un único fibroblasto de ratón 3T3 capaz de replicación.

Para verificar que el procedimiento experimental dio como resultado una distribución celular uniforme, el número de células 3T3 proliferantes detectadas se analizó inicialmente sobre una base por placa. El número medio de pocillos positivos por placa de 96 pocillos se determinó para cada nivel de fondo ensayado de células 3T3 tratadas con mitomicina-C por pocillo (Tabla 4). El número medio de pocillos positivos por placa varió con la densidad celular, no obstante, los valores de desviación estándar para cada conjunto de placas examinadas eran notablemente consistentes. Esta consistencia indicó que los procedimientos resultaron en una distribución relativamente uniforme de fibroblastos 3T3 proliferativos, competentes para replicación que no se vieron afectados por las variables de densidad celular.

Tabla 4: Número promedio de pocillos positivos para la proliferación de 3T3 por placa de 96 pocillos paracada condición ensayada

Número de células 3T3 tratadas con mitomicina-C por pocillo (0,32 cm2)

Réplica 1 Réplica 2

Promedio

Desv. Est. Promedio Desv. Est.

0 células/pocillo (0 células/cm2)

11,4 3,3 13,8 4,4

(continuación)

Número de células 3T3 tratadas con mitomicina-C por pocillo (0,32 cm2)

Réplica 1 Réplica 2

Promedio

Desv. Est. Promedio Desv. Est.

1.000 células/pocillo (3.130 células/cm2)

17,8 3,6 21 4,1

2.500 células/pocillo (7.810 células/cm2)

20 4,3 23,8 3,3

5.000 células/pocillo (15.630 células/cm2)

19 3,2 24,2 5,2

10.000 células/pocillo (31.250 células/cm2)

15,2 3,6 20,2 2,9

Se analizaron los datos de la Tabla 4 para comparar la eficiencia de formación de colonias (EFC) de células 3T3 proliferativas cultivadas en placas en cada condición de densidad de células 3T3 tratadas con mitomicina-C (Tabla 5 5). La comparación de las eficiencias de formación de colonias en cada nivel de fondo ensayado se representa en la Figura 2. Las densidades celulares de 2.500 y 5.000 fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C por pocillo (7.810 y

15.630 células/cm2) parecen soportar la proliferación y posterior detección de fibroblastos de ratón 3T3 capaces de replicación igualmente bien y mejor que las otras tres densidades celulares ensayadas.

Tabla 5: Comparación de los valores de eficiencia de formación de colonias para cada condición ensayada.

10 Comparación del número de pocillos positivos para la proliferación de 3T3 con el número teórico de células 3T3 proliferativas añadidas a cada condición de ensayo.

Número de células 3T3 tratadas con mitomicina-C por pocillo (0,32 cm2)

Réplica 1 Réplica 2

Pocillos positivos

Total posible EFC Pocillos positivos Total posible EFC

0 células/pocillo (0 células/cm2)

57 125 46 % 69 125 55 %

1.000 células/pocillo (3.130 células/cm2)

89 125 71 % 105 125 84 %

2.500 células/pocillo (7.810 células/cm2)

100 125 80 % 119 125 95 %

5.000 células/pocillo (15.630 células/cm2)

76 100 76 % 121 125 97 %

10.000 células/pocillo (31.250 células/cm2)

76 125 61 % 101 125 81 %

Promedio EFC

Desv. Est.

0 células/pocillo (0 células/cm2)

50 % 7 %

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(continuación)

Promedio EFC

Desv. Est.

1.000 células/pocillo (3.130 células/cm2)

78 % 9 %

2.500 células/pocillo (7.810 células/cm2)

88 % 11 %

5.000 células/pocillo (15.630 células/cm2)

86 % 15 %

10.000 células/pocillo (31.250 células/cm2)

71 % 14 %

La eficiencia de formación de colonias de fibroblastos 3T3 competentes para replicación se vio afectada por la densidad celular de células 3T3 tratadas con mitomicina-C inicialmente cultivadas en placas. Para las células 3T3 competentes para replicación cultivadas en placas en ausencia de células 3T3 tratadas con mitomicina-C, se obtuvo una eficiencia de formación de colonias del 50 %. Un incremento de 1,5 veces de la eficiencia de formación de colonias se produjo a partir de células 3T3 competentes para replicación cultivadas en placas en presencia de 3.130 células 3T3 tratadas con mitomicina-C/cm2. Para 7.810 y 15.630 células 3T3 tratadas con mitomicina-C/cm2, se obtuvo un incremento de 1,7 veces de la eficiencia de formación de colonias. Se obtuvo un incremento de 1,4 veces de la eficiencia de formación de colonias para células 3T3 cultivadas en placas en presencia de 31.250 células 3T3 tratadas con mitomicina-C/cm2.

