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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen analytische Biochemie.
Genauer ist die vorliegende Erfindung zum Überwachen von chemischen Umwandlungen
von detektierbaren Verbindungen mit einer chemisch umwandelbaren
ersten Verbindung, die kovalent an eine elektrochemolumineszente
Verbindung gebunden ist, geeignet.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Ein
sich immer weiter ausdehnendes Gebiet von Verwendungen besteht für schnelle,
hoch spezifische, empfindliche und genaue Verfahren zum Detektieren
und Quantifizieren von chemischen, biochemischen und biologischen
Substanzen, einschließlich
Enzymen, wie sie in biologischen Proben gefunden werden können. Da
die Menge eines besonderen Analyten von Interesse wie eines Enzyms
in einer typischen biologischen Probe oft sehr klein ist, bemühen sich
analytische Biochemiker fortwährend,
die Leistungscharakteristika der Tests wie die Empfindlichkeit zu
verbessern.
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Ein
Versuch zur Verbesserung der Testempfindlichkeit bezog eine Amplifizierung
des Signals ein, das durch eine detektierbare Markierung erzeugt
wird, welche mit dem Analyten von Interesse assoziert ist. In dieser
Hinsicht sind lumineszente Markierungen von Interesse. Solche Markierungen,
die durch photolumineszente, chemolumineszente oder elektrochemolumineszenzte
Techniken zum Lumineszieren gebracht werden können, sind bekannt. „Photolumineszenz" ist der Vorgang,
wobei ein Material, anschließend
an die Absorption von Licht durch dieses Material, luminesziert
(alternativ als elektromagnetische Strahlung oder emr bezeichnet).
Fluoreszenz und Phosphoreszenz sind zwei unterschiedliche Typen
von Photolumineszenz. „Chemolumineszente" Vorgänge verursachen
die Erzeugung der lumineszenten Spezies durch eine chemische Reaktion. „Elektrochemolumineszenz" ist der Vorgang,
wobei eine Spezies durch die Exposition dieser Spezies an elektrochemische
Energie in einer geeigneten umgebenden chemischen Umgebung luminesziert.
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Das
Signal bei jeder dieser drei lumineszenten Techniken kann durch
die Verwendung von bekannten Instrumenten (z.B. eines Photomultipliers
oder pmt), die auf Photonenbasis auf ein einzelnes Photon reagieren können, sehr
wirksam amplifiziert (d.h. hohe Zunahme) werden. Jedoch unterscheidet
sich die Weise, in welcher die lumineszenten Spezies erzeugt werden,
stark unter und zwischen photolumineszenten, chemolumineszenten
und elektrochemolumineszenten Vorgängen. Darüber hinaus sind diese mechanistischen
Unterschiede für
die wesentlichen Vorteile als ein bioanalytisches Werkzeug, die
Elektrochemolumineszenz [hier nachstehend manchmal „ECL"] gegenüber Photolumineszenz
und Chemolumineszenz aufweist, verantwortlich. Einige der Vorteile,
die mit Elektrochemolumineszenz möglich sind, schließen ein:
(1) einfachere, günstigere
instrumentelle Ausrüstung;
(2) stabile, nicht gefährliche
Markierungen; und (3) erhöhte
Leistungscharakteristika des Tests wie niedrigere Nachweisgrenzen,
höhere
Signal-Rausch-Verhältnisse
und niedrigere Hintergrundlevels.
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Wie
vorstehend angegeben, weist im Zusammenhang mit bioanalytischen
Chemiemesstechniken Elektrochemolumineszenz wesentliche Vorteile
gegenüber
von sowohl Photolumineszenz als auch Chemolumineszenz auf. Darüber hinaus
wurden bestimmte Verwendungen von ECL entwickelt und es wurde darüber in der
Literatur berichtet. U.S. Patent Nummern 5,147,806; 5,068,808; 5,061,445;
5,296,191; 5,247,243; 5,221,605; 5,238,808 und 5,310,687, deren
Offenbarungen bestimmte Verfahren, Einrichtungen, chemische Einheiten,
Erfindungen und in Zusammenhang stehende Vorteile von ECL im Detail
erläutern.
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Keines
der vorstehend angegeben Dokumente offenbart weder die vorliegende
Erfindung noch schlägt
es sie vor. Zusätzlich
bietet die Praxis der Erfindung wesentliche Vorteile für den bioanalytischen
Fachchemiker im Vergleich zu den elektrochemolumineszenten Techniken,
die in diesen Dokumenten gelehrt werden. Demgemäß erfüllt die Erfindung den bisher
nicht erfüllten
Bedarf des Fachmanns in Bezug auf das Erlangen von verbesserten
Leistungscharakteristika der Tests (z.B. Signalleistung, Nachweisgrenzen,
Empfindlichkeit, usw.) für
die gemessenen Spezies und stellt einen patentierbaren Fortschritt
auf dem Gebiet dar.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, Verfahren und Kits,
die zum elektrochemolumineszenten Überwachen von Verbindungen
geeignet sind. Ein kritisches Merkmal der Erfindung, welches diese Verbindungen,
Verfahren und Kits gemeinsam haben, ist detektierbare Verbindungen,
die eine chemisch umwandelbare erste Verbindung umfassen, die kovalent
an eine elektrochemolumineszente Verbindung gebunden ist.
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In
Kürze,
diese detektierbaren Verbindungen und ihre Verwendungen stellen
aufgrund ihrer Eigenschaften einen patentierbaren Fortschritt auf
dem Gebiet von elektrochemolumineszenten Messungen dar. Diese Eigenschaften
schließen
die folgenden ein:
- 1. Sie sind elektrochemolumineszent;
- 2. Sie können
zum Überwachen
von chemisch umwandelbaren ersten Verbindungen, die kovalent an
elektrochemolumineszente Verbindungen gebunden sind, verwendet werden;
und
- 3. Das vorstehend beschriebene Überwachen kann ausgeweitet
werden, um ein integraler Schritt bei der Durchführung von Tests für getrennte,
nicht-konjugierte Verbindungen in Probenlösungen (z.B. Enzyme) zu werden.
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Die
vorliegenden Erfindungen der Anmelder werden unmittelbar nachstehend
in den folgenden nicht ausschließenden, nicht einschränkenden
Aufgaben der Erfindung dargelegt.
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Eine
erste Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von elektrochemolumineszenten
detektierbaren Verbindungen, die eine chemisch umwandelbare erste
Verbindung umfassen, welche kovalent an eine elektrochemolumineszente
Verbindung gebunden ist.
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Eine
zweite Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von elektrochemolumineszenten
Verfahren zum Überwachen
von chemischen Umwandlungen der ersten Verbindung. Im Einklang mit
dieser zweiten Aufgabe werden Tests bereitgestellt, worin die chemische
Umwandlung der ersten Verbindung ein integraler Schritt bei der
Durchführung
dieses Tests ist.
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Eine
dritte Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Kits, die
zur praktischen Ausführung
der Erfindung und zur Implementierung der vorstehend beschriebenen
ersten und zweiten Aufgaben der Erfindung geeignet sind. Im Einklang
mit dieser dritten Aufgabe werden Kits bereitgestellt, worin mindestens
ein Satz von Lösungen,
die die detektierbaren Verbindungen enthalten, eingeschlossen ist.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
einen vorgeschlagenen ECL-Mechanismus, der Reaktionsschritte in
Zusammenhang mit der Verwendung von TPA als ein nicht-konjugiertes
Reduktionsmittel zeigt.
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2 zeigt
einen vorgeschlagenen ECL-Mechanismus, der Reaktionsschritte in
Zusammenhang mit der Verwendung von Betalactam als ein nicht-konjugiertes
Reduktionsmittel zeigt.
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3 (a
bis c) zeigt einen vorgeschlagenen ECL-Mechanismus, der Reaktionsschritte
in Zusammenhang mit der Verwendung einer chemisch umwandelbaren
ersten Verbindung als ein konjugiertes Reduktionsmittel zeigt.
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4 zeigt
die Synthese von Ru-AMP.
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5 zeigt
das Massenspektrum des Ammoniumhexafluorphosphatsalzes von Ru-AMP.
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6 zeigt
das Protonen-NMR-Spektrum des Ammoniumhexafluorphosphatsalzes von
Ru-AMP.
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7 zeigt
die Synthese von Ru-APA.
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8 zeigt
die Strukturen von 5 speziellen Betalactamen.
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9 zeigt
die Hydrolyse von Ru-AMP (linke Seite) und Ru-APA (rechte Seite)
durch NaOH oder durch Betalactamaseenzym.
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10 zeigt
den Vergleich von gemessener ECL für eine Serie von unterschiedlichen
Proben.
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11 zeigt
den Vergleich von gemessener ECL für eine Serie von unterschiedlichen
Proben.
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12 zeigt
die Wirkung der Konzentration von nicht hydrolysiertem (volle Kreise)
und hydrolysiertem (leere Kreise) Ru-AMP auf die gemessene ECL.
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13 zeigt
den Vergleich von gemessener ECL für eine Serie von unterschiedlichen
Proben.
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14 zeigt
die Wirkung der Konzentration von nicht hydrolysierter (volle Kreise)
und hydrolysierter (leere Kreise) Ru-APA auf die gemessene ECL.
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15 zeigt
den Vergleich von gemessener ECL für eine Serie von unterschiedlichen
Proben.
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16 zeigt
einen vorgeschlagenen ECL-Mechanismus, der Reaktionsschritte in
Zusammenhang mit der NADH-geförderten
ECL von Ru(bpy)3 +2 zeigt.
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17 zeigt
die Synthese von Ru-NAD.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft detektierbare Verbindungen, die (A)
eine chemisch umwandelbare erste Verbindung umfassen, welche (B)
kovalent gebunden ist an (C) eine elektrochemolumineszente Verbindung.
Die herausragenden Merkmale von jedem dieser drei Anteile [(A),
(B) und (C)] der detektierbaren Verbindungen werden einzeln nachstehend
beschrieben. Verwendungen der detektierbaren Verbindungen erscheinen
bei (D), während
spezielle Beispiele der vorliegenden Erfindung bei (E) erscheinen.
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(A) Die chemisch umwandelbaren
ersten Verbindungen.
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Die
Ausdrucke „chemisch
umwandelbare erste Verbindung(en)" (hier nachstehend „CTFC") und „elektrochemolumineszente
Verbindung(en)" (hier
nachstehend „EC") betreffen jeweils
die entsprechende Verbindung, unabhängig von bestimmten kleineren
Variationen dieser Verbindung. Der Fachmann wird verstehen, welche
kleinere Variation, wenn eine vorhanden ist, bei einer bestimmten
Verwendung von entweder CTFC oder EC in ihrem Zusammenhang Verwendung
findet. Die folgenden Erklärungen
sind beim Verständnis
dieses Zusammenhangs hilfreich.
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Der
Ausdruck CTFC umfasst die folgenden kleineren Variationen: (i) bestimmte Änderungen
beim formalen Redoxstatus, die durch Reduktions- oder Oxidationsreaktionen
verursacht werden, und bestimmte chemische Änderungen an der CTFC, die
die kovalente Verknüpfung
zwischen ihr und der EC nicht zerstören (z.B. der Ausstoß von H+1 durch die CTFC); und (ii) bestimmte chemische
Umwandlungen (z.B. die Hydrolyse der CTFC), die die messbare Lumineszenz
der detektierbaren Verbindung ändern,
im Vergleich zur messbaren Lumineszenz bevor eine von solchen chemischen
Umwandlungen stattgefunden hat.
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Beim
Vergleichen der messbaren Lumineszenz der detektierbaren Verbindung
vor und nach einer solchen chemischen Umwandlung sind mehrere Kombinationen
möglich,
wie detailliert in der Aufstellung nachstehend angegeben wird.
| messbare
Lumineszenz vorher | messbare
Lumineszenz nachher |
| nein | ja
(ein Anstieg ausgehend von null) |
| ja | nein
(ein Abfall auf null) |
| ja | ja
(ein Anstieg ausgehend nicht von null) |
| ja | ja
(ein Abfall ausgehend nicht von null) |
| ja | ja
(keine Änderung)
UNWIRKSAM |
| nein | nein
UNWIRKSAM |
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Wie
in dieser Aufstellung gezeigt, wird die messbare Lumineszenz der
detektierbaren Verbindung durch die chemische Umwandlung der CTFC
geändert;
d.h. die gemessene Lumineszenz vor und nach der chemischen Umwandlung
unterscheiden sich voneinander.
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Jedoch
muss etwas messbare Lumineszenz entweder vor oder nach, oder sowohl
vor und nach einer solchen chemischen Umwandlung vorhanden sein.
Folglich stellen der fünfte
und sechste Eintrag in der vorstehenden Aufstellung keine Verbindungen
dar, die von der vorliegenden Erfindung umfasst werden, während die
ersten vier Einträge
Verbindungen darstellen, die durch die vorliegende Erfindung umfasst
werden.
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3 (a
bis c) zeigt einen vorgeschlagenen ECL-Mechanismus, der Reaktionsschritte
in Zusammenhang mit der Verwendung einer CTFC als ein konjugiertes
Reduktionsmittel, die kovalent an eine EC gebunden ist, zeigt. Genauer
wird die EC durch das Ruthenium(II)-trisbipyridylkation (hier nachstehend „Ru(bpy)3 +2") überall in 3 (a
bis c) beispielhaft dargestellt. 3 (a bis
c) veranschaulicht in Betracht gezogene kleinere Variationen in
diesen zwei Verbindungen (d.h. in einer CTFC und in einer EC).
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3(a) zeigt den postulierten ECL-Mechanismus
für eine
detektierbare Verbindung, die eine CTFC umfasst, welche kovalent
an eine EC gebunden ist. Die Aufstellung nachstehend erklärt die gezeigten
Umsetzungen zusätzlich.
| Symbol | Definition |
| CTFC | elektrochemisch
nicht veränderte
CTFC (Ausgangsverbindung) |
| CTFC*+1 | Radikal,
elektrochemisch oxidierte CTFC |
| CTFC*(-H+1) | Radikal,
elektrochemisch neutrale CTFC, gebildet durch H+1-abspaltendes CTFC+1 und befähigt zum Wirken als ein Reduktionsmittel
mit hoher Energie in einer Weise, die ähnlich zu TPA ist |
| CTFC(-H+1, -e–1) | elektrochemisch
neutrale, nicht radikalische CTFC, gebildet durch CTFC*(-H+1), das intramolekular ein Elektron (e–1)
an die kovalent gebundene EC abgibt |
| Ru(bpy)3 +2 | nicht
angeregte EC vor der elektrochemischen Oxidation |
| Ru(bpy)3+3 | nicht
angeregte EC nach der elektrochemischen Oxidation |
| *Ru(bpy)3 +2 | angeregte
EC, nachdem sie intramolekular durch die CTFC*(-H+1) reduziert
worden ist |
| Ru(bpy)3 +2 | nicht
angeregte, regenerierte EC, gebildet durch die Emission von Licht
durch die angeregte EC |
| hv | Licht,
das durch die angeregte EC emittiert wird |
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3(b) zeigt, parallel zu 3(a),
alle analogen Umsetzungen zu jenen von 3(a) mit
der Ausnahme, dass das Symbol yCTFC überall verwendet
wird, um die resultierende chemisch umgewandelte yCTFC darzustellen,
die durch die Wechselwirkung zwischen einer CTFC und einer zweiten
Verbindung (hier nachstehend „SC") hergestellt wird.
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3(c) zeigt die schematische Veranschaulichung
der Wechselwirkung zwischen einer CTFC mit einer SC, wobei die resultierende yCTFC gebildet wird.
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Die
detektierbare Verbindung, die in 3(a),
(b), (c) gezeigt wird, stellt eine Verbindung der vorliegenden Erfindung
dar, die zur Erzeugung von messbarer Lumineszenz sowohl vor als
auch nach der chemischen Umwandlung der CTFC in der Lage ist. Folglich
stellt diese Verbindung die dritte und vierte mögliche Kombination der messbaren
Lumineszenz beispielhaft dar, die in der vorstehend erörterten
Aufstellung enthalten sind. Die gezeigten Umsetzungen stehen im
Einklang mit den postulierten Reaktionsmechanismen, die in messbarer
Lumineszenz, sowohl bevor als auch nachdem die CTFC chemisch umgewandelt
wurde, gipfeln. Für
Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die zum ersten und zweiten
Eintrag der vorstehend erörterten Aufstellung
gehören
(d.h. für
jene Verbindung, die nur eine messbare Lumineszenz entweder vor
oder (ausschließlich)
nach der chemischen Umwandlung der CTFC erzeugt), sind nur die Reaktionsmechanismen
von entweder 3(a) oder (ausschließlich) 3(b) für
jede besondere Verbindung repräsentativ.
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In
Bezug auf die kleineren Variationen von (i) werden sowohl elektrochemische
Redoxreaktionen als auch nicht elektrochemische Redoxreaktionen
umfasst. Zudem sind solche Änderungen
integral für
den und stehen in Zusammenhang mit dem postulierten elektrochemolumineszenten
Mechanismus, einschließlich
(a) Schritte, die zur Bildung eines Reduktionsmittels mit hoher
Energie als eine Form der CTFC führen;
und (b) Schritte, die zur tatsächlichen
Lumineszenz durch die EC führen.
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In
Bezug auf die kleineren Variationen von (ii) werden chemische Umwandlungen
umfasst, die die intramolekulare Elektronenabgabefähigkeit
der CTFC beeinflussen, wenn sie als ein Reduktionsmittel mit hoher Energie
in Elektrochemolumineszenzmechanismen wirkt. Die Hydrolyse einer
CTFC/Substrat durch entweder NaOH oder ein Enzym ist ein Beispiel
einer solchen chemischen Umwandlung.
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Ein
kritisches Merkmal der CTFC ist, dass sie kovalent an die EC bei
allen postulierten Umsetzungen gebunden bleibt. Folglich gilt es
als selbstverständlich,
dass die vorstehend erörterten Änderungen
in und an der CTFC speziell Änderungen
ausschließen,
die die kovalente Verknüpfung
der CTFC zu der EC zerstören brechen
würden.
Es gilt auch als selbstverständlich,
dass die Änderungen
in und an der CTFC die intramolekulare Elektronenabgabefähigkeit
der CTFC verändern,
so dass sich die messbare Lumineszenz vor und nach jedweden solchen Änderungen
unterscheidet. Die CTFC wird so gewählt, dass eine messbare Lumineszenz entweder
vor oder (ausschließlich)
nach oder sowohl vor als auch nach jedweden solchen Änderungen
vorhanden ist.
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Wenn
man auf die Erklärung
des Ausdrucks CTFC und der kleineren Variationen, die damit umfasst werden,
zurückkehrt,
ist der Umfang dieser Variationen für den Fachmann klar.
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Die
CTFC muss zur Teilnahme an den ECL-Mechanismen, die die EC zum Lumineszieren
bringen, in der Lage sein. Im Speziellen muss die CTFC als ein Reduktionsmittel
mit hoher Energie fungieren, das zur intramolekularen Bereitstellung
eines Elektrons bei der EC befähigt
ist, so dass die EC in einen angeregten (d.h. zur Emission befähigten)
Zustand reduziert wird. Geeignete Reduktionsmittel mit hoher Energie
zur Bildung des angeregten Zustandes von EC weisen oft ein ungepaartes
Elektron auf und sind als Radikale bekannt. 1 veranschaulicht
einen vorgeschlagenen ECL-Mechanismus, der TPA als ein nicht-konjugiertes Reduktionsmittel
mit hoher Energie verwendet. Dieser Mechanismus erzeugt das tatsächliche
Reduktionsmittel mit hoher Energie in situ, anschließend an
die anfängliche
elektrochemische Oxidation (Auslösen)
des TPA-Vorläufers.
Geeignete potentielle Verbindungen für die CTFC der vorliegenden
Erfindung sind dem Fachmann basierend auf der Offenbarung hierin
bekannt.
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Für die Anmelder
ist es nicht erforderlich den theoretischen Hintergrund, der das
beobachtete Verhalten der detektierbaren Verbindungen erklärt, zu verstehen.
Obwohl es nicht gewünscht
ist, an irgendeine besondere wissenschaftliche Erklärung für diese
beobachteten Eigenschaften gebunden zu sein, postulieren die Anmelder
die folgenden Erklärungen
(I) und (II).
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- (I.) Die Fähigkeit
der kovalent gebundenen CTFC als ein Reduktionsmittel mit hoher
Energie durch intramolekulares Abgeben eines Elektrons an die EC
zu wirken, variiert gemäß der Tatsache,
ob die CTFC eine geeignete chemische Umwandlung durchlaufen oder
noch nicht durchlaufen hat. Diese Abweichung kann abhängig von
der besonderen einbezogenen CTFC die gemessene Lumineszenz bei jeder
der vier vorstehend erörterten
Kombinationen entweder erhöhen
oder erniedrigen. Die chemische Umwandlung in einer CTFC, die von
der Wechselwirkung mit einer SC resultiert, scheint diese Abweichung
bei der intramolekularen Elektronenabgabefähigkeit wegen der strukturellen Änderungen
in der CTFC zu verursachen, was sich auswirken könnte auf (i) den Weg, den das
reduzierende Elektron zu durchlaufen hat; (ii) die Fähigkeit des
reduzierenden Elektrons, das Wandern durch einen solchen Weg zu
beginnen; oder (iii) Überlegungen über die
stereochemische/räumliche
Orientierung.
- (II.) Die Fähigkeit
der kovalent gebundenen CTFC, durch intramolekulares Abgeben eines
Elektrons an die EC als ein Reduktionsmittel zu wirken, ist größer im Vergleich
zu der Fähigkeit
der selben (nicht-konjugierten) CTFC intermolekular ein Elektron
an die EC abzugeben. Dementsprechend ist die gemessene Lumineszenz
für die
detektierbaren Verbindungen der vorliegenden Erfindung größer, im
Vergleich mit der gemessenen Lumineszenz der elektrochemolumineszenten
Verbindungen, wobei das Reduktionsmittel mit hoher Energie nicht
kovalent an die elektrochemolumineszente Verbindung gebunden ist.
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Obwohl
nicht-konjugierte Reduktionsmittel mit hoher Energie nicht der Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind, veranschaulichen sie sehr schön die Wichtigkeit
der mechanistischen Unterschiede. Bestimmte elektrochemolumineszente
Techniken haben sich jedoch auf die Verwendung von solchen nicht-konjugierten
Reduktionsmitteln mit hoher Energie fokussiert. Die 1 und 2 veranschaulichen
vorgeschlagene elektrochemolumineszente Mechanismen mit solchen
nicht-konjugierten Reduktionsmitteln. Speziell 1 zeigt
elektrochemolumineszente Umsetzungen, die Tri-n-propylamin (hier nachstehend „TPA") als ein solches Reduktionsmittel
verwenden, während 2 in ähnlicher
Weise diese Umsetzungen mit Betalactam als das Reduktionsmittel
zeigt. Der postulierte Elektrochemolumineszenzmechanismus, der in 1 gezeigt
ist und nicht-konjugiertes
TPA und Ru(bpy)3 +2 verwendet,
wurde früher
in der Literatur berichtet. Die postulierten Elektrochemolumineszenzmechanismen
für Betalactame
(nicht-konjugiert), die in 2 gezeigt
sind [wie vorstehend angegeben, ist die Verwendung von Betalactamen
als nicht-konjugierte Reduktionsmittel mit hoher Energie in Elektrochemolumineszenztechniken
der Gegenstand einer auch anhängigen
und gemeinsam angemeldeten Patentanmeldung in den Vereinigten Staaten],
und für
die konjugierten Reduktionsmittel mit hoher Energie der vorliegenden
Erfindung sind teilweise abgeleitet von und man nimmt an, dass sie
im Einklang stehen mit der mechanistischen Erklärung für die TPA-induzierte Elektrochemolumineszenz,
die in 1 gezeigt ist.
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Die
Anmelder gehen als Theorie, warum zum Beispiel Betalactam als ein
nicht-konjugiertes Reduktionsmittel weniger Elektrochemolumineszenz
erzeugt als Betalactam als ein konjugiertes Reduktionsmittel (d.h.
als ein CTFC), von der folgenden Erklärung aus. Das nicht-konjugierte
Betalactam muss zuerst durch eine Lösung diffundieren, um ausreichend
nahe an die EC zu kommen und dann intermolekular ein Elektron daran
abzugeben. Darüber
hinaus kann sich während
diesem Diffusionsvorgang das nicht-konjugierte Betalactam mit irgendeiner
verfügbaren
Spezies (verschieden von der EC) umsetzen, da es eine sehr reaktive Radikalspezies
ist. In direktem Gegensatz muss das CTFC nicht durch die Lösung als
eine freie Spezies diffundieren. Die CTFC muss nur intramolekular
ein Elektron an die kovalent gebundene EC abgeben.
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Die
vorstehende Analyse lehrt Eigenschaften der CTFC, die ausreichend
detailliert sind, um einen Fachmann zu befähigen, die vorliegende Erfindung
in die Praxis umzusetzen. Um das vorstehend Gelehrte zu erweitern,
stellen die Anmelder später
Beispiele unter Verwendung von besonders identifizierten Verbindungen als
die CTFC bereit. Jedoch ist die Erfindung der Anmelder nicht auf
irgendwelche speziellen Verbindungen eingeschränkt; vielmehr ist die Erfindung
der Anmelder nur auf eine geeignete CTFC, wie durch das Vorstehende
gelehrt, eingeschränkt.
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(B) Die kovalente Verknüpfung.
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Die
kovalente Verknüpfung
umfasst eine Linkergruppe, die einen der Chelatliganden der EC an
die CTFC bindet. Folglich endet das nahe Ende der Linkergruppe mit
und erstreckt sich in eine kovalente Bindung zwischen einem Atom
der Linkergruppe und einem Atom von einem der Chelatliganden der
EC, während
das ferne Ende der Linkergruppe endet mit und sich erstreckt in
eine kovalente Bindung zwischen einem Atom der Linkergruppe und
einem Atom der CTFC.
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Diese
Linkergruppe muss die folgenden Eigenschaften aufweisen, um sicher
zu stellen, dass die detektierbaren Verbindungen der Anmelder wirksam
sind. Wie nachstehend detailliert beschrieben, werden diese Eigenschaften
in zwei Hauptkategorien eingeteilt; nämlich nicht beeinflussend und
steigernd.
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Die
nicht beeinflussenden Eigenschaften sind Eigenschaften, die die
Linkergruppe aufweisen muss, da ansonsten ihre Anwesenheit die Wirksamkeit
der Erfindung beeinflussen würde.
Speziell darf die Linkergruppe während
der in Betracht gezogenen praktischen Durchführung der Erfindung nicht:
(i) die elektrochemischen Umsetzungen verhindern; (ii) die Wechselwirkungen
zwischen der CTFC und der SC verhindern; (iii) den gesamten Elektrochemolumineszenzmechanismus
verhindern; und (iv) selbst durch die notwendigen Umsetzungen der
Erfindung zerstört
werden. Zum Beispiel würde
eine Linkergruppe, die eine elektrochemisch oxidierbare Spezies
mit einem formalen Oxidationspotential von nahe dem des zentralen
Metallkations der EC enthält,
nicht als eine wirksame Linkergruppe dienen.
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Die
steigernden Eigenschaften der Linkergruppe sind jene Eigenschaften,
die sich speziell auf die Fähigkeit
der CTFC, intramolekular ein Elektron auf das Zentralmetallkation
der EC zu übertragen,
beziehen. Diese steigernden Eigenschaften schließen die Länge der Linkergruppe und die
Natur der Bindungen innerhalb einer solchen Länge ein. Zuerst muss die Länge der
dazwischen liegenden Linkergruppe zwischen der CTFC und der EC (i)
ermöglichen
und erlauben, dass die geeignete intramolekulare Elektronenübertragung
stattfindet; und (ii) darf das Stattfinden von jedweder notwendigen
Umsetzung aufgrund von sterischen oder anderen Erwägungen nicht
verhindern.
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Der
Ausdruck „intramolekulare" Übertragung eines Elektrons
von der CTFC auf die EC umfasst sowohl die Übertragung durch Bindungen
als auch durch den Raum. Solche „intramolekularen" Übertragungen sind jedoch auf Übertragungen
zwischen einer abgebenden Verbindung (d.h. der CTFC) und einer entsprechenden aufnehmenden
Verbindung (d.h. der EC) eingeschränkt, welche kovalent durch
die Linkergruppe miteinander gebunden sind. Der kovalente Verknüpfungsanteil
der detektierbaren Verbindungen muss mindestens einen dieser zwei
Typen von intramolekularer Übertragung
ermöglichen
und erlauben.
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Für eine intramolekulare Übertragung
durch Bindungen muss die Linkergruppe ausreichend delokalisierte,
leitende Elektronen bereitstellen (z.B. konjugierte π-Systeme),
um dem Elektron zu ermöglichen,
durch die Bindungen der Linkergruppe zu wandern, um dann das Zentralmetallkation
der EC zu erreichen.
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Für eine intramolekulare Übertragung
durch den Raum muss die Linkergruppe die CTFC zu einer Annährung in
einer relativ großen
Nähe an
das Zentralmetallkation der EC befähigen. Die Linkergruppe sollte
lange genug und stereochemisch flexibel genug sein, so dass die
CTFC, die an das ferne Ende der Linkergruppe angefügt ist,
zurück
zum Metallkation schwingen kann und dann das Elektron intramolekular
durch den Raum übertragen
kann, wobei sich dann die CTFC und die EC trennen. Eine zusätzliche
Einschränkung
für die
geeignete Länge
der Linkergruppe ist, dass sie nicht so lange sein sollte, dass
die Häufigkeit
des beschriebenen Umherschwingens seine Wirkung (wobei man annimmt,
dass die Wirkung für
eine intramolekulare Übertragung
durch den Raum notwendig ist) wesentlich erniedrigt. Im Falle einer übermäßig langen
Linkergruppe würde
der Umfang an erzeugter Lumineszenz erniedrigt.
