ES2230716T3 - Sensor de afinidad capacitivo especifico de iones metalicos. - Google Patents
Sensor de afinidad capacitivo especifico de iones metalicos.Info
- Publication number
- ES2230716T3 ES2230716T3 ES98944398T ES98944398T ES2230716T3 ES 2230716 T3 ES2230716 T3 ES 2230716T3 ES 98944398 T ES98944398 T ES 98944398T ES 98944398 T ES98944398 T ES 98944398T ES 2230716 T3 ES2230716 T3 ES 2230716T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- self
- baselineskip
- assembling
- capacitance
- piece
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Conductive Materials (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Un método para producir un sensor de afinidad capacitivo, específico de iones metálicos, adecuado para determinar la presencia de un determinado ion de metal pesado mediante medida de la capacitancia, que comprende las etapas de: a) preparar una pieza de un metal noble, en el que dicha pieza puede ser opcionalmente una varilla, o como alternativa, una pieza de un material aislante tal como vidrio, silicio o cuarzo, sobre la que un material noble es pulverizado o imprimido; b) preparar una primera molécula formadora de una monocapa autoensamblante, que comprende un grupo de acoplamiento; c) poner en contacto la pieza de la etapa a) con la primera molécula formadora de una monocapa autoensamblante de la etapa b), obteniendo de este modo una monocapa autoensamblante sobre dicha superficie de metal noble; d) poner en contacto dicha moncapa autoensamblante dispuesta sobre dicha pieza de metal noble con una molécula que se une de manera específica a dicho ion de metal pesado, acoplando de este modo dicha molécula a la monocapa autoensamblante; e) poner en contacto la pieza obtenida en la etapa d) con una segunda molécula formadora de una monocapa autoensamblante, obteniendo de este modo una superficie de metal noble que está cubierta al menos en el 90%, preferiblemente al menos en el 95%, más preferiblemente al menos en el 97%, y muy preferiblemente al menos en el 99%, con una monocapa autoensamblante.
Description
Sensor de afinidad capacitivo específico de iones
metálicos.
Existe la necesidad de medir concentraciones de
trazas de iones de metales pesados en el medio ambiente, en
medicinas, en alimentos y en otros productos. Los metales pesados
son elementos tóxicos y es por lo tanto importante poder
determinarlos al nivel de trazas. Algunos metales pesados, p. ej.,
cobre y zinc, son esenciales para las células vivas. Distintos
métodos clásicos tales como la espectroscopía de absorción atómica,
espectrometría de emisión en plasma de acoplamiento inductivo y
espectrometría de masas y de emisión en plasma, son de uso
generalizado. Estos métodos requieren instrumentación sofisticada y
personal especializado. Por lo tanto, se necesitan métodos más
fáciles y económicos. Los métodos electroquímicos para la
determinación de iones metálicos incluyen electrodos selectivos de
iones, polarografía y otros electrodos voltamétricos. Los
biosensores son aparatos analizadores selectivos y sensibles y en el
pasado se han descrito varias configuraciones diferentes de
biosensores para la detección de metales pesados. Los biosensores
basados en células enteras representan uno de los posibles diseños y
estos biosensores pueden utilizar bacterias, levaduras, hongos,
líquenes, musgos y plantas acuáticas como elemento de reconocimiento
[Wittman, C.; Riedel, K.; Schmid, R.; Handb. Biosens. Electron.
Noses, 1997, 299-332]. Otra estrategia consiste
en utilizar enzimas para la detección. Hasta el momento, el uso de
apoenzimas ha sido el método utilizado con más éxito y de modo más
generalizado [Mattiasson, B.; Nilsson, H.; Olsson, B. J. Appl.
Biochem. 1, 1979, 377-384]. Sin embargo, estos
sensores se caracterizan por tener una selectividad limitada y una
sensibilidad bastante baja.
La ingeniería genética de proteínas ha abierto la
posibilidad de diseñar y producir nuevas proteínas, p. ej., con una
selectividad mayor que la de las proteínas naturales. La proteína de
fusión GST-SmtA (SEQ. ID. NO. 1) ha sido elaborada por
ingeniería genética y se ha publicado que muestra una selectividad
hacia diferentes iones de metales pesados (Cu^{2+}, Zn^{2+},
Cd^{2+} y Hg^{2+}) [Shi, J.; Lindsay, W.P.; Huckle, J.W.; Morby,
A.P.; Robinson, N.J. FEBS, 303, 1992,
159-163]. Otra proteína de fusión denominada
MerR (SEQ. ID. NO. 2) está construida por ingeniería genética
para que sea selectiva de manera exclusiva hacia Hg^{2+} [Frantz,
B.; O Hallaran, T.V.; Biochemistry, 29, 1990,
4747-4751]. Una tercera proteína, PbrR (SEQ. ID. NO.
3), procedente de la cepa Alcaligenes eutrophus CH34 (la cepa
está depositada en BCCM con el número de registro LMG
P-18077) es selectiva hacia a Pb^{2+}. Una cuarta
proteína, MerP (SEQ. ID. NO. 4), es selectiva frente a
Hg^{2+}. Se cree que un gran cambio conformacional tiene lugar
cuando iones de metales pesados se unen a estas proteínas. Este
invento describe un sensor capacitivo que es capaz de detectar
directamente estos cambios conformacionales.
Las monocapas autoensambladas de tioles, sulfuros
y disulfuros, sobre electrodos de oro, han sido ampliamente
estudiadas, y se sabe que los alcanotioles de cadena larga forman
estructuras aislantes perfectamente organizadas sobre sustratos de
oro [Porter, M.D.; Bright, T.B., Allara, D.L.; Chidsey, C.E.D. J.
Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3559-3568]. La unión
formada entre el átomo de azufre y el de oro es muy fuerte y las
monocapas autoensambladas formadas (SAM) (del inglés,
"Self-Assembled Monolayers") son
estables en aire, agua y disolventes orgánicos a temperatura
ambiente [Bain, C.D.,; Troughton, E.B.; Tao, Y.-Y.; Evall, J.;
Whitesides, G.M.; Nuzzo, R.G. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111,
321-335]. Se ha sugerido que la impresión por
microcontacto [Mrksich, M.; Whitesides, G.M. Tibtech 1995,
13, 228-235] y la fotolitografía [Bhatia, S.K.;
Hickman, J.J.; Ligler, F.S. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114,
4432-4433] pueden utilizarse para imprimir
superficies con monocapas funcionalizadas autoensambladas para la
producción de biosensores con bajo coste para diversas aplicaciones,
pero hasta el momento no ha sido posible producir sensores directos
de afinidad que tengan una sensibilidad alta.
Rojas y col., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117,
336-343 tratan sobre un sensor de afinidad
capacitivo para realizar determinaciones de ferroceno. La
per-6-tio-\beta-ciclodextrina,
compuesto capaz de formar una monocapa autoensamblante, se una a una
superficie de oro. Los defectos de la monocapa se cubren mediante
tratamiento con una disolución de ferroceno y pentanetiol. Steinberg
y col., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113,
5176-5182, tratan sobre un sensor de afinidad
capacitivo que ha sido producido adsorbiendo
2,2'-tiobis(etilacetoacetato), o adsorbiendo
simultáneamente 2,2'-tiobis(etilacetoacetato)
y n-octadecilmercaptano en una superficie de oro. Se
investiga el efecto de la unión de iones dependiente del potencial
aplicado.
Ahora ha aparecido un método para producir
sensores de afinidad capacitivos, específicos de iones metálicos,
inesperadamente buenos, adecuados para determinar la presencia de un
determinado ion de metal pesado mediante medida de la capacitancia,
que comprende las etapas de:
a) preparar una pieza de un metal noble, en el
que dicha pieza puede ser opcionalmente una varilla, o como
alternativa, una pieza de un material aislante tal como vidrio,
silicio o cuarzo, sobre la que un metal noble es pulverizado o
imprimido;
b) preparar una primera molécula formadora de SAM
que comprende un grupo de acoplamiento;
c) poner en contacto la pieza de la etapa a) con
la primera molécula formadora de SAM de la etapa b), obteniendo de
este modo una monocapa autoensamblante sobre dicha superficie de
metal noble;
d) poner en contacto dicha moncapa
autoensamblante dispuesta sobre dicha pieza de metal noble, con una
molécula que se une de manera específica a dicho ion de metal
pesado, acoplando de este modo dicha molécula a la monocapa
autoensamblante;
e) poner en contacto la pieza obtenida en la
etapa d) con una segunda molécula formadora de SAM, obteniendo de
este modo una superficie de metal noble que está cubierta al menos
en el 90%, preferiblemente al menos en el 95%, más preferiblemente
al menos en el 97%, y muy preferiblemente al menos en el 99%, con
una monocapa autoensamblante.
Los límites de descritos en este invento son
varios órdenes de magnitud mejores que los publicados con
anterioridad para métodos electroquímicos de detección de metales.
Las percepciones que hay detrás de este invento son que la capa de
reconocimiento debe ser fina, perfectamente ordenada y que debe
cubrir al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más
preferiblemente al menos el 97%, y muy preferiblemente al menos el
99%, de la superficie del sensor. En una etapa posterior, todas los
sitios sin recubrir que se encuentren entre los elementos de
reconocimiento se "tapan", es decir, se cubren con una segunda
molécula formadora de una monocapa autoensamblante, p. ej., un
alcanotiol que comprende 3-25 átomos de carbono,
preferiblemente en una cadena lineal, obteniéndose después una
monocapa autoensamblante que comprende grupos de afinidad,
aumentando con ello la impermeabilidad y el aislamiento. Un
biosensor capacitivo se cubre con una monocapa autoensamblante en la
que el elemento de reconocimiento está inmovilizado en relación con
la disolución. En términos de electricidad esto es equivalente a un
condensador situado entre el electrodo metálico conductor y la
disolución conductora.
Cualquier parte de la superficie que permita a la
disolución acuosa penetrar por debajo del plano en el que el
reconocimiento tiene lugar, actuará como un elemento en
cortocircuito. La capacitancia aumentará por lo tanto debido a la
constante dieléctrica más alta de la disolución acuosa que penetra.
Las capas de óxido no están bien ordenadas y es por lo tanto
imposible que formen una capa de reconocimiento densa. Las monocapas
autoensambladas están mucho mejor ordenadas y debido a ello puede
esperarse un cubrimiento más perfecto en las capas inmovilizadas.
Además, las monocapas autoensambladas son mucho más finas que las
capas de óxido, dando como resultado una mayor capacitancia en serie
con la capacitancia formada cuando las moléculas se unen sobre la
superficie. Esto hace más fácil detectar cambios en la capacitancia
cuando un analito se une a la superficie.
Este invento describe un sensor de afinidad para
detectar iones de metales pesados al nivel de trazas, basado
opcionalmente en proteínas fabricadas por bioingeniería. Una
sustancia que se une de manera específica a metales pesados se
acopla a una superficie conductora a través de una monocapa
autoensamblante. La unión del ion de metal pesado deseado a dicha
sustancia produce un cambio de conformación que está asociado con un
cambio en la capacitancia. La capa de reconocimiento insertada debe
ser eléctricamente aislante para prevenir interferencias
provenientes de parejas redox presentes del electrolito y de altas
corrientes faradaicas de fondo. Por otra parte, la capa debe ser lo
más fina posible con el fin de conseguir una sensibilidad alta. El
uso de uniones autoensambladas a oro o a otros metales
autoensamblantes da lugar a capas especialmente finas y compactas.
El invento también muestra cómo puede obtenerse un aislamiento
adicional tapando con un tipo diferente de molécula
autoensamblante.
Por consiguiente, el presente invento trata de un
método para producir un sensor de afinidad capacitivo, específico de
iones metálicos, en el que una pieza de un metal noble se cubre con
una capa de una monocapa autoensamblante que comprende grupos de
afinidad. Posteriormente, todo espacio sin cubrir sobre la
superficie del metal noble se cubre con una segunda molécula
formadora de una monocapa autoensamblante.
En otro aspecto, el presente invento trata de un
sensor de afinidad capacitivo, específico de iones metálicos que
comprende una pieza de un metal noble cubierta sustancial y
completamente con una monocapa autoensamblante que comprende grupos
de afinidad que se unen específicamente a una determinada molécula
de interés.
En todavía otro aspecto, el presente invento
trata de un método para determinar cualitativa o cuantitativamente
cualitativa o cuantitativa la presencia de un determinado ion de
metal pesado de interés. Un sensor de afinidad capacitivo,
específico de iones metálicos, que comprende una superficie de un
metal noble cubierta sustancial y completamente con una monocapa
autoensamblante que comprende grupos de afinidad, que se une
específicamente a un determinado ion de metal pesado de interés, se
pone en contacto con una muestra líquida que comprende el ion de
metal pesado de interés y se determina el cambio de capacitancia del
sensor.
En un aspecto más, el presente invento trata del
uso de dichos sensores para analizar determinados iones de metales
pesados de interés, tales como Zn^{2+}, Hg^{2+}, Cd^{2+},
Cu^{2+} y Pb^{2+}.
Según aquí se describe, la expresión "monocapa
autoensamblada" y el término "SAM" son sinónimos y se
refieren a la adsorción espontánea de componentes laminares
procedentes de una disolución sobre una superficie sólida,
constituyendo una monocapa perfectamente ordenada. Este tipo de capa
sobre sustratos de oro ha sido previamente descrita [Porter, M.D.;
Bright, T.B.; Allara, D.L.; Chidsey, C.E.D. J. Am. Chem. Soc.
1987, 109, 3559-3558].
Según aquí se describe, la expresión "metal
noble" se refiere a un metal elegido entre el grupo de oro,
plata, cobre, platino y paladio. Se prefiere el oro.
Según aquí se describe, las expresiones
"grupo/molécula que se une específicamente a un determinado ion de
metal pesado de interés" se refiere respectivamente a un grupo o
a una molécula que se une específicamente a un determinado ion de
metal pesado. Cualquier molécula que posea esas características de
unión puede utilizarse en el presente invento. Sin ejemplos de esas
moléculas los compuestos quelantes y determinadas proteínas. En una
realización preferida, se utilizan las proteínas que tienen las
secuencias según una cualquiera de las secuencias SEQ. ID. NO. 1,
SEQ. ID. NO. 2, SEQ. ID. NO. 3 y SEQ. ID. NO. 4.
Según aquí se describe, la expresión molécula
formadora de SAM se refiere a una molécula que tiene la capacidad de
formar una monocapa autoensamblante sobre un metal noble. Una
molécula formadora de SAM comprende al menos un grupo tiol, sulfuro
o disulfuro. Las moléculas que se unen a metales pesados, no son,
sin embargo, moléculas formadoras de SAM por sí solas. Deben de
acoplarse a moléculas pequeñas formadoras de SAM en una etapa
diferente. Ejemplos de esas moléculas pequeñas formadoras de SAM son
el ácido tióctico y la cisteamina. Esta etapa de acoplamiento se
lleva a cabo después de la formación de la monocapa autoensamblante
sobre la superficie de metal noble. El experto en la técnica es
plenamente conocedor de como elegir las reacciones de acoplamiento y
los grupos de acoplamiento adecuados. En los siguientes ejemplos,
una monocapa autoensamblante constituida por ácido tióctico se
activa con
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida.
Posteriormente una molécula que se une a un metal pesado se acopla a
la monocapa activada. No obstante, otras reacciones de acoplamiento
similares se encuentran descritas en la literatura.
Según aquí se describe, el término "tapar"
se refiere a un tratamiento en una disolución que contiene un tiol,
sulfuro o disulfuro después de la inmovilización del grupo de
afinidad, o a una monocapa autoensamblante dispuesta sobre una
superficie de metal noble, o en el caso de que la molécula de
afinidad comprenda grupos tiol, sulfuro o disulfuro que hacen que la
molécula de afinidad sea una molécula formadora de SAM per
se, directamente a la superficie del metal noble, con el fin de
bloquear todos los espacios no bloqueados presentes sobre dicha
superficie. Según se ha mencionado anteriormente, es necesario que
la superficie del metal noble esté lo más completamente cubierta
posible con una SAM con el fin de optimizar la sensibilidad del
sensor.
Según aquí se describe, la expresión "ion de
metal pesado" se refiere a iones metálicos que tienen números
atómicos mayores que 21, tales como iones de Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co,
Ni, Cu, Zn, Zr, Nb, Mo, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Ta, W, Re, Os,
Ir, Pt, Au, Hg, Ti, Pb y Bi. El presente invento es particularmente
útil para determinar la presencia de Zn^{2+}, Hg^{2+},
Cd^{2+}, Cu^{2+} y Pb^{2+}.
Según aquí se describe, la expresión "derivados
funcionales" se refiere a derivados en los que la secuencia de
aminoácidos original se ha modificado o cambiado mediante inserción,
adición, o sustitución o exclusión de uno o más aminoácidos, así
como a derivados que contienen múltiplos de la secuencia original o
partes de la misma.
Según aquí se describe, SCE representa al
electrodo de calomelanos saturado; Perturbación potencioestática
significa un cambio rápido de potencial. PEGDGE significa
polietilenglicol-diglicidil-éter. BSA significa
albúmina de suero bovino.
En este invento, una disolución que contiene los
iones de metal pesado que han de ser determinados se deja que entre
en contacto eléctrico con una superficie conductora que contiene el
elemento de reconocimiento, después de lo cual se determina el
cambio en la capacitancia o impedancia. El cambio en la capacitancia
tiene lugar entre la disolución y una superficie metálica,
constituida por un metal sólido o por un metal pulverizado sobre una
superficie no conductora subyacente. Las reacciones faradaicas con
el metal así como las corrientes de fondo son bloqueadas por el
elemento de reconocimiento dispuesto sobre la superficie, en última
instancia mejorado mediante tratamiento con compuestos auxiliares
que mejoran el aislamiento. El elemento de reconocimiento se une a
la superficie de metal, ya sea directamente a través de un
autoensamblaje, o uniéndose a un compuesto autoensamblado dispuesto
sobre el electrodo. También puede unirse a través de adsorción,
polimerización o revestimiento. Las medidas se realizan aplicando al
electrodo voltajes variables utilizando métodos potenciostáticos y
analizando los cambios en la corriente. La sensibilidad puede
mejorarse dejando que una disolución que contiene un ligando
específico secundario se una al analito ya dispuesto sobre la
superficie, aumentando de este modo el tamaño del agregado unido y
el cambio en la capacitancia.
El invento se describirá ahora con más detalle
haciendo referencia a los dibujos que se adjuntan.
La Fig. 1 muestra esquemáticamente como una
proteína específica de un metal pesado se inmoviliza sobre la
superficie de metal y como su conformación tridimensional cambia
cuando los iones del metal pesado se unen a la proteína.
La Fig. 2 muestra la celda de flujo medidora, a)
electrodo de medida, b) electrodo auxiliar de lámina de platino, c)
electrodo de referencia de alambre de platino, d) electrodo de
referencia de Ag/AgCl.
La Fig. 3 muestra la respuesta para el cobre en
el caso de electrodos inmovilizados con proteína GST-SmtA con
acoplamiento mediado por EDC (curva superior) y con atrapamiento en
PEGDGE (curva inferior). Véase el ejemplo 1 para más detalles.
La Fig. 4 muestra las respuestas voltamétricas
cíclicas registradas en una disolución de
Fe(CN)_{6}^{3-} cuando el electrodo de medida fue
a) oro no modificado, b) oro modificado con ácido tióctico, c) igual
que en b con una modificación adicional con la proteína de fusión
GST-SmtA, y d) igual que en c con una modificación adicional
con 1-dodecanotiol. En el ejemplo 2 se proporcionan
más detalles.
La Fig. 5 muestra el cambio en la capacitancia
frente a la concentración del ion del metal pesado correspondiente a
un electrodo inmovilizado con GST-SmtA. La curva 1) muestra
la respuesta para Zn^{2+}, la curva 2) para Hg^{2+}, la curva 3)
para Cd^{2+} y la curva 4) para Cu^{2+}. Las medidas se
realizaron en tampón de borato 100 mM, pH 8,75, a una velocidad de
flujo de 0,5 ml/min. Se inyectaron muestras con un volumen de 250
\mul. Para más detalles, véase el ejemplo 3.
La Fig. 6 muestra el cambio en capacitancia
frente a la concentración de Cu^{2+} en el caso de electrodos que
utilizan el acoplamiento de la proteína con EDC. La curva superior
muestra la señal correspondiente al electrodo basado en
GST-SmtA y la curva inferior representa la señal registrada
por un electrodo blanco que lleva BSA sobre la superficie. Las
medidas se realizaron en tampón de borato 100 mM, pH 8,75, a una
velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Se inyectaron muestras con un
volumen de 250 \mul. En el ejemplo 3 se proporcionan más
detalles.
La Fig. 7 muestra el cambio en capacitancia
frente a la concentración de Cu^{2+} en el intervalo desde
10^{-15} M hasta 0,1 M. Las medidas se realizaron en tampón de
borato 100 mM, pH 8,75, a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Se
inyectaron muestras con un volumen de 250 \mul. Para los detalles
véase el ejemplo 3.
La Fig. 8 muestra un estudio de estabilidad
correspondiente a un electrodo de GST-SmtA según el presente
invento. Una curva de calibración desde 1 femtomolar hasta 100
picomolar se registró cada día y se representó gráficamente el
cambio en capacitancia total frente al tiempo. Entre las medidas, el
sensor se guardó a 4ºC en tampón de borato 100 mM, pH 8,75. En el
ejemplo 3 se proporcionan los detalles.
La Fig. 9 muestra el cambio en capacitancia
frente a la concentración del ion del metal pesado correspondiente a
un electrodo inmovilizado con MerR. La curva 1) muestra la
respuesta para Cd^{2+}, la curva 2) para Cu^{2+} y la curva 3)
para Hg^{2+}. Las medidas se realizaron en tampón de borato 100
mM, pH 8,75, a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Se inyectaron
muestras con un volumen de 250 \mul. En el ejemplo 4 se
proporcionan más detalles.
Si se utiliza un electrodo de metal que mide
sólidos, una varilla de oro de típicamente 3 mm de diámetro, se
pule, se limpia y se reviste por medio de autoensamblaje con un
elemento de reconocimiento o con un compuesto que puede acoplarse
con un elemento de reconocimiento. Se conocen un gran número de
métodos de acoplamiento y pueden utilizarse como alternativas
adecuadas a las descritas en los ejemplos. También es posible
utilizar como electrodos desechables un metal pulverizado o
imprimido sobre vidrio, cuarzo, silicio u otro material aislante.
Una vez limpios, los electrodos se revisten en discontinuo y se
insertan en una celda medidora de conexión rápida. Varios elementos
de reconocimiento diferentes pueden inmovilizarse sobre el mismo
electrodo pulverizado si se encuentran separados por partes
aislantes y conectados al potenciostato con interruptores que pueden
ser controlados por un microprocesador.
La capacitancia inversa total es la suma de las
capacitancias inversas de cada una de las capas de la serie, es
decir, de la capa de ácido tióctico, de la capa de proteína y de la
capacitancia entre la carga del espacio de la doble capa y la
disolución. Si una de estas capacitancias es pequeña comparada con
las otras, dominará la capacitancia total. Especialmente si las
partes autoensambladas dan lugar a una capacitancia pequeña, ésta
dominará sobre las capacitancias de la capa de reconocimiento. Los
cambios en la capa de reconocimiento tendrán por ello poco efecto
sobre la capacitancia total, produciendo una baja sensibilidad
global del sensor.
El electrodo está insertado en una celda que
puede ser o bien del tipo de una cubeta o bien una celda de flujo
como la mostrada en la Fig. 2. La celda debe contener un electrodo
auxiliar, típicamente una lámina de platino que debe estar colocada
simétricamente y enfrente del electrodo de medida. Un electrodo de
referencia, típicamente SCE o de Ag/AgCl, se coloca en la celda de
manera que el voltaje caiga entre los electrodos de referencia y de
medida debido a que la corriente capacitiva o Faradaica se vuelve
muy pequeña. En algunos casos el funcionamiento puede mejorarse si
se utiliza un electrodo de referencia adicional muy pequeño, véase
Fig. 1c, y el electrodo de referencia SCE se retira, Fig. 1d. Una
celda de flujo proporciona un control más preciso sobre la
transferencia de masa al electrodo de medida, y la inyección de la
muestra y el lavado se automatizan más fácilmente. Se encontró que
celdas de flujo con volúmenes de 2 ml y 10 \mul tenían
aproximadamente la misma sensibilidad. Una celda de flujo con
electrodos desechables, preparada pulverizando oro sobre silicio,
también presentaba propiedades similares.
Los electrodos se conectan a un potenciostato
rápido que ha su vez está controlado por un microprocesador. El
potenciostato mantendrá el electrodo de medida en un valor
predeterminado frente al electrodo de referencia. Una perturbación
potenciostática se impone en el electrodo de medida. Puede ser una
onda sinusoidal, puede ser un voltaje escalonado o cualquier otra
forma de onda que permita la interpretación de los resultados. Las
corrientes producidas por el voltaje de perturbación se utilizan
para la evaluación de la capacitancia del electrodo de medida. La
evaluación puede hacerse, en el caso de perturbaciones sinusoidales,
separando la parte de la fase de entrada y la parte de la fase de
salida de la corriente en un amplificador de enganche. Si esto se
repite a frecuencias diferentes, pueden obtenerse espectros de
impedancia. En todos lo casos, la capacitancia puede evaluarse a
partir de las respuestas de la corriente. Como suele suceder en
electroquímica, el papel de la corriente y el del potencial pueden
invertirse, es decir, un escalón galvanostático en la corriente
ocasionará que el potencial cambie. Este cambio puede utilizarse
para la evaluación de la capacitancia, aunque utilizando algoritmos
diferentes.
Un volumen conocido de muestra normalmente se
mezcla con un volumen conocido de un líquido conductor, p. ej., en
una cubeta en una celda de tipo discontinuo. En el caso de una celda
de flujo, un volumen conocido se inyecta en un flujo portador
conductor bombeado con una velocidad de flujo distinta. Los líquidos
conductores normalmente son tampones con fuerzas iónicas a partir de
una concentración milimolar baja y concentraciones ascendentes. La
muestra puede encontrarse en un medio no conductor pero una
disolución conductora puede llenar la celda cuando se hacen las
medidas.
El presente invento se describirá a continuación
con referencia a los siguientes ejemplos. Los ejemplos se
proporcionan con fines de información y no tienen intención de
limitar el alcance del presente invento.
Las proteínas de fusión GST-SmtA y
MerR se produjeron según se describe más adelante y se
disolvieron en disolución salina tamponada con fosfato (NaCl 70 mM,
KCl 1,3 mM, Na_{2}HPO_{4} 5 mM, KH_{2}PO_{4} 0,9 mM, pH 7,3)
que contenía glicerol al 50% (v/v) hasta alcanzar una concentración
final de proteína de 1 mg/ml. El ácido tióctico y el glutaraldehído
se adquirieron procedentes de Sigma y el hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida
se obtuvo procedente de Fluka. El 1-dodecanotiol y
las varillas de oro utilizadas para los electrodos (n.º de catálogo
26.583-7, = 3 mm) procedieron de Aldrich
Chemicals. Los metales pesados CuCl_{2}\cdot2H_{2}O,
ZnCl_{2}, HgCl_{2} y
Cd(NO_{3})_{2}\cdot4H_{2}O procedieron todos ellos de Merck (Darmstadt, Alemania). El PEGDGE se adquirió en Polysciences Inc. (USA). Todos los demás reactivos utilizados fueron de grado analítico.
Cd(NO_{3})_{2}\cdot4H_{2}O procedieron todos ellos de Merck (Darmstadt, Alemania). El PEGDGE se adquirió en Polysciences Inc. (USA). Todos los demás reactivos utilizados fueron de grado analítico.
Los biosensores se prepararon inmovilizando las
proteínas de fusión sobre la superficie de oro mediante acoplamiento
mediado por EDC, atrapamiento en PEGDGE o acoplamiento con
glutaraldehído. En todos los casos, 20 \mul de las proteínas de
fusión disueltas se diluyeron con 480 \mul de tampón de borato 100
mM, pH 8,75, y la disolución se filtró en un microfiltro (Amicon,
USA) con un valor de exclusión de 3.000 Da. Después de la
ultrafiltración, el filtro se volcó para recuperar la proteína de
fusión y su concentración se ajustó a 0,04 mg/ml en tampón de
borato. Los electrodos de oro se lavaron y se pretrataron con un
autoensamblaje de ácido tióctico, de la manera previamente descrita
por Berggren y Johansson [Berggren, C., Johansson, G., Anal.
Chem., pendiente de aceptación]. Debido a que la proteína
MerR es sensible a la oxidación en aire, la preparación de
estos electrodos se realizó en atmósfera de nitrógeno.
Acoplamiento mediado por EDC: Los
electrodos autoensamblados se lavaron meticulosamente con etanol, se
secaron y seguidamente se activaron en una disolución al 1% de
hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida
en acetonitrilo seco durante 5 horas. Después de lavar con tampón de
borato 100 mM, pH 8,75, los electrodos se sumergieron en la
disolución de proteína a una temperatura de 4ºC durante 24 horas.
Posteriormente cada electrodo se lavó meticulosamente con tampón de
borato y se sumergió en una disolución de
1-dodecanotiol durante 20 minutos.
Atrapamiento en PEGDGE: El electrodo
activado con ácido tióctico se cubrió con 1,5 \mul de una
disolución de proteína con una concentración de 0,4 mg/ml en tampón
de borato 100 mM que contenía PEGDGE al 30% (p/p) y el electrodo se
incubó a 45ºC durante 15 minutos. Después el electrodo se trató con
1-dodecanotiol durante 20 minutos, se lavó con
tampón de borato y se colocó en la celda medidora.
Acoplamiento con glutaraldehído: Antes de
la inmovilización en glutaraldehído, el electrodo se modificó con
cisteamina en lugar de con ácido tióctico. El electrodo seco se
sumergió en una disolución que contenía glutaraldehído al 12,5%
(p/v) en tampón de acoplamiento (fosfato sódico 0,1 M, NaCl 0,15 M,
pH 7) y NaCNBH_{3} 6 g/litro, durante 4 horas. A continuación, el
electrodo se lavó meticulosamente con el tampón de acoplamiento y se
sumergió en la disolución de proteína (0,04 mg/ml) con NaCNBH_{3}
6 g/l, durante 4 horas. Por último, el electrodo se lavó
meticulosamente con el tampón de acoplamiento antes de su uso.
Medidas de capacitancia: El biosensor se
colocó como electrodo de trabajo en un sistema de tres electrodos
conectado a un potenciostato rápido como se muestra en la figura 1.
Se colocó en una celda de flujo con un volumen muerto de 10 \mul
de construcción propia. Una lámina de platino sirvió como electrodo
auxiliar y un alambre de platino sirvió como electrodo de
referencia. Un electrodo de referencia extra (Ag/AgCl) se colocó en
la corriente de salida, ya que el platino no tiene un potencial
definido. La disolución tampón se bombeó por medio de una bomba
peristáltica con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min, a través de
la celda de flujo. Las muestras se inyectaron dentro del flujo a
través de un bucle para muestras de 250 \mul. El tampón utilizado
fue borato 10 mM, pH 8,75. Antes de utilizarlo, el tampón se filtró
a través de un filtro Millipore de 0,22 \mum y se desgaseó.
El electrodo de trabajo presentó un potencial de
descanso de 0 mV frente al electrodo de referencia de Ag/AgCl.
Cuando se realizó la medida, se aplicó un escalón de potencial de 50
mV y el tránsito de corriente que se produjo cuando el potencial
aumentó, se supuso que seguía la ecuación:
(1)i(t)=u/R_{S}
exp(-t/R_{S}\cdotC_{1})
en la que i(t) es la
corriente existente al tiempo t, u es la amplitud del pulso de
potencial aplicado, R es la resistencia entre el electrodo de oro y
el electrodo de referencia, C_{1} es la capacitancia total sobre
la capa inmovilizada y t es el tiempo transcurrido después de
aplicar el pulso de potencial. Los valores de corriente se
recogieron con una frecuencia de 50 kHz y los primeros diez valores
se utilizaron en la evaluación de la capacitancia. Cada valor de
capacitancia se calculó como la media de diez
medidas.
Con las medidas de capacitancia se estudia la
interfase entre un electrodo conductor y la disolución que contiene
la muestra. Esta interfase se denomina bicapa eléctrica ya que las
cargas y los dipolos se orientan con signos opuestos sobre la
superficie conductora y en la disolución. Cuando la proteína
específica del metal pesado se encuentra inmovilizada sobre la
superficie del electrodo, intercambiará la disolución tampón en la
superficie y tendrá lugar una separación de cargas, produciéndose un
descenso de la capacitancia. El principio de detección utilizado en
este trabajo se basa en detectar un cambio conformacional que es el
resultado de una unión específica de un determinado ion de metal
pesado, a una proteína inmovilizada sobre la superficie del
electrodo (véase la Fig. 2). Debido a que el sensor mide cambios en
la conformación, es importante optimizar las condiciones de la
inmovilización.
Inmovilización del elemento de
reconocimiento: Un electrodo de oro se utilizó en este trabajo
como superficie de metal noble conductora. Para inmovilizar los
elementos de reconocimiento, que eran proteínas de fusión
diferentes, la superficie de oro tenía que ser modificada de alguna
manera. Un método muy conocido y sencillo consiste en utilizar
autoensamblajes de compuestos tiólicos, sulfuros o disulfuros sobre
la superficie de oro. El autoensamblaje es un proceso espontáneo que
produce monocapas de moléculas perfectamente ordenadas. Además, la
unión entre el azufre y el oro es bastante fuerte, un aspecto de
estabilidad importante en el diseño de un biosensor, en el que las
pérdidas del elemento de reconocimiento da como resultado una
pérdida de actividad. Se estudiaron tres métodos de inmovilización
diferentes con el fin de producir una superficie óptima para las
medidas de capacitancia en concreto; el acoplamiento mediado por
EDC, el atrapamiento en PEGDGE y el acoplamiento a glutaraldehído.
En todos los casos un compuesto pequeño que contiene uno o más
grupos con azufre, se autoensambló en primer lugar sobre la
superficie de oro. El acoplamiento mediado por EDC produce una
monocapa de moléculas de proteínas sobre la superficie, sin
reticulación alguna entre las moléculas individuales. Este método se
ha demostrado con anterioridad que consigue la inmovilización de
anticuerpos dispuestos sobre electrodos de oro que llevan ácido
tióctico autoensamblado sobre su superficie (Duan, C.; Meyerhoff,
M.E., Anal. Chem. 66, 1994, 1369-1377]. Con
la inmovilización en PEGDGE, la proteína estará atrapada en una red
polimérica, en la que los metales pesados son capaces de difundir
hacia el interior de los poros del polímero. Las curvas de
calibración correspondientes al cobre se muestran en la figura 3 en
el caso del acoplamiento mediado por EDC (curva superior) y en el
caso del atrapamiento de la proteína en PEGDGE (curva inferior). Se
encontró que la sensibilidad era mucho más alta en el caso del
electrodo activado con EDC. Una explicación posible pudiera ser que
el atrapamiento en PEGDGE impide el cambio conformacional de la
proteína de fusión en cierta medida. La reproducibilidad fue también
menor en el caso de los electrodos de PEGDGE, debido a la dificultad
para depositar exactamente la misma cantidad de la proteína/agente
de reticulación en cada electrodo. Experimentos posteriores se
realizarán con menos concentración de PEGDGE para disminuir la
reticulación y producir con ello una capa de proteína menos rígida.
El glutaraldehído es también un agente de reticulación, pero en este
caso, la superficie se activó primero con glutaraldehído antes de
añadir la proteína. También en este caso es muy importante optimizar
la cantidad del agente de reticulación con el fin de no reticular
demasiado la proteína, haciéndola rígida y no susceptible a
experimentar cambios conformacionales. Todos los demás experimentos
se realizaron con electrodos fabricados mediante el método de
EDC.
Se registraron voltamogramas cíclicos en
K_{3}[Fe(CN)_{6}] 5 mM, KCl 1 M, en una
celda de tipo discontinuo, con el electrodo de oro modificado/no
modificado como electrodo de trabajo, SCE como electrodo de
referencia y un vástago de platino como electrodo auxiliar. La
velocidad de barrido fue de 50 mV/s. Los electrodos se conectaron a
un potenciostato Princeton Applied 274 A, conectado a un
ordenador.
Con el fin de elaborar un sensor de afinidad
sensible, basado en medidas de capacitancia, la capa de
inmovilización tiene que ser lo más fina posible y estar
perfectamente ordenada. Sitios defectuosos en la monocapa pudieran
producir la penetración de moléculas de la disolución a través de la
capa y cerca de la superficie del metal, produciendo el
cortocircuito de la capa de reconocimiento con canales acuosos
altamente conductores. El resultado sería que los cambios en
capacitancia serían más pequeños o estarían ausentes en esos
sensores defectuosos. La importancia de un buen aislamiento de la
superficie del electrodo se ha demostrado con anterioridad
[Berggren, C., Johansson, G., Anal. Chem., pendiente de
aceptación]. El grado de aislamiento puede estudiarse teniendo en la
disolución una pareja redox de tamaño pequeño y permeable. En la
figura 4 se muestra como el bloqueo aumenta para cada una de las
capas adicionales. En el caso de una superficie de oro limpia la
pareja redox K_{3}[Fe(CN)_{6}] se oxida y
se reduce en la superficie del metal. Una superficie cubierta con
ácido tióctico autoensamblado reduce el acceso a la superficie. La
inmovilización de la proteína aísla también la superficie, pero no
es hasta que tiene lugar el tratamiento en
1-dodecanotiol cuando el pico de oxidación/reducción
desaparece por completo. Todos los electrodos de los siguientes
experimentos fueron tratados por lo tanto durante 20 minutos con
1-dodecanotiol.
En este trabajo se estudiaron características
tales como sensibilidad, selectividad, tiempo de respuesta
estabilidad y posibilidad de regeneración de la superficie del
electrodo. Sin embargo, los electrodos basados en GST-SmtA se
estudiaron con mayor profundidad, aunque algunas características de
los electrodos basados en la proteína MerR se estudiaron
también, y los resultados obtenidos se evaluaron y compararon. La
afinidad de la proteína GST-SmtA se estudió para cobre,
cadmio, mercurio y zinc (véase la Fig. 5). Los electrodos
respondieron a los cuatro iones metálicos con sensibilidad
decreciente para Cu > Cd > Hg > Zn, coincidiendo plenamente
con resultados previamente publicados obtenidos con una disolución
de esta proteína fabricada por ingeniería genética [Shi, J.;
Lindsay, W.P.; Huckle, J.W.; Morby, A.P.; Robinson, N.J., FEBS, 303,
1992, 159-163]. El límite de detección estuvo en el
intervalo de concentraciones femtomolares o inferiores para cada uno
de los metales pesados estudiados. Los electrodos de referencia,
preparados del mismo modo pero utilizando BSA en lugar de
GST-SmtA, produjeron señales difícilmente detectables para
Cu, y ausencia completa de señales en el caso de los otros iones
(véase Fig. 6). Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizó
otra proteína, la ureasa, muy conocida por unirse a metales pesados.
En este último caso, la ausencia de señales detectables se supuso
que era debida a la falta de cambios conformacionales después de la
exposición al metal pesado.
La actividad de un electrodo GST-SmtA se
estudió durante un intervalo de tiempo prolongado. Se inyectaron
muestras de cobre de concentraciones desde 10^{-15} M hasta 0,1 M
y se determinaron los cambios en capacitancia. Se obtuvo un aumento
lento de la señal hasta aproximadamente una concentración 10^{-5}
M, después de lo cual el aumento de la señal se hizo mucho más
rápido hasta aproximadamente una concentración 10^{-2} M, a la que
la saturación tuvo lugar (véase la Fig. 7). Se piensa que el aumento
en la primera parte de la curva es debido a la unión específica del
metal pesado y que el segundo aumento probablemente es debido a la
desnaturalización de la proteína presente sobre la superficie del
electrodo. La imposibilidad de regenerar el electrodo después de una
inyección de una disolución de cobre 1 mM apoyaría esta suposición.
La estabilidad del biosensor basado en GST-SmtA se estudió
durante 16 días. Una curva de calibrado entre concentraciones de Cu
de 10^{-15} M a 10^{-10} M se midió cada día y el cambio en
capacitancia total frente al tiempo se representa gráficamente en la
Fig. 8. Entre las medidas, el sensor se guardó a 4ºC, en tampón de
borato 100 mM, pH 8,75. Se observó una pérdida de actividad pasados
10 días, y la actividad disminuyó siendo aproximadamente del 40%
pasados 16 días.
La superficie del biosensor pudo ser regenerada
inyectando 250T1, EDTA 1 mM. Se encontró que si el EDTA se inyectaba
justo antes de guardarlo, el biosensor perdía actividad durante la
noche, pero si el electrodo se guardaba con el metal pesado y el
procedimiento de regeneración tenía lugar inmediatamente antes de
realizar las medidas al día siguiente, no podía observarse pérdida
de actividad. El fenómeno observado se atribuyó a la suposición de
que la proteína tiene una estructura más abierta cuando el ion del
metal pesado está ausente y por ello esta estructura se
desnaturaliza más fácilmente. La regeneración con EDTA después de la
inyección de una muestra que contenía una concentración de Cu^{2+}
tan alta como 1 mM no pudo conseguirse, lo que se atribuye a la
desnaturalización irreversible de la superficie producida por esta
alta concentración del ion del metal pesado.
Se construyeron biosensores utilizando la segunda
proteína construida por ingeniería genética, MerR, y se
registraron las señales para Cu, Cd, Hg y Zn. Esta proteína se había
publicado que era altamente específica para los iones de
mercurio(II) [Frantz, B.; O'Hallaran, T.V.;
Biochemistry, 29, 1990, 4747-4751. Esta
proteína fue inmovilizada sobre la superficie de oro, únicamente
utilizando el método de acoplamiento mediado por EDC. Los resultados
obtenidos presentaron una buena concordancia con las propiedades
publicadas, los electrodos basados en MerR manifestaban la
sensibilidad más alta para mercurio, y que este electrodo mostraba
una mayor selectividad que los electrodos basados en GST-SmtA
(Véase la Fig. 9).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Vlaamse Instelling voor Technologish Onderzoek
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Boeretang 200
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Mol
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Bélgica
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 2400
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +32 14 33 51 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +32 14 32 03 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Universidad de Birmingham
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Edgbaston
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Birmingham
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: B15 2TT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Universidad de Lund
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE/APARTADO DE CORREOS: 124
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lund
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 221 00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: Sensor de afinidad capacitivo, específico de iones metálicos
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release n.º 1.0, Versión n.º 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 289 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Synechococcus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 144 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Pseudomonas aeruginosa
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 145 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Alcaligenes eutrophus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: CH34
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE EL SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Pseudomonas aeruginosa
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Un método para producir un sensor de afinidad
capacitivo, específico de iones metálicos, adecuado para determinar
la presencia de un determinado ion de metal pesado mediante medida
de la capacitancia, que comprende las etapas de:
a) preparar una pieza de un metal noble, en el
que dicha pieza puede ser opcionalmente una varilla, o como
alternativa, una pieza de un material aislante tal como vidrio,
silicio o cuarzo, sobre la que un material noble es pulverizado o
imprimido;
b) preparar una primera molécula formadora de una
monocapa autoensamblante, que comprende un grupo de
acoplamiento;
c) poner en contacto la pieza de la etapa a) con
la primera molécula formadora de una monocapa autoensamblante de la
etapa b), obteniendo de este modo una monocapa autoensamblante sobre
dicha superficie de metal noble;
d) poner en contacto dicha moncapa
autoensamblante dispuesta sobre dicha pieza de metal noble con una
molécula que se une de manera específica a dicho ion de metal
pesado, acoplando de este modo dicha molécula a la monocapa
autoensamblante;
e) poner en contacto la pieza obtenida en la
etapa d) con una segunda molécula formadora de una monocapa
autoensamblante, obteniendo de este modo una superficie de metal
noble que está cubierta al menos en el 90%, preferiblemente al menos
en el 95%, más preferiblemente al menos en el 97%, y muy
preferiblemente al menos en el 99%, con una monocapa
autoensamblante.
2. Un método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la reacción de acoplamiento de la etapa
d) se lleva a cabo en presencia de PEGDEG.
3. Un método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la pieza se expone a una disolución que
contiene una sustancia formadora de reticulación, tal como
glutaraldehído, antes de la etapa d).
4. Un método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la primera molécula formadora de una
monocapa autoensamblante es el ácido D/L-tióctico, y
porque dicho ácido D/L-tióctico se activa con
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida
antes de que la etapa d) se lleve a cabo.
5. Un método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la segunda molécula formadora de una
monocapa autoensamblante es un tiol que comprende
3-25 átomos de carbono en una cadena lineal
saturada, y preferiblemente es 1-dodecanotiol.
6. Un sensor de afinidad capacitivo, específico
de iones metálicos, que comprende una pieza de un metal noble, en el
que dicha pieza puede ser opcionalmente una varilla, o como
alternativa, una pieza de un material aislante tal como vidrio,
silicio o cuarzo, sobre la que un material noble es pulverizado,
pieza a la que se han unido grupos que se unen específicamente a un
determinado ion de metal pesado de interés, caracterizado
porque dichos grupos que se unen específicamente a dicho ion de
metal pesado, están unidos a una monocapa autoensamblante que cubre
al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más
preferiblemente al menos el 97%, y muy preferiblemente al menos el
99% de la superficie del metal noble, caracterizado porque
dicho sensor ha sido producido por medio de un método según una
cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
7. Un sensor según la reivindicación 6,
caracterizado porque los grupos que se unen específicamente a
iones de metales pesados, se seleccionan entre el grupo de proteínas
que tienen las secuencias SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2, SEQ. ID.
NO. 3 o SEQ. ID. NO. 4, o de sus derivados funcionales que poseen
características de unión equivalentes.
8. Un método para determinar cualitativa o
cuantitativamente la presencia de un determinado ion de metal pesado
de interés en una muestra líquida, que comprende las etapas de:
a) preparar un sensor según la reivindicación 6,
en el que dichos grupos de afinidad se unen de manera específica a
dicho ion de metal pesado de interés;
b) poner en contacto dicho sensor con un líquido
de referencia que no contiene dicho ion de metal pesado de interés y
determinar la capacitancia según métodos conocidos per
se;
c) poner en contacto dicho sensor con una muestra
sospechosa de contener dicho ion de metal pesado y determinar la
capacitancia según métodos conocidos per se; y
d) calcular la diferencia entre la capacitancia
de la muestra y la capacitancia de la muestra de referencia, y
calcular opcionalmente la cantidad de dicho compuesto utilizando
datos de calibración preregistrados.
9. Un método según la reivindicación 8, para
determinar la presencia de iones seleccionados entre el grupo de
Zn^{2+}, Hg^{2+}, Cd^{2+}, Cu^{2+} y Pb^{2+}.
10. El uso de un sensor según la reivindicación
6, para determinar la presencia de iones seleccionados entre el
grupo de Zn^{2+}, Hg^{2+}, Cd^{2+}, Cu^{2+} y Pb^{2+}.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9703315A SE520302C2 (sv) | 1997-09-15 | 1997-09-15 | Metalljonspecifik kapacitanssensor |
| SE9703315 | 1997-09-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2230716T3 true ES2230716T3 (es) | 2005-05-01 |
Family
ID=20408244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98944398T Expired - Lifetime ES2230716T3 (es) | 1997-09-15 | 1998-09-15 | Sensor de afinidad capacitivo especifico de iones metalicos. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6933153B1 (es) |
| EP (1) | EP1018011B1 (es) |
| JP (1) | JP2001516882A (es) |
| AT (1) | ATE272840T1 (es) |
| DE (1) | DE69825460T2 (es) |
| ES (1) | ES2230716T3 (es) |
| SE (1) | SE520302C2 (es) |
| WO (1) | WO1999014597A1 (es) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7553448B2 (en) | 2002-06-20 | 2009-06-30 | Bioveris Corporation | Electrochemiluminescence flow cell and flow cell components |
| US7964146B2 (en) | 2004-05-30 | 2011-06-21 | Agamatrix, Inc. | Measuring device and methods for use therewith |
| US20060194198A1 (en) * | 2004-06-29 | 2006-08-31 | Carlo Licata | Use of fibrous protein fibers for chemical sensing and radiation detection |
| JP2006090782A (ja) * | 2004-09-22 | 2006-04-06 | Fyuuensu:Kk | 基板上に固定化した蛋白質の構造変化を検出する方法 |
| EP1893990B1 (en) * | 2005-06-03 | 2018-05-02 | Board of Regents of the University of Texas System | Electrochemistry and electrogenerated chemiluminescence with a single faradaic electrode |
| US20100317124A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-12-16 | Yong Hyup Kim | Metal-containing nanomembranes for molecular sensing |
| AR090303A1 (es) * | 2013-03-11 | 2014-11-05 | Consejo Nac Invest Cient Tec | Polipeptido mutado, cepa de bacterias que lo comprende y metodos para detectar diferentes cationes metalicos simultaneamente |
| ITUA20163876A1 (it) * | 2016-05-27 | 2017-11-27 | Univ Del Salento | Biorecettore per ioni metallici. |
| CN106279374A (zh) * | 2016-08-26 | 2017-01-04 | 深圳市职业病防治院 | 一种与铅离子结合的多肽及其应用 |
| WO2023240255A2 (en) * | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Northwestern University | Cell-free biosensors for in vitro detection of target molecules |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU609736B2 (en) | 1986-09-19 | 1991-05-09 | Dow Chemical Company, The | Process and apparatus for producing extruded thermoplastic foam bodies |
| DE3634573C1 (de) * | 1986-10-10 | 1987-10-22 | Messerschmitt Boelkow Blohm | Biosensor |
| US5972656A (en) * | 1989-03-14 | 1999-10-26 | Bionebraska, Inc. | Mercury binding polypeptides and nucleotides coding therefore |
| US4964972A (en) * | 1989-03-30 | 1990-10-23 | Yeda Research And Development Company Limited | Ionic recognition and selective response in self assembling monolayer membranes on electrodes |
| US5498538A (en) * | 1990-02-15 | 1996-03-12 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Totally synthetic affinity reagents |
| DE69132902D1 (de) * | 1990-02-15 | 2002-02-21 | Univ North Carolina Chapel Hill | Methoden zur identifizierung heterofunktionaler fusionsproteine |
| US5594115A (en) * | 1990-04-09 | 1997-01-14 | Pharmacia & Upjohn Company | Process of purifying recombinant proteins and compounds useful in such process |
| US6391590B1 (en) * | 1991-10-21 | 2002-05-21 | The Regents Of The University Of California | Recombinant streptavidin-metallothionein chimeric protein having biological recognition specificity |
| GB9315183D0 (en) * | 1993-07-22 | 1993-09-08 | British Nuclear Fuels Plc | Biosensors |
| US6111079A (en) * | 1995-06-05 | 2000-08-29 | Bionebraska, Inc. | Lead binding polypeptides and nucleotides coding therefore |
| US6306584B1 (en) * | 1997-01-21 | 2001-10-23 | President And Fellows Of Harvard College | Electronic-property probing of biological molecules at surfaces |
-
1997
- 1997-09-15 SE SE9703315A patent/SE520302C2/sv unknown
-
1998
- 1998-09-15 JP JP2000512082A patent/JP2001516882A/ja active Pending
- 1998-09-15 US US09/508,775 patent/US6933153B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-15 AT AT98944398T patent/ATE272840T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-09-15 ES ES98944398T patent/ES2230716T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-15 EP EP98944398A patent/EP1018011B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-15 DE DE69825460T patent/DE69825460T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-15 WO PCT/SE1998/001638 patent/WO1999014597A1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6933153B1 (en) | 2005-08-23 |
| SE9703315L (sv) | 1999-03-16 |
| ATE272840T1 (de) | 2004-08-15 |
| SE520302C2 (sv) | 2003-06-24 |
| EP1018011A1 (en) | 2000-07-12 |
| JP2001516882A (ja) | 2001-10-02 |
| WO1999014597A1 (en) | 1999-03-25 |
| DE69825460D1 (de) | 2004-09-09 |
| DE69825460T2 (de) | 2005-08-04 |
| EP1018011B1 (en) | 2004-08-04 |
| SE9703315D0 (sv) | 1997-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mahmoud et al. | Modification of N, S co-doped graphene quantum dots with p-aminothiophenol-functionalized gold nanoparticles for molecular imprint-based voltammetric determination of the antiviral drug sofosbuvir | |
| Chauhan et al. | An amperometric uric acid biosensor based on multiwalled carbon nanotube–gold nanoparticle composite | |
| Privett et al. | Electrochemical sensors | |
| Pingarrón et al. | Gold nanoparticle-based electrochemical biosensors | |
| EP0886773B1 (de) | Detektion von molekülen und molekülkomplexen | |
| Hasanzadeh et al. | Electrochemical nanobiosensing in whole blood: Recent advances | |
| US6013170A (en) | Detection of analytes using reorganization energy | |
| EP1254372B1 (en) | Binding acceleration techniques for the detection of analytes | |
| IL124322A (en) | Detection of an entity in a sample | |
| WO2009032901A1 (en) | Biosensors and related methods | |
| Heli et al. | Adsorption of human serum albumin onto glassy carbon surface–Applied to albumin-modified electrode: Mode of protein–ligand interactions | |
| ES2230716T3 (es) | Sensor de afinidad capacitivo especifico de iones metalicos. | |
| Veloso et al. | Electrochemical biosensors for medical applications | |
| Babkina et al. | Amperometric biosensor based on denatured DNA for the study of heavy metals complexing with DNA and their determination in biological, water and food samples | |
| Sánchez-Paniagua et al. | Electrochemical genosensor for Klotho detection based on aliphatic and aromatic thiols self-assembled monolayers | |
| Kafi et al. | Development of a peroxide biosensor made of a thiolated-viologen and hemoglobin-modified gold electrode | |
| EP2700937A1 (en) | Electrode chip for detecting biological molecule, and method for detecting biological molecule | |
| Fink et al. | Thin functionalized films on cylindrical microelectrodes for electrochemical determination of Hg (II) | |
| Wang et al. | A pendulum-type electrochemical aptamer-based sensor for continuous, real-time and stable detection of proteins | |
| ULUDAĞ et al. | An ultrasensitive electrochemical immunosensor platform based on disposable ITO electrode modified by 3-CPTMS for early detection of parathyroid hormone | |
| Yáñez-Sedeño et al. | Recent Advances and Prospects in Nanomaterials-Based Electrochemical Affinity Biosensors for Autoimmune Disease Biomarkers | |
| Shin et al. | A superior anti-fouling electrode sensing layer based on a tannic acid–polyethyleneimine–graphene oxide nanocomposite for thrombin detection in complex biological fluids | |
| Radi et al. | Investigation of antimalarial drug pyrimethamine and its interaction with dsDNA by electrochemical and spectroscopic techniques | |
| Kanbes-Dindar et al. | Nanostructured materials-modified electrochemical biosensing devices for determination of neurochemicals | |
| Önal et al. | Electroanalytical Investigation of Cancer Chemotherapy Drug Vinorelbine On Disposable Pencil Graphite Electrode in Surfactant Media by Voltametric Method |