Teniendo en cuenta estos resultados, la densidad óptima de cultivo en placas de fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C por cm2 para la detección de células 3T3 proliferantes parece estar entre 7.810 y 15.630 células/cm2. En base a este hallazgo, y la preferencia para aproximar las densidades celulares utilizadas en un cultivo monocapa de células NIKS para la producción de STRATAGRAFT, se determinó que la densidad celular de fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C que se utilizan para la detección de células 3T3 proliferantes era de 1,56 X 104 células/cm2.

Ejemplo 9

Determinación de la sensibilidad de detección de la proliferación de 3T3

Este ejemplo describe cómo se determinó la sensibilidad de detección de la proliferación de células de fibroblastos 3T3. Para determinar la sensibilidad de detección de 3T3 proliferante, se completó después una experimentación adicional como se describe en la Figura 3 empleando la densidad celular óptima establecida previamente. Para esta evaluación, se sembraron un número específico de fibroblastos 3T3 proliferantes conocidos, competentes para replicación (nunca tratados con mitomicina-C) en un número específico de células 3T3 tratadas con mitomicina-C por cm2 a partir de varias preparaciones de fibroblastos 3T3 criopreservados tratados con mitomicina-C. Se incluyeron cultivos de control en este experimento para determinar el nivel de proliferación de 3T3 competente para replicación en ausencia de células 3T3 tratadas con mitomicina-C. Se cultivaron en placas los cultivos de células 3T3 tratadas con mitomicina-C únicamente para controlar los posibles niveles de fondo de la proliferación de 3T3 que surgen de la inactivación por replicación incompleta. En este estudio, se utilizaron tres lotes separados de células 3T3 criopreservadas tratadas con mitomicina-C.

En este experimento, 5.000 fibroblastos de ratón 3T3 inactivados por replicación se cultivaron en placas en cada pocillo de cinco placas de 96 pocillos, conteniendo cada una de estas placas de 96 pocillos 25 células 3T3 proliferantes, no tratadas. Las células 3T3 proliferantes se diluyeron en la medida en que cada pocillo tenía aproximadamente una de cada cuatro posibilidades de contener un único fibroblasto de ratón 3T3 competente para replicación. Los cultivos se mantuvieron durante tres semanas para permitir la proliferación de células 3T3 competentes para replicación.

Se incluyeron en este análisis cultivos para controlar el nivel de proliferación de 3T3 en ausencia de fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C. Para tal fin, se utilizaron placas de 96 pocillos que contenían 25 células 3T3 proliferantes, no tratadas. Las células 3T3 proliferantes se diluyeron en la medida en que cada pocillo de las placas de control tenía aproximadamente una de cada cuatro posibilidades de contener un único fibroblasto de ratón 3T3 competente para replicación.

5.000 fibroblastos de ratón 3T3 tratados con mitomicina-C se cultivaron en placas en cada pocillo de cinco placas de

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Tabla 8: Comparación de los valores de eficiencia de formación de colonias para cada lote ensayado.

Comparación del número de pocillos positivos para la proliferación de 3T3 (ajustados para los niveles de proliferación de 3T3 de fondo) con el número teórico de células proliferativas 3T3 añadidas a cada lote ensayado.

Identificación por lotes

Proliferación de 3T3 en presencia de células 3T3 tratadas con mitomicina-C Control de la proliferación de 3T3 en ausencia de células 3T3 tratadas con mitomicina-C

Ajustados

Pocillos positivos (ajustados) Total posible EFC Pocillos positivos (ajustados) Total posible EFC

FF-121001-SCO

89 125 71 % 19 50 38 %

FF-031102-06

113 125 90 % 21 50 42 %

FF-120301-SCO

120 125 96 % 69 125 55 %

Promedio EFC

Desv. Est. Promedio EFC Desv. Est.

86 %

13 % 45 % 9 %

Para este examen, se determinó que la eficiencia de formación de colonias para células 3T3 competentes para replicación cultivadas en placa en presencia de 1,56 x 104 células 3T3 tratadas con mitomicina-C/cm2 era del 86 % ± 13 %. Se calculó una eficiencia de formación de colonias de 45 % ± 9 % para células 3T3 competentes para replicación cultivadas en placas en ausencia de células 3T3 tratadas con mitomicina-C. Este incremento de casi 2 veces la eficiencia de formación de colonias cuando se compara la detección de células 3T3 competentes para replicación a una densidad celular de 1,56 x 104 fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C/cm2 con la de células 3T3 competentes para replicación cultivadas en ausencia de fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina-C es consistente con observaciones previas (véase la Tabla 5).

Estos números tienen en cuenta el nivel muy bajo de proliferación de 3T3 de fondo detectada en dos de los tres lotes ensayados. La proliferación de 3T3 indica que los lotes afectados no estaban completamente inactivados para replicación. Estos resultados refuerzan asimismo que un nivel muy bajo de proliferación de 3T3 (por ejemplo en el caso de una célula competente para replicación de 2,4 x 106 células examinadas) se detecta utilizando los parámetros establecidos para estos ensayos.

Para calcular la sensibilidad de detección de la proliferación de 3T3 para este conjunto de experimentos se emplearon dos valores, la eficiencia de formación de colonias en la densidad celular óptima y el número total de células examinadas. Se examinaron los valores de eficiencia de formación de colonias resultantes y se descubrió que eran 86 % ± 13 %. Por lo tanto, una única célula 3T3 competente para replicación tiene una probabilidad del 73 % al 99 % de establecer una colonia 3T3 detectable, proliferante en este entorno celular específico. El examen de 2,4 x 106 células tratadas con mitomicina-C, utilizando una probabilidad del 73 % de detección por célula proliferativa, da como resultado una sensibilidad de detección de la proliferación de 3T3 de 1 en 1,75 x 106 células.

Ejemplo 10

Establecimiento de los parámetros para el procedimiento de ensayo: detección de la proliferación en lotes de 3T3 criopreservados tratados con mitomicina-C

Este ejemplo describe los experimentos utilizados para establecer los parámetros que rodean la detección de la proliferación en lotes de 3T3 criopreservados tratados con mitomicina-C. Para eliminar un lote de células 3T3 tratadas con mitomicina-C para su uso en la producción, se ha de verificar la inactivación mitótica completa. Un nivel de "proliferación de 3T3 no detectada" (dentro de los límites de sensibilidad entendidos del ensayo) es el único criterio aceptable para este procedimiento de ensayo. Para asegurar la detección, se proporcionará tiempo adicional extendiendo el tiempo original de mantenimiento del cultivo de tres semanas a un total de cinco semanas.

El control positivo para el procedimiento de ensayo ha de incorporar células 3T3 competentes para replicación en el fondo apropiado de células tratadas con mitomicina-C. El control positivo ha de permitir asimismo niveles adecuados de detección de la proliferación de 3T3 entre tres a cinco semanas después del cultivo en placas. Por lo tanto, se empleará un control positivo de un número específico de fibroblastos 3T3 proliferativos por cultivo en el procedimiento de ensayo.

El número de fibroblastos 3T3 criopreservados tratados con mitomicina-C que han de ensayarse en el procedimiento de ensayo final para la liberación de lote se basa en el formato elegido y la sensibilidad de detección de la proliferación de 3T3. Utilizando matraces para cultivo tisular de 225 cm2 cultivados en placas en 1,56 x 104 células/cm2 para el procedimiento de ensayo, el número total de células por matraz examinado sería de 3,5 x 106

células.

Se ha establecido que una única célula 3T3 competente para replicación tiene una probabilidad del 73 % al 99 % de establecer una colonia 3T3 detectable, proliferante en este entorno celular específico. Por lo tanto, el examen de 7 x 106 células tratadas con mitomicina-C, con al menos un 73 % de probabilidad de detección por célula proliferativa, 5 da como resultado una sensibilidad de detección de la proliferación de 3T3 de 1 en 5,1 x 106 células.

El número de equivalentes de ADN celular potencialmente permisible en una dosis no es más de 1,45 x 104 equivalentes de ADN celular. Por lo tanto, el total de 5,1 x 106 células supera el número de equivalentes de ADN celular potencialmente permisible de una dosis en aproximadamente 350 veces. Además, el ensayo de 7 x 106 células proporciona un intervalo de confianza del 95 % ya que no hay células competentes para replicación en 1,7 x

10 106 células, lo que excede el número de equivalentes de ADN de célula 3T3 permisible por dosis de STRATAGRAFT en más de 117 veces.

Claims (1)

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