AT401526B - Reagenzlösung zur stabilisierung der lumineszenz bei der luciferasemessung - Google Patents

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Description

AT 401 526 B
Die Erfindung bezieht sich auf eine Reagenzlösung zur Stabilisierung der Lumineszenz bei der Luciferasemessung. Luciferasen sind Enzyme, deren natürliche Quelle Leuchtkäfer, Photobakterien etc. sind. Heute werden sie verbreitet in der Gentechnologie in der sogenannten "Reportergentechnik" eingesetzt, wobei das Luciferasegen als Indikator für die Transkription anderer Gene in den verschiedenen Testsystemen eingesetzt wird.
Die Messung von Luciferase erfolgt durch Umsetzung von Luciferin zu Oxiluciferin unter ATP-Ver-brauch, wobei das hierbei entstehende Licht mittels Photonenvervielfachern gemessen wird. Diese Reaktion läuft sehr schnell ab ("Lichtblitz" über einige Sekunden) und ist daher für größere Serienmessungen sowie für quantitative Messungen nur sehr bedingt geeignet.
Seit einigen Jahren werden auf dem Markt Reagenziensätze mit verbesserten Eigenschaften angebo-ten, wobei die Lumineszenz mit einer Halbwertszeit von ca. 5 Minuten abfällt. Aus der WO 92/044 68 ist z.B. eine Reagenzlösung bekannt, die aus einem Puffer und ATP (Adenosintriphosphat), DTT (Dithiothreit), Luciferin sowie Co A (Coenzym A) besteht. Für die Messung von großen Probenmengen, z.B. in 96-Kuppen-Mikroplatten, für die neuerdings Meßgeräte zur Verfügung stehen, ist zur praktikablen Messung eine wesenlich länger andauernde Lumineszenzerscheinung notwendig. Pro Platte werden etwa 10 Minuten Meßzeit benötigt, sodaß - bei einem im Screening üblichen Stapel von 20 Platten - ca. 3 Stunden gemessen wird. Dies wird durch die bekannten Reagenzlösungen nicht ermöglicht.
Ziel der Erfindung ist es, das Lumineszenzsignal durch chemische Zusätze zum Meßreagens so zu verändern, daß ein annähernd linearer Abfall des Lumineszenzsignals mit einer brauchbaren Halbwertszeit im Stundenbereich resultiert, wobei jedoch eine ausreichende Anfangssignalhöhe erhalten bleibt.
Dieses Ziel wird erfindungsgemäß mit einer Reagenzlösung erreicht, bei der pro 100 ml eines Puffers 110 mg ATP (Adenosintriphosphat) 2,8 mg Luciferin 385 mg DTT (Dithiothreit) 2,2 mg AMP (Adenosinmonophosphat) zugesetzt sind, wobei der Puffer aus 0,05 M HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) 0,02% EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 0,4% eines nichtionischen Reinigungmittels, beispielsweise einer Polyoxyethylenäther-Verbindung mit 2n-NaOH auf pH 7,8 gebracht, besteht.
Es werden hierbei verschiedene Zusätze kombiniert, die einen unterschiedlichen Einfluß auf die Reaktion haben. Da die Reaktion auch durch mit den zu messenden Proben eingebrachte Substanzen beeinflußt wird, muß das Reagens auf das jeweils benützte Standardverfahren abgestimmt werden.
Es wurden eine Vielzahl von Substanzen beschrieben, welche die Luciferin-Luciferase-Reaktion beeinflussen, wie z.B.: Dithiothreit, Adenosin-5'-Monophosphat, Cytidinnucleotide, Pyrophosphat, Coenzym A, EDTA. Weiters kann der Abbau bzw. die Inaktivierung der Luciferase durch endogene Enzyme bzw. andere Einflüsse erfolgen. Ebenso kann das Substrat Luciferin einem Abbau unterliegen. Dem kann ebenfalls durch Zugabe verschiedener Agenzien (Inhibitoren/Stabilisatoren wie z.B. das Luciferin-Analog Phenylbenzothia-zol) zum Reaktionsgemisch engegengewirkt werden.
Da die einzelnen Agentien unterschiedliche Charakteristika, wie Verstärkung, Dämpfung, Verzögerung, Stabilisierung etc. haben und zusätzlich ihre Wirkung sich im zeitlichen Verlauf der Reaktion in verschiedener Weise ändert (einige Beispiele hiefür sind in Fig. 1 veranschaulicht), kann durch logische Kombination solcher Agentien das Lichtsignal vielfältig manipuliert werden.
Die erfindungsgemäße Kombination von verschiedenen Agentien, welche die Luciferin-Luciferase-Reaktion so beeinflussen, daß ein annähernd gleichförmiges Lichtsignal erhalten wird, das sowohl in der Intensität als auch in der Dauer ausreichend ist, ist neu. In Fig. 2 sind die mit der erfindungsgemäßen Reagenzlösung erzielten Resultate wiedergegeben. Wie ersichtlich, wurde ein Lichtsignal mit einer Halbwertszeit von etwa 5 Stunden und guter Linearität erreicht. In diesem Beispiel wurden humane T-zellen (Jurkat) mit einem Luciferase-Vektor mit EF-Promotor transient transformiert und 48 Stunden inkubiert. Die Zellsuspension wurde unmittelbar nach Zugabe von 1 Volumen des Reagens, das gleichzeitig ein Agens zur Freisetzung der Luciferase enthielt, gemessen.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Reagenzlösung ist es möglich, die endogene Luciferase in Zellen zu messen. Weiters können durch das langandauernde und leicht kalkulierbare Signal große Meßserien bewerkstelligt werden. Dadurch wird es möglich, die Luciferase-Reportergentechnik in großen Screeningprogrammen einzusetzen. 2

Claims (2)

  1. AT 401 526 B Patentansprüche 1. Reagenzlösung zur Stabilisierung der Lumineszenz bei der Luciferasemessung, dadurch gekennzeichnet, daß pro 100 ml eines Puffers 110 mg ATP (Adenosintriphosphat) 2,8 mg Luciferin 385 mg DTT (Dithiothreit) 2,2 mg AMP (Adenosinmonophosphat) zugesetzt sind, wobei der Puffer aus 0,05 M HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N’-[2-ethansulfonsäure]) 0,02% EDTA (Ehtylendiamintetraessigsäure) 0,4% eines nichtionischen Reinigungsmittels, beispielsweise einer Polyoxyethylenäther-Verbindung mit 2n-NaOH auf pH 7,8 gebracht, besteht. Hiezu
  2. 2 Blatt Zeichnungen 3
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