DE69825460T2

DE69825460T2 - Metallionen spezifischer kapazitiver affinitätssensor

Info

Publication number: DE69825460T2
Application number: DE69825460T
Authority: DE
Inventors: Bo Mattiasson; Elisabeth CSÖREGI; Ibolya Bontidean; Gillis Johansson; Christine Berggren; Nigel Birmingham BROWN; Jonathan Lloyd; Kenneth Birmingham JAKEMAN; Jonathan Alvechurch HOBMAN; Jonathan Birmingham WILSON; Daniel Van Der Lelie; Philippe Corbisier
Original assignee: Vlaamse Instelling Voor Technologish Onderzoek NV VITO; SCHOOL OF BIOLOG SCIENCES; University of Birmingham
Current assignee: Vlaamse Instelling Voor Technologish Onderzoek NV VITO; SCHOOL OF BIOLOG SCIENCES; University of Birmingham
Priority date: 1997-09-15
Filing date: 1998-09-15
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2018-09-16
Also published as: JP2001516882A; US6933153B1; SE9703315L; EP1018011A1; ES2230716T3; ATE272840T1; WO1999014597A1; SE520302C2; EP1018011B1; DE69825460D1; SE9703315D0

Description

Es besteht das Bedürfnis, Spurenkonzentrationen von Schwermetallionen in der Umwelt, in der Medizin, in Lebensmitteln und in anderen Produkten zu messen. Schwermetalle sind toxische Elemente und es ist daher wichtig, sie in Spurenmengen bestimmen zu können. Einige Schwermetalle, z. B. Kupfer und Zink, sind für die lebenden Zellen lebensnotwendig. Verschiedene klassische Verfahren, wie die Atomabsorptionsspektroskopie, die induktiv gekuppelte Plasmaemissionsspektrometrie und die Plasmaemissionsmassenspektrometrie, finden breite Anwendung. Diese Verfahren benötigen komplexe Vorrichtungen und ausgebildetes Personal. Daher besteht die Nachfrage nach einfacheren und kostengünstigeren Verfahren. Elektrochemische Verfahren zur Metallionenbestimmung schließen ionenselektive Elektroden, die Polarographie und andere voltametrische Elektroden ein. Biosensoren sind selektive und empfindliche analytische Vorrichtungen, und mehrere verschiedene Biosensorkonfigurationen sind in der Vergangenheit zur Schwermetalldetektion beschrieben worden. Gänzlich auf Zellen basierende Biosensoren stellen ein mögliches Design dar und diese können Bakterien, Hefen, Pilze, Flechten, Moose und Wasserpflanzen als Erkennungselement verwenden [Wittman, C.; Riedel, K.; Schmid, R. D. Handb. Biosens. Electron. Noses, 1997 299–332]. Ein anderer Ansatz ist die Verwendung von Enzymen für die Detektion. Bisher war die Verwendung von Apoenzymen das erfolgreichste und am meisten verwendete Verfahren [Mattiasson, B.; Nilsson, H.; Olsson, B. J. Appl. Biochem., 1 1979 377–384]. Jedoch sind diese Sensoren durch beschränkte Selektivität und recht geringe Empfindlichkeit charakterisiert.
Das Protein-Engineering hat die Möglichkeit eröffnet, neue Proteine mit z. B. höherer Selektivität als die natürlichen zu entwerfen und zu erzeugen. Das Fusionsprotein GST-SmtA (SEQ ID. Nr. 1) wurde durch Protein-Engineering entwickelt und es wird berichtet, dass es eine breite Selektivität gegenüber verschiedenen Schwermetallionen (Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺ und Hg²⁺) zeigt [Shi, J.; Lindsay, W. P.; Huckle, J. W.; Morby, A. P.; Robinson, N. J. FEBS, 303, 1992 159–163]. Ein anderes Fusionsprotein, das MerR (SEQ. ID. NO. 2) genannt wird, wurde entwickelt, um ausschließlich selektiv gegenüber Hg²⁺ zu sein [Frantz, B.; O'Hallaran, T. V.; Biochemistry, 29, 1990 4747–4751]. Ein drittes Protein, PbrR (SEQ ID. Nr. 3), aus dem Stamm Alcaligenes eutrophus CH34 (der Stamm ist bei der BCCM unter der Zugangsnummer LMG P-18077 hinterlegt) ist gegenüber Pb²⁺ selektiv. Ein viertes Protein, MerP (SEQ ID. Nr. 4), ist gegenüber Hg²⁺ selektiv. Es wird angenommen, dass eine große konformelle Änderung stattfindet, wenn Schwermetallionen an diese Proteine binden. Diese Erfindung beschreibt einen kapazitären Sensor, welcher diese konformellen Veränderungen direkt detektieren kann.
Selbstgeordnete Monoschichten von Thiolen, Sulfiden und Disulfiden auf Goldelektroden sind vielfältig untersucht worden und von langkettigen Alkanthiolen ist bekannt, dass sie isolierende gut organisierte Strukturen auf Goldsubstraten bilden [Porter, M. D.; Bright, T. B.; Allara, D. L.; Chidsey, C. E. D. J. Am. Chem. Sac. 1987, 109, 3559–3568]. Die Bindung, die zwischen dem Schwefelatom und Gold gebildet wird, ist sehr stark und die gebildeten selbstgeordneten Monoschichten (SAMs) sind ein der Luft, in Wasser und in organischen Lösungsmitteln bei Raumtemperatur stabil [Bain., C. D.; Troughton, E. B.; Tao, Y.-T.; Evall, J.; Whitesides, G. M.; Nuzzo, R. G. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 321–335]. Es wurde vorgeschlagen, dass das Mikrokontaktdrucken [Mrksich, M.; Whitesides, G. M. Tibtech 1995, 13, 228–235] und die Photolithographie [Bhatia, S. K.; Hickman, J. J.; Ligler, F. S. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4432–4433] verwendet werden kann, um Oberflächen mit Mustern funktionalisierter selbstgeordneter Monoschichten für die Biosensorherstellung bei geringen Kosten für eine Vielzahl von Anwendungen zu versehen, jedoch war es bis jetzt nicht möglich, direkt Affinitätssensoren mit hoher Empfindlichkeit zu erzeugen.
Rojas et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 336–343 bezieht sich auf einen Kapazitäts-Affinitäts-Sensor zum Analysieren bzw. Testen von Ferrocen, Per-6-thio-β-cyclodextrin, eine Verbindung, die im Stande ist, eine selbstordnende Monoschicht zu bilden, wird an eine Goldoberfläche gebunden. Monoschicht-Defekte werden durch die Behandlung mit einer Lösung aus Ferrocen und Pentanthiol abgedeckt. Steinberg et al., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 5176–5182 betrifft einen Kapazitäts-Affinitäts-Sensor, der hergestellt wurde, indem 2,2'-Thiobis-(ethylacetoacetat) adsorbiert wird oder indem gleichzeitig 2,2'-Thiobis(ethylacetoacetat) und n-Pctadecylmercaptan an eine Goldoberfläche adsorbiert werden. Der Effekt der Applied-Potential-Ionenbindung wird untersucht.
Zusammenfassung der Erfindung
Es hat sich nun herausgestellt, dass unerwartet gute Metallionen-spezifische Kapazitäts-Affinitäts-Sensoren erhalten werden können, die zu Bestimmung der Gegenwart eines gewissen Schwermetallions durch Kapazitanzmessung geeignet sind, erhalten werden können, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen eines Edelmetallstücks, wobei das Stück optional ein Stab sein kann oder alternativ ein Stück isolierenden Materials wie Glas, Silicium oder Quarz, auf das ein Edelmetall aufgedampft bzw. aufgesputternt oder gedruckt wurde;
b) Bereitstellen eines ersten SAM-bildenden Moleküls, umfassend eine Kupplungsgruppe;
c) Kontaktieren des Stücks aus Schritt a) mit dem ersten SAM-bildenden Molekül aus Schritt b), um damit eine selbstordnende Monoschicht auf der Edelmetalloberfläche zu erhalten;
d) Kontaktieren der selbstordnenden Monoschicht auf dem Edelmetallstück mit einem Molekül, welches spezifisch das Schwermetallion bindet, um damit das Molekül an die selbstordnende Monoschicht zu kuppeln;
e) Kontaktieren des Stücks, erhalten in Schritt d), mit einem zweiten SAM-bildenden Molekül, um dadurch eine Edelmetalloberfläche zu erhalten, die wenigstens 90%, bevorzugt mindestens 95%, stärker bevorzugt wenigstens 97% und am stärksten bevorzugt wenigstens 99% mit einer selbstordnenden Monoschicht bedeckt ist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Detektionsgrenzen, die in dieser Erfindung genannt werden, sind um mehrere Größenordnungen besser als diejenigen, die zuvor für die elektrochemischen Metalldetektionsverfahren genannt wurden. Die Einsichten aus dieser Erfindung sind, dass die Erkennungsschicht dünn und gut geordnet sein muss, und sie muss mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, mehr bevorzugt mindestens 97% und am meisten bevorzugt mindestens 99%, der Sensoroberfläche bedecken. In einem anschließendem Schritt werden jedwede freie Stellen zwischen den Erkennungselementen „aufgefüllt", d. h. mit einem zweiten selbstordnenden eine Monoschicht bildenden Molekül, z. B. einem Alkanthiol, umfassend 3–25 Kohlenstoffatome, vorzugsweise in einer geraden Kette, bedeckt, nachdem eine selbstordnende Monoschicht erhalten wurde, die Affinitätsgruppen umfasst, wodurch die Dichtigkeit und Isolierung erhöht wird. Ein kapazitärer Biosensor wird durch eine selbstordnende Monoschicht bedeckt, auf der das Erkennungselement gegenüber der Lösung immobilisiert wird. Elektrisch ist es äquivalent zu einem Kondensator zwischen der leitenden Metallelektrode und der leitenden Lösung.
Jeder Teil der Oberfläche, die es der wässrigen Lösung erlaubt, unterhalb der Ebene, auf der die Erkennung stattfindet, einzudringen, wirkt wie ein kurzschließendes Element. Die Kapazitanz wird daher aufgrund der höheren dielektrischen Konstante der penetrierenden wässrigen Lösung zunehmen. Oxidschichten sind nicht gut geordnet und es ist daher unmöglich, eine dichte Erkennungsschicht zu bilden. Selbstordnende Monoschichten sind viel besser geordnet und eine perfektere Bedeckung kann daher bei den immobilisierten Schichten erwartet werden. Weiter sind die selbstgeordneten Monoschichten viel dünner als die Oxidschichten, was zu einer größeren Kapazitanz in Serie mit der Kapazitanz führt, die gebildet wird, wenn die Moleküle auf der Oberfläche binden. Dies macht es leichter, Veränderungen der Kapazitanz zu detektieren, wenn ein Analyt an die Oberfläche bindet.
Diese Erfindung beschreibt einen Affinitätssensor zur Analyse von Schwermetallionen in Spurenmengen, der wahlweise auf biotechnologisch prozessierten Proteinen basiert. Eine spezifisch Schwermetall bindende Substanz wird an eine leitende Oberfläche über eine selbstordnende Monoschicht gekuppelt. Die Bindung des gewünschten Schwermetallions an die Substanz verursacht eine Konformationsänderung, welche mit einer Veränderung der Kapazitanz verbunden ist. Die gepfropfte Erkennungsschicht sollte elektrische isolierend sein, um Störungen von Redoxpaaren in dem Elektrolyten und hohe faradaysche Hintergrundströme zu vermeiden. Andererseits sollte sie so dünn wie möglich sein, um eine hohe Empfindlichkeit zu erreichen. Die Verwendung einer selbstgeordneten Bindung an Gold oder an andere selbstordnende Metalle ergibt besonders dünne und kompakte Schichten. Die Erfindung zeigt auch, wie eine zusätzliche Isolierung erhalten werden kann, indem mit einem anderen Typ eines selbstordnenden Molekül aufgefüllt wird.
Demgemäss bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Metallionen-spezifischen Kapazitäts-Affinitäts-Sensors, bei dem ein Stück eines Edelmetalls mit einer Schicht einer selbstordnenden Monoschicht bedeckt wird, die Affinitätsgruppen umfasst. Anschließend werden jedwede freien Stellen der Edelmetalloberfläche durch ein zweites selbstordnendes eine Monoschicht ausbildendes Molekül bedeckt.
In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Metallionen-spezifischen Kapazitäts-Affinitäts-Sensor, der ein Edelmetallstück umfasst, dass im wesentlichen vollständig mit einer selbstordnenden Monoschicht, die Affinitätsgruppen, die spezifisch an ein gewisses Molekül von Interesse binden, umfasst, bedeckt ist.
In noch einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung der Gegenwart eines gewissen Schwermetallions von Interesse. Ein Metallionen-spezifischer Kapazitäts-Affinitäts-Sensor, der eine Edelmetalloberfläche umfasst, die im wesentlichen vollständig mit einer selbstordnenden Monoschicht, umfassend Affinitätsgruppen, die spezifisch an ein gewisses Schwermetallion von Interesse bindet, bedeckt ist, wird mit einer flüssigen Probe, die das Schwermetallion von Interesse umfasst, kontaktiert, und die Veränderung der Kapazitanz des Sensors wird bestimmt.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der Sensoren zur Analyse von gewissen Schwermetallionen von Interesse, wie Zn²⁺, Hg²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺ und Pb²⁺.
Definitionen
Wie hier offenbart sind die Ausdrücke „selbstgeordnete Monoschicht" und „SAM" Synonyme und beziehen sich auf die spontane Adsorption von Filmkomponenten aus einer Lösung auf eine feste Oberfläche unter Erzeugung einer gut geordneten Monoschicht. Solch eine Schicht auf Goldsubstraten wurde zuvor beschrieben [Porter, M. D.; Bright, T. B.; Allara, D. L.; Chidsey, C. E. D. J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3559–3568].
Wie hier offenbart bezieht sich der Ausdruck „Edelmetall" auf ein Metall, das aus der Gruppe von Gold, Silber, Kupfer, Platin und Palladium gewählt ist. Gold ist bevorzugt.
Wie hier offenbart beziehen sich jeweils die Ausdrücke „Gruppe/Molekül, die/das spezifisch an ein gewisses Schwermetallion von Interesse bindet" auf eine Gruppe oder ein Molekül, welches spezifisch an ein gewisses Schwermetallion bindet. Jedwedes Molekül mit solchen Bindungscharakteristika kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele solcher Moleküle sind chelatbildende Verbindungen und gewisse Proteine. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine mit den Sequenzen gemäss irgendeiner der SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2, SEQ. ID. NO. 3 und SEQ. ID. NO. 4 verwendet.
Wie hier offenbart bezieht sich der Ausdruck SAM-ausbildendes Molekül auf ein Molekül mit der Fähigkeit, eine selbstordnende Monoschicht auf einem Edelmetall auszubilden. Ein SAM-ausbildendes Molekül umfasst mindestens eine Thiol-, Sulfid- oder Disulfidgruppe. Schwermetall-bindende Moleküle sind für sich genommen jedoch nicht SAM-ausbildende Moleküle. Sie müssen mit kleinen SAM-ausbildenden Molekülen in einem getrennten Schritt gekuppelt werden. Beispiele solcher kleinen SAM-ausbildenden Moleküle sind Thioctäure und Cysteamin. Dieser Kupplungsschritt wird vor oder nach der Bildung der selbstordnenden Monoschicht auf der Edelmetalloberfläche ausgeführt. Dem Fachmann ist gut bekannt, wie er geeignete Kupplungsreaktionen und Kupplungsgruppen auswählen muss. In den folgenden Beispielen wird eine selbstordnende Monoschicht, die aus Thioctsäure besteht, durch 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid aktiviert. Im Anschluss daran wird ein Schwermetall-bindendes Molekül an die aktivierte Monoschicht gekuppelt. Jedoch sind andere ähnliche Kupplungsreaktionen in der Literatur beschrieben.
Wie hier offenbart bezieht sich der Ausdruck „Auffüllen" auf die Behandlung in einer Lösung, die ein Thiol, ein Sulfid oder ein Disulfid enthält, nach der Immobilisierung der Affinitätsgruppe an entweder eine selbstordnende Monoschicht auf einer Edelmetalloberfläche, oder, falls das Affinitätsmolekül verfügbare Thiol-, Sulfid- oder Disulfidgruppen umfasst, was das Affinitätsmolekül per se zu einem SAM-ausbildenden Molekül macht, direkt an die Edelmetalloberfläche, um jedwede nichtblockierten Stellen der Oberfläche zu blockieren. Wie bereits erwähnt ist es notwendig, dass die Edelmetalloberfläche so vollständig wie möglich durch ein SAM bedeckt ist, um die Empfindlichkeit des Sensors zu optimieren.
Wie hier offenbart bezieht sich der Ausdruck „Schwermetallion" auf Metallionen mit Atomzahlen größer als 21, wie die Ionen von Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Zr, Nb, Mo, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, Tl, Pb und Bi. Die vorliegende Erfindung ist insbesonders nützlich zur Bestimmung der Anwesenheit von Zn²⁺, Hg²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺ und Pb²⁺.
Wie hier offenbart bezieht sich der Ausdruck „funktionale Derivate" auf Derivate, bei denen die ursprüngliche Aminosäuresequenz durch Insertion, Addition, Substitution oder Ausschluss einer oder mehrerer Aminosäuren modifiziert oder verändert wurde, sowie auf Derivate, die ein Vielfaches der ursprünglichen Sequenz oder Teile davon enthalten.
Wie hier offenbart steht SCE für die gesättigte Kalomelelektrode; potentiostatische Störung bedeutet eine schnelle Änderung des Potentials. PEGDGE steht für Polyethylenglykoldiglycidylether. BSA steht für Rinder-Serumalbumin.
In dieser Erfindung wird eine Lösung, die die zu bestimmenden Schwermetallionen enthält, in elektrischen Kontakt gebracht mit einer leitenden Oberfläche, die das Erkennungselement, nach dem die Kapazitanz- oder Impedanzänderung bestimmt wird, enthält. Die Kapazitanzänderung findet statt zwischen der Lösung und einer Metalloberfläche, die aus einem festem Metall oder einem Metall besteht, das auf eine darunter liegende nichtleitende Oberfläche aufgedampft wurde. Faradaysche Reaktionen mit dem Metall sowie Hintergrundströme sind durch das Erkennungselement auf der Oberfläche blockiert, wobei dies schließlich durch die Behandlung mit Hilfsverbindungen, die die Isolation verbessern, verbessert wird. Das Erkennungselement ist entweder direkt durch Selbstordnung oder durch dessen Bindung an eine selbstgeordnete Verbindung auf der Elektrode an die Metalloberfläche gebunden. Es kann auch durch Adsorption, Polymerisation oder Beschichtung gebunden sein. Messungen werden durchgeführt, indem variierende Spannungen an die Elektrode unter Verwendung potentiostatischer Verfahren angelegt werden und die Stromänderungen analysiert werden. Die Empfindlichkeit kann verbessert werden, indem es einer Lösung, die einen sekundären spezifischen Liganden enthält, ermöglicht wird, an den Analyten, der sich bereits an der Oberfläche befindet, zu binden, wodurch die Größe des gebundenen Aggregats und die Kapazitanzänderung gesteigert wird.
Die Erfindung wird nun detaillierter unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben werden.
Die 1 zeigt schematisch, wie ein Schwermetall-spezifisches Protein auf der Metalloberfläche immobilisiert ist und wie seine dreidimensionale Konformation sich verändert, wenn Schwermetallionen an das Protein binden.
Die 2 zeigt die Fließmesszelle, a) Messelektrode, b) Hilfsplatinfolienelektrode, c) Platindrahtreferenzelektrode, d) Ag/AgCl-Referenzelektrode.
Die 3 zeigt die Antwort für Kupfer für Elektroden, die mit dem GST-SmtA-Protein, unter EDC-vermittelter Kupplung (obere Kurve) und PEGDGE-Einfangen (untere Kurve) immobilisiert sind. Siehe das Beispiel 1 für mehr Details.
Die 4 zeigt die zyklischen Voltametrieantworten, die in einer Fe(CN)₆ ^3–-Lösung aufgezeichnet werden, wenn die Messelektrode aus a) nicht modifiziertem Gold, b) Gold, das mit Thioctsäure modifiziert war, c) wie in b mit der zusätzlichen Modifikation mit dem immobilisierten Fusionsprotein GST-SmtA und d) wie in c mit der zusätzlichen Modifikation mit 1-Dodecanthiol war. Mehr Details sind in dem Beispiel 2 angegeben.
Die 5 zeigt die Kapazitanzänderung gegenüber der Schwermetallionenkonzentration für eine GST-SmtA-immobilisierte Elektrode. Die Kurve 1) zeigt die Antwort für Zn²⁺, die Kurve 2) für Hg²⁺, die Kurve 3) für Cd²⁺ und die Kurve 4) für Cu²⁺. Die Messungen wurden in einem 100 mM Boratpuffer, pH 8,75, bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durchgeführt. Proben mit einem Volumen von 250 μl wurden injiziert. Für mehr Details siehe das Beispiel 3.
Die 6 zeigt die Kapazitanzänderung gegenüber der Cu²⁺-Konzentration für Elektroden unter Verwendung der EDC-Kupplung des Proteins Die obere Kurve zeigt das Signal für die GST-SmtA-basierende Elektrode und die untere Kurve gibt das Signal wieder, das von einer Blindelektrode mit BSA auf der Oberfläche aufgezeichnet wurde. Die Messungen wurden in einem 100 mM Boratpuffer, pH 8,75, bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durchgeführt. Proben mit einem Volumen von 250 μl wurden injiziert. Mehr Detailangaben sind in dem Beispiel 3 angegeben.
Die 7 zeigt die Kapazitanzänderung gegenüber der Cu²⁺-Konzentration in dem Bereich 10^–5 M bis 0,1 M. Die Messungen wurden in einem 100 mM Boratpuffer, pH 8,75, und bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durchgeführt. Proben mit einem Volumen von 250 μl wurden injiziert. Für Details siehe das Beispiel 3.
Die 8 zeigt eine Stabilitätsuntersuchung für eine GST-SmtA-Elektrode gemäss der vorliegenden Erfindung. Eine Kalibrationskurve von 1 femtomolar bis 100 pikomolar wurde jeden Tag aufgezeichnet und die Gesamtkapazitanzänderung gegenüber der Zeit wurde geplottet. Zwischen den Messungen wurde der Sensor bei 4°C in 100 mM Boratpuffer, pH 8,75, gelagert. Die Details sind in dem Beispiel 3 angegeben.
Die 9 zeigt die Kapazitanzänderung gegenüber der Schwermetallionenkonzentration für eine MerR-immobilisierte Elektrode. Die Kurve 1) zeigt die Antwort für Cd²⁺, die Kurve 2) für Cu²⁺ und die Kurve 3) für Hg²⁺. Die Messungen wurden in einem 100 mM Boratpuffer, pH 8,75, und bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durchgeführt. Proben mit einem Volumen von 250 μl wurden injiziert. Genauere Detailangaben sind in dem Beispiel 4 angegeben.
Falls eine feste Metallmesselektrode verwendet wird, wird ein Goldstab mit einem Durchmesser von typischerweise 3 mm poliert, gereinigt und durch Selbstordnung mit einem Erkennungselement oder mit einer Verbindung, die mit einem Erkennungselement gekuppelt werden kann, beschichtet. Eine große Anzahl von Kupplungsverfahren sind bekannt und können als geeignete Alternativen zu denjenigen, die in den Beispielen beschrieben sind, verwendet werden. Es ist auch möglich, Metall, das auf Glas, Quarz, Silicium oder ein anderes isolierendes Material aufgedampft oder gedruckt ist, als Wegwerfelektroden zu verwenden. Nach der Reinigung werden die Elektroden in einer Charge beschichtet und in eine Schnellanschlussmesszelle eingesetzt. Eine Anzahl von verschiedenen Erkennungselementen kann auf der gleichen aufgedampften Elektrode immobilisiert werden, falls sie durch isolierende Teile getrennt sind und an den Potentiostat mit Schaltern, die durch einen Mikroprozessor reguliert werden können, angeschlossen sind.
Die inverse Gesamtkapazitanz ist die Summe der inversen Kapazitanzen jeder Schicht in Serie, d. h. der Thioctsäureschicht, der Proteinschicht und der Kapazitanz zwischen der Doppelschichtraumladung und der Lösung. Falls eine dieser im Vergleich zu den anderen klein ist, dominiert sie die Gesamtkapazitanz. Falls insbesondere die selbstgeordneten Teile eine geringe Kapazitanz ergeben, wird es über die Kapazitanzen in der Erkennungsschicht dominieren. Veränderungen in der Erkennungsschicht weisen somit eine geringe Wirkung auf die Gesamtkapazitanz auf, was zu einer geringen Gesamtempfindlichkeit des Sensors führt.
Die Elektrode wird in eine Zelle eingesetzt, die entweder vom Küvettentyp oder eine Fliesszelle, wie in der 2 gezeigt, sein kann. Die Zelle muss eine Hilfselektrode, typischerweise eine Platinfolie, enthalten, welche symmetrisch und entgegengesetzt zu der Messelektrode platziert sein sollte. Eine Referenzelektrode, typischerweise SCE oder Ag/AgCl, wird in die Zelle eingesetzt, so dass der Spannungsabfall zwischen den Referenz- und Messelektroden aufgrund der kapazitären oder faradayschen Ströme sehr gering wird. In einigen Fällen kann die Leistung verbessert werden, falls eine sehr kleine zusätzliche Referenzelektrode verwendet wird, siehe die 1c, und die SCE-Referenz wegbewegt wird, 1d. Eine Fliesszelle gibt eine präzisere Kontrolle über den Massentransfer an die Messelektrode und die Injektion einer Probe und die Reinigung lässt sich leichter automatisieren. Von Fliesszellen mit Volumina von 2 ml und 10 μl wurde gefunden, dass sie etwa die gleiche Empfindlichkeit aufweisen. Eine Fliesszelle mit Wegwerfelektroden, die hergestellt wurden, indem Gold auf Silicium aufgedampft wurde, wies ebenfalls ähnliche Eigenschaften auf.
Die Elektroden werden an einen schnellen Potentiostaten angeschlossen, der wiederum durch einen Mikroprozessor reguliert wird. Der Potentiostat hält die Messelektrode bei einem vorher eingestellten Wert gegenüber der Referenzelektrode. Eine potentiostatische Störung wird an die Messelektrode angelegt. Sie kann eine sinuide Welle sein, sie kann eine Stufenspannung sein oder jedwede andere Wellenform, welche eine Interpretation der Ergebnisse ermöglicht. Die Ströme, die durch die Störungsspannung verursacht werden, werden zur Bewertung der Kapazitanz der Messelektrode verwendet. Sie kann für sinuide Störungen bewerkstelligt werden, indem der In-phasige und der Out-phasige Teil des Stroms in einem Lock-In-Verstärker abgetrennt werden. Falls dies bei verschiedenen Frequenzen wiederholt wird, kann ein Impedanzspektrum erhalten werden. In allen Fällen kann die Kapazitanz aus den Stromantworten bewertet werden. Wie gewöhnlich in der Elektrochemie kann die Rolle von Strom und Potential umgekehrt werden, d. h. ein galvanostatischer Schritt im Strom verursacht die Potentialveränderung. Diese Veränderung kann zur Bewertung der Kapazitanz verwendet werden, obgleich andere Algorithmen verwendet werden.
Ein bekanntes Volumen einer Probe wird normal mit einem bekannten Volumen einer leitenden Flüssigkeit in z. B. einer Küvette in einer Zelle vom Chargentyp vermischt. Bei einer Fliesszelle wird ein bekanntes Volumen in einen leitenden Trägerfluss, der mit einer bestimmten Fliessgeschwindigkeit gepumpt wird, injiziert. Die leitenden Flüssigkeiten sind normalerweise Puffer mit Ionenstärken von einigen Millimolar und darüber. Die Probe kann in einem nichtleitenden Medium vorliegen, jedoch muss eine leitende Lösung die Zelle füllen, wenn die Messungen vorgenommen werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben werden. Die Beispiele sind zum Zweck der Information angegeben und es ist nicht beabsichtigt, den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1
Die Fusionsproteine GST-SmtA und MerR wurden wie nachfolgend beschrieben hergestellt und in einer phophatgepufferten Salzlösung (70 mM NaCl, 1,3 mM KCl, 5 mM Na₂HPO₄, 0,9 mM KH₂PO₄, pH 7,3), die 50% (v/v) Glycerin enthält, zu einer endgültigen Konzentration von 1 mg/ml Protein gelöst. Thioctsäure und Glutaraldehyd wurden von Sigma erworben und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid wurde von Fluka erhalten. 1-Dodecanthiol und die Goldstäbe, die für die Elektroden verwendet wurden, (Kat.-Nr. 26,583-7, = 3 mm) wurden von Aldrich Chemicals bezogen. Die Schwermetalle CuCl₂*2H₂O, ZnCl₂, HgCl₂ und Cd(NO₃)₂*4H₂O waren alle von Merck (Darmstadt, Deutschland). PEGDGE wurde von Polysciences Inc. (USA) erhalten. Alle anderen verwendeten Reagenzien waren von analytischer Qualität.
Die Biosensoren wurden hergestellt, indem Fusionsproteine auf die Goldoberfläche durch die EDC-vermittelte Kupplung, das PEGDGE-Einfangen oder durch die Glutaraldehydkupplung immobilisiert wurden. In allen Fällen wurden 20 μl der gelösten Fusionsproteine mit 480 μl 100 mM Boratpuffer, pH 8,75, verdünnt, und die Lösung wurde mit einem Mikrofilter mit einer molekularen Ausschlussgrenze von 3000 D (Amicon, USA) ultrafiltriert. Nach der Ultrafiltration wurde der Filter umgedreht, um das Fusionsprotein rückzugewinnen und seine Konzentration wurde auf 0,04 mg/ml in Boratpuffer eingeregelt. Goldelektroden wurden gereinigt und mit selbstordnender Thioctsäure vorbehandelt, wie zuvor von Berggren und Johansson [Berggren, C., Johansson, G., Anal. Chem., eingereicht] beschrieben. Da das MerR-Protein empfindlich gegenüber Oxidation an Luft ist, wurde die Herstellung dieser Elektroden unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt.
EDC-vermittelte Kupplung: Die selbstgeordneten Elektroden wurden gründlich mit Ethanol gewaschen, getrocknet und anschließend in einer 1%-igen Lösung von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid in getrocknetem Acetonitril für 5 Stunden aktiviert. Nach dem Waschen mit 100 mM Boratpuffer, pH 8,75, wurden die Elektroden in die Proteinlösung bei einer Temperatur von 4°C für 24 Stunden eingetaucht. Anschließend wurde jede Elektrode gründlich mit Boratpuffer gewaschen und in eine Lösung von 1-Dodecanthiol für 20 Minuten eingetaucht.
PEGDGE-Einfangen: Die mit Thioctsäure aktivierte Elektrode wurde mit 1,5 μl einer 0,04 mg/ml Proteinlösung in 100 mM Boratpuffer, enthaltend 30% (w/w) PEGDGE, beschichtet, und die Elektrode wurde bei 45°C für 15 Minuten inkubiert. Anschließend wurde die Elektrode mit 1-Dodecanthiol für 20 Minuten behandelt, mit Boratpuffer gewaschen und in die Messzelle platziert.
Glutaraldehydkupplung: Vor der Glutaraldehydimmobilisierung wurde die Elektrode mit Cysteamin anstelle von Thioctsäure modifiziert. Die getrocknete Elektrode wