SE520302C2 - Metalljonspecifik kapacitanssensor - Google Patents

Description

20 25 520 30% 1990 4747-4751]. Ett tredje protein, PbrR (SEK. ID. NR. 3) från stammen Alcalige- nes eutrophus CH34 (stammen är deponerad vid BCCM under tilldelningsnum- rer LMG P-isøvv) är Scream för Pb? En fjärde protein, Merr (SEK. 1D. NR. 4), är selektivt för Hgæ. Det antas att en stor konfoimationsförändring äger rum när tungmetalljoner binder till dessa proteiner. Denna uppfinning beskriver en kapacitiv sensor som direkt kan detektera dessa konfoimationsförändringar.

Självsammansättande enkelskikt av tioler, sulfider och disulfider på guldelektroder har studerats i stor omfattning och man vet att långkedjiga alkantioler bildar isole- rande välorganiserade strukturer på guldsubstrat [M.D. Porter; TB. Bright; D.L.

Allara; C.E. Chidsey, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3559-3568]. Den bindning som bildas mellan svavelatomen och guld är mycket kraftig och de bildade självsamman- sättande enkelskikten (SAM) är stabila i luft, vatten och organiska lösningsmedel vid rumstemperatur [C.D. Bain; E.B. Troughton; Y.-T. Tao; J. Evall; GM. Whitesides; R.G. Nuzzo J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 32l-335]. Det har fö- reslagits att rnikrokontaktprinting [M. Mrksich; GM. Whitesides 'lïbtech 1995, 13, 228-235] och fotolitografier [S.K. Bhatia; JJ. Hickman; F.S. Ligier J. Am. Chem.

Soc. 1992, 114, 4432-4433] kan användas för att erhålla mönstrade ytor med funk- tionaliserade självsaminansättande enkelskikt med avseende på framställning av bio- sensorer, och dessa till en låg kostnad för ett stort antal tillämpningar, men hittills har det inte varit möjligt att framställa direkta affinitetssensorer med hög känslighet.

Sammandrag av uppfinningen Det har nu visat sig att oväntat bra metalljonspecifika kapacitetsaffinitetssensorer som lämpar sig för bestämning av närvaron av en viss tungmetalljon genom kapaci- tansmätning, kan framställas genom ett förfarande omfattande stegen att: 10 is 20 25 30 3 520 302 a) tillhandahålla ett stycke av en ädelmetall, där nämnda stycke eventuellt kan vara en stav, eller altemativt ett stycke av ett isolerande material såsom glas, kisel eller kvarts, på vilket en ädelmetall spottats eller tryckts; b) tillhandahålla en första SAM-bildande molekyl omfattande en kopplingsgrupp och/eller grupper som specifikt binder till nämnda tungmetalljon; c) låta stycket i steg a) komma i kontakt med den första SAM-bildande molekylen i steg b), för att därigenom erhålla ett självsammansättande enkelskikt på nämn- da ädelmetallyta; d) låta nämnda självsammansättande enkelskikt på nämnda ädelmetallstycke komma i kontakt med en molekyl som specifikt binder till nämnda tungmetall- jon i det fall den första SAM-bildande molekylen inte omfattar en grupp som specifikt binder till nämnda tungmetalljon, för att därigenom koppla nämnda molekyl till det självsammansättande enkelskiktet; e) låta stycket som erhållits i steg c) eller d) komma i kontakt med en andra SAM- bildande molekyl, för att därigenom erhålla en ädelmetallyta som åtminstone till 99% är täckt med ett självsammansättande enkelskikt.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen De detektionsgränser som rapporteras i samband med denna uppfinning är flera storleksordningar bättre än de som tidigare rapporterats i samband med elektroke- miska metalldetektionsförfaranden. Insikten bakom denna uppfinning är att igen- känningsskiktet måste vara tunt, välordnat, och det måste täcka åtminstone 99% av sensorytan. I ett efterföljande steg ”pluggas” eventuella fria ytor mellan igenkän- ningselementen, d v s de täcks med en andra molekyl som bildar ett självsamman- sättande enkelskikt, exempelvis en alkantiol omfattande 3-25 kolatomer företrädes- vis i en rak kedja, efter erhållande av ett sj älvsammansättande enkelskikt omfattande affinitetsgrupper, vilka därigenom ökar tätheten och isoleringen. En kapacitiv bio- sensor täcks av ett immobiliserat skikt med igenkänningselementet mot 10 15 20 25 30 520 302 4 lösningen. Ur ett elektriskt perspektiv är detta ekvivalent med en kondensator mellan den ledande metallelektroden och den ledande lösningen.

Vilken del som helst av ytan som gör det möjligt för den vattenbaserade lösningen att tränga in under det plan där igenkänningen äger rum fungerar som ett kortslutan- de element. Kapacitansen kommer således att öka beroende på den högre dielektri- citetskonstanten hos den inträngande vattenbaserade lösningen. Oxidskikt är inte välordnade och det är därför omöjligt att bilda ett tätt igenkänningslager. Självsam- mansättande enkelskikt är mycket bättre ordnade och en mer perfekt täckning kan därför förväntas i de immobiliserade skikten. Vidare är de självsammansättande en- kelskikten mycket tunnare än oxidskikten, vilket resulterar i en större kapacitans i serie med den kapacitans som bildas när molekyler bindes till ytan. Detta gör det enklare att detektera förändringar i kapacitansen då en analys binder till ytan.

Denna uppfinning beskriver en affinitetssensor för att detektera tungmetalljoner i spårhalter, eventuellt baserat på gentekniskt förändrade proteiner. En specifik tung- metallbindande substans kopplas till en ledarrde yta. Birrdning av den önskade tungmetalljonen till nämnda substans förorsakar' en konformationsförändring vilken är associerad med en kapacitansförändring. Det yrnpade igenkännirrgsskiktet bör va- ra elektriskt isolerande för att förhindra störningar från redoxpar i elektrolyten och kraftiga Faraday-strömmar som bakgrundsbrus. På andra sidan bör det vara så tunt som möjligt för att hög känslighet skall kunna uppnås. Användning av självsamman- sättande bindning till guld eller andra självsarrrrnarrsättarrde rnetaller ger särskilt tun- na och kompakta skikt. Uppfrnningen visar även hur ytterligare isolering kan erhål- las genom pluggning med en annorlunda typ av självsarnrnansättarrde molekyl.

Således hänför sig denna uppfinning till ett förfarande för framställning av en me- talljonspecifrk kapacitetsaffinitetssensor, i vilken ett stycke ädelrrretall är belagt med ett skikt av ett självsamrrransättarrde enkelskikt omfattande affinitetsgrupper. Senare täcks eventuella fria ytor på ädelmetallen med en andra rnolekyl som bildar själv- sammansättande enkelskikt. 10 15 20 25 520 302 5 I en annan aspekt hänför sig denna uppfinning till en metalljonspecifik kapacitetsaf- finitetssensor omfattande ett ädelmetallstycke som väsentligen fullständigt belagts med ett självsammansättande enkelsikt omfattande affinitetsgrupper som specifikt binder till en viss intressant molekyl.

I ytterligare en aspekt hänför sig denna uppfinning till ett förfarande för att kvalita- tivt eller kvantitativt bestämma närvaron av en viss intressant tungmetalljon. En metalljonspecifik kapacitetsaffinitetssensor omfattande en ädelmetallym som vä- sentligen fullständigt belagts med ett självsammansättande enkelskikt omfattande affinitetsgrupper som specifikt binder till en viss intressant tungmetalljon får komma i kontakt med ett vätskeforrnigt prov omfattande den intressanta tungmetalljonen och sensoms kapacitansförändring bestäms. l ytterligare en aspekt hänför sig denna uppfinning till användning av nämnda senso- rer för analys av vissa intressanta turigrnetalljoner, såsom Znzi, Hgzi, Cdzl, Cuzi och Pb”.

Definitioner: De här använda tennerna ”självsammansättande enkelskikt” och ”SAM” är synony- mer och hänför sig till den spontana absorptionen av filmkomponenter från en lös- ning på en fast yta som bildar ett välordnat enkelskikt. Ett sådant skikt på guldsub- strat har tidigare beskrivits [MD Porter; T.B. Bright; DL. Allara; CED. Chidsey J. Am. Chem. S06. 1987, 109, 3559-3568] Den här använda termen “ädelmetall” hänför sig till en metall vald ur gruppen be- stående av guld, silver, koppar, platina och palladium. Guld är föredraget. 10 15 20 25 30 . »s 1- _ , _.

-'. I. ' I I. .-~ i., I: :'\.. i” '1 l -- v - 6 , i i i -f * ' ' Här använda terrnema ”grupp/molekyl som specifikt binder till en viss intressant t1mgmetalljon”, hänför sig till en grupp resp. en molekyl som specifikt binder till en viss tungmetalljon. Vilken molekyl som helst med sådana bindningskännetecken kan användas i samband med denna uppfinning. Exempel på sådana molekyler är kelate- rande föreningar och vissa proteiner. I en föredragen utföringsfonn används protei- nema med sekvenser enligt någon av SEK ID. NR. l, SEK. ID. NR. 2, SEK ID.

NR. 3 och SEK ID NR. 4.

Den här använda termen ”SAM-bildande molekyl” hänför sig till en molekyl med förmågan att bilda ett självsammansättande enkelskikt på en ädelmetall. En SAM- bildande molekyl omfattar åtminstone en tiol, sulfid eller disulfidgrupp och kan eventuellt också omfatta en tungmetallbindande grupp. När en lämplig tungmetall- bindande molekyl, exempelvis ett protein eller en peptid, omfattar en tiol, sulfid el- ler disulfidgrupp, kan den vara en SAM-bildande molekyl i sig själv. De flesta tungmetallbindande molekyler är, emellertid, inte i sig själv SAM-bildande mole- kyler. De måste kopplas till små SAM-bildande molekyler i ett separat steg. Exem- pel på sådana små SAM-bildande molekyler är I,2-ditiolan-3-pentansyra och cys- teamin. Detta kopplingssteg utförs efter bildande av ett självsammansättande enkel- skikt på ädelmetallytan. Fackmannen känner väl till hur man väljer lämpliga kopp- lingsreaktioner och kopplingsgiupper, l följande exempel aktiveras det självsam- mansättande enkelskiktet bestående av l,2-ditiolan-3-pentansyra av 1-(3- dimetylaminopropyl)-3-etyl-karbodiimid. Därefter kopplas en tungmetallbindande molekyl till det aktiverade enkelskiktet. Enielleitid beskrivs andra liknande kopp- lingsreaktioner i litteraturen.

Den här använda termen ”pluggnirig” hänför sig till behandling i en lösning inne- hållande en tiol, sulfid eller disulfid efter immobilisering av affinitetsgiuppen till antingen ett självsalnmarisättaride enkelskikt på en ädelmetallyta eller, i det fall då affinitetsmolekylen omfattar tillgängliga tiol-, sulfid- eller disulfidgrupper som gör att affinitetsmolekylen kan vara en SAM-bildande molekyl i sig själv, direkt till ädelmetallytan, för att blockera eventuellt obelagda fläckar på nämnda yta. Som re- 10 15 20 25 30 520 502 flw33wqu@y¿:. g 7 l dan nämnts är det nödvändigt att ädelmetallytan är så fullständigt täckt som möjligt av ett SAM för att optimera sensoms känslighet.

Den här använda termen ”tungmetalljon” hänför sig till metalljoner med atomnum- mer högre än 21, såsom joner av Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Zr, Nb, Mo, Ru, Ph, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Ta, W, Re, Os, lr, Pt, Au, Hg, Tl, Pb och Bi. Denna uppfinning är särskilt användbar för att bestämma närvaron av Znzl, Hgzl, Cdzl, Cuzloch Pb”.

Den här använda termen ”funktionella derivat” hänför sig till derivat i vilka den ur- sprimgliga aminosyrasekvensen har modifierats eller förändrats genom insättning, tillägg, substitution eller uteslutning av en eller flera aminosyror, såväl som derivat innehållande multiplar av den ursprungliga sekvensen eller delar av denna.

Den här använda termen ”SCE” betyder mättad kalomelelektrod; potentiostatisk perturbering avser en snabb förändring i potential. PEGDGE betyder polyetylengly- kol-diglycidyl-eter. BSA betyder iiötkretatursseruiiialbumin.

I denna uppfinning får en lösning innehållande de tungmetalljoner som skall be- stämmas ha elektrisk kontakt med en ledande yta omfattande igenkärmingselementet efter vilken kapacitans- eller impedansförändringen bestäms. Kapacitansförändring- en äger rum mellan lösningen och en inetallyfta, bestående av fast metall eller metall som spottats på en underliggande icke-ledande yta. Faraday-reaktioiier med metallen såväl som bakgrundsströmmar blockeras av igenkäiiiiingselemeiitet på ytan, och denna blockering förbättras senare genom behandling med hjälpföreningar som för- bättrar isoleringen. Igenkänningseleinentet är bundet till metallytan, antingen direkt genom självsammansättning, eller genom bindning till en självsainmansättande fö- rening på elektroden. Den kan även bindas genom adsoiption, polymerisation eller beläggning. Mätningar utförs genom att lägga på elektroden varierande spänningar genom att utnyttja potentiostatiska metoder och analysera strömförändringama.

Känsligheten kan förbättras genom att låta en lösning innehållande en andra specifik 10 15 20 25 520 302 ¿,» 8 s ligand bindas till analysen redan på ytan, för att därigenom öka storleken hos det bundna aggregatet och kapacitetsförändringen.

Uppfrnningen kommer nu att beskrivas mer i detalj med hänvisning till de bifogade figurema.

Fig. 1 visar schematiskt hur ett tungmetallspecifikt protein immobiliseras på metal- lytan och hur dess tredimensionella konfonnation förändras då tungmetalljoner bin- der till proteinet.

Fig. 2 visar flödesmätcellen, a) rnätrringselektrod, b) lrjälpelektroder av platinafolie, c) referenselektroder av platinatråd, d) Ag/AgCl-referenselektrod.

Fig. 3 visar responsen för koppar i samband med elektroder som irnmobiliserats med GST-SmaA-protein med EDC-förmedlad koppling (övre kurvan) och PEGDGE- infonnning (lägre kurvan). Se Exempel l för ytterligare detaljer.

Fig. 4 visar resultat med cyklisk voltametri uppmätt i en Fe(CN)(,3'-lösning då mä- telektroden var a) omodifrerat guld, b) guld rnodifrerat med l,2-ditiolan-3- pentansyra, c) som i b med ytterligare modifiering med det immobiliserade fusions- proteinet GST-SnrtA och d) som i c med ytterligare modifiering med l-dodekantiol.

Ytterligare detaljer ges i Exempel 2.

Fig. 5 visar kapacitansförändring som funktion av turrgrnetalljonkoncentration för en GST-SmtA-immobiliserad elektrod. Kurva l) visar responsen för Znzi, kurva 2) för Hgzi, kurva 3) för Cdz' och kurva 4) för Cu”. Mätningarna utfördes i 100 mM bo- ratbuffert, pH 8,75 i en flödeshastiglret av 0,5 rnl/min. Prover med en volym på 250 um injicerades. Se Exempel 3 för ytterligare detaljer. , ï,.:t__r*,¿'»; 12 É' :vill 10 15 20 25 30 52Û 302 w,«f3%f=°«;-tf q-ig _- g _ i 9 . _ Fig. 6 visar kapacitansförändiingar som funktion av Cuzïkoncentration för elektro- der som utnyttjar EDC-koppling av proteiner. Den övre kurvan visar signalen för GST-SmtA-baserade elektroder och den lägre kurvan representerar den signal som registrerats av en blank elektrod med BSA på ytan. Mätningama utfördes i 100 mM boratbuffert, pH 8,75 i en flödeshastighet av 0,5 ml/min. Prover med en volym på 250 um injicerades. Ytterligare detaljer ges i Exempel 3.

Fig. 7 visar kapacitansförändiingar som funktion av Cuzi-koncentration inom inter- vallet 1045 M till 0,1 M. Mätningama utfördes i 100 mM boratbuffert, pH 8,75 och en flödeshastighet på 0,5 ml/min. Prover med en volym på 250 um injiccrades. Se Exempel 3 för detaljer.

Fig. 8 visar en stabilitetsstudie för en GST-SmIA-elektrod enligt denna uppfinning.

En kalibreringskurva från l femtomolar till 100 picomolar registrerades var dag och den totala kapacitansförändringen som funktion av tid registrerades. Mellan mät- ningama lagrades sensorn vid 4°C i 100 mM boratbuffert pH 8,75. Detaljer ges i Exempel 3.

Fig. 9 visar kapacitansförändringar som funktion av tungmetalljonkoncentration för en MerR-immobiliserad elektrod. Kurva l) visar resultaten för Cdzi, kurva 2) för Cu” och kurva 3) för Hgzf Mätningama utfördes i 100 mM boratbuffert, pH 8,75, och en flödeshastighet på 0,5 inl/niin. Prover med en volym på 250 um injiccrades.

Mer detaljer ges i Exempel 4.

Om en fast metallmätelektrod används poleras en guldstav på typiskt 3 mm i dia- meter, rengörs och belåggs genom självsaininansättning med ett igenkänningsele- ment eller med en förening som kan kopplas till ett igenkänningselement. Ett stolt antal kopplingsförfaranden är kända och kan användas som läinpliga alternativ för de som beskrivs i exemplen. Det är även möjligt att utnyttja metall som spottats eller tryckts på glas, kvarts, kisel eller något annat isolerande material som engångselek- 10 15 20 25 30 520 302 ' O 10 ¿ i » troder. Efter rengöring beläggs elektroderna i en sats och sätts in i en snabbansluten mätcell. Ett antal olika igenkänningselement kan immobiliseras på samma spottade elektroder om de separeras genom isolerande delar och ansluts till potentiostaten med strömställare som kan kontrolleras av en mikroprocessor.

Den inverterade kapacitansen är summan av de inverterade kapacitansema för varje skikt i serien, 1,2-ditio1an-3-pentansyraskikteg proteinskiktet och kapacitansen mellan dubbelskiktet och lösningen. Om en av dessa är liten i förhållande till det andra kommer den att dominera den totala kapacitansen. I synnerhet om självsam- mansättande delar ger upphov till en liten kapacitans kulminerar detta över kapaci- tansema i igenkänningsytskiktet. Förändringar i igenkänningsskiktet kommer såle- des att ha liten effekt på totalkapacitansen vilket resulterar i en låg totalkänslighet för sensom.

Elektroden sätts in i en cell som antingen kan vara av kuvettyp eller en flödescell såsom visas i Fig. 2. Cellen måste innehålla en hjälpelektrod, typiskt en platinafolie vilket bör placeras symmetriskt och mitt emot mätelektroden. En referenselektrod, typiskt SCE eller Ag/AgCl, placeras i cellen så att spänningsfallet mellan referens- och mätelektrodema beroende på kapacitiva eller Faraday-strömmar blir mycket små. l några fall kan resultatet förbättras om en mycket liten ytterligare referense- lektrod används, se Fig. lc och SCE-referensen flyttas, Fig. ld. En flödescell ger noggrannare kontroll över massöverföriiigeri till inätelektroden och irijiceringen av prover och rengöringen automatiseras enklare. Flödesceller med volymer på 2 ml och 10 ul befanns ha ungefär samma känslighet. En flödescell med engångselektro- der framställda av spottat guld på kisel hade också liknande egenskaper.

Elektroderna ansluts till en snabb potentiostat vilken i sin tur kontrolleras av en mikroprocessor. Potentiostaten håller mätelektroden vid ett i förväg inställt värde i förhållande till referenselektroden. En potentiostatisk peiturbation läggs på mäte- lektroden. Det kan vara en sinusform av våg, det kan vara en stegvis spänning eller 10 15 20 25 30 520 302 11 någon annan vågform som möjliggör tolkning av resultaten. Strömmarna som föror- sakas av peiturbationsspänningen används för utvärdering av kapacitansen hos mä- telektroden. Detta kan göras i samband med sinusfonnade perturbationer genom att separera infasdelen och utfasdelen av strömmen i en inslutningsförstärkare. Om detta upprepas vid olika frekvenser kan ett impedansspektrum erhållas. I alla fall kan kapacitansen beräknas från strömsvaren. Som vanligt i elektrokemi kan rollen hos spänning och potential bli omvänd, d v s ett galvanostatiskt steg i ström och orsaka en potentialförändring. Denna förändring kan användas för beräkning av kapacitan- sen, men andra algoritmer utnyttjas i så fall.

En känd provvolym blandas normalt med en känd volym av en ledande vätska i ex- empelvis i en kuvett i en cell av satstyp. l en flödescell injiceras en känd volym i ett ledande bärarflöde som pumpas med en viss flödeshastighet. De ledande vätskoma är nonnalt buffertlösningar med jonstyrkor från nägra få millimolar och uppåt. Pro- vet kan förekomma i ett icke-ledande medium men en ledande lösning måste fylla cellen då mätningar utförs.

Denna uppfinning kommer nu ytterligare att beskrivas med hänvisning till följande exempel. Exemplen ges för infoimationsändaxiiål och är inte avsedda att begränsa omfånget hos denna uppfinning.

Exempel 1 Fusionsproteinema GST-SnilA och MerR framställdes såsom beskrivits nedan och löstes i fosfatbuffrad saltlösning (70 mM NaCl, 1,3 mM KCI, 5 mM Na2HPO4, 0,9 mM KH2PO4, pH 7,3) innehållande 50% (volym/volym) glycerol till en slutkon- centration på l mg protein/ml. l,2-ditiolaii-3-pentansyra och glutaraldehyd erhölls från Sigma och 1-(3-diinetylaininopropyl)-3-etyl-karbodiimidliydroklorid erhölls från Fluka. l-dodekantiol och guldstavama som användes som elektroder (katalognr. 26 583-7, = 3 mm) kom från Aldrich Chemicals. Tungmetallema CuCIJZHQO, ZnClg, HgClz och Cd(NO_;)2*4H2O kommer alla från Merck 10 15 20 25 .. .- i ' "" U. w-Ö: '_,",, , = u i f . Ä :i -i -- 'ß ' ' f ' , I 'J- ,.. h.. n. .ri -_ (I ' _ , i l- l2 (Darmstadt, Tyskland). PEGDGE erhölls från Polysciences Inc. (USA). Alla andra reagens som utnyttjades var av analytisk kvalitet.

Biosensorema framställdes genom att immobilisera fusionsproteiner på guldytan genom EDC-förmedlad koppling, PEGDGE-informning eller glutaraldehydkopp- ling. I alla fall späddes 20 um av de lösta fusionsproteinema med 480 iiml 100 mM boratbuffert, pH 8,75 och lösningen ultrafiltrerades med ett mikrofilter (Amicon, USA) med ett molekylärt brottvärde på 3 000D. Efter ultrafiltreringen vändes filtret för att tillvarata fusionsprotein och dess koncentration justerades till 0,04 mg/ml i boratbuffert. Guldelektroder rengjordes och förbehandlades med självsammansätt- ning av tioktinsyra, såsom tidigare beskrivits av Berggren och Johansson [C. Berg- gren, G. Johansson, Anal. Chenz., Lämnad för publicering]. Eftersom MerR- proteinet är känsligt för oxidation i luft utfördes framställning av dessa elektroder under kvävgasatrnosfar.

EDC-fiirmedlad koppling: De självsainriiaiisättaiide elektrodema tvättades noga med etanol, torkades och aktiverades därefter i en 1% lösning av l-(3- dimetylaminopropyl)-3-etyl-karbodiimidhydroklorid i torr acetonitril under 5 tim- mar. Efter tvättning med 100 mM boratbuffeit, pH 8,75, doppades elektrodema i proteinlösningen vid en temperatur på 4°C under 24 timmar. Därefter tvättades varje elektrod noga med boratbuffeit och doppades i en lösning av l-dodekantiol under 20 minuter.

PEGDGE-irg/iirnining: l,2-ditiolan-3-pentansyra-aktiverad elektrod täcktes med 1,5 ul av en 0,04 mg/ml proteinlösning i 100 mM boratbuffeit innehållande 30% (vikt/vikt) PEGDGE och elektroden inkuberades vid 45°C under l5 minuter. Efteråt behandlades elektroden med l-dodekantiol under 20 minuter, tvättades med borat- buffert och placerades i niätcellen. 10 15 20 25 30 . , .. .. .« . . tt.. ... ... _, , _ . . .- . x, -- - - _ _ . - . .r f. »r :rj , . r . . p» . - > ' _ , , . f - t : ø- _' u' ., ,, d. .. i . . 13 Glutaraldehydkoppling: Före glutaraldehydimmobilisering modifierades elektro- den med cysteamin, i stället för 1,2-ditiolan-3-pentansyra Den torkade elektroden doppades i en lösning innehållande l2,5% (vikt/volym) glutaraldehyd i kopplings- buffert (0,1 M natriumfosfat, 0,15 M NaCl, pH 7) och 6 g/l NaCNBH3 under 4 tim- mar. Därefter tvättades elektroden noga med kopplingsbuffert och doppades i pro- tein1ösning(0,04 mg/ml) tillsammans med 6 g/l NaCNBH3 under 4 timmar. Slutli- gen tvättades elektroden noga med kopplingsbuffert före användning.

Kapacitetsmätningar: Biosensom arrangerades som arbetselektrod i ett tre-elektrodsystem anslutet till en fast potensiostat, såsom visas i Fig. l. Den place- rades i en flödescell med en dödvolym på 10 ul vilken byggdes på laboratoriet. En latinafolie fungerade som hjälpelektrod och en platinatråd som referenselektrod. En extra referenselektrod (Ag/AgCl) placerades i utgångsströmmen, då platina inte har en definierad potential. Buffertlösningen pumpades med en peristaltisk pump med en flödeshastighet på 0,5 ml/min genom flödescellen. Prover injicerades i flödet via en 250 ul provloop. Den använda buffeiten var 10 mM borat, pH 8,75. Före an- vändning filtrerades den genom ett 0,22 um milliporefrlter och avgasades.

Arbetselektroden hade en vilopotential på O mV i förhållande till Ag/AgCl- referenselektroden. Vid rnätning applicerades ett potentialsteg på 50 mV och ström- övergången som följde då potentialen ökades antogs följa ekvationen: i(t)=u/RSexp(-t/RS*C,) (1) där i(t) är ställningen vid tiden t, u är amplituden hos den pålagda potentialpulsen, R är resistensen mellan guldelektroden och referenselektroden, Cl är den totala kapa- citansen över det immobiliserade skiktet och t är den tid som gått efter det att po- tentialpulsen applicerats. Strömvärdena samlades upp med en frekvens på 50 kHz och de första tio värdena användes i beräkningen av kapacitansen. Varje kapacitans- värde uträknades som medelvärde av tio mätningar. 10 15 20 25 30 520 302 14 Med kapacitansmätningar studeras gränsytan mellan en ledande elektrod och prov- lösningen. Denna gränsyta kallas det elektriska dubbelskiktet då laddningar och di- poler orienteras med motsatta tecken efter den ledande ytan och lösningen. Då det tungmetallspecifika proteinet iinmobiliseras på elektrodytan byter det ut buffertlös- ningen vid ytan och en laddningsseparation äger rum, vilket leder till en minskning av kapacitansen. Den detektionsprincip som används i detta arbete baseras på regist- rering av en konformationsförändring som ett resultat av en specifik bindning av en viss tungmetalljon till ett immobiliserat protein på elektrodytan (se Fig. 2). Då sen- sorn mäter förändringar i konfotmation är det viktigt att optimera immobiliserings- förhållandena.

Immobilisering av igenkänningselementet: En guldelektrod användes som ledande ädelmetallyta i detta arbete. För att immobilisera igenkänningselementen, vilka var olika funktionsproteiner, måste guldytan modifieras på något sätt. Ett välkänt och enkelt förfarande är att använda självsaminansättiiiiig av tiol-, sulfid- eller disulfid- föreningar på guldytan. Självsaininansättiiing är en spontan process som ger upphov till välordnade enkelskikt av molekyler. Vidare är bindningen mellan svavel och guld ganska stark, en viktig stabilitetsaspekt i samband med utformning av biosenso- rer, där förlust av igenkänningselementet resulterar i förlust av aktivitet. Tre olika immobiliseringsförfaranden studerades för att ge en optimal yta för kapacitansmät- ningar, nämligen; EDC-fönnedlad koppling, PEGDGE-iiifomiiiiiig och glutaralde- hydkoppling. 1 alla fall fick en koit förening imieliållaiide en eller flera svavelgrup- per först självsammansättas på guldytan. Den EDC-förmedlade kopplingen produce- rar ett enkelskikt av proteinmolekyler på ytan utan någon tvärbindiiing mellan en- skilda molekyler. Detta förfarande har tidigare visat sig vara framgångsrikt för im- mobilisering av antikroppar på guldelektroder med självsammansatt tioktinsyra på ytan [C. Duan; M.E. Meyerhoff, Anal. (Üheni, 66, 1994, 1369-1377] Med PEGD- GE-iminobilisering kommer proteinet att iiifångas i ett polymeriiätverk, där tung- metaller kan diffundera in i polyinerens porer. Kalibreringskurvor på koppar visas i Fig. 3 för EDC-koppling (övre kun/an) och PEGDGE-infoimning (nedre kurvan) för 10 15 20 25 30 520 302 15 proteinet. Det visade sig att känsligheten var mycket högre för den EDC-aktiverade elektroden. En möjlig förklaring kan vara att PEGDGE-inforrnning förhindrar kon- formationsförändringen hos fusionsproteinet i en viss utsträckning. Reproducerbar- heten var även lägre för PEGDGE-elektroder, p g a svårigheten att avsätta exakt samma mängd protein/tvärbindare för varje elektrod. Ytterligare experiment kom- mer att utföras med mindre PEGDGE-koncentration för att minska tvärbindningen och därigenom ge ett mindre styvt proteinskikt. Glutaraldehyd är också en tvärbin- dare, men i detta fall aktiverades ytan först med glutaraldehyd före tillsats av protei- net. Även i detta fall är det mycket viktigt att optimera mängden tvärbindare för att inte tvärbinda proteinet för mycket, och göra det styvt och inte mottagligt för kon- formationsförändringar. Alla ytterligare experiment utfördes med elektroder som framställts genom EDC-förfarandet.

Exempel 2 Cykliska voltammogram uppmättes i 5 mM K3[Fe(CN)(,], l M KC] i en satsvis cell, med omodifierad/modifrerad guldelektrod som arbetselektrod, en SCE som refe- renselektrod och en platinaflagga som hjälpelektrod. Avläsningshastigheten var 50 mV/s. Elektrodema var anslutna till en Princeton Applied 274 A potentiostat, an- sluten till en dator.

För att utveckla en känslig affmitetssensor baserat på kapacitansniätningar' måste immobiliseririgslagret vara så tunt som möjligt och välordnat. Defekta positioner i enkelskiktet kan leda till genomträngning av lösningsrnolekyler genom skiktet och nära metallytan, vilket leder till kortslutning av igenkänningsskiktet med kraftigt le- dande vattenkanaler. Resultatet blir att kapacitansförändririgariia blir mindre eller att de upphör i samband med sådana defekta sensorer. Vikten av god isolering hos elektrodytan har tidigare demonstrerats [C . Berggren; G. Johansson Anal. (Them.

Lämning för publicering] Graden av tvärbindniiig kan studeras med ett litet redox- par med genomträngnirigsfönnåga i lösning. l Fig. 4 visas det hur blockeringen ökar för varje ytterligare lager. Vid en ren guldyta oxideras redoxparet K3[Fe(CN)(,] och 10 15 20 25 30 520 302 16 reduceras vid metallytan. En yta täckt med självsammansatt tioktinsyra minskar till- gängligheten till ytan. lmmobilisering av proteinet isolerar ytan ytterligare, men det är inte förrän behandlingen i 1-dodekantiol som oxidation/reduktionstoppar helt för- svinner. Alla elektroder i följande experiment behandlades därför 20 minuter med 1- dodekantiol.

Exempel 3 Kännetecken såsom känslighet, selektivitet, responstid, stabilitet och möjlighet till elektrodytregenerering studerades i detta arbete. Emellertid studerades GST-SmtA- baserade elektroder mera noggrant, men några kännetecken studerades även för MerR-proteinbaserade elektroder, och erhållna resultat utvärderades och jämfördes.

Affiniteten hos GST-SmtA-proteinet studerades för koppar, kadmium, kvicksilver och zink (se Fig. 5). Elektrodema reagerade på alla fyra metalljoner med minskande känslighet för Cu > Cd > Hg > Zn, vilket stämmer väl överens med tidigare rappor- terade resultat som erhållits med en lösning av detta förändrade protein [l Shi; W.P.

Lindsay; J.W. Huckle; AP. Morby, NJ. Robinson Flfßßfl 303, 1992 159-163] De- tektionsgränsen låg inom femtomolarintewallet eller under för var och en av de des- tillerade tungmetallema. Referenselektroder, framställda på samma sätt som men med BSA i stället för GST-SmtA resulterade i knappt detekterbara signaler för Cu och inga signaler alls för de andra jonema (Se Fig. 6). Liknande resultat erhölls då ett annat protein användes, ureas, vilket man vet binder tungmetaller. I det senare fallet antogs frånvaron av eventuella detekterbara signaler orsakas av avsaknad av konfonnationsförändringar vid exponering för tungmetall.

Aktiviteten hos en GST-SmtA-elektrod studerades över ett utvidgat intervall. Kop- parprover med koncentrationer på 10"” M till 0,1 M injicerades och kapacitansför- ändringama bestämdes. En långsam ökning av signalen erhölls till ungefär 105 M och därefter blev signalökningen mycket snabbare tills ungefär 102 M, där mättnad skedde (se Fig. 7). Det antas att ökningen i den första delen av kurvan är orsakad av den specifika bindningen av tungmetall och att den andra förmodligen beror på de- 10 15 20 25 520 302 17 naturering av proteinet på elektrodytan. Oförmåga att regenerera elektrodema efter injektion av en l M kopparlösning kan stödja detta antagande. Stabiliteten hos den GST-SmtA-baserade biosensorn studerades under 16 dygn. En kalibreringskurva mellan 1045 M till 1040 M Cu uppmättes var dag och den totala kapicatansföränd- ringen som funktion av tid anges i Fig. 8. Mellan mätningarna lagrades sensom vid 4°C i 100 mM boratbuffert, pH 8,75. En förlust av aktivitet observerades efter 10 dygn och den minskade med ungefär 40% efter 16 dygn.

Biosensoms yta kunde regenereras genom injektion av 250Tl, 1 mM EDTA. Det visade sig att om EDTA injicerades omedelbart före lagring förlorade biosensom aktivitet över natten, men om elektroden lagrades med tungmetall och regenererings- förfarandet ägde rum omedelbart före mätning nästa dag kunde ingen aktivitetsför- lust observeras. Det observerade fenomenet tillskrevs antagandet att proteinet har en öppnare struktur då tungmetalljonema är frånvarande och således denatureras denna struktur enklare. Regenerering med EDTA efter injektion av ett prov innehållande så mycket som l M Cuz* var misslyckad, vilket tillskrevs irreversibel ytdenaturering av denna höga metalljonkoncentration.

Exempel 4 Biosensorer konstruerades som utnyttjar det andra modifierade proteinet, MerR, och signaler registrerades för Cu, Cd, Hg och Zn. Detta protein rapporterades vara mycket specifikt för kvicksilver (ll) joner [B. Frantz; T.V. O”Hallaran, Bioche- mistry, 29, 1990, 4747-4751]. Proteinet immobiliserades på guldytan enbart genom utnyttjande av EDTA-kopp]ingsförfararrdet. Erlrållna resultat stämde väl överens med de rapporterade egenskaperna, och de MerR-baserade elektroderna uppvisade högsta selektivitet för kvicksilver och denna elektrod uppvisade högre selektivitet än GST-SmtA-baserade elektroder (se Fig. 9). 5 20 25 520 302 18 SEKVENSLISTA (1) ALLMÄN INFORMATION: (i) SÖKANDE; (A) NAMN: Vlaanise Instelling voor Technologish Onderzoek (B) GATA: Boeretang 200 (C) STAD: Mol (D) LAND: Belgien (F) PosTNR. (ZIP) 2400 (G) TELEFON: +32 14 33 51 12 (H) TELEFAX: +32 14 32 03 72 (A) NAMN: The University of Birmingham (B) GATA: Edgbaston (C) STAD: Bimiingham (E) LAND: Storbritannien (F) POSTNR. (ZIP): B15 ZTT (A) NAMN: Lund University (B) GATA: Po Box 124 (C) STAD: Lund (E) LAND: Sverige (F) POSTNR. (ZIP): 221 00 (ii) UPPFINNTNGENS TITEL: Metalljonspeciñk kapacitetsaffinitetssensor (iii) ANTAL SEKVENSER: 4 5 20 25 30 520 302 19 (iv) DATALÄSBAR FORM: (A) MEDIUMTYP: Floppy disk (B) DATOR: IBM PC kompatibel (C) OPERATIVSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) MIUKVARA: Patentln Release #10, Version #130 (EPO) (2) INFORMATION FÖR SEK ID NR. 1: (i) SEKVENSKARAKTERJSTIK; (A) LÄNGD: 289 aminosyror (B) TYP: aminosyra (c) KEDJETYP; (D) TOPOLOGII linjär (ii) MOLEKYLTYP: protein (iii) HYPOTETISK: NEJ (iv) ANTISENS: NEJ (vi) URSPRUNGSKÄLLA: (A) ORGANISM: Synechococcus sp. (xi) SEKVENSBESKRIVNING: SEK. ID. NR. 1: Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Tip Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Tip Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 I 20 25 30 35 40 45 520 302 20 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 1 10 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Tip Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly 210 215 220 Arg Gly Ile Pro Met Thr Ser Thr Thr Leu Val Lys Cys Ala Cys Glu 225 230 235 240 Pro Cys Leu Cys Asn Val Asp Pro Ser Lys Ala Ile Asp Arg Asn Gly 245 250 255 Leu Tyr Tyr Cys Ser Glu Ala Cys Ala Asp Gly His Thr Gly Gly Ser 260 265 270 Lys Gly Cys Gly His Thr Gly Cys Asn Cys Ser Glu Phe Ile Val Thr 275 280 285 20 25 30 520 302 21 (2) INFORMATION FÖR SEK ID NR. 2: (i) SEKVENSKARAKTERISTIKI (A) LÄNGD: 144 aminosyror (B) TYP: aminosyra (c) KEDJETYP; (D) roPoLoGL iiiijäi (ii) MOLEKYLTYP: protein (iii) HYPOTETISK; NEJ (iv)ANT1sENs; NEJ (v) FRAGMENTTYP: intem (vi) URSPRUNGSKÅLLA: (A) ORGANISM: Pseudomonas aemginosa (xi) SEKVENSBESKRIVNING: SEK. ID. NR. 2: Met Glu Asn Asn Leu Glu Asn Leu Thr Ile Gly Val Phe Ala Lys Ala 1 5 10 15 Ala Gly Val Asn Val Glu Thr lle Arg Phe Tyr Gln Arg Lys Gly Leu 20 25 30 Leu Leu Glu Pro Asp Lys Pro Tyr Gly Ser lle Arg Arg Tyr Gly Glu 35 40 45 Ala Asp Val Thr Arg Val Arg Phe Val Lys Ser Ala Gln Arg Leu Gly 50 55 60 20 25 30 35 520 302 = 22 * Phe Ser Leu Asp Glu Ile Ala Glu Leu Leu Arg Leu Glu Asp Gly Thr 65 70 75 80 His Cys Glu Glu Ala Ser Ser Leu Ala Glu His Lys Leu Lys Asp Val 85 90 95 Arg Glu Lys Met Ala Asp Leu Ala Arg Met Glu Ala Val Leu Ser Glu 100 105 l 10 Leu Val Cys Ala Cys His Ala Arg Arg Gly Asn Val Ser Cys Pro Leu 1 15 120 125 Ile Ala Ser Leu Gln Gly Gly Ala Ser Leu Ala Gly Ser Ala Met Pro 130 135 140 (2) INFORMATION FÖR SEK ID NR. 3: (i) SEKVENSKARAKTERISTIK: (A) LÄNGD: 145 aminosyror (B) TYP: aminosyra (C) KEDJETYP: (D) TOPOLOGI: linjär (ii) MOLEKYLTYP: protein (iii) HYPGTETISK; NEJ (iv) ANTISENS; NEJ (WFRAGMENTTYP: intern (vi) URSPRUNGSKÄLLA (A) ORGANISM: Alcaligenes eutrophus (B) STRÄNG: CH34 .Ma 20 25 30 35 40 520 302 23 (Xi) SEKVENSBESKRIVNING: SEK. ID. NR. 3: Met Asn Ile Gln Ile Gly Glu Leu Ala Lys Arg Thr Ala Cys Pro Val 1 5 10 15 Val Thr Ile Arg Phe Tyr Glu Gln Glu Gly Leu Leu Pro Pro Pro Gly 20 25 30 Arg Ser Arg Gly Asn Phe Arg Leu Tyr Gly Glu Glu His Val Glu Arg 35 40 45 Leu Gln Phe Ile Arg His Cys Arg Ser Leu Asp Met Pro Leu Ser Asp 50 55 60 Val Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg Pro Asp Gln Asp Cys Gly 65 70 75 80 Glu Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile Arg Gln Val Glu Ser Arg 85 90 95 Ile Gly Ala Leu Leu Glu Leu Lys His His Leu Val Glu Leu Arg Glu 100 105 110 Ala Cys Ser Gly Ala Arg Pro Ala Gln Ser Cys Gly Ile Leu Gln Gly 115 120 125 Leu Ser Asp Cys Val Cys Asp Thr Arg Gly Thr Thr Ala His Pro Ser 130 135 140 Asp 145 (2) INFORMATION FÖR SEK ID NR. 4: (i) SEKVENSKARAKTERISTIKC (A) LÄNGD: 72 aminosyror (B) TYP: aminosyra (C) KEDJETYP; (D) ToPoLoGL linjär 20 25 520 302 24 (ii) MOLEKYLTYP: protein (iii) HYPOTETISK; NEJ (iv) ANTISENS: NEJ (WFRAGMENTTYP: intem (A) ORGANISM: Pseuomonas aeruginosa (VÛURSPRUNGSKALLA (A) ORGANISM: Pseudomonas aeruginosa (xi) SEKVENSBESKRIVNINGI SEK. ID. NR. 4: Ala Thr Gln Thr Val Thr Leu Ser Val Pro Gly Met Thr Cys Ser Ala 1 5 l0 15 Cys Pro lle Thr Val Lys Lys Ala Ile Ser Glu Val Glu Gly Val Ser 20 25 30 Lys Val Asp Val Thr Phe Glu Thr Arg Gln Ala Val Val Thr Phe Asp 35 40 45 Asp Ala Lys Thr Ser Val Gln Lys Leu Thr Lys Ala Thr Ala Asp Ala 50 55 60 Gly Tyr Pro Ser Ser Val Lys Gln 65 70

Claims (10)

520 302 3,5 03-02-20 Andrade patentkrav

1. Förfarande för framställning av en metallj onspecifik kapacitetsaffinitetssensor som lämpar sig för bestämning av närvaron av en viss tungmetalljon genom kapacitansmätning, omfattande stegen att: a) tillhandahålla ett stycke av en ädelmetall, där nämnda stycke eventuellt kan vara en stav eller altemativt ett stycke av isolerande material såsom glas, kisel eller kvarts, på vilken en ädelmetall spottats eller tryckts; b) tillhandahålla en första SAM-bildande molekyl omfattande en kopplingsgrupp; c) låta stycket i steg a) komma i kontakt med den forsta SAM-bildande molekylen i steg b), för att därigenom erhålla ett självsammansatt enkelskikt på nämnda ädelmetallyta; d) låta nämnda självsammansatta enkelskikt på nämnda ädelmetallstycke komma ikontakt med en molekyl som specifikt binder till nämnda tungmetalljon for att därigenom koppla nämnda molekyl till det sj älvsammansatta enkelskiktet; e) låta stycket som erhållits i steg d) komma i kontakt med en andra SAM-bindande molekyl, för att därigenom erhålla en ädelmetallyta som till åtminstone 99% är täckt med ett sj älvsammansatt enkelskikt.

2. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av att kopplingsreaktionen i steg d) utförs i närvaro av PEGDGE.

3. F örfarande enligt krav 1, kännetecknat av att stycket exponeras för en lösning innehållande en tvärbindande substans såsom glutaraldehyd före steg d).

4. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av att den SAM-bildande molekylen är D/L- l,2-ditio1an-3-pentansyra, och att nämnda D/L-1,2-ditiolan-3-pentansyra aktiveras med 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etyl-karbodiimid före det att steg d) utförs. 520 302 slö

5. Förfarande enligt krav l, kännetecknat av att den andra SAM-bildande molekylen 03-02-20 är en tiol omfattande 3-25 kolatomer i en rak mättad kedja, och att den företrädesvis är l-dodekantiol.

6. Metalljonspecifik kapacitetsaffinitetssensor omfattande ett stycke av en ädelmetall, där nämnda stycke eventuellt kan vara en stav, eller alternativt ett stycke av isolerande material såsom glas, kisel eller kvarts, på vilket en ädelmetall spottats, till vilket stycke grupper som specifikt binder till en viss tungmetalljon av intresse har bundits, kännetecknat av att nämnda grupper som specifikt binder till nämnda tungmetalljoner ingår i ett självsammansatt enkelskikt som täcker åtminstone 99% av ädelmetallytan och att den har framställts genom ett förfarande enligt något av krav 1-6.

7. Sensor enligt krav 6, kännetecknad av att specifikt tungmetalljonbindande grupper väljs ur grupperna proteiner med sekvensema SEK ID. NR. 1, SEK. ID. NR. 2, SEK ID. NR. 3 eller SEK ID NR. 4, eller funktionella derivat av dessa med ekvivalenta bindningsegenskaper.

8. Förfarande för kvalitativ eller kvantitativ bestämning av närvaron av en viss tungmetalljon av intresse i ett flytande prov, omfattande stegen att: a) tillhandahålla en sensor enligt krav 6, i vilken nämnda affinitetsgrupper specifikt binder till nämnda tungmetallj on av intresse; b) låta nämnda sensor komma i kontakt med en referensvätska som inte innehåller nämnda tungmetalljon av intresse och bestämmer kapacitansen enligt i sig kända förfaranden; c) låta nämnda sensor komma i kontakt med ett prov som misstänks innehålla nämnda tungmetallj on och bestämma kapacitansen enligt i sig kända förfaranden; och 520 302 03-02-20 f) ; A .;» v»=; =. d) räkna ut skillnaden mellan kapacitansen hos provet och kapacitansen hos referensprovet, och eventuellt räkna ut mängden av nämnda förening genom att utnyttja i förväg registrerade kalibreringsdata.

9. Förfarande enligt krav 8 för bestämning av närvaro av joner valda ur gruppen bestående av Znü, Hgzl, Cdh, Cu2+ och Pbzf

10. Användning av en sensor enligt krav 6 för bestämning av närvaron av joner valda ur gruppen bestående av Znh, Hgzlr, Cdzl, Cu2+ och Pbzll.