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Zum
Beispiel wäre
eine Linkergruppe, die nicht ausreichend lange/flexibel ist, um
eine intramolekulare Übertragung
durch den Raum zu ermöglichen,
und nur gesättigte
Bindungen ohne irgendwelche delokalisierten Elektronen (z.B. Alkylketten)
enthält,
keine wirksame Linkergruppe.
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Es
gibt mehrere Vorteile, die die Linkergruppe den detektierbaren Verbindungen
im Vergleich zu den elektrochemolumineszenten Verbindungen, die
mit nicht-konjugierten Reduktionsmitteln mit hoher Energie verwendet
werden, verleiht. Die detektierbaren Verbindungen der vorliegenden
Erfindung vermeiden die Verwendung von jedweder Diffusion von freien
Spezies durch Lösungen.
Mögliche
Vorteile schließen
eine schnellere Erzeugung der angeregten, lumineszenten Form der
EC und höhere
Signale ein, was in Zusammenhang mit der wirksameren intramolekularen Übertragung
der vorliegenden Erfindung der Anmelder steht, im Vergleich zur
intermolekularen Übertragung,
die bei nicht-konjugierten
Reduktionsmitteln mit hoher Energie verwendet wird.
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Diese
Verknüpfung
stellt auch sicher, dass das Verhältnis der CTFC und der EC eins
zu eins ist. Dieses Verhältnis
ist ungleich dem, das mit elektrochemolumineszenten Techniken in
Zusammenhang steht, die TPA, nicht-konjugierte Betalactame als das
Reduktionsmittel mit hoher Energie verwenden. Wegen diesem Verhältnis zwischen
den zwei Anteilen der detektierbaren Verbindungen der vorliegenden
Erfindung sind die Anmelder in der Lage, qualitativ und quantitativ
chemische Umwandlungen in der CTFC zu überwachen. Ungleich bekannten
elektrochemolumineszenten Techniken ist die überwachte Verbindung gleichzeitig
(i) kovalent an die EC gebunden und (ii) in der Lage intramolekular
ein Elektron an die EC abzugeben.
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Geeignete
potentielle Gruppen, die als Linkergruppe in der vorliegenden Erfindung
getestet werden, sind für
den Fachmann verfügbar.
Insbesondere offenbart Bd. 136, Methods in Enzymology, K. Mosbach,
Herausg., S. 3–30,
Academic Press, NY (1987) eine Serie von „Abstandshaltermolekülen" für immobilisierte
aktive Coenzyme, einschließlich
NAD und ATP. Die Abstandshaltermoleküle dieses Artikels sind Beispiele
für solche
geeigneten potentiellen Gruppen.
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Die
vorstehende Analyse in Verbindung mit der Offenbarung hierin lehrt
die Eigenschaften der kovalenten Verknüpfung ausreichend detailliert,
um dem Fachmann zu befähigen,
die vorliegende Erfindung in die Praxis umzusetzen. Folglich kann
der Fachmann geeignete potentielle Gruppen als Linkergruppen auswählen und
durch Routineexperimentieren jene bestimmen, die funktionieren oder
nicht. Um das vorstehend Gelehrte zu erweitern, stellen die Anmelder
später
Beispiele unter Verwendung von speziellen detektierbaren Verbindungen
mit identifizierten Linkergruppen bereit. Jedoch ist die Erfindung
der Anmelder nicht auf irgendeine solche als beispielhaft angegebene
Linkergruppe eingeschränkt.
Vielmehr ist die vorliegende Erfindung nur auf kovalente Verknüpfungen,
wie sie hier dem Fachmann gelehrt wurden, eingeschränkt.
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(C) Die elektrochemolumineszenten
Verbindungen.
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Der
dritte und letzte Anteil der detektierbaren Verbindungen sind EC.
Diese und ihre Verwendungen in bestimmten Zusammenhängen wurden
in der Literatur berichtet. Siehe zum Beispiel die veröffentlichten
U.S. Patente, die vorstehend aufgeführt sind. Die Eigenschaften
und Identitäten
von solchen bekannten EC sind dem Fachmann bekannt und müssen hier
nicht im Detail wiederholt werden. Folglich ist der Ausdruck elektrochemolumineszente
Verbindung ein Fachausdruck, dessen Maß und Ziel der Fachmann kennt.
Nicht einschränkende,
nicht ausschließende
Beispiele von besonderen detektierbaren Verbindungen (einschließlich dem
EC-Anteil) und ihre Verwendungen werden später bereitgestellt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft jedoch nicht EC selbst, noch betrifft
sie irgendeine von ihren bekannten Verwendungen. Die Erfindung betrifft
eine neue und nicht nahe liegende Verwendung von EC; nämlich ihre Verwendung
in detektierbaren Verbindungen, die eine CTFC umfassen, welche kovalent
an EC gebunden ist. Demgemäß kann der
Fachmann die vorliegende Erfindung gemäß der Offenbarung hierin in
Kombination mit dem vorhandenen Wissen über EC in die Praxis umsetzen.
Ungeachtet dessen stellen die Anmelder Richtlinien für die Bereitstellung
einer in der vorliegenden Erfindung wirksamen EC bereit.
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Die
kleineren Variationen, die vom Ausdruck CTFC umfasst werden und
vorstehend unter (A) erörtert wurden,
gelten in einer analogen Weise für
jene des Ausdrucks EC und müssen
hier nicht erneut erklärt
werden. Folglich werden Änderungen
des formalen Redoxzustandes der EC aufgrund zum Beispiel von elektrochemischer
Oxidation und intramolekularer Reduktion sowie angeregte/nicht angeregte
Zustände
von dem Ausdruck EC umfasst und solche Änderungen stellen akzeptabel
unterschiedliche Formen der EC dar.
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Die
folgende Formel (I.) zeigt geeignete elektrochemolumineszente Verbindungen
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung: M(L1)a(L2)b(L3)c(L4)d(L5)e(L6)f (I.); wobei
M ein Zentralmetallkation ist, das Ruthenium oder Osmium umfasst;
L1 bis L6 jeweils
Liganden von M sind, die jeweils einzähnig oder mehrzähnig sein
können
und die jeweils gleich oder unterschiedlich voneinander sein können; a
bis e jeweils 0 oder 1 sind; mit der Maßgabe, dass die Liganden von
M in einer solchen Anzahl vorhanden sind und aus einer solchen Zusammensetzung
bestehen, dass die Verbindung zu Elektrochemolumineszenz induziert
werden kann; und zusätzlich
mit der Maßgabe,
dass die Gesamtanzahl der Bindungen, die von den Liganden zum Zentralmetallkation
M bereitgestellt werden, der Koordinationszahl von M entspricht.
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In
der Praxis der vorliegenden Erfindung schließen bevorzugte elektrochemolumineszente
Verbindungen jene ein, wobei das Zentralmetallkation Ruthenium Ru
oder Osmium Os ist. Eine besonders bevorzugte Verbindung ist Ru(bpy)3 +2.
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Etabliert
wurde(n), (i) dass elektrochemolumineszente Verbindung ein Fachausdruck
ist; (ii) Richtlinien zur Bereitstellung einer solchen EC; der Ausdruck
EC, wie hier verwendet, ist für
den Fachmann klar. Nichtdestoweniger erweitern die Anmelder später diese
Lehre durch Bereitstellen von nicht einschränkenden, nicht ausschließenden besonderen
Beispielen, die die EC identifizieren.
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(D) Verwendungen der detektierbaren
Verbindungen.
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Die
Identitäten,
Eigenschaften und theoretische Grundlage der detektierbaren Verbindungen
der vorliegenden Erfindung wurden vorstehend im Detail erläutert. Demzufolge
erläutert
dieser Abschnitt die Verwendungen von solchen detektierbaren Verbindungen
im Detail.
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Die
elektrochemolumineszenten Verfahren, die die detektierbaren Verbindungen
verwenden, können als
in zwei Hauptkategorien eingeteilt betrachtet werden; nämlich Überwachen
und Testen.
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Die
detektierbaren Verbindungen können
zum Überwachen
von chemischen Umwandlungen in der CTFC, die die wirksame intramolekulare
Abgabefähigkeit
dieser CTFC ändern,
verwendet werden. Diese Überwachungsverfahren
sind primär
nicht gestaltet, um entweder qualitativ oder quantitativ die Anwesenheit/Menge
einer jedweden besonderen SC zu identifizieren. Vielmehr sind die Überwachungsverfahren
gestaltet, um qualitativ und/oder quantitativ die Anwesenheit/das
Ausmaß von
chemischen Umwandlungen in der CTFC anzuzeigen, ohne Identifizierungen
zu erfordern, die darauf gerichtet sind, welche besondere SC in
der Probenlösung
für jedwede
von solchen chemischen Umwandlungen verantwortlich ist.
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Durch
Vergleichen (i) der gemessenen Lumineszenz der detektierbaren Verbindung
nach der Exposition dieser detektierbaren Verbindung an Probenlösungen,
wovon angenommen wird, dass sie mindestens eine SC enthalten, die
zur Wechselwirkung mit der CTFC und zum Bewirken einer chemischen
Umwandlung in der CTFC befähigt
ist, mit (ii) der gemessenen Lumineszenz des zuvor bestimmten Standards
wird die CTFC wirksam überwacht.
Genauer kann die Anwesenheit und das Ausmaß von solchen chemischen Umwandlungen
in der CTFC überwacht
werden. Der zuvor bestimmte Lumineszenzstandard des Überwachungsverfahrens
wird in der folgenden Weise erzeugt.
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Die
Herstellung dieser Kalibrierungskurve wird für eine detektierbare Verbindung,
die zur Erzeugung von messbarer Lumineszenz vor jedweden chemischen
Umwandlungen in der CTFC in der Lage ist, veranschaulicht. Bekannte
unterschiedliche Mengen einer besonderen detektierbaren Verbindung
werden (in der zweckdienlichen Abwesenheit von jedweder SC, die
zur Wechselwirkung mit der CTFC befähigt ist, wobei eine chemische
Umwandlung verursacht wird) in einer Serie von Probenlösungen hergestellt.
In jeder dieser Probenlösungen
wird durch Exposition an elektrochemische Energie in der Form einer
positiven Vorspannung, die auf eine Elektrode einer elektrochemolumineszenten
Zelle aufgebracht wird, Elektrochemolumineszenz erzeugt. Die resultierende
experimentell gemessene Lumineszenz wird aufgezeichnet. Der zuvor
bestimmte Lumineszenzstandard für Überwachungstechniken
umfasst eine Kalibrierungskurve mit experimentell gemessener Lumineszenz
auf einer ersten Achse und bekannten Mengen der besonderen detektierbaren
Verbindung auf der zweiten Achse. Durch Vergleichen der experimentell
gemessenen Lumineszenz einer Lösung,
die eine bekannte Menge der detektierbaren Verbindung enthält und auch
eine Probe enthält,
von der man annimmt, dass sie jedwede zweite Verbindungen enthält, mit
dem entsprechenden Lumineszenzwert aus der Kalibrierungskurve wird
die CTFC wirksam überwacht. Änderungen
in der CTFC, die durch Wechselwirkungen mit jedweden zweiten Verbindungen
in der Probenlösung
verursacht werden, werden in messbaren Unterschieden (Abweichungen)
von der Kalibrierungskurve resultieren.
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Die Überwachungsverfahren
können
zum Sichten/Serientesten (engl. screen) von vermuteten Lösungen auf
Aktivität
gegen die CTFC verwendet werden. Speziell kann eine Serie von Probenlösungen mit
den detektierbaren Verbindungen überwacht
werden. Ein positives Elektrochemolumineszenztestergebnis (d.h.
ein Ergebnis, das entweder höher
oder niedriger ist als der zuvor bestimmte Standard) für jedwede
besondere Probenlösung
weist auf mindestens eine SC in dieser besonderen Probenlösung hin.
Demgemäß wäre diese
Lösung
dann eine geeignete potentielle Lösung für zusätzliche detaillierte Untersuchungen.
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Die
Testverfahren sind Erweiterungen der Überwachungsverfahren, wobei
die Testverfahren so gestaltet sind, dass sie speziell auf die Anwesenheit
und/oder die Menge einer besonderen SC testen. Als solche basieren
die Testverfahren ebenso auf den chemischen Umwandlungen in der
CTFC, die die wirksame intramolekulare Abgabefähigkeit der CTFC zur EC verändern.
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Durch
Vergleichen (i) der gemessenen Lumineszenz der detektierbaren Verbindung
nach der Exposition dieser detektierbaren Verbindung an einer Probenlösung, von
welcher angenommen wird, dass sie eine besondere SC enthält, die
zur Wechselwirkung mit der CTFC und zum Bewirken einer chemischen
Umwandlung in der CTFC befähigt
ist, mit (ii) der gemessenen Lumineszenz des zuvor bestimmten Standards
wird die besondere SC wirksam getestet. Genauer kann die Anwesenheit
und die Menge der besonderen SC getestet werden. Der zuvor bestimmte
Lumineszenzstandard des Testverfahrens wird in der folgenden Weise
erzeugt.
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Bekannte
Mengen einer besonderen detektierbaren Verbindung werden an eine
Serie von Probenlösungen
exponiert, die jeweils bekannte unterschiedliche Mengen einer besonderen
SC enthalten, welche zur Wechselwirkung mit der CTFC der detektierbaren
Verbindung gemäß der vorliegenden
Erfindung befähigt
ist. Die Exposition wird unter Bedingungen durchgeführt, die
vorteilhaft sind für
die und im Einklang stehen mit den gewünschten Wechselwirkungen. Anschließend an
solche Wechselwirkungen wird in jeder dieser Probenlösungen Elektrochemolumineszenz
verursacht und die experimentell gemessene Lumineszenz wird aufgezeichnet.
Der zuvor bestimmte Lumineszenzstandard für Testverfahren umfasst eine
Kalibrierungskurve mit experimentell gemessener Lumineszenz auf
einer ersten Achse und bekannten Mengen der besonderen SC auf der
zweiten Achse.
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Für sowohl Überwachungs-
als auch Testverfahren kann die experimentell gemessene Lumineszenz entweder
größer als
oder kleiner als die Lumineszenz für die verwendbare zuvor bestimmte
Lumineszenzkalibrierungskurve sein. Mit anderen Worten, die Wechselwirkung
zwischen der CTFC und der mindestens einen zweiten Verbindung kann
die wirksame intramolekulare Elektronenabgabefähigkeit dieser CTFC entweder
erhöhen
oder erniedrigen (was entsprechend die experimentell gemessene Lumineszenz
erhöhen
oder erniedrigen würde).
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Bevorzugte
Verwendungen der detektierbaren Verbindungen sind Überwachungs-
und Testverfahren, wenn die erste CTFC-Verbindung ein Substrat umfasst
und die SC ein Enzym umfasst, das für dieses Substrat spezifisch
ist. Besonders bevorzugte Substrate sind Betalactame. Solche Betalactame
sind in Testverfahren geeignet, die auf die entsprechende Betalactamase
testen.
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Eine
andere Verwendung der detektierbaren Verbindungen der vorliegenden
Erfindung nutzt Vorteile eines gekoppelten, regenerativen Reaktionsmechanismus,
der die Umwandlung eines getrennten, nicht-konjugierten Substrats
in Lösung
zu einem getrennten, nicht-konjugierten Produkt in Lösung über Exposition
an ein geeignetes Enzym und Comediatoren einbezieht. Die Wechselwirkungen
zwischen der CTFC und der enzymatisch-katalysierten, co-vermittelten Umwandlung
einer Substratspezies in Lösung
zu einer Produktspezies in Lösung
bilden die theoretische Grundlage für einen Test, der für das Substrat
in Lösung,
das Enzym in Lösung
und/oder die CTFC spezifisch sein kann.
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Eine
andere Verwendung der detektierbaren Verbindungen der Erfindung
ist bei Kits, die speziell gestaltet sind, um Verfahren der vorliegenden
Erfindung zu implementieren. Dementsprechend werden zwei Typen von
Kits bereitgestellt. Die Überwachungskits
umfassen jeweils eine Vielzahl von Probenstandardlösungen,
die jeweils bekannte Mengen einer besonderen detektierbaren Verbindung
umfassen, mit der zweckdienlichen Abwesenheit von jeglicher SC.
Diese Überwachungskits
können
zur Bestimmung der zuvor bestimmten Lumineszenzstandardkalibrierungskurve
verwendet werden. Die Testkits umfassen jeweils eine Vielzahl von Probenlösungen,
die jeweils bekannte Mengen einer besonderen detektierbaren Verbindung
enthalten, zusätzlich
zu einer entsprechenden Vielzahl von Testlösungen, die jeweils bekannte
unterschiedliche Mengen einer besonderen SC enthalten, welche zur
Wechselwirkung mit der detektierbaren Verbindung in der beschriebenen
Weise befähigt
ist.
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(E) Beispiele.
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Ungeachtet
der vorstehenden detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung
stellen die Anmelder nachstehend spezielle Beispiele nur für die Zwecke
von Veranschaulichung und als eine Hilfe beim Verständnis der
Erfindung bereit. Insbesondere in Bezug auf den Schutz, auf welchen
die vorliegende Erfindung Anspruch erhebt, sind diese Beispiele
sowohl nicht einschränkend
als auch nicht ausschließend.
Demgemäß soll der
Umfang der Erfindung der Anmelder, wie sie in den angefügten Patentansprüchen dargelegt
ist, unter Berücksichtigung
der Lehre der gesamten Beschreibung bestimmt werden, ohne dass in
solche Patentansprüche
die speziellen Einschränkungen
eines besonderen Beispiels eingebracht werden.
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Beispiel 1. Herstellung
von Ru(bpy)3 +2-markierten
Betalactamantibiotika
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(a) Herstellung von Ru(bpy)3 +2-markiertem Ampicillin
(Ru-AMP):
-
Ru(bpy)3 +2-NHS-Ester (15,1
mg) in Acetonitril (250 μl)
wurde mit Ampicillin (29,1 mg) in 0,2 M Natriumbicarbonat, pH-Wert
8,0, (250 μl)
gemischt und man ließ die
Umsetzung bei Raumtemperatur für
2 Stunden fortzuschreiten (4). Ru-AMP
wurde unter Verwendung eines Waters HPLC-Systems (Milford, MA),
das mit einer ProgelTM-TSJ CM-5PW-Säule (7,5
cm × 7,5
mm) (Supelco, Inc., Bellefonte, PA) ausgestattet war, unter Verwendung
eines linearen Gradienten von 20 nach 180 mM Natriumphosphat, pH-Wert
7,0, für
15 Minuten bei 1,0 ml/Minute gereinigt. Das Substrat wurde spektrophotometrisch
durch Messen der Extinktion des Rutheniumkomplexes quantifiziert
(der molare Extinktionskoeffizient bei 453 nm ist 13.700 M–1cm–1).
Nach der Bildung des Ammoniumhexafluorphosphatsalzes wurde die Struktur
und Reinheit von Ru-AMP durch Massenspektroskopie und Protonen-NMR
bestätigt
(5 bis 6).
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(b) Herstellung von Ru(bpy)3 +2-markierter 6-Aminopenicillansäure (hier
nachstehend „Ru-APA")
-
Ru(bpy)3 +2-NHS-Ester (15
mg) (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) in Acetonitril (250 μl) wurde
mit 6-Aminopenicillansäure
(12,4 mg) in 0,2 M Natriumbicarbonat, pH-Wert 8,0, (350 μl) gemischt
und man ließ die
Umsetzung bei Raumtemperatur für
2 Stunden fortschreiten ( 7). Ru-APA
wurde mit einem Waters HPLC-System (Milford, MA), das mit einer
ProgelTM-TSK
CM-5PW-Säule
(7,5 cm × 7,5
mm) (Supelco, Inc., Bellefonte, PA) ausgestattet war, unter Verwendung
eines linearen Gradienten von 20 nach 100 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, für 20 Minuten
bei 1,0 ml/Minute gereinigt. Das Substrat wurde spektrophotometrisch
durch Messen der Extinktion des Rutheniumkomplexes quantifiziert
(der molare Extinktionskoeffizient bei 453 nm ist 13.700 M–1cm–1).
-
(c) Herstellung von anderen
Ru(bpy)3 +2-markierten
Betalactamen
-
Andere
Betalactame, wie 7-Aminocephalosporinsäure, die ein primäres Amin
in ihren Strukturen aufweisen, können
sich auch mit Ru(bpy)3 +2-NHS-Ester
umsetzen, um ähnliche
Konjugate, wie vorstehend beschrieben, zu bilden. Die Reaktions-
und Reinigungsbedingungen werden ähnlich sein, möglicherweise
etwas unterschiedlich in den Wegen, was vom Fachmann behandhabt
werden kann. 8 zeigt die Struktur von 5 speziellen
Betalactamen.
-
Beispiel 2. ECL-Test von
Ru-AMP-Hydrolyse
-
Versuche
wurden durchgeführt,
um die ECL-Eigenschaften von Ru-AMP (konjugiert) mit Ru(bpy)3 +2- und Ampicillin-Gemischen
(nicht-konjugiert) zu vergleichen. Die ECL-Eigenschaften wurden
sowohl vor als auch nach NaOH- und enzymatischer Hydrolyse verglichen
(9, linke Seite).
-
Es
wurde gefunden, dass Ru-AMP ein sehr gutes Substrat für Betalactamase
ist. Die Hydrolyse von Ru-AMP (33 μM) durch Betalactamase I von
Bacillus cereus (0,3 nM) wurde spektrophotometrisch bei 240 nm unter
Verwendung eines Hitachi U3200-Spektrophotometers
(Danbury, CT) bei 25,0°C
in 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, überwacht. Eine Halbwertszeit
(t1/2)-Analyse ergab einen kcat/Km, für
eine enzymatische Hydrolyse von Ru-AMP von 3,9 × 108 min–1M–1.
-
Die
ECL-Eigenschaften von äquimolaren
Gemischen von Ru(bpy)3 +2 und
Ampicillin (hydrolysiert oder nicht hydrolysiert) wurden mit der
gleichen Konzentration des Ru-AMP-Konjugats (hydrolysiert oder nicht hydrolysiert)
verglichen. In getrennten Versuchen wurden Ampicillin und Ru-AMP
durch entweder 250 mM NaOH (Basenhydrolyse) oder 441 nM Betalactam
I von Bacillus cereus (Enzymhydrolyse) hydrolysiert. Für die Basenhydrolyse
wurden 50 μl
5 M NaOH zu 1,0 ml-Lösungen
von deionisiertem Wasser, das entweder 24,85 μM Ru-AMP oder ein Gemisch von
25 μM Ampicillin
und 25 μM
Ru(bpy)3 +2 enthielt,
gegeben. Nach Inkubationen für
30 Minuten wurden die Lösungen
mit 50 μl
5 M HCl neutralisiert. Für
die Versuche der nicht hydrolysierten Gegenstücke wurden 50 μl H2O zu Lösungen
von entweder 24,85 μM
Ru-AMP oder einem Gemisch, das 25 μM Ampicillin und 25 μM Ru(bpy)3 +2 enthielt, gegeben.
Nach Inkubationen für
30 Minuten wurden 50 μl
5 M NaCl zu diesen Lösungen
gegeben. Die in 10 gezeigten Ergebnisse zeigen:
(1) dass die Ampicillinhydrolyse durch entweder NaOH oder Betalactamase
einen Anstieg bei der ECL der Gemische verursacht; und (2) dass
der Anstieg bei der ECL, der durch die Hydrolyse verursacht wird,
viel stärker
ist, wenn der Licht-emittierende Rutheniumkomplex kovalent an Ampicillin
gebunden ist. Bei Basenhydrolyse stieg die ECL um das 1,5-fache,
wenn Ampicillin in einem Gemisch von Ampicillin und Ru(bpy)3 +2 hydrolysiert
wurde, während
die ECL um das 5,2-fache stieg, wenn Ru-AMP hydrolysiert wurde. Ähnliche
Ergebnisse wurden bei Enzymhydrolyse erhalten: die ECL stieg um
das 2,1-fache, wenn Ampicillin in einem Gemisch von Ampicillin und Ru(bpy)3 +2 hydrolysiert
wurde, während
die ECL um das 9,8-fache durch die Hydrolyse von Ru-AMP stieg. Die Daten,
die diese Folgerungen etablierten, werden in 10 gefunden,
die die experimentell gemessene Elektrochemolumineszenz zeigt von
(von links nach rechts):
Ru(bpy)3 +2 alleine;
Ru(bpy)3 +2 plus nicht hydrolysiertes Ampicillin;
Ru(bpy)3 +2 plus NaOH-hydrolysiertes
Ampicillin;
Nicht hydrolysiertes Ru-AMP;
NaOH-hydrolysiertes
Ru-AMP;
Ru(bpy)3 +2 plus
nicht hydrolysiertes Ampicillin;
Ru(bpy)3 +2 plus Betalactamase-hydrolysiertes Ampicillin;
Nicht
hydrolysiertes Ru-AMP; und
Betalactamase-hydrolysiertes Ru-AMP.
-
Diese
Arbeit wurde in einem zweiten Versuch unter Verwendung von Enzymhydrolyse
bestätigt,
der sich dadurch unterschied, dass die Inkubationszeit mit dem Enzym
von 30 auf 60 Minuten verlängert
wurde (11). Hier verursachte die Enzymhydrolyse
einen 2,5-fachen
Anstieg bei der ECL, wenn Ampicillin und Ru(bpy)3 +2 nicht-konjugiert waren, und einen 11,1-fachen
Anstieg bei der ECL, wenn das Ru-AMP-Konjugat hydrolysiert wurde.
Die Daten, die diese Folgerungen etablierten, werden in 11 gefunden,
die die experimentell gemessene Lumineszenz zeigt von (von links
nach rechts):
Ru(bpy)3 +2 alleine;
Ru(bpy)3 +2 plus
nicht hydrolysiertes Ampicillin;
Ru(bpy)3 +2 plus Betalactamase-hydrolysiertes Ampicillin;
Nicht
hydrolysiertes Ru-AMP; und
Betalactamase-hydrolysiertes Ru-AMP.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass Ru(bpy)3 +2-Konjugation intramolekulare Wirkungen
verursacht, die sehr stark die experimentell gemessene Lumineszenz
erhöhen,
wenn der Betalactamring hydrolysiert wird.
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12 zeigt,
dass niedrige Konzentrationen von Ru-AMP durch Hydrolyse detektiert
werden können. Man
fand, dass die untere Nachweisgrenze 50 nM ist (464 relative ECL-Zählereignisse für hydrolysiertes Ru-AMP
gegen einen Mittelwert bei der Ablesung vom Instrument von –152 relativen
Zählereignissen
für nicht hydrolysiertes
Ru-AMP). Dieser Vergleich mit der unteren Nachweisgrenze der Hydrolyse
von (nicht-konjugiertem) Ampicillin, die 5000 nM war, fällt günstig aus.
-
Beispiel 3. ECL-Test von
Ru-APA-Hydrolyse
-
Man
nahm an, dass Ru-APA unterschiedliche ECL-Eigenschaften (vor und
nach einer Hydrolyse) von jenen von Ru-AMP aufweisen könnte. Die
Unterschiede wären
eine Konsequenz der strukturellen Unterschiede zwischen APA und
AMP, insbesondere des Unterschiedes beim Abstand zwischen dem Betalactamring
und der primären
Aminogruppe, die zur Konjugation des Ru(bpy)3 +2-NHS-Esters verwendet wurde (9,
rechte Seite). In Ru-AMP ist der Betalactamring drei Bindungslängen weiter
entfernt von der Aminogruppe als in Ru-APA. Insbesondere kann die
Hydrolyse von Ru-APA (oder anderen Betalactamkonjugaten) mehr oder
weniger empfindlich durch ECL detektiert werden als die Ru-AMP-Hydrolyse.
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Die
ECL-Eigenschaften des Ru-APA-Konjugats wurden mit jenen der Gemische
von nicht-konjugiertem
Ru(bpy)3 +2 und 6-APA
verglichen. Die ECL-Eigenschaften wurden vor und nach NaOH- und
enzymatischer Hydrolyse verglichen. Die Daten wurden dann mit den
Ergebnissen von ähnlichen
Versuchen mit Ru-AMP, die in Beispiel 2 beschrieben werden, verglichen.
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Es
wurde gefunden, dass Ru-APA ein sehr gutes Substrat für Betalactamase
ist. Die Hydrolyse von Ru-APA (23 μM) durch Betalactamase I von
Bacillus cereus (0,6 nM) wurde spektrophotometrisch bei 240 nm unter
Verwendung eines Hitachi U3200-Spektrophotometers
(Danbury, CT) bei 25,0°C
in 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, überwacht. Eine Halbwertszeit
(t1/2)-Analyse ergab einen kcat/Km für
eine enzymatische Hydrolyse von Ru-APA von 9,8 × 107 min–1M–1.
Diese Rate weist daraufhin, dass das Enzym Ru-APA mit einer 4-fach
niedrigeren Effizienz hydrolysierte als Ru-AMP, dass aber die Ru-APA-Hydrolyse durch
Betalactamase noch außergewöhnlich wirksam
ist.
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Die
ECL-Eigenschaften von äquimolaren
Gemischen von Ru(bpy)3 +2 und
APA (hydrolysiert oder nicht hydrolysiert) wurden mit der gleichen
Konzentration des Ru-APA-Konjugats (hydrolysiert oder nicht hydrolysiert)
verglichen. In getrennten Versuchen wurden 6-APA und Ru-APA durch
entweder 250 mM NaOH (Basenhydrolyse) oder 347 nM Betalactamase
I von Bacillus cereus (Enzymhydrolyse) hydrolysiert.
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Für die Basenhydrolyse
wurden 50 μl
5 M NaOH zu 1,0 ml-Lösungen
von deionisiertem Wasser, das entweder 23,0 μM Ru-APA oder ein Gemisch, das
23,0 μM
APA und 23,0 μM
Ru(bpy)3 +2 enthielt,
enthielt, gegeben. Nach Inkubationen für 60 Minuten wurden die Lösungen mit
50 μl 5
M HCl neutralisiert. Für
die Versuche der nicht hydrolysierten Gegenstücke wurden 50 μl H2O zu Lösungen
von entweder 23,0 μM
Ru-APA oder einem Gemisch von 23,0 μM APA und 23,0 μM Ru(bpy)3 +2 gegeben. Nach
Inkubationen für
60 Minuten wurden 50 μl
5 M NaCl zu diesen Lösungen
gegeben. Die in 13 gezeigten Ergebnisse zeigen:
(1) dass die 6-APA (konjugiert oder nicht-konjugiert)-Hydrolyse
durch entweder NaOH oder Betalactamase einen Anstieg bei der ECL
verursacht; und (2) dass der Anstieg bei der ECL, der durch die
Hydrolyse verursacht wird, viel stärker ist, wenn der Licht-emittierende
Rutheniumkomplex kovalent an 6-APA gekuppelt ist. Bei Basenhydrolyse
stieg die ECL um das 1,9-fache, wenn 6-APA (nicht-konjugiert) in
einem Gemisch von 6-APA
und Ru(bpy)3 +2 hydrolysiert
wurde, während
die ECL um das 13,2-fache stieg, wenn Ru-APA (konjugiert) hydrolysiert
wurde. Ähnlich wie
bei der Enzymhydrolyse stieg die ECL um das 1,4-fache, wenn 6-APA
(nicht-konjugiert) in einem Gemisch von 6-APA und Ru(bpy)3 +2 hydrolysiert
wurde, während
die ECL um das 31,8-fache stieg, wenn Ru-APA (konjugiert) hydrolysiert
wurde. Die Daten, die diese Folgerungen etablierten, werden in 13 gefunden,
die die experimentell gemessene Lumineszenz zeigt von (von links
nach rechts):
Ru(bpy)3 +2 alleine;
Ru(bpy)3 +2 plus nicht hydrolysiertes
6-APA;
Ru(bpy)3 +2 plus
NaOH-hydrolysiertes 6-APA;
Nicht hydrolysiertes Ru-APA;
NaOH-hydrolysiertes
Ru-APA;
Ru(bpy)3 +2 plus
nicht hydrolysiertes 6-APA;
Ru(bpy)3 +2 plus Betalactamase-hydrolysiertes 6-APA;
Nicht
hydrolysiertes Ru-APA; und
Betalactamase-hydrolysiertes APA.
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Diese
Arbeit zeigt klar, dass eine Konjugation der 6-APA und des elektrochemolumineszenten
Rutheniumkomplexes in intramolekularen Wirkungen resultiert, die
die Elektrochemolumineszenz erhöhen,
wenn der Betalactamring hydrolysiert wird. Darüber hinaus zeigt ein Vergleich
mit den in Beispiel 2 beschriebenen Ergebnissen für das Ampicillinkonjugat,
dass eine Hydrolyse von Ru-APA in einem viel größeren Elektrochemolumineszenzsignal
resultiert als eine Hydrolyse von Ru-AMP. Da das Rutheniumatom näher an dem
Betalactamring bei Ru-APA ist als bei Ru-AMP, weisen diese Ergebnisse
daraufhin, dass es eine kritische Wirkung des Abstandes zwischen
dem Rutheniumkomplex und dem Betalactamring geben kann. Andere,
bis jetzt noch nicht getestete Betalactam- Ru(bpy)3 +2-Konjugate können eine sogar noch größere Änderung
bei der Elektrochemolumineszenz durch Betalactamhydrolyse ergeben.
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14 zeigt,
dass die Hydrolyse von sehr niedrigen Konzentrationen von Ru-APA
durch ECL detektiert werden kann. Genauer zeigt 14 die
Wirkung einer Konzentration von nicht hydrolysierter (volle Kreise) und
hydrolysierter (leere Kreise) Ru-APA auf die experimentell gemessene
Elektrochemolumineszenz. Man fand, dass die untere Nachweisgrenze
50 nM ist (eine Ablesung vom Instrument von –33 relativen ECL-Zählereignissen für hydrolysierte
Ru-APA gegen einen Mittelwert von –648 relativen ECL-Zählereignissen für nicht hydrolysierte
Ru-APA (konjugiert)). Dieser Vergleich mit der unteren Nachweisgrenze
der Hydrolyse von (nicht-konjugierter) APA, die 50 μM war, (in
der Anwesenheit von 10 μM
Ru(bpy)3 +2), fällt günstig aus.
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Ein
Versuch wurde durchgeführt,
um den Vorteil der Konjugation eines Betalactams an die ECL-Markierung
Ru(bpy)3 +2 zu quantifizieren.
Der Anstieg bei der ECL durch die Hydrolyse von 10 μM Ru-APA
wurde mit einer ECL-Standardkurve verglichen, bei welcher verschiedene
Konzentrationen von 6-APA (nicht-konjugiert) in der Anwesenheit
von 10 μM
Ru(bpy)3 +2 hydrolysiert
wurden. Durch Extrapolation der 6-APA-Standardkurve zeigen die Ergebnisse
(15), dass die ECL-Änderung durch Hydrolyse von
10 μM Ru-APA
(konjugiert) äquivalent
ist zu der ECL-Änderung
bei der Hydrolyse von 1250 μM
6-APA (nicht-konjugiert) in der Anwesenheit von 10 μM Ru(bpy)3 +2. Dies zeigt,
dass eine Konjugation von Ru(bpy)3 +2 und 6-APA in einem 125-fachen Anstieg
bei der ECL-Änderung,
die während
der 6-APA-Hydrolyse gesehen wird, resultiert. Die Daten, die diese
Folgerungen etablierten, werden in 15 gefunden,
die einen Vergleich der Elektrochemolumineszenzwirkungen von Ru-APA
(konjugiert) zu Ru(bpy)3 +2 plus
6-APA (nicht-konjugiert) zeigt. Dreiecke stellen die Elektrochemolumineszenz
von 10 μM
nicht hydrolysierter (leere Dreiecke) und hydrolysierter (volle
Dreiecke) Ru-APA dar. Kreise stellen die Elektrochemolumineszenzwirkungen
von nicht hydrolysierter (volle Kreise) und hydrolysierter (leere
Kreise) 6-APA (0 bis 1000 μM)
in der Anwesenheit von 10 μM
Ru(bpy)3 +2 dar.
Eine Extrapolation in 15 weist daraufhin, dass die
Elektrochemolumineszenzänderung
durch die Hydrolyse von 10 μM
Ru-APA äquivalent
ist zur Elektrochemolumineszenzänderung
durch die Hydrolyse von 1250 μM
freier 6-APA in der Anwesenheit von 10 μM Ru(bpy)3 +2.
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Beispiel 4. Herstellung
von Ru(bpy)3 +2-markiertem β-Nicotinamidadenin-Cofaktoren
-
(a) Theorie der Oxidoreduktaseenzyme
und ihre Verwendung in Tests
-
β-Nicotinamidadenin-Cofaktoren
(wie NAD+, NADH, NADP+,
NADPH) werden häufig
in der Natur durch Oxidoreduktaseenzyme als Oxidationsmittel oder
Reduktionsmittel während
einer Reduktion oder Oxidation von Metaboliten verwendet. Solche
Enzyme schließen
viele Dehydrogenasen (Laktatdehydrogenase, Alkoholdehydrogenase,
Glucosedehydrogenase, usw.) ein. Die oxidierten Formen dieser Cofaktoren
(NAD+ oder NADP+)
haben geringe oder keine TPA-ähnlichen
Wirkungen bei der ECL. Jedoch verhalten sich die reduzierten Formen
(NADH oder NADPH) wie TPA bei der Förderung der Ru(bpy)3 +2-Elektrochemolumineszenz (1,2).
Folglich kann ECL zur Messung der enzymatisch-katalysierten Bildung
oder des Verschwindens der reduzierten Formen dieser Cofaktoren
verwendet werden. Demgemäß können Substrate
(Glucose, Ethanol, usw.) von Dehydrogenasen durch ECL detektiert
werden, da ihre chemischen Umwandlungen durch das geeignete Enzym
stöchiometrisch
in der Oxidation oder Reduktion von Nicotinamidadenin-Cofaktoren
resultieren.
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Man
nimmt an, dass reduzierte Nicotinamid-Cofaktoren (NADH oder NADPH)
nicht während
der ECL-Reaktionen zerstört
werden, wie TPA und Betalactame, sondern anstelle in ihre oxidierten
Formen (NAD+ oder NADP+)
umgewandelt werden. Dies bedeutet, dass in der Anwesenheit eines
geeigneten Dehydrogenaseenzyms Nicotinamidadenin-Cofaktoren wieder
verwendet werden können,
so dass ein einzelnes Cofaktormolekül, das kovalent an eine elektrochemolumineszente
Verbindung gebunden ist, an mehrfachen ECL-Reaktionen teilhaben
kann (16). Auch wird in 16 darauf
hingewiesen, dass das Ru(bpy)3 +2 auch
regeneriert wird, so dass es für
eine einzelne detektierbare Verbindung, die einen solchen Cofaktor
kovalent an eine elektrochemolumineszente Verbindung gebunden umfasst,
möglich
ist, dass sie möglicherweise
mehrfache Photonen, eines nach dem anderen, emittiert.
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Nicotinamidadenin-Cofaktoren
haben Vorteile gegenüber
vorliegenden elektrochemolumineszenten Techniken, die TPA verwenden.
Insbesondere können
diese Cofaktoren (i) in regenerativen ECL-Reaktionsmechanismen teilhaben;
(ii) zur Detektierung und Quantifizierung von Dehydrogenasen und
ihren entsprechenden Substraten verwendet werden. Ein Nachteil ist,
dass das ECL-Signal (d.h. die experimentell gemessene Lumineszenz)
bei einer ECL-Reaktion mit NADH oder NADPH niedriger ist als bei
einer ECL-Reaktion mit TPA. Dieser Nachteil konnte durch die Verwendung
eines Konjugats von Derivaten von Ru(bpy)3 +2 und dem Nicotinamidadenin-Cofaktor verringert
oder beseitigt werden. Wie in den Beispielen vorstehend gezeigt
wird, wenn Ru(bpy)3 +2 an
eine chemisch umwandelbare erste Verbindung konjugiert wird, die
als ein Reduktionsmittel mit hoher Energie wirken kann und intramolekular
ein Elektron an die kovalent gebundene elektrochemolumineszente
Verbindung (wie ein Betalactam) abgeben kann, ist das erzeugte ECL-Signal
viel größer, als
wenn die CTFC nicht mit der EC konjugiert ist. In ähnlicher
Weise wird ein Ru(bpy)3 +2-Nicotinamidadenin-Cofaktor (reduzierte
Form)-Konjugat auch mehr ECL aufweisen als ein nicht-konjugiertes
Gemisch von Ru(bpy)3 +2 und dem
reduzierten Cofaktor. In ähnlicher
Weise wird der Unterschied beim ECL-Signal zwischen den reduzierten (NADH
oder NADPH) und oxidierten Formen (NAD+,
NADP+) der Cofaktoren größer sein, wenn die Cofaktoren kovalent
an das Ru(bpy)3 +2 gebunden
sind, als wenn sie nicht konjugiert sind.
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Konjugate
von Nicotinamidadenin-Cofaktorderivaten sind bekannt und sind enzymatisch
funktionell (3,4). Ein solches Cofaktorderivat, N6-([6-Aminohexyl]carbamoylmethyl)-nicotinamidadenindinucleotid,
ist kommerziell erhältlich
(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Die primäre Aminogruppe dieser Verbindung
kann zur Kupplung dieser Verbindung an den gleichen vorstehend beschriebenen
Ru(bpy)3 +2-NHS-Ester
(erhältlich von
IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) durch das gleiche oder ein ähnliches
Verfahren verwendet werden ( 17) (3,4).
Andere ähnliche
Kupplungsverfahren werden auch arbeiten. Das Konjugat (Ru-NAD) kann durch HPLC in
einer ähnlichen
Weise, wie für
die Reinigung von Ru-AMP und Ru-APA beschrieben wurde, gereinigt
werden. Die vier Bezugnahmen, die vorstehend aufgeführt sind,
sind (1) Downey, T.M. und Nieman, T.A. (1992) Anal. Chem. 64, 261–268; (2)
Martin, A.F. und Nieman, T.A. (1993) Anal. Chem. Acta. 281, 475–481; (3)
Mansson, M.-O.,
Larsson, P.-O., und Mosbach, K. (1982) Methods Enzym. 89, 457–468; und
(4) Persson, M., Mansson, M.O., Bulow, L., Mosbach, K. (1991) Bio/Technology
9, 280–284. 17 zeigt
die Herstellung von Ru-NAD.
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Die
oxidierte Form von Ru-NAD (Ru-NAD+) kann
in Enzymtests an einem ECL-Instrument zur Detektion und Quantifizierung
eines Dehydrogenaseenzyms oder eines Substrats einer Dehydrogenase
(oder einer Verbindung, die eine andere erhöht) verwendet werden. Die Tests
werden gemäß herkömmlichen
Protokollen (Dauer, Temperatur, pH-Wert, Puffer, Salz, Substrat-
und Enzymkonzentrationen, usw.) durchgeführt, außer, dass das normalerweise
eingeschlossene NAD+ nicht eingeschlossen
sein wird und dass Ru-NAD+ anstelle verwendet
wird. Die Konzentration von Ru-NAD+ kann
wegen Unterschieden bei der Substratspezifität, Löslichkeit, Kosten oder anderen
Faktoren niedriger oder höher
sein als bei herkömmlichen
Tests. Nach der Inkubation wird das Gemisch in einem ECL-Instrument
(IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) analysiert. Kein zusätzliches
Ru(bpy)3 +2 wird
zugegeben. Eine Reduktion von Ru-NAD+ wird
durch einen Anstieg beim ECL-Signal über den Hintergrund erkannt
und wird auf die Anwesenheit der relevanten Dehydrogenase und des
Substrats hinweisen.
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In ähnlicher
Weise kann die Oxidation der reduzierten Form von Ru-NAD (Ru-NADH)
durch ECL detektiert werden. Wieder werden Bedingungen und die Anwesenheit
eines relevanten Enzyms und Enzymsubstrats in Betracht gezogen und
werden von bekannten Bedingungen für Tests, die nicht-konjugiertes
NADH einbeziehen, abgeleitet. NADH wird von dem Test weggelassen
und Ru-NADH (in einer geeigneten Konzentration, die nicht die herkömmliche
Konzentration sein muss) wird eingeschlossen. Nach einer Inkubation
wird das Gemisch mit einem ECL-Instrument analysiert. Jeder Rückgang der
ECL vom anfänglichen
Ru-NADH-Signal wird
darauf hinweisen, dass etwas Ru-NADH oxidiert worden ist, und wird
ein Beweis für
die Anwesenheit des relevanten Enzyms oder Substrats sein.
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(b) Herstellung von Ruthenium-markiertem
N6-[6-Aminohexyl(carbamoylmethyl)-NAD+
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Zu
einer Lösung,
die 6,6 mg N6-[6-Aminohexyl(carbamoylmethyl)-NAD+ (Li+-Salz, Sigma
Chem. Co., St. Louis, MO) in 0,4 ml eines Gemisches von 1:1 von
Acetonitril und NaHCO3 (0,2 M, pH-Wert 8,6)
enthielt, wurde ein NHS-Ester von Ru(bpy)3 +2 (IGEN, Inc., Gaithersburg, MD) in 0,2
ml eines Gemisches von 1:1 von Acetonitril und NaHCO3 (0,2
M, pH-Wert 8,6) gegeben. Man ließ das Reaktionsgemisch über Nacht
bei Raumtemperatur laufen. Am folgenden Morgen wurde die Umsetzung
abgestoppt, das Lösungsmittel
wurde entfernt und die Verbindung wurde durch Größenausschlusschromatographie
(BioRad Bio-Gel
P-2, BioRad Laboratories, Richmond, CA) gereinigt. Protonen-NMR
zeigte, dass die Verbindung korrekt, aber nicht vollständig rein war.
Die Verbindung (Ru-NAD) wurde an einer Säule von Sp-Sephadex (Pharmacia,
Uppsala, Schweden) erneut gereinigt, wobei mit Änderungen von steigenden Konzentrationen
von Trifluoressigsäure
(0, 0,05, 0,2, 0,3 M) eluiert wurde. NMR zeigte, dass die Verbindung
reines Ru-NAD war.
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(c) Ru-NAD als ein Enzymcofaktor
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Um
zu bestimmen, ob Ru-NAD als ein Enzymcofaktor funktionell war, wurde
eine Umsetzung getestet, die eine Oxidation von D-Glucose-6-phosphat
durch Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
einbezog. Die Umsetzung wurde spektrophotometrisch bei 340 nm überwacht.
Diese Wellenlänge
wird normalerweise zur Beobachtung der Interkonversion von NAD+ und NADH verwendet. Ein Gemisch von 63 μM Ru-NAD,
400 μM Glucose-6-phosphat und 22 nM
Enzym in 55 mM Tris-Puffer, pH-Wert 7,8, der 33 mM MgCl2 enthielt,
wurde bei 30°C
in einer Küvette
inkubiert. Ein kontinuierliches Ablesen der Extinktion zeigte, dass
die Extinktion über
ungefähr
40 Minuten in einer Weise anstieg, die für die enzymatische Reduktion
von NAD+ charakteristisch ist. Dies wies
daraufhin, dass Ru-NAD tatsächlich
als ein funktioneller Cofaktor von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
akzeptiert wurde.
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(d) Wirkung der enzymatischen
Reduktion auf die ECL von Ru-NAD
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Man
fand, dass Ru-NAD als ein Cofaktor von der Dehydrogenase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, akzeptiert
wurde. Ein Versuch wurde durchgeführt, der die Oxidation von
Glucose-6-phosphat durch dieses Enzym mit gleichzeitiger Reduktion
von Ru-NAD einbezog. Hier wurden ECL-Messungen durchgeführt, um
zu bestimmen, ob (1) die ECL-induzierenden
Wirkungen von NADH (aber nicht von NAD
+)
auch bei Ru-NADH (aber nicht bei Ru-NAD) vorhanden sind, und (2)
ob eine Konjugation von Ru(bpy)
3 +2 mit NADH eine Erhöhung bei der ECL-Messempfindlichkeit
verursacht, verglichen mit der ECL eines Gemisches von nicht-konjugiertem
Ru(bpy)
3 +2 und NADH.
Die Ergebnisse sind nachstehend gezeigt (alle Lösungen enthielten das Substrat,
Glucose-6-phosphat, Lösungen,
die kein Ru-NAD
enthielten, enthielten 1,0 μM
Ru(bpy)
3 +2);
| Probe | ECL-Zählereignisse |
| 21 μM NAD+ | 45.500 |
| 21 μM NAD+ + Enzym | 45.200 |
| 21 μM NADH | 47.900 |
| 21 μM NADH +
Enzym | 40.800 |
| 21 μM Ru-NAD | 71.700 |
| 21 μM Ru-NAD
+ Enzym | 132.000 |
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass eine Zugabe von Enzym zu Ru-NAD das ECL-Signal
erhöht.
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Die
Ergebnisse zeigen auch, dass bei Konzentrationen von nicht-konjugiertem
NAD, die zu niedrig sind, um ECL-Wirkungen zu sehen, Ru-NAD klar
einen großen
Umfang an ECL ergibt, wenn Enzym zugegeben wird. Schließlich verhält sich
Ru-NAD in der gleichen Weise wie freies Ru(bpy)3 +2 plus freies NAD+ in
einem ECL-Instrument (Enzymzugabe verursacht einen Anstieg bei der
ECL), aber Ru-NAD wird viel empfindlicher detektiert. Dies wies
daraufhin, dass niedrige Konzentrationen von Dehydrogenasen oder
ihren Substraten empfindlich durch ECL von Ru-NAD+-Reduktion
oder Ru-NADH-Oxidation detektiert werden können.
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Der
Umfang des Patentschutzes, auf welchen die vorliegende Erfindung
Anspruch erhebt, wird nicht durch den vorangehenden Text eingeschränkt. Vielmehr
wird die vorliegende Erfindung durch die hier angefügten Patentansprüche und
alle Ausführungsformen,
die darunter fallen, definiert.
