DE69433962T2

DE69433962T2 - Biosensor zum Nachweis von Metallionen

Info

Publication number: DE69433962T2
Application number: DE69433962T
Authority: DE
Inventors: Harry Salwick Eccles; Geoffrey W. Salwick Garnham; Neil Charles Tennis Court Road Bruce; Christopher Robin Tennis Court Road Lowe
Original assignee: British Nuclear Fuels PLC
Current assignee: Sellafield Ltd
Priority date: 1993-07-22
Filing date: 1994-07-13
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2014-07-14
Also published as: DE69433962D1; JPH07151725A; EP0635571A3; EP0635571B1; KR950003450A; AU6758394A; EP0635571A2; US5500351A; AU687809B2; GB9315183D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Biosensoren und spezieller Biosensoren zum Nachweis von Metall-, insbesondere Schwermetall-Ionen.
In einer bekannten Form eines Biosensors, die im europäischen Patent Nr. 263 948 beschrieben ist, ist eine reaktive biochemische Komponente in Form eines Peptids aus der Gruppe der Phytochelatine auf einem Wandler immobilisiert. Beim Kontakt mit wässrigen Lösungen von Schwermetall-Ionen führen Komplexe mit dem Phytochelatin zu einer Änderung des Wandler-Ausgangssignals und stellen so eine rasche Analyse von Schwermetall-Ionen bereit. Jedoch ist der Nachweis auf diese Weise nicht für einzelne Metall-Spezies und darüber hinaus spezifisch, wenn sich das Peptid mit dem Schwermetall aus dem gebildeten Komplex vereinigt, z. B. wenn es erforderlich ist, weitere Messungen unter Verwendung des Peptids vorzunehmen.
In der JP-A-05 023 198 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Quecksilber-Konzentrationen beschrieben, in dem eine Lösung, die Quecksilber-Ionen enthält, mit einem Quecksilberionen-Reduktase-Enzym und NADPH in Kontakt gebracht wird. Die Quecksilber-Ionen werden zu metallischem Quecksilber reduziert, und das NADPH wird gleichzeitig zu NADP⁺ oxidiert. Die Änderung der Konzentration von NADPH zu NADP⁺ wird direkt durch Änderungen der Fluoreszenz der Probe überwacht, welche durch Bestrahlen des NADP⁺ mit Licht erhalten wird. Jedoch erfordert diese Methode als Ergebnis ihres Einstufen-Verfahrens eine Reagenszugabe, um NADPH, das teuer ist, aufrechtzuerhalten, und sie beinhaltet ein relativ komplexes Stück Apparatur mit einer vorherigen Probenmodifikation durch Zugabe von Mercapto-Verbindungen und einen Nachweis an einem getrennten Ort.
In der EP-A-0 007 476 ist ein Verfahren zur Bestimmung von NADPH in einem klinischen System beschrieben.
Der Artikel in Environmental Science and Technology, Bd. 25, Nr. 2, 1991 S. 302–305, offenbart ein wohlbekanntes Verfahren zum Abbau von Organoquecksilber-Verbindungen für den Nachweis von Quecksilber in biologischen Proben.
Der Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, einen verbesserten Biosensor bereitzustellen, bei dem diese Probleme vermieden werden.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Biosensor zum Nachweis von Ionen eines Metalls bereitgestellt, die durch ein Metall-Reduktase-Enzym reduziert werden können, wobei der Biosensor einen Wandler und eine Enzym-Zusammensetzung umfasst, die ein Metall-Reduktase-Enzym und ein erstes Coenzym umfasst, das einen reduzierten Zustand und einem oxidierten Zustand besitzt und durch die Reduktion von Metall-Ionen durch das Metall-Reduktase-Enzym von seinem reduzierten Zustand in seinen oxidierten Zustand überführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass
die Enzym-Zusammensetzung, die das Metall-Reduktase-Enzym und das erste Coenzym umfasst, immobilisiert ist; und
der Biosensor auch ein oder mehrere andere Coenzyme in einer chemischen Coenzym-Kette umfasst, wobei das eine oder die mehreren anderen Coenzyme ein Signal erzeugen, wobei das Signal von dem Wandler nachgewiesen wird.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Metall-Ionen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Metall-Ionen einem Biosensor gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung aussetzt.
Bei den Metall-Ionen, die gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden, kann es sich um Ionen von Quecksilber, Chrom, Arsen, Technetium, Kupfer, Silber, Gold, Selen, Vanadium, Molybdän oder Uran handeln. Reduktase-Enzyme für die biochemische Reduktion von jeder dieser Metall-Spezies sind als solche aus der Literatur bekannt. Die nachzuweisenden Metall-Spezies können in einer gegebenen zu untersuchenden Probe, z. B. wässrigen Lösung, als einfache Metall-Ionen oder als Verbindungen oder Komplexe, z. B. organometallische Verbindungen, vorliegen.
Wenn die nachzuweisende Metall-Spezies als Verbindung oder Komplex vorliegt, kann es wünschenswert sein, ein weiteres chemisches oder biochemisches Agens, z. B. ein Enzym, zu verwenden, um die Verbindung oder den Komplex in ihren bzw. seinen einfachen Metall-Ionen-Zustand zu überführen, so dass sie bzw. er durch das Reduktase-Enzym nachgewiesen werden kann. Beispielsweise kann Organoquecksilber-Lyase verwendet werden, um Quecksilber-organometallische Verbindungen in einfache Quecksilber(II)-Ionen zu überführen, die durch Quecksilber(II)-Reduktase nachgewiesen werden können.
Im Gegensatz zum Stand der Technik, der in der oben erwähnten EP-Patentschrift beschrieben ist, erlaubt die vorliegende Erfindung einen Metall-Ionen-Nachweis, der für die interessierende Metall-Spezies hoch spezifisch sein kann. So ist z. B. Quecksilber(II)-Reduktase für die Anwesenheit von Quecksilber(II)-Ionen hoch spezifisch. Weiter kann das Metall, das aus dem Reduktionsprozess erhalten wird, an dem die Verwendung des Reduktase-Enzyms beteiligt ist, abgetrennt, konzentriert und, falls notwendig, aus dem Medium, in dem es ursprünglich vorliegt, wiederverwertet werden.
Der Biosensor gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann erfordern, dass zusammen mit der Metall-Reduktase ein Coenzym verwendet wird, welches eine Elektronenquelle für den Metall-Ionen-Reduktionsprozess ist. Das Coenzym kann selbst ein Signal erzeugen oder kann über eine oder mehrere andere Coenzyme in einer Coenzym-Kette ein solches erzeugen, wobei dieses durch den Wandler nachgewiesen werden kann.
Die Reduktase kann zusammen mit dem Nicotinamid-Enzym NADPH als Coenzym verwendet werden, welches durch die Reduktion der nachzuweisenden Metall-Spezies, z. B. Hg(II) zu Hg(0), durch Quecksilber(II)-Reduktase zu NADP⁺ oxidiert wird. Die Produktion von NADP⁺ kann durch Oxidation eines weiteren Reduktionsmittels nachgewiesen werden, wobei die Oxidation dadurch direkt oder durch Induzieren der einen oder mehreren weiteren Oxidations-Reduktions-Reaktionen eines der oben erzeugten Endproduktagenzien produziert.
Beispiele für Enzym-induzierte Oxidations-Reduktions-Ketten, welche die Verwendung von Reduktase und NADPH beinhalten, werden nachstehend angegeben.
Der Wandler kann einen Detektor umfassen, welcher ein wandelbares Endproduktagens nachweist, das in einer Reaktion erzeugt wird, die eine chemische Änderung in einem Coenzym beinhaltet, das mit der Reduktase oder einem Coenzym derselben assoziiert ist, und direkt oder indirekt durch die von der Reduktase erzeugten Reduktion hervorgerufen wird. Dieses Endproduktagens kann beispielsweise Photonen umfassen, die durch einen bekannten Photodetektor, z. B. ein Luminometer, nachgewiesen werden können. Alternativ kann das Endproduktagens Elektronen umfassen, die durch eine bekannte amperometrische Anordnung, die eine elektronenempfindliche Elektrode umfasst, nachgewiesen werden können. Das Endproduktagens könnte alternativ Protonen, Ionen, Wärme oder Masse umfassen, die jeweils kontinuierlich erfasst werden könnten, wie sie in Echtzeit produziert werden.
Wenn die Reduktase Quecksilber(II)-Reduktase ist, kann sie zusammen mit dem Nicotinamid-Enzym NADPH als Coenzym verwendet werden, welches durch die Reduktion von Hg(II) zu Hg(0) durch Quecksilber(II)-Reduktase zu NADP⁺ oxidiert wird.
Die Produktion von NADP⁺ kann durch Oxidation eines weiteren Reduktionsmittels nachgewiesen werden, wobei die Oxidation dabei direkt oder durch Induzieren von weiteren Oxidations-Reduktions-Reaktionen eines der oben erzeugten Endproduktagenzien produziert.
Beispiele für Enzym-induzierte Oxidations-Reduktions-Ketten, welche die Verwendung von Quecksilber(II)-Reduktase und NADPH beinhalten, werden nachstehend angegeben.
Quellen von Quecksilber(II)-Lyase und Quecksilber(II)-Reduktase für den Nachweis von Quecksilber auf die oben beschriebene Weise sind bekannt. Jedoch können Quecksilber(II)-Lyase und -Reduktase durch eine molekulare Klonierungstechnik hergestellt werden, in der DNA-Fragmente, welche das Lyase- und Reduktase-Gen kodieren, in vitro in Klonierungs-Vektor-Moleküle inseriert werden. Die rekombinanten Quecksilber(II)-Lyase- und -Reduktase-Klone werden isoliert und einer physikalischen und funktionellen Charakterisierung mit einer Reihe von Subklonierungs-Verfahren unterzogen. Schließlich bringt die Klonierung die Einverleibung von Transkriptions- und Translationssignalen mit sich, da die klonierten Kodierungssequenzen von Quecksilber(II)-Lyase und Quecksilber(II)-Reduktase starke endogene Transkriptions- und Translationssignale aufweisen sollten, die für den Wirt geeignet sind.
Der Biosensor des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung mit seiner Spezifität für gegebene Metall-Ionen weist viele potentielle Anwendungen für den Nachweis von irgendeinem der Metalle mit einem geeigneten Reduktase-Enzym auf, z. B. den oben angegebenen. Quecksilber ist beispielsweise eines der toxischeren Metalle, das in signifikanten Mengen in der Umgebung anwesend ist, und es ist wünschenswert, dass es in vielen Situationen genau nachgewiesen wird. Quecksilber ist selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen für Organismen toxisch, und anders als viele anderen Schwermetalle weist es keine bekannte vorteilhafte biologische Funktion auf. Metallisches Quecksilber ist mit biologischen Systemen etwas weniger reaktiv als die ionischen oder organischen Formen. In höheren Konzentrationen ist Quecksilber biozid, während niedrige Konzentrationen von Quecksilber(II)-Ionen mutagen und teratogen sind. Mehrere Tausend-fache Konzentrationszunahmen von Hg²⁺-Ionen über Hintergrundkonzentrationen sind der Verwendung von gecksilberhaltigen Fungiziden bei der Papierherstellung und in der Landwirtschaft, Quecksilber-Katalysatoren in der Industrie und der Verwendung von Desinfektionsmitteln in Krankenhäusern zuschreibbar. Allein in der Chloralkali-Industrie können mehr als 15 g Quecksilber in Form von Quecksilber(II)-Ionen pro jede erzeugte Tonne Chlor an die Umgebung verloren gehen. Das häufigste anorganische Quecksilber(II)-Salz ist HgS, das bis zu 7 Gew.-% Quecksilber des Erzes roter Zinnober umfasst. Einige 10¹⁰ Tonnen Fels (durchschnittlich 80 μg Hg/kg) werden global jedes Jahr verwittert, was 800 Tonnen Hg(II) in die Umgebung freisetzt; das ozeanische Reservoir von Quecksilber wird auf 200 Millionen Tonnen geschätzt. Die gelöste Hg(II)-Konzentration in Wasser liegt typisch im Bereich von 0,03 bis 2,0 μg/Liter (d. h. bis zu 10^–8 M). Natürlich liegt Quecksilber in der Umgebung hauptsächlich als Methylquecksilber vor, das aus der Biomethylierung von Quecksilber(II)-Ionen über Methyl-B₁₂ in Abwasser und Sedimenten entsteht. Arylquecksilber-Verbindungen sind industrielle Verunreinigungen, z. B. aus der Papierindustrie. Diese Organoquecksilber-Verbindungen sind teilweise aufgrund ihrer Bindung an Thiol-Gruppen in Proteinen und teilweise aufgrund ihrer Lipophilie toxisch, welche sie leicht durch biologische Membranen treten lässt und zu ihrer Akkumulation in der Nahrungskette führt. Methylquecksilber ist 50- bis 100-mal toxischer als anorganisches Hg²⁺ und hatte bei Minimata und Niigata in Japan in den 1950er Jahren durch den Verzehr von Meeresnahrung, welche Methylquecksilber(II)-Verbindungen enthielt, menschliche Vergiftungen zur Folge. Später wurden im Irak ähnliche Vergiftungen der Verwendung von Mehl zugeschrieben, das mit Alkylquecksilber-Fungiziden behandelt worden war.
Gemäß einer speziellen Form der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis einer interessierenden Metall-Spezies bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Ionen der nachzuweisenden Spezies einem Biosensor wie in dem ersten Aspekt aussetzt, wodurch das Reduktase-Enzym veranlasst wird, eine Reduktion der Metall-Spezies zu induzieren und dadurch durch Oxidation des Coenzyms ein Photonen-Endprodukt zu erzeugen, und die Endprodukt-Photonen durch einen Photodetektor nachweist.
Das Coenzym selbst kann die Photonen produzieren, oder diese können über ein oder mehrer andere Coenzyme produziert werden, die in einer biochemischen Coenzym-Kette wirken.
Die Photonen können durch das Enzym Luciferase produziert werden. Dieses kann zusammen mit NADPH z. B. auf die nachstehend beschriebene Weise in einer biochemischen Kettenreaktion verwendet werden.
Die Reduktasen in der speziellen Form der vorliegenden Erfindung können zweckmäßig zusammen mit dem Nicotinamid-Enzym NADPH als Coenzym verwendet werden, welches durch die Reduktion von Metall-Ionen durch die Reduktase zu NADP⁺ oxidiert wird. Die Produktion von NADP⁺ kann durch Oxidation eines weiteren Reduktionsmittels nachgewiesen werden, wobei die Oxidation dadurch direkt oder durch Induzieren von weiteren Oxidations-Reduktions-Reaktionen die Endprodukt-Photonen erzeugt.
Beispielsweise kann die Produktion von NADP durch die Oxidation eines Alkohols, z. B. eines primären oder sekundären Alkohols, z. B. eines aliphatischen Alkohols, wie Hexanol oder Octanol, zu dessen entsprechendem Aldehyd z. B. in Anwesenheit einer Alkohol-Dehydrogenase, z. B. TADH, die aus Thermoanaerobium brockii erhalten wird, nachgewiesen werden. Der so erzeugte Aldehyd kann durch Reaktion mit reduziertem Flavin FMNH₂ in Anwesenheit von Sauerstoff zusammen mit dem Enzym Luciferase zur Katalyse der Reaktion nachgewiesen werden. Luciferase kann aus Vibrio harveyi erhalten werden und ist im Handel erhältlich. Sie ist für die Anwesenheit von Aldehyd sehr empfindlich und kann so niedrige Konzentrationen wie pMol-Mengen nachweisen, wobei sie eine Lichtemission aus der Reaktion liefert, welche sie katalysiert. Die Intensität des emittierten Lichts liefert ein Maß für das NADP⁺, das in NADPH überführt wird, welches wiederum ein Maß für die vorhandene Metall-Ionen-Konzentration liefert. Beispiele für derartige Reaktionsketten sind nachstehend erläutert.
Bei dem Biosensor gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, das biochemische Agens oder die biochemischen Agenzien in enger Nachbarschaft zu dem Wandler zu immobilisieren und zu stabilisieren, so dass die Enzyme über lange Zeitspannen (z. B. Monate oder Jahre) aktiv bleiben und nicht aus dem Sensor verloren gehen. Wie im Stand der Technik kann eine Immobilisierung durch Adsorption auf einem organischen oder anorganischen Träger, physikalischen Einschluss in ein Gel, hinter einer semipermeablen Membran, durch Vernetzung mittels bifunktioneller oder multifunktioneller Reaktionen oder kovalente Bindung an den Wandler entweder direkt oder unter Verwendung eines Linkers erzielt werden.
Wenn der Wandler eine Elektrode umfasst, kann die Elektrode z. B. Wolfram oder glasartigen Kohlenstoff oder Scheiben oder Drähte oder Metall umfassen, das auf Kunststoff- oder Aluminiumoxid-Substrate gedruckt ist. Die Biochemikalie kann in geeigneten Fällen z. B. durch Siebdruck auf der Elektrode abgeschieden werden.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden mittels Beispielen mit Bezug auf die begleitende Zeichnung beschrieben, in der:
1 eine Schnitt-Endansicht einer Biosensor-Anordnung ist, welche die vorliegende Erfindung verkörpert;
2 eine Seitenansicht einer weiteren Biosensor-Anordnung ist, welche die vorliegende Erfindung verkörpert;
3 eine Seitenansicht einer alternativen Biosensor-Anordnung ist, welche die vorliegende Erfindung verkörpert;
die 4 bis 7 diagrammatische Darstellungen von biochemischen Reaktionen sind, die in Biosensoren verwendet werden können, welche die vorliegende Erfindung verkörpern.
Wie in 1 gezeigt, umfasst ein Biosensor eine immobilisierte und stabilisierte Enzymschicht 1, welche eine Metall-Reduktase enthält, die auf (der Unterseite von) einer Elektrode 2 abgeschieden ist, welche ein Substrat dafür bereitstellt, und eine semipermeable Membran 3 bedeckt die Schicht 1.
In Verwendung steht die Schicht 1 über die Membran 3 mit einer Probe einer wässrigen Lösung in Kontakt, welche möglicherweise die Metall-Ionen enthält, die nachgewiesen werden sollen. Durch eine Reihe von biochemischen Reaktionen auf eine der nachstehend beschriebene Weisen werden Metall-Ionen durch die Schicht 1 zu Metall reduziert, und als Ergebnis werden Elektronen erzeugt, wobei die Zahl der erzeugten Elektronen ein Maß für die Konzentration der Metall-Ionen ist. Die Elektrode 2 ist mit einem Potentiostat verbunden (nicht gezeigt), welcher wiederum ein Ausgangs-Spannungssignal an eine Anzeigeeinrichtung (nicht gezeigt) liefert, wobei die Größe des Signals ein Maß für die nachgewiesene Metall-Ionen-Konzentration ist.
Wie in 2 gezeigt, umfasst eine weitere Biosensor-Anordnung eine immobilisierte und stabilisierte Enzymschicht 11, die eine Reduktase enthält, welche mit einer semipermeablen Membran 13 beschichtet ist, in einer Probe 15 einer zu untersuchenden wässrigen Lösung, die in einem Gefäß 17 gehalten wird. Ein Lichtleitfaserkabel 19 ist über eine Zwinge 21 so angebracht, dass es an einem seiner Enden mit der Schicht 11 in Kontakt steht, wobei das andere Ende des Kabels 19 mit einem Photodetektor 23 verbunden ist, der innerhalb eines Luminometers 25 enthalten ist. Ausgangssignale aus dem Photodetektor 23 werden durch eine Elektronikeinheit 27 innerhalb des Luminometers 25 verarbeitet, und die Ausgangssignale werden sichtbar auf einer Anzeigeeinrichtung 29 angezeigt.
Bei der Verwendung der in 2 gezeigten Anordnung werden in der Probe 15 nachzuweisende Metall-Ionen durch Enzyme in der Schicht 11 auf eine der hierin beschriebenen Weisen reduziert, und Photonen werden durch eine geeignete Reihe von chemischen Reaktionen erzeugt, wobei die Zahl der Photonen ein Maß für die Konzentration der vorhandenen Metall-Ionen ist. Die Photonen werden über das Kabel 19 durch den Photodetektor 23 nachgewiesen, und das Ausgangssignal des Photodetektors wird verwendet, um die Anzeigeeinrichtung 29 zu betreiben, was eine Anzeige der Höhe der Konzentration der nachgewiesenen Metall-Ionen ergibt.
Die in 3 gezeigte Anordnung ist der in 2 gezeigten ähnlich, außer dass die immobilisierte Enzymschicht einen Teil des Luminometers bildet, das in 3 durch das Bezugszeichen 30 angezeigt ist, und so kein Lichtleitfaserkabel zwischen den beiden erforderlich ist. So werden in 3 Metall-Ionen in einer Probe 31 durch eine stabilisierte und immobilisierte Enzymschicht 33, mit der sie über eine semipermeable Membran 35 in Kontakt stehen, umgewandelt, und resultierende Photonen, die in der Schicht 33 erzeugt werden, werden direkt durch einen Photodetektor 37 nachgewiesen, welcher an die Schicht 33 angrenzt, die über eine Elektronikeinheit 39 ein Ausgangssignal für eine Anzeige auf einer Anzeigeeinrichtung 41 liefert.
Beispiele für immobilisierte Enzymschichten zur Verwendung in den obigen Ausführungsformen werden nun beschrieben. In jedem der folgenden Beispiele wird angenommen, dass Metall-Ionen bereits vorliegen. Andere Enzyme können erforderlich sein, um Komplex- oder Verbindungs-Metall- Spezies zu Metall-Ionen abzubauen, um das Verfahren einzuleiten. Beispielsweise kann Quecksilber(II)-Lyase in Verbindung mit Quecksilber(II)-Reduktase verwendet werden, um Organoquecksilber-Verbindungen in einfache Quecksilber(II)-Ionen zu überführen, wenn es erforderlich ist, Quecksilber nachzuweisen.
Beispiel 1: gekoppeltes Diaphorase/Methylviologen- (MV-) System
Dieses Beispiel ist in 4 veranschaulicht. Die Reduktase wird zusammen mit NADPH verwendet, um Metall-Ionen in einer gegebenen Probe nachzuweisen.
Die Reduktase bewirkt die Reduktion von Metall-Ionen, und das Enzym NADPH wird gleichzeitig zu NADP⁺ oxidiert. Dieses oxidierte Produkt wird durch Diaphorase aus Clostridium kluyveri und das Einelektronen-Reduktionsmittel (MV⁺) von Methylviologen (MV²⁺) wieder reduziert. Elektronen, die aus der Methylviologen-Oxidation freigesetzt werden, werden verwendet, um die Konzentration an vorhandenen Metall-Ionen anzuzeigen, z. B. auf die mit Bezug auf 1 beschriebene Weise.
Beispiel 2: gekoppeltes Peroxid-System
Dieses Beispiel ist in 5 veranschaulicht. In diesem Fall reduziert die Metall-Reduktase wiederum die nachzuweisenden Metall-Ionen, und NADPH wird zu NADP⁺ oxidiert. Das oxidierte Coenzym NADP⁺ wird enzymatisch mit L-Glutamat-Dehydrogenase (z. B. aus Rinderleber), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (z. B. aus Schweineherz) und Pyruvat-Oxidase (z. B. aus Pediococcus spp) wieder reduziert.
Das Produkt ist H₂O₂, wie in 5 veranschaulicht, und die Konzentration dieses Produkts kann direkt z. B. an einer Platin-Elektrode bei 0,7 V oder über eine vermittlerfreie Peroxidase-Elektrode unter Verwendung einer Pilz-Peroxidase, die aus Arthromyces ramosus erhalten wird, für die Oxidation von H₂O₂ in einer Phosphat-Pufferlösung bei pH 7,0 gemessen werden. Die Elektrode und die Enzymschicht können wie in 1 gezeigt angeordnet sein.
Beispiel 3: Biolumineszierendes gekoppeltes Luciferase-System, an dem Octanol beteiligt ist
Dieses Beispiel ist in 6 veranschaulicht. In diesem Fall reduziert die Reduktase die nachzuweisenden Metall-Ionen, und NADPH wird wiederum zu NADP⁺ oxidiert. Dieses oxidierte Produkt wird durch die Oxidation von Octanol zu Octanal wieder reduziert, welche durch das Coenzym Alkohol-Dehydrogenase, z. B. erhalten aus dem kommerziell erhältlichen Thermoanaerobium brockii, bewirkt wird.
Die Alkohol-Dehydrogenase ist in 6 durch TADH dargestellt. Das Octanal wird mit reduziertem Flavin, FMHN₂, in Anwesenheit von Sauerstoff und katalysiert durch Luciferase, LUC, umgesetzt, und die Produkte Octansäure, FMN-Oxidoreduktase und Wasser werden erzeugt, wie es in 6 veranschaulicht ist, und es wird verursacht, dass Licht erzeugt wird, und dieses kann auf die mit Bezug auf 2 oder 3 beschriebene Weise nachgewiesen werden.
Wie oben angemerkt, versprechen biolumineszierende Biosensoren aufgrund der enzymatischen Reaktion und einer Empfindlichkeit, die ausreicht, um Lichtquanten anzuzeigen, eine hohe Spezifität. Luciferase ist vorzugsweise das Enzym, das für die lichtemittierende Reaktion von leuchtenden Bakterien verantwortlich ist, und kann wie in 6 veranschaulicht verwendet werden, um die Reaktion von molekularem Sauerstoff mit reduziertem Flavin und aliphatischem Aldehyd unter Bildung von langlebigen Zwischenprodukten zu katalysieren, deren Abbau Energie bereitstellt, um mit vernünftig hoher Quantenausbeute (etwa 10%) wie folgt eine Lichtemission zu ergeben: FMNH₂ + RCHO + O₂ → FMN + RCOOH + H₂O + hν RCOH stellt den aliphatischen Aldehyd dar, und hν stellt Licht dar.
Das reduzierte Flavin wird in situ durch spezifische NAD(P)H : FMN-Oxidoreduktasen erzeugt NAD(P)H + FMN + H+ → NAD(P)⁺ + FMNH₂ und dadurch mit dem Zielsystem über die NADP⁺-abhängige Alkohol-Dehydrogenase gekoppelt.
Beispiel 4: Biolumineszierendes gekoppeltes Luciferase-System für die Nitrit-Reduktion
Dieses Beispiel ist in 7 veranschaulicht. Das Verfahren wird auf ähnliche Weise durchgeführt wie diejenige, die in 6 veranschaulicht ist, außer dass in diesem Fall die Zurückreduktion von NADP⁺ durch die Oxidation von Decanol zu Decanal durch das Coenzym Dehydrogenase bewirkt wird, das z. B. aus dem kommerziell erhältlichen Thermoanaerobium brockii erhalten wird.

Claims

Biosensor zum Nachweisen von Ionen eines Metalls, welche durch ein Metall-Reduktase-Enzym reduziert werden können, wobei der Biosensor einen Wandler sowie ein Enzym-Gemisch umfaßt, das ein Metall-Reduktase-Enzym und ein erstes Coenzym enthält, welches in einem reduzierten Zustand und einem oxidierten Zustand vorliegen kann und welches durch die Reduktion von Metall-Ionen durch das Metall-Reduktase-Enzym von seinem reduzierten Zustand in seinen oxidierten Zustand überführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym-Gemisch, welches das Metall-Reduktase-Enzym und das erste Coenzym enthält, immobilisiert ist; und der Biosensor außerdem ein oder mehrere andere Coenzyme in einer chemischen Coenzym-Kette umfaßt, wobei das eine andere Coenzym oder die mehreren anderen Co-Enzyme ein Signal erzeugt bzw. erzeugen und das Signal durch den Wandler nachgewiesen wird.
Biosensor nach Anspruch 1, bei welchem die Metall-Ionen aus der Gruppe bestehend aus Quecksilber, Chrom, Arsen, Technetium, Kupfer, Silber, Gold, Selen, Vanadium, Molybdän und Uran ausgewählt sind.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei welchem die nachzuweisenden Metall-Ionen als Komplex oder als Verbindung vorliegen und der Biosensor außerdem ein chemisches oder biochemisches Agens umfaßt, um den Komplex oder die Verbindung in seinen/ihren einfachen Metall-Ionen-Zustand zu überführen, so daß dieser durch das Metall-Reduktase-Enzym nachgewiesen werden kann.
Biosensor nach Anspruch 3, bei welchem das Metall-Reduktase-Enzym Quecksilber-Reduktase und das biochemische Agens Organoquecksilber-Lyase ist, so daß Quecksilber(II)-Ionen bereitgestellt werden, welche daraufhin durch das Metall-Reduktase-Enzym nachgewiesen werden können.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Signal Photonen, Elektronen, Protonen, Ionen, Temperatur oder Masse umfaßt, wobei diese sämtlich kontinuierlich in Echtzeit durch das Detektionsmittel nachgewiesen werden können, wie sie erzeugt werden.
Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das erste Coenzym in seinem reduzierten Zustand NADPH und in seinem oxidierten Zustand NADP⁺ ist.
Biosensor nach Anspruch 6, bei welchem NADP⁺ in Anwesenheit des Einelektronen-Reduktionsmittels Methylviologen und von Diaphorase zu NADPH reduziert wird, wobei das Methylviologen-Reduktionsmittel weiter oxidiert wird und diejenigen Elektronen, die durch die Oxidation des Methylviologen-Reduktionsmittels freigesetzt werden, dazu genutzt werden, die Konzentration von anwesenden Metall-Ionen anzuzeigen.
Biosensor nach Anspruch 7, bei welchem die Reduktion von NADP⁺ zu NADPH durch Diaphorase bewirkt wird.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem das NADP⁺ enzymatisch durch eine H₂O₂-erzeugende Zusammensetzung zu NADPH reduziert wird, die aus L-Glutamat-Dehydrogenase, Glutamat-Pyruvat-Transaminase und Pyruvat-Oxidase besteht, und bei welchem die Konzentration direkt unter Verwendung einer Elektrode gemessen wird.
Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei welchem das eine andere Coenzym oder die mehreren anderen Coenzyme Alkohol-Dehydrogenase ist.
Biosensor nach Anspruch 10, bei welchem das eine andere Coenzym oder die mehreren anderen Coenzyme Alkohol zu Aldehyd oxidiert bzw, oxidieren, wobei Luciferase verwendet wird, um eine Oxidation des Aldehyds zu katalysieren.
Biosensor nach Anspruch 11, bei welchem die Luciferase Photonen erzeugt und das Mittel zum Nachweisen des Ausmaßes der Oxidation einen Photodetektor umfaßt.
Biosensor nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, bei welchem die Oxidation von Aldehyd durch eine Reaktion des Aldehyds mit reduziertem Flavin in Anwesenheit von Sauerstoff zusammen mit der Luciferase bewirkt wird.
Verfahren zum Nachweisen von Metall-Ionen, wobei das Verfahren umfaßt, daß die Metall-Ionen einem Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche ausgesetzt werden.