JP2001516882A - 金属イオン特異的静電容量アフィニティーセンサー - Google Patents

金属イオン特異的静電容量アフィニティーセンサー

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JP2001516882A
JP2001516882A JP2000512082A JP2000512082A JP2001516882A JP 2001516882 A JP2001516882 A JP 2001516882A JP 2000512082 A JP2000512082 A JP 2000512082A JP 2000512082 A JP2000512082 A JP 2000512082A JP 2001516882 A JP2001516882 A JP 2001516882A
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JP2000512082A
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ボー マティアソン，
エリザベス クセレギ，
イボリヤ ボンティダン，
ギリス ヨハンソン，
クリスティン ベルグレン，
ニジェル ブラウン，
ジョナサン ロイド，
ケネス ジェイクマン，
ジョナサン ホブマン，
ジョナサン ウィルソン、
デル レリ， ダニエル ヴァン
フィリップ コルビシェ，
Original Assignee
ヴラームス インステリング ヴール テクノロギシュ オンデルゾーク
スクール オブ バイオロジカル サイエンスィズ
ボー マティアソン，
エリザベス クセレギ，
イボリヤ ボンティダン，
ギリス ヨハンソン，
クリスティン ベルグレン，
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は例外的な感度と幅広い作動範囲を持つ金属イオン特異的静電容量センサーに関する。測定貴金属電極の表面を実質的に完全に被覆する自己集成単一層に様々な種類の認識要素を直接固定することができるのでそれは多方面に利用できる。かくして電極は表面上の認識要素に親和性を示す溶液中の金属イオンに対して選択的になる。従来記述されている電気化学的センサーと比較して、本発明によるセンサーは独特の測定原理のために感度が極めて良好である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 環境中の、医薬中の、食品又は他の製品中の重金属イオンの微量濃度を測定す
る必要がある。重金属は毒性元素であるので、微量レベルでそれらを測定できる
ことが重要である。いくつかの重金属（銅や亜鉛等）は生きている細胞にとって
必須である。原子吸光分光分析法、誘導結合プラズマ放出分光測定法及びプラズ
マ放出質量分光測定法の如き様々な古典的方法が幅広く使用されている。これら
の方法は精巧な装置及び熟練した人員を必要とする。それ故、容易かつ安価な方
法に対する要求がある。金属イオン測定のための電気化学的方法はイオン選択的
電極、ポーラログラフィ及び他の電圧測定電極を含む。バイオセンサーは選択的
かつ鋭敏な分析装置であり、いくつかの異なるバイオセンサー構成が重金属検出
のために過去において記述されている。細胞全体に基づくバイオセンサーは一つ
の可能な設計を表し、これらは細菌、酵母、真菌、地衣、苔、及び水生植物を認
識要素として利用することができる［Wittman,C.;Riedel,K.;Schmid,R.D.Handb.
Biosens.Electron.Noses,1997 299-332］。他のアプローチは酵素を検出のため に用いることである。今までのところ、アポ酵素の利用が最も成功しており幅広
く用いられている方法である［Mattiasson,B.;Nilsson,H.;Olsson,B.J.Appl.Bio
chem., 1 1979 377-384］。しかしこれらのセンサーは選択性に限界があり、感 度もかなり低いという特徴を有する。
【０００２】 タンパク質工学は天然に存在するタンパク質よりも選択性が高い新規タンパク
質を設計して製造する可能性を切り開いた。融合タンパク質ＧＳＴ−ＳｍｔＡ（
配列番号１）はタンパク質工学によって開発され、様々な重金属イオン（Ｃｕ２ ＋ ，Ｚｎ２＋，Ｃｄ２＋及びＨｇ２＋）に対して幅広い選択性を示すことが報告
されている［Shi,J.;Lindsay,W.P.;Huckle,J.W.;Morby,A.P.;Robinson,N.J.FEBS
,303,1992 159-163］。ＭｅｒＲと呼ばれる他の融合タンパク質（配列番号２） はＨｇ２＋に対して独占的に選択性となるように改変されている［Frantz,B.;O'
Hallaran,T.V.;Biochemistry,29,1990 4747-4751］。アルカリゲネス・エウトロ
フス（Alcaligenes eutrophus）ＣＨ３４株（この株は寄託番号ＬＭＧ Ｐ−１ ８０７７としてＢＣＣＭに寄託されている）からの第三のタンパク質ＰｂｒＲ（
配列番号３）はＰｂ２＋に対して選択的である。第四のタンパク質ＭｅｒＰ（配
列番号４）はＨｇ２＋に対して選択的である。重金属イオンがこれらのタンパク
質に結合する場合、大きな構造変化が起こるものと考えられている。本発明はこ
れらの構造変化を直接検出することが可能な静電容量センサーを記述する。
【０００３】 金電極上のチオール、スルフィド、及びジスルフィドの自己集成単一層は幅広
く研究されてきており、長鎖のアルカンチオールは金基体上に絶縁性の良く組織
された（well-organized）構造を形成することが知られている［Porter,M.D.;Br
ight,T.B.;Allara,D.L.;Chidsey,C.E.D.J.Am.Chem.Soc 1987,109,3559-3568］。
硫黄原子と金との間に形成された結合は極めて強く、形成された自己集成単一層
（ＳＡＭ）は室温で大気中、水中、及び有機溶媒中で安定である［Bain,C.D.;Tr
oughton,E.B.;Tao,Y.-T.;Evall,J.;Whitesides,G.M.;Nuzzo,R.G.J.Am.Chem.Soc.
1989,111,321-335］。多様な適用について低コストでバイオセンサーを製造する
ために官能基を付与された(functionalized)自己集成単一層で表面にパターンを
付与するため、微小接触印刷(micro-contact printing)［Mrksich,M.;Whiteside
s,G.M.Tibtech 1995,13,228-235］及びフォトリソグラフィー［Bhatia,S.K.;Hic
kman,J.J.;Ligler,F.S.J.Am.Chem.Soc.1992,114,4432-4433］を用いることがで きることが示唆されている。しかし高感度を持つ直接アフィニティーセンサーを
製造することは今まで不可能であった。
【０００４】発明の概要 以下の工程を含む、キャパシタンス測定によって特定の重金属イオンの存在を
測定するのに好適な金属イオン特異的静電容量アフィニティーセンサーが予測外
に良好であることが今や明らかとなった： ａ） 一片の貴金属を準備する（但し前記片は所望により棒であってもよいし
、又は貴金属がスパッター又は印刷されているガラス、珪素、又は石英の如き絶
縁材料の一片であってもよい）； ｂ） 結合基を含む第一ＳＡＭ形成分子を準備する； ｃ） 工程ａ）の片を工程ｂ）の第一ＳＡＭ形成分子と接触させ、それによっ
て前記貴金属表面上に自己集成単一層を得る； ｄ） 前記貴金属片上の前記自己集成単一層を前記重金属イオンに特異的に結
合する分子と接触させ、それによって前記分子を自己集成単一層に結合させる； ｅ） 工程ｄ）において得られた片を第二ＳＡＭ形成分子と接触させ、それに
よって少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なく
とも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％が自己集成単一層で被覆された貴
金属表面を得る。
【０００５】発明の実施の形態 本発明において報告された検出限界は電気化学的金属検出法について従来報告
されていたものよりも１０の何乗倍も良好である。本発明の背後にある明察は認
識層は薄くて良好に整列されて（well-ordered）おらなければならず、それはセ
ンサー表面の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは
少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％を被覆しておらねばならな
いということである。続く工程においては認識要素間のいかなる自由点も親和性
基を含む自己集成単一層を得た後、第二自己集成単一層形成分子（例えば３−２
５の炭素原子を含む、好ましくは直鎖状のアルカンチオール）でプラグされ(plu
gged)、即ち被覆され、それによって堅固さ及び絶縁度を増大させる。静電容量 バイオセンサーは認識要素が溶液に対して固定された自己集成単一層によって被
覆される。電気的にはそれは導電性金属電極と導電性溶液との間のコンデンサー
に相当する。
【０００６】 認識が行われる面の下に水溶液が浸透することを許す表面のいかなる部分も短
絡素子のように作用するであろう。それ故、キャパシタンスは浸透する水溶液の
高い誘電率のため増大するであろう。酸化物層はそれほど良好には整列されてお
らず、従って密な認識層を形成することは不可能である。自己集成単一層はずっ
と良好に整列されており、従ってより完全な被覆が固定された層中に期待され得
る。更に、自己集成単一層は酸化物層よりもずっと薄く、分子が表面に結合する
際に形成されるキャパシタンスと直列により大きいキャパシタンスを生ずる。こ
れは分析対象物が表面に結合する際にキャパシタンスの変化を検出することを容
易にする。
【０００７】 本発明は生物工学的に改変されたタンパク質に所望により基づく、重金属イオ
ンを微量レベルで監視するためのアフィニティーセンサーを記述する。重金属を
特異的に結合する物質は自己集成単一層を介して導電性表面に結合される。所望
の重金属イオンが前記表面に結合すると構造変化が起こり、それはキャパシタン
ス変化に関連している。融合された認識層は電解質溶液中のレドックス結合及び
高い誘導背景電流からの干渉を防止するため、電気的に絶縁性であるべきである
。その一方では、それは高感度を達成するために可能な限り薄くあるべきである
。金又は他の自己集成金属に対する自己集成結合の使用は特に薄くて密な層を与
える。本発明は様々なタイプの自己集成分子を用いたプラグ形成によってどのよ
うにして付加的な絶縁が得られるかをも示す。
【０００８】 従って本発明は金属イオン特異的静電容量アフィニティーセンサーの製造方法
に関し、そこでは一片の貴金属が親和性基を含む自己集成単一層形成分子の層で
被覆される。続いて貴金属表面上のいかなる残存自由点をも第二自己集成単一層
形成分子によって被覆される。
【０００９】 他の側面においては本発明は自己集成単一層で実質的に完全に被覆された貴金
属の片を含む金属イオン特異的静電容量アフィニティーセンサーに関し、前記自
己集成単一層は関心のある特定分子に特異的に結合する親和性基を含む。
【００１０】 また別の側面においては本発明は関心のある特定重金属イオンの存在を定性的
又は定量的に測定する方法に関する。関心のある特定重金属イオンに特異的に結
合する親和性基を含む自己集成単一層で実質的に完全に被覆された貴金属表面を
含む金属イオン特異的静電容量アフィニティーセンサーは関心のある重金属イオ
ンを含む液体サンプルに接触させられ、センサーのキャパシタンス変化が測定さ
れる。
【００１１】 更なる側面においては本発明はＺｎ２＋，Ｈｇ２＋，Ｃｄ２＋，Ｃｕ２＋及び
Ｐｂ２＋の如き関心のある特定重金属を分析するための前記センサーの使用方法
に関する。
【００１２】 定 義： ここで述べる通り、用語「自己集成単一層(self-assembled monolayer)」及び
「ＳＡＭ」は同意語であり、固体表面への溶液からの薄膜成分の自然吸着によっ
て形成される、良好に整列された単一層を意味する。金基体上のかかる層は従来
記載されている［Porter,M.D.;Bright,T.B.;Allara,D.L.;Chidsey,C.E.D.J.Am.C
hem.Soc.1987,109,3559-3568］。
【００１３】 ここで述べる通り、用語「貴金属(noble metal) 」は金、銀、銅、白金及びパ
ラジウムからなる群から選択される金属を意味する。金が好ましい。
【００１４】 ここで述べる通り、用語「関心のある特定重金属イオンに特異的に結合する基
／分子」は特定重金属イオンに特異的に結合する基又は分子をそれぞれ意味する
。かかる結合特性を有するいかなる分子も本発明において使用することができる
。かかる分子の例はキレート化合物及び特定タンパク質である。好ましい実施態
様では配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれかの配列を
持つタンパク質が用いられる。
【００１５】 ここで述べる通り、用語「ＳＡＭ形成分子（ＳＡＭ−forming molecule）」は
貴金属上に自己集成単一層を形成する能力を持つ分子を意味する。ＳＡＭ形成分
子は少なくとも一つのチオール、スルフィド又はジスルフィド基を含む。しかし
重金属結合分子はそれ自体はＳＡＭ形成分子ではない。それらは別の工程におい
て小さいＳＡＭ形成分子に結合されなくてはならない。かかる小さいＳＡＭ形成
分子の例はチオクト酸及びシステアミンである。この結合工程は貴金属表面上で
の自己集成単一層の形成後に行われる。当業者ならどのようにして好適な結合反
応及び結合基を選択するか良く知っているであろう。以下の実施例においてはチ
オクト酸からなる自己集成単一層は１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−
エチル−カルボジイミドによって活性化される。続いて重金属結合分子は活性化
された単一層に結合される。しかし、他の同様の結合反応が文献においては記述
されている。
【００１６】 ここで述べる通り、用語「プラグする(plugging)」は貴金属表面上の自己集成
単一層への、又は親和性分子が利用できるチオール、スルフィド又はジスルフィ
ド基（これらは親和性分子をＳＡＭ形成分子自体とせしめる）を含む場合は直接
貴金属表面への親和性基の固定後に前記表面上のいかなるブロックされていない
点をもブロックするための、チオール、スルフィド又はジスルフィドを含む溶液
中での処理を意味する。既に述べた通り、センサーの感度を最適化するために貴
金属表面は可能な限り完全にＳＡＭによって被覆されることが必要である。
【００１７】 ここで述べる通り、用語「重金属イオン」は原子番号２１以上の金属イオン（
たとえばＴｉ，Ｖ，Ｃｒ，Ｍｎ，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｎｉ，Ｃｕ，Ｚｎ，Ｚｒ，Ｎｂ，
Ｍｏ，Ｒｕ，Ｒｈ，Ｐｄ，Ａｇ，Ｃｄ，Ｉｎ，Ｓｎ，Ｔａ，Ｗ，Ｒｅ，Ｏｓ，Ｉ
ｒ，Ｐｔ，Ａｕ，Ｈｇ，Ｔｌ，Ｐｂ及びＢｉ）を意味する。本発明はＺｎ２＋，
Ｈｇ２＋，Ｃｄ２＋，Ｃｕ２＋及びＰｂ２＋の存在を測定するのに特に有用であ
る。
【００１８】 ここで述べる通り、用語「機能的誘導体（functional derivatives）」は元の
アミノ酸配列が修飾されているか又は一以上のアミノ酸の挿入、付加、置換又は
除去によって変更されている誘導体並びに元のアミノ酸配列又はその一部分の重
複を含む誘導体を意味する。
【００１９】 ここで述べる通り、ＳＣＥは飽和カロメル電極を表し；静電位摂動（potentio
static perturbation）は電位の迅速な変化を意味し；ＰＥＧＤＧＥはポリエチ レン−グリコール−ジ−グリシジル−エーテルを表す。ＢＳＡはウシ血清アルブ
ミンを意味する。
【００２０】 本発明においては測定されるべき重金属イオンを含む溶液は認識要素を含む導
電性表面と電気的に接触させられ、その後、キャパシタンス又はインピーダンス
変化が測定される。キャパシタンス変化は溶液と固体金属又は下に横たわる非導
電性表面上にスパッターされている金属からなる金属表面の間で起こる。金属と
のファラデー反応及び背景電流は表面の認識要素によってブロックされ、絶縁を
改良する補助化合物を用いた処理によって結局改良される。認識要素は自己集成
を通して直接的に又は電極上の自己集成化合物にそれを結合させることによって
金属表面に結合される。それは吸着、重合又は被覆を通しても結合されることが
できる。測定は定電位法を用いて電極に変動電圧を適用し、電流変化を分析する
ことによって行われる。感度は二次特異的リガンドを含む溶液を既に表面上にあ
る分析対象物に結合させ、それによって境界凝集体及びキャパシタンス変化の大
きさを増大させることによって改良することができる。
【００２１】 本発明は添付の図面を参照して以下より詳細に説明される。
【００２２】 図１はどのようにして重金属特異的タンパク質が金属表面に固定されるか、及
びどのようにしてその三次元構造が重金属イオンがタンパク質に結合すると変化
するかを模式的に示す。
【００２３】 図２は測定フローセル、ａ）測定電極、ｂ）補助白金箔電極、ｃ）白金電線参
照電極、ｄ）Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を示す。
【００２４】 図３はＥＤＣ媒体結合を持つＧＳＴ−ＳｍｔＡタンパク質で固定された電極に
ついての銅についての応答（上方の曲線）、及びＰＥＧＤＧＥ閉じ込めを持つＧ
ＳＴ−ＳｍｔＡタンパク質で固定された電極についての銅についての応答（下方
の曲線）を示す。詳細については実施例１を参照されたい。
【００２５】 図４は測定電極がａ）非修飾金、ｂ）チオクト酸で修飾された金、ｃ）ｂにお
いて固定された融合タンパク質ＧＳＴ−ＳｍｔＡで余分な修飾をされた金、及び
ｄ）ｃにおいて１−ドデカンチオールで余分な修飾をされた金である場合のＦｅ
（ＣＮ）６ ３−溶液で記録された循環電圧応答を示す。更なる詳細は実施例２に
与えられている。
【００２６】 図５はＧＳＴ−ＳｍｔＡで固定された電極についての重金属イオン濃度に対す
るキャパシタンス変化を示す。曲線１）はＺｎ２＋に対する応答を示し、曲線２
）はＨｇ２＋に対する、曲線３）はＣｄ２＋に対する、曲線４）はＣｕ２＋に対
する応答を示す。測定は１００ｍＭ硼酸緩衝液ｐＨ８．７５で０．５ｍｌ／分の
流速で行われた。２５０μｌの容量を持つサンプルが注入された。更なる詳細に
ついては実施例３を参照されたい。
【００２７】 図６はタンパク質のＥＤＣ結合を用いた電極についてのＣｕ２＋濃度に対する
キャパシタンス変化を示す。上方の曲線はＧＳＴ−ＳｍｔＡベースの電極につい
てのシグナルを示し、下方の曲線は表面上にＢＳＡを持つ空試験電極によって記
録されたシグナルを示す。測定は１００ｍＭ硼酸緩衝液ｐＨ８．７５で０．５ｍ
ｌ／分の流速で行われた。２５０μｌの容量のサンプルが注入された。更なる詳
細については実施例３を参照されたい。
【００２８】 図７は１０−１５Ｍから０．１Ｍの範囲のＣｕ２＋濃度に対するキャパシタン
ス変化を示す。測定は１００ｍＭ硼酸緩衝液ｐＨ８．７５で０．５ｍｌ／分の流
速で行われた。２５０μｌの容量のサンプルが注入された。更なる詳細について
は実施例３を参照されたい。
【００２９】 図８は本発明によるＧＳＴ−ＳｍｔＡ電極についての安定性研究を示す。１フ
ェムトモルから１００ピコモルの検量線は各日に記録され、時間に対する総キャ
パシタンス変化がプロットされた。測定と測定の間、センサーは４℃で１００ｍ
Ｍ硼酸緩衝液ｐＨ８．７５で貯蔵された。詳細は実施例３に与えられている。
【００３０】 図９はＭｅｒＲ固定電極についての重金属イオン濃度に対するキャパシタンス
変化を示す。曲線１）はＣｄ２＋に対する応答を示し、曲線２）はＣｕ２＋に対
する応答を示し、曲線３）はＨｇ２＋に対する応答を示す。測定は１００ｍＭ硼
酸緩衝液ｐＨ８．７５で０．５ｍｌ／分の流速で行われた。２５０μｌの容量の
サンプルが注入された。更なる詳細については実施例４を参照されたい。
【００３１】 固体測定金属電極が用いられる場合、金の棒（通常は直径３ｍｍ）が研磨され
、清潔にされ、認識要素を持つ自己集成体又は認識要素と結合することができる
化合物を持つ自己集成体を通して被覆される。多数の結合法が知られており、実
施例において述べられる結合法の好適な代替法として用いることができる。ガラ
ス、石英、珪素又は使い捨て電極の如き他の絶縁材料上にスパッター又は印刷さ
れた金属を用いることも可能である。清潔にされた後、電極は回分式に被覆され
、迅速接続測定セルに挿入される。多数の異なる認識要素は、もしそれらが絶縁
部分によって隔離され、マイクロプロセッサーによって制御可能なスイッチで定
電位に接続されるのなら、同一のスパッターされた電極上に固定することができ
る。
【００３２】 総キャパシタンスの逆数は直列に接続された各層（即ちチオクト酸の層、タン
パク質の層）のキャパシタンスの逆数及び二重層空間電荷と溶液の間のキャパシ
タンスの逆数の総和である。もしこれらのうちの一つが他のものと比較して小さ
ければ、それが総キャパシタンスを左右することになる。特に自己集成部分が小
さいキャパシタンスを生ずる場合、それは認識層のキャパシタンスよりも優勢と
なる。かくして認識層の変化は総キャパシタンスに対してほとんど影響を与えず
、このことはセンサーの全体的な感度の低下をもたらす。
【００３３】 電極はキュベット型(cuvette type)又は図２に示すようなフローセルであるこ
とができるセルに挿入される。セルは補助電極（通常は白金箔）を含んでいなく
てはならず、それは測定電極と対称的にかつ測定電極の反対側に配置されるべき
である。参照電極（通常はＳＣＥ又はＡｇ／ＡｇＣｌ）は容量性電流又は誘導電
流による参照電極と測定電極の間の電圧低下が極めて小さくなるようにセル中に
配置される。いくつかの場合には、もし極めて小さい付加参照電極が用いられる
なら（図１ｃ参照）、そしてＳＣＥ参照電極が取り除かれるのなら（図１ｄ）、
性能を改良することができるであろう。フローセルは測定電極への物質移動につ
いてより正確なコントロールを与え、サンプルの注入及び清掃はより容易に自動
化される。２ｍｌ及び１０μｌの容量を持つフローセルはほぼ同様の感度を持つ
ことが見出された。珪素上に金をスパッターすることによって作られた使い捨て
電極を持つフローセルも同様の特性を持っていた。
【００３４】 電極は迅速定電位に接続されており、その定電位はマイクロプロセッサーによ
って制御されている。定電位は測定電極を参照電極に対して予備設定値に保つで
あろう。定電位摂動が測定電極上に課せられる。それは正弦波であってもよいし
、ステップ電圧又は結果の解釈を可能にするいかなる他の波形であってもよい。
摂動電圧によって生じた電流は測定電極のキャパシタンスの測定に用いられる。
それはロックイン増幅器中の電流のインフェーズ（in-phase）及びアウトフェー
ズ（out-phase）部分を分離することによって正弦波摂動について行うことがで きる。もしこれが様々な周波数で繰り返されるとインピーダンススペクトルを得
ることができる。すべての場合においてキャパシタンスは電流応答から測定する
ことができる。電気化学においては普通のことであるように、電流と電位の役割
は反転させることができる。即ち、電流におけるガルバーニ静電気ステップは電
位を変化させるであろう。この変化は異なるアルゴリズムを用いてではあるがキ
ャパシタンス測定に利用することができる。
【００３５】 既知の容量のサンプルは例えば回分型セル中のキュベット中で既知の容量の導
電性液体と通常混合される。フローセルの場合、既知の容量が既知の流速でポン
プされている導電性担体流中に注入される。導電性液体は通常数ミリモル以上の
イオン強度を持つ緩衝液である。サンプルは非導電性媒体中にあることもできる
が、測定が行われる際は導電性溶液がセルを満たしていなくてはならない。
【００３６】 本発明は以下の実施例において以下更に説明される。これらの実施例は説明の
目的で与えられるものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものでは
ない。
【００３７】実施例１ 融合タンパク質ＧＳＴ−ＳｍｔＡ及びＭｅｒＲは以下のようにして製造され、
リン酸緩衝食塩水（７０ｍＭ ＮａＣｌ，１．３ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ Ｎａ２ ＨＰＯ４，０．９ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．３）含有５０％（ｖ／ｖ）グリ
セロールに最終濃度が１ｍｇ／ｍｌタンパク質となるように溶解された。チオク
ト酸及びグルタルアルデヒドはSigmaから購入し、１−（３−ジメチルアミノプ ロピル）−３−エチル−カルボジイミドヒドロクロライドはFlukaから購入され た。１−ドデカンチオール及び電極に用いられた金棒（Cat. No 26,583-7,=3mm ）はAldrich Chemicalsから得られた。重金属ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，ＺｎＣｌ ２ ，ＨｇＣｌ２，及びＣｄ（ＮＯ３）２・４Ｈ２ＯはすべてMerck（Darmstadt,
Germany）から得た。ＰＥＧＤＧＥはPolysciences Inc.(USA)から得た。用いら れた他の試薬は全て分析用の等級のものであった。
【００３８】 バイオセンサーはＥＤＣ媒介結合、ＰＥＧＤＧＥ閉じ込め又はグルタルアルデ
ヒド結合によって金表面上に融合タンパク質を固定することによって製造された
。全ての場合において２０μｌの溶解融合タンパク質は４８０μｌの１００ｍＭ
硼酸緩衝液ｐＨ８．７５で希釈され、溶液は３０００Ｄの分子カットオフを持つ
マイクロフィルター（Amicom, USA）で限外濾過された。限外濾過後、フィルタ ーはひっくり返されて融合タンパク質が回収され、その濃度は硼酸緩衝液で０．
０４ｍｇ／ｍｌに調整された。金電極は洗浄され、BerggrenとJohanssonによっ て既に記述されているように［Berggren,C.,Johansson,G.,Anal.Chem.,投稿中］
チオクト酸の自己集成体で前処理された。ＭｅｒＲタンパク質は大気中での酸化
に対して敏感であるので、これらの電極の製造は窒素雰囲気下で行われた。
【００３９】 ＥＤＣに媒介される結合：自己集成電極はエタノールで完全に洗浄され、乾燥
され、その後１％の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボ
ジイミドヒドロクロライド含有乾燥アセトニトリル溶液中で５時間の間活性化さ
れた。１００ｍＭの硼酸緩衝液ｐＨ８．７５で洗浄した後、電極はタンパク質溶
液に４℃で２４時間浸された。続いて各電極は硼酸緩衝液に完全に洗浄され、１
−ドデカンチオールの溶液に２０分間浸された。
【００４０】 ＰＥＧＤＧＥ閉じ込め：チオクト酸で活性化された電極は１．５μｌの０．０
４ｍｇ／ｍｌタンパク質溶液（３０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧＤＧＥ含有１００ｍＭ硼
酸緩衝液中の）で被覆され、電極は４５℃で１５分間インキュベートされた。そ
の後、電極は１−ドデカンチオールで２０分間処理され、硼酸緩衝液で洗浄され
て測定セル中に置かれた。
【００４１】 グルタルアルデヒド結合：グルタルアルデヒドの固定に先立って電極はチオク
ト酸の代わりにシステアミンで修飾された。乾燥された電極は１２．５％（ｗ／
ｖ）グルタルアルデヒド含有結合緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５
Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７）及び６ｇ／ｌ ＮａＣＮＢＨ３を含む溶液に４時間の間
浸された。次に電極は結合緩衝液で完全に洗浄され、６ｇ／ｌ ＮａＣＮＢＨ３ とタンパク質溶液（０．０４ｍｇ／ｍｌ）に４時間の間浸された。最後に電極は
使用前に結合緩衝液で完全に洗浄された。
【００４２】 キャパシタンス測定：図１に示される通り、バイオセンサーは迅速定電位に連
結された三電極システム中の作動電極として配置された。それはハウス中に構築
された１０μｌの死容積を持つフローセル中に配置された。白金箔が補助電極と
して、白金電線が参照電極として用いられた。白金は規定された電位を持たない
ので、余分の参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）が出口流中に置かれた。緩衝液はフロ
ーセルを通って０．５ｍｌ／分の流速で蠕動ポンプによってポンプされた。サン
プルは２５０μｌのサンプルループを介して注入された。用いられた緩衝液は１
０ｍＭ硼酸、ｐＨ８．７５であった。使用前にそれは０．２２μｍのミリポアフ
ィルターを通して濾過され、脱ガスされた。
【００４３】 作動電極はＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して０ｍＶの静止電位を持っていた。
測定の際、５０ｍＶの電位ステップが適用され、電位が増大した時に続いて起こ
る電流過渡は以下の式に従うものとみなされた：
【００４４】 ｉ（ｔ）＝ｕ／Ｒｓｅｘｐ（−ｔ／Ｒｓ ＊Ｃｌ） （１）
【００４５】 式中、ｉ（ｔ）は時間ｔにおける電流であり、ｕは適用された電位パルスの振
幅であり、Ｒは金電極と参照電極の間の抵抗であり、Ｃｌは固定層に渡っての総
キャパシタンスであり、ｔは電位パルスが適用された後の経過時間である。電流
値は５０ｋＨｚの周波数で集められ、最初の１０の値がキャパシタンスの測定に
用いられた。各キャパシタンス値は１０の測定の平均として計算された。
【００４６】 キャパシタンス測定を用いて導電性電極とサンプル溶液の間の界面が研究され
る。この界面は電気的二重層と呼ばれる。というのも電荷と双極子が導電性表面
上と溶液中に反対の符号を持って配向するであろうからである。重金属特異的タ
ンパク質が電極表面に固定されると、それは表面で緩衝液を交換するので電荷分
離が起こり、キャパシタンスの減少をもたらす。この研究で用いられる検出原理
は電極表面上の固定されたタンパク質への特定重金属イオンの特異的結合から生
ずる構造的変化を監視することに基づいている（図２参照）。センサーは構造の
変化を測定するので、固定条件を最適化することが重要である。
【００４７】 認識要素の固定化：本研究においては金電極が導電性貴金属表面として用いら
れた。認識要素（これは様々な融合タンパク質であった）を固定するため、金表
面は何らかの方法で修飾される必要があった。周知でかつ容易な方法は金表面上
のチオール、スルフィド又はジスルフィドの自己集成化合物を用いることである
。自己集成は分子の良く整列された単一層を作り出す自発的な過程である。更に
硫黄と金との間の結合はかなり強い。このことは認識要素の漏出が活性の損失を
もたらすバイオセンサーの設計においては重要な安定性の側面である。キャパシ
タンス測定にとって最適な表面を作り出すために三つの異なる固定法が研究され
た；即ち、ＥＤＣ媒介結合、ＰＥＧＤＧＥ閉じ込め及びグルタルアルデヒド結合
である。すべての場合において一以上の硫黄基を含む短い化合物が最初に金表面
上に自己集成させられた。ＥＤＣ媒介結合は個々の分子間の架橋なしで表面上に
タンパク質分子の単一層を作り出す。この方法は表面上に自己集成したチオクト
酸を持つ金電極上に抗体を固定するのに有用であることが従来示されている［Du
an,C.;Meyerhoff,M.E.,Anal.Chem.,66,1994,1369-1377］。ＰＥＧＤＧＥ固定化 を用いるとタンパク質はポリマー網目中に閉じ込められ、そこでは重金属がポリ
マーの細孔中に拡散することができるであろう。銅についての検量線がＥＤＣ結
合（上方の曲線）及びタンパク質のＰＥＧＤＧＥ閉じ込め（下方の曲線）につい
て図３に示されている。感度はＥＤＣ活性された電極についてずっと高いことが
見出された。可能な説明はＰＥＧＤＧＥ閉じ込めは融合タンパク質の構造変化を
ある程度妨げるということであるかもしれない。再現性もＰＥＧＤＧＥ電極につ
いての方が低い。というのも各電極に正確に同量のタンパク質／架橋剤を付着さ
せることが困難であるからである。更なる実験は架橋を減少させてそれによって
堅固さの少ないタンパク質層を作り出すためにＰＥＧＤＧＥの濃度を低下させて
行われるであろう。グルタルアルデヒドも架橋剤であるが、この場合、表面はタ
ンパク質が添加される前にグルタルアルデヒドによってまず活性化された。また
この場合、タンパク質をたくさん架橋させないために（たくさん架橋すると堅く
なり、構造変化に敏感でなくなる）、架橋剤の量を最適化することが極めて重要
である。更なる実験は全て、ＥＤＣ法によって製造された電極を用いて行われた
。
【００４８】実施例２ 循環電圧は非修飾／修飾金電極を作動電極として、ＳＣＥを参照電極として、
及び白金箔を補助電極として回分セル中で５ｍＭ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］，１
Ｍ ＫＣｌ中で記録された。走査速度は５０ｍＶ／ｓであった。電極はコンピュ
ーターに接続されたPrinceton Applied 274 A 定電位に接続された。
【００４９】 キャパシタンス測定に基づく敏感なアフィニティーセンサーを開発するために
は、固定層は可能な限り薄く、良好に整列されている必要がある。単一層中に欠
陥部があると層を通して溶液分子が金属表面の近くにまで浸透し、高度に導電性
の水路で認識層を短絡させることになるであろう。その結果、キャパシタンス変
化はかかる欠陥センサーの場合は小さくなるか又は起こらなくなるであろう。電
極表面の絶縁を良好にすることの重要性は既に示されている［Berggren,C.;Joha
nsson,G.Anal.Chem.投稿中］。絶縁の度合いは溶液中に小さな透過性レドックス
結合を持つことによって研究することができる。図４は各添加層についてブロッ
キングがどのように増大するかを示す。清潔な金表面についてはレドックス結合
Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］は金属表面で酸化され、還元される。自己集成チオクト
酸で被覆された表面は表面へのアクセスを減少させる。タンパク質の固定は表面
を更に絶縁性にする。しかし、酸化／還元ピークが完全に消えるのは１−ドデカ
ンチオールで処理した時である。それ故、以下の実験においては電極は全て１−
ドデカンチオールで２０分間処理された。
【００５０】実施例３ 本研究においては感度、選択性、応答時間、安定性及び電極表面の再生の可能
性などの特性が研究された。ＧＳＴ−ＳｍｔＡベースの電極は徹底的に研究され
たが、いくつかの特性はＭｅｒＲタンパク質ベースの電極でも研究され、得られ
た結果は評価され、比較された。ＧＳＴ−ＳｍｔＡタンパク質の親和性は銅、カ
ドミウム、水銀及び亜鉛について研究された（図５参照）。電極は四つの金属イ
オン全てに対して、Ｃｕ＞Ｃｄ＞Ｈｇ＞Ｚｎという順序で感度を減少させつつ応
答した。これはこの改変されたタンパク質の溶液を用いて以前得られて報告され
ている結果とよく一致する［Shi,J.;Lindsay,W.P.;Huckle,J.W.;Morby,A.P.;Rob
inson,N.J.FEBS,303,1992 159-163］。検出限定は研究された重金属それぞれに ついてフェムトモル又はそれ以下のモル濃度範囲であった。ＧＳＴ−ＳｍｔＡの
代わりにＢＳＡを用いて同等に製造された参照電極はＣｕについてはほとんど検
出できないシグナルを生じ、他のすべてのイオンについてはシグナルは生じなか
った（図６参照）。重金属を結合することがよく知られているウレアーゼという
別のタンパク質を用いた場合にも同様の結果が得られた。後者の場合、検出可能
なシグナルの不在は重金属への暴露後の構造変化が起こらないためであると考え
られた。
【００５１】 ＧＳＴ−ＳｍｔＡ電極の活性は延長された間隔について研究された。１０−１ ５ Ｍから０．１Ｍの濃度の銅サンプルが注入され、キャパシタンス変化が測定さ
れた。約１０−５Ｍまででシグナルのゆっくりとした増加が得られ、その後約１
０−２Ｍまでシグナルはより迅速に増大し、そこで飽和が生じた（図７参照）。
曲線の最初の部分における増大は重金属の特異的結合のためであり、次の部分に
おける増大は電極表面上でのタンパク質の変性のためであると考えられる。１ｍ
Ｍの銅を注入した後でも電極を再生することができないという事実はこの仮説を
支持するであろう。ＧＳＴ−ＳｍｔＡベースのバイオセンサーの安定性は１６日
間研究された。１０−１５Ｍから１０−１０Ｍの間のＣｕの検量線は各日に測定
され、時間に対する総キャパシタンス変化は図８に示されている。測定と測定の
間、センサーは４℃で１００ｍＭ硼酸緩衝液、ｐＨ８．７５中に貯蔵された。活
性の損失は１０日後に観察され、それは１６日後には約４０％に低下した。
【００５２】 バイオセンサーの表面は２５０Ｔｌの１ｍＭ ＥＤＴＡを注入することによっ
て再生することができた。ＥＤＴＡが貯蔵直前に注入されるとバイオセンサーは
一晩で活性を失うが、電極が重金属と共に貯蔵されて再生手順が翌日の測定の直
前に行われると活性の損失は観察されないことが見出された。観察された現象は
重金属イオンが存在しない場合タンパク質はより開放的な構造を持ち、従ってこ
の構造はより容易に変性されるという仮説によって解釈される。１ｍＭものＣｕ ２＋ を含むサンプルの注入後のＥＤＴＡを用いた再生は成功しなかった。このこ
とはこの高い金属イオン濃度によって不可逆的な表面変性が起こったためと考え
られる。
【００５３】実施例４ バイオセンサーは第二の改変タンパク質であるＭｅｒＲを用いて構築され、シ
グナルはＣｕ，Ｃｄ，Ｈｇ及びＺｎについて記録された。このタンパク質は水銀
（II）イオンに対して極めて特異的であることが報告されている［Frantz,B.;O'
Hallaran,T.V.;Biochemistry,29,1990 4747-4751］。タンパク質はＥＤＣ結合法
のみを用いて金表面上に固定された。得られた結果は報告されていた特性とよく
一致し、ＭｅｒＲベースの電極は水銀に対して最高の選択性を示し、この電極は
ＧＳＴ−ＳｍｔＡベースの電極よりも高い選択性を示した（図９参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 どのようにして重金属特異的タンパク質が金属表面に固定されるか、及びどの
ようにしてその三次元構造が重金属イオンがタンパク質に結合すると変化するか
を模式的に示す。
【図２】 測定フローセル、ａ）測定電極、ｂ）補助白金箔電極、ｃ）白金電線参照電極
、ｄ）Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を示す。
【図３】 ＥＤＣ媒体結合を持つＧＳＴ−ＳｍｔＡタンパク質で固定された電極について
の銅についての応答（上方の曲線）、及びＰＥＧＤＧＥ閉じ込めを持つＧＳＴ−
ＳｍｔＡタンパク質で固定された電極についての銅についての応答（下方の曲線
）を示す。
【図４】 測定電極がａ）非修飾金、ｂ）チオクト酸で修飾された金、ｃ）ｂにおいて固
定された融合タンパク質ＧＳＴ−ＳｍｔＡで余分な修飾をされた金、及びｄ）ｃ
において１−ドデカンチオールで余分な修飾をされた金である場合のＦｅ（ＣＮ
）６ ３−溶液で記録された循環電圧応答を示す。
【図５】 ＧＳＴ−ＳｍｔＡで固定された電極についての重金属イオン濃度に対するキャ
パシタンス変化を示す。
【図６】 タンパク質のＥＤＣ結合を用いた電極についてのＣｕ２＋濃度に対するキャパ
シタンス変化を示す。
【図７】 １０−１５Ｍから０．１Ｍの範囲のＣｕ２＋濃度に対するキャパシタンス変化
を示す。
【図８】 本発明によるＧＳＴ−ＳｍｔＡ電極についての安定性研究を示す。
【図９】 ＭｅｒＲ固定電極についての重金属イオン濃度に対するキャパシタンス変化を
示す。
【配列表】
配 列 表 (1)一般情報： (i)出願人： (A)名称：ヴラームス インステリング ヴール テクノロギシュ オンデ ルゾーク (B)住所：ボーレタン ２００ (C)都市名：モル (E)国名：ベルギー (F)郵便番号 (ZIP)： 2400 (G)電話番号：+ 32 14 33 51 12 (H)ファクシミリ番号：+32 14 32 03 72 (A)名称：ザ ユニヴァーシティ オブ バーミンガム (B)住所：エッジバストン (C)都市名：バーミンガム (E)国名：イギリス (F)郵便番号 (ZIP)： B15 2TT (A)名称：ルンド ユニヴァーシティ (B)住所：ピー．オー． ボックス １２４ (C)都市名：ルンド (E)国名：スウェーデン (F)郵便番号 (ZIP)： 221 00 (ii)発明の名称： 金属イオン特異的静電容量アフィニティーセンサー (iii)配列の数：4 (iv)コンピューターが読出し可能なフォーム： (A)媒体の種類： フロッピーディスク (B)コンピューター： IBM PC コンパチブル (C)オペレーティングシステム： PC-DOS/MS-DOS (D)ソフトウェア： PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2)配列番号：１についての情報： (i)配列の特性： (A)配列の長さ：289 (B)配列の型：アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (vi)起源： (A)生物名： シネココックス（Synechococcus sp.） (xi)配列：配列番号：１： Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly 210 215 220 Arg Gly Ile Pro Met Thr Ser Thr Thr Leu Val Lys Cys Ala Cys Glu 225 230 235 240 Pro Cys Leu Cys Asn Val Asp Pro Ser Lys Ala Ile Asp Arg Asn Gly 245 250 255 Leu Tyr Tyr Cys Ser Glu Ala Cys Ala Asp Gly His Thr Gly Gly Ser 260 265 270 Lys Gly Cys Gly His Thr Gly Cys Asn Cys Ser Glu Phe Ile Val Thr 275 280 285 Asp (2)配列番号：２についての情報： (i)配列の特性： (A)配列の長さ：144 (B)配列の型：アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (v)フラグメント型：中間部 (vi)起源： (A)生物名： プセウドモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa） (xi)配列：配列番号：２： Met Glu Asn Asn Leu Glu Asn Leu Thr Ile Gly Val Phe Ala Lys Ala 1 5 10 15 Ala Gly Val Asn Val Glu Thr Ile Arg Phe Tyr Gln Arg Lys Gly Leu 20 25 30 Leu Leu Glu Pro Asp Lys Pro Tyr Gly Ser Ile Arg Arg Tyr Gly Glu 35 40 45 Ala Asp Val Thr Arg Val Arg Phe Val Lys Ser Ala Gln Arg Leu Gly 50 55 60 Phe Ser Leu Asp Glu Ile Ala Glu Leu Leu Arg Leu Glu Asp Gly Thr 65 70 75 80 His Cys Glu Glu Ala Ser Ser Leu Ala Glu His Lys Leu Lys Asp Val 85 90 95 Arg Glu Lys Met Ala Asp Leu Ala Arg Met Glu Ala Val Leu Ser Glu 100 105 110 Leu Val Cys Ala Cys His Ala Arg Arg Gly Asn Val Ser Cys Pro Leu 115 120 125 Ile Ala Ser Leu Gln Gly Gly Ala Ser Leu Ala Gly Ser Ala Met Pro 130 135 140 (2)配列番号：３についての情報： (i)配列の特性： (A)配列の長さ：145 (B)配列の型：アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (iii)ハイポセティカル配列：NO (iv)アンチセンス：NO (v)フラグメント型：中間部 (vi)起源： (A)生物名： アルカリゲネス・エウトロフス（Alcaligenes eutrophus） (B)株名：CH34 (xi)配列：配列番号：３： Met Asn Ile Gln Ile Gly Glu Leu Ala Lys Arg Thr Ala Cys Pro Val 1 5 10 15 Val Thr Ile Arg Phe Tyr Glu Gln Glu Gly Leu Leu Pro Pro Pro Gly 20 25 30 Arg Ser Arg Gly Asn Phe Arg Leu Tyr Gly Glu Glu His Val Glu Arg 35 40 45 Leu Gln Phe Ile Arg His Cys Arg Ser Leu Asp Met Pro Leu Ser Asp 50 55 60 Val Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg Pro Asp Gln Asp Cys Gly 65 70 75 80 Glu Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile Arg Gln Val Glu Ser Arg 85 90 95 Ile Gly Ala Leu Leu Glu Leu Lys His His Leu Val Glu Leu Arg Glu 100 105 110 Ala Cys Ser Gly Ala Arg Pro Ala Gln Ser Cys Gly Ile Leu Gln Gly 115 120 125 Leu Ser Asp Cys Val Cys Asp Thr Arg Gly Thr Thr Ala His Pro Ser 130 135 140 Asp 145 (2)配列番号：４についての情報： (i)配列の特性： (A)配列の長さ：72 (B)配列の型：アミノ酸 (C)鎖の数： (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (iii)ハイポセティカル配列：NO (iv)アンチセンス：NO (v)フラグメント型：中間部 (vi)起源： (A)生物名： プセウドモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa） (xi)配列：配列番号：４： Ala Thr Gln Thr Val Thr Leu Ser Val Pro Gly Met Thr Cys Ser Ala 1 5 10 15 Cys Pro Ile Thr Val Lys Lys Ala Ile Ser Glu Val Glu Gly Val Ser 20 25 30 Lys Val Asp Val Thr Phe Glu Thr Arg Gln Ala Val Val Thr Phe Asp 35 40 45 Asp Ala Lys Thr Ser Val Gln Lys Leu Thr Lys Ala Thr Ala Asp Ala 50 55 60 Gly Tyr Pro Ser Ser Val Lys Gln 65 70
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月１３日（２０００．３．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】 金電極上のチオール、スルフィド、及びジスルフィドの自己集成単一層は幅広
く研究されてきており、長鎖のアルカンチオールは金基体上に絶縁性の良く組織
された（well-organized）構造を形成することが知られている［Porter,M.D.;Br
ight,T.B.;Allara,D.L.;Chidsey,C.E.D.J.Am.Chem.Soc 1987,109,3559-3568］。
硫黄原子と金との間に形成された結合は極めて強く、形成された自己集成単一層
（ＳＡＭ）は室温で大気中、水中、及び有機溶媒中で安定である［Bain,C.D.;Tr
oughton,E.B.;Tao,Y.-T.;Evall,J.;Whitesides,G.M.;Nuzzo,R.G.J.Am.Chem.Soc.
1989,111,321-335］。多様な適用について低コストでバイオセンサーを製造する
ために官能基を付与された(functionalized)自己集成単一層で表面にパターンを
付与するため、微小接触印刷(micro-contact printing)［Mrksich,M.;Whiteside
s,G.M.Tibtech 1995,13,228-235］及びフォトリソグラフィー［Bhatia,S.K.;Hic
kman,J.J.;Ligler,F.S.J.Am.Chem.Soc.1992,114,4432-4433］を用いることがで きることが示唆されている。しかし高感度を持つ直接アフィニティーセンサーを
製造することは今まで不可能であった。 Rojas等，J.Am.Chem.Soc.1995,117.336-343はフェロセンをアッセイするため の静電容量アフィニティーセンサーを記述しており、そこではペル−６−チオ−
β−シクロデキストリンという自己集成単一層を形成することができる化合物が
金表面に結合される。単一層の欠陥はフェロセンとペンタンチオールの溶液を用
いた処理によって被覆される。Steinberg等，J.Am.Chem.Soc.1991,113,5176-518
2は金表面に２，２′−チオビス（エチルアセトアセテート）を吸着させること によって又は２，２′−チオビス（エチルアセトアセテート）とｎ−ペンタデシ
ルメルカプタンを同時に吸着させることによって製造された静電容量アフィニテ
ィーセンサーを記述する。適用された電位イオン結合の効果が調査されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 マティアソン， ボー スウェーデン， エス−245 62 イェル プ， トレドゴルドスメスタレン 26 (71)出願人 クセレギ， エリザベス スウェーデン， エス−224 72 ルンド, ボルゴスリンガン 31 (71)出願人 ボンティダン， イボリヤ ルーマニア， アールオー−4400 ビスト リタ， ストル． デセバル 44／シー ／32 (71)出願人 ヨハンソン， ギリス スウェーデン， エス−224 64 ルンド, スモスコレヴェーゲン 37 (71)出願人 ベルグレン， クリスティン スウェーデン， エス−224 72 ルンド, イリオングレンデン 11 (72)発明者 マティアソン， ボー スウェーデン， エス−245 62 イェル プ， トレドゴルドスメスタレン 26 (72)発明者 クセレギ， エリザベス スウェーデン， エス−224 72 ルンド, ボルゴスリンガン 31 (72)発明者 ボンティダン， イボリヤ ルーマニア， アールオー−4400 ビスト リタ， ストル． デセバル 44／シー ／32 (72)発明者 ヨハンソン， ギリス スウェーデン， エス−224 64 ルンド, スモスコレヴェーゲン 37 (72)発明者 ベルグレン， クリスティン スウェーデン， エス−224 72 ルンド, イリオングレンデン 11 (72)発明者 ブラウン， ニジェル イギリス， ウエスト ミドランズ ビー 29 ７エイチエル， バーミンガム， セ リー パーク， オークフィールド ロー ド 85 (72)発明者 ロイド， ジョナサン イギリス， ウエスト ミドランズ ビー 67 ５ジェイキュー， スメスウイック, ラスボーン ロード ５ (72)発明者 ジェイクマン， ケネス イギリス， ウエスト ミドランズ ビー 32 ２ユーデイ， バーミンガム， クィ ントン レイン 205 (72)発明者 ホブマン， ジョナサン イギリス， ウスターシャー ビー48 ７ エルワイ， アルヴチャーチ， ヒントン アヴェニュー 20 (72)発明者 ウィルソン、 ジョナサン イギリス， ウエスト ミドランズ ビー 14 ７キューデイ， バーミンガム， キ ング ヒース， アボッツ ロード 21 (72)発明者 ヴァン デル レリ， ダニエル ベルギー， ベ−2400 モル， ボーレタ ン 246 (72)発明者 コルビシェ， フィリップ ベルギー， ベ−2400 モル， ボーレタ ン 222 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BC10 BC11 BC13 BE05 CB03 GA10 2G060 AA10 AC05 AE16 AE17 AF10 EA06

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の工程を含む、キャパシタンス測定によって特定の重金
    属イオンの存在を測定するのに好適な金属イオン特異的静電容量アフィニティー
    センサーの製造方法： ａ） 一片の貴金属を準備する（但し前記片は所望により棒であってもよいし
    、又は貴金属がスパッター又は印刷されているガラス、珪素、又は石英の如き絶
    縁材料の一片であってもよい）； ｂ） 結合基を含む第一ＳＡＭ形成分子を準備する； ｃ） 工程ａ）の片を工程ｂ）の第一ＳＡＭ形成分子と接触させ、それによっ
    て前記貴金属表面上に自己集成単一層を得る； ｄ） 前記貴金属片上の前記自己集成単一層を前記重金属イオンに特異的に結
    合する分子と接触させ、それによって前記分子を自己集成単一層に結合させる； ｅ） 工程ｄ）において得られた片を第二ＳＡＭ形成分子と接触させ、それに
    よって少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なく
    とも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％が自己集成単一層で被覆された貴
    金属表面を得る。
  2. 【請求項２】 工程ｄ）における結合反応がＰＥＧＤＧＥの存在下で行われ
    ることを特徴とする請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 工程ｄ）に先立って前記片がグルタルアルデヒドの如き架橋
    物質を含む溶液に暴露されることを特徴とする請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 第一ＳＡＭ形成分子がＤ／Ｌ−チオクト酸であること、及び
    工程ｄ）が行われる前に前記Ｄ／Ｌ−チオクト酸が１−（３−ジメチルアミノプ
    ロピル）−３−エチル−カルボジイミドを用いて活性化されることを特徴とする
    請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 第二ＳＡＭ形成分子が飽和直鎖中に３〜２５の炭素原子を含
    むチオール、好ましくは１−ドデカンチオールであることを特徴とする請求項１
    の方法。
  6. 【請求項６】 一片の貴金属を含む金属イオン特異的静電容量アフィニティ
    ーセンサーであって、前記片が所望により棒であってもよいし又は貴金属がスパ
    ッターされているガラス、珪素、又は石英の如き絶縁材料の一片であってもよく
    、関心のある特定重金属イオンに特異的に結合する基が前記片に結合されている
    場合において、貴金属表面の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、
    より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％を被覆する
    自己集成単一層に、前記重金属イオンに特異的に結合する前記基が結合されてい
    ることを特徴とする金属イオン特異的静電容量アフィニティーセンサー。
  7. 【請求項７】 前記センサーが請求項１−６のいずれかの方法によって製造
    されていることを特徴とする請求項６の金属イオン特異的静電容量アフィニティ
    ーセンサー。
  8. 【請求項８】 重金属イオンに特異的に結合する基が配列番号１、配列番号
    ２、配列番号３又は配列番号４の配列を持つタンパク質及び同等の結合特性を持
    つその機能的誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項６のセン
    サー。
  9. 【請求項９】 以下の工程を含む、液体サンプル中の関心のある特定重金属
    イオンの存在を定性的又は定量的に測定する方法： ａ） 請求項６記載のセンサーを準備し（但し前記親和性基は前記関心のある
    重金属イオンに特異的に結合する）； ｂ） 前記センサーを前記関心のある重金属イオンを含まない参照液体と接触
    させて既知の方法によってキャパシタンスを測定し； ｃ） 前記センサーを前記重金属イオンを含む疑いのあるサンプルと接触させ
    て既知の方法によってキャパシタンスを測定し；そして ｄ） サンプルのキャパシタンスと参照サンプルのキャパシタンスの間の差を
    計算し、そして予め記録された検量データを用いて前記化合物の量を所望により
    計算する。
  10. 【請求項１０】 Ｚｎ２＋，Ｈｇ２＋，Ｃｄ２＋，Ｃｕ２＋及びＰｂ２＋か
    らなる群から選択されるイオンの存在を測定するための請求項９の方法。
  11. 【請求項１１】 Ｚｎ２＋，Ｈｇ２＋，Ｃｄ２＋，Ｃｕ２＋及びＰｂ２＋か
    らなる群から選択されるイオンの存在を測定するための請求項６のセンサーの使
    用方法。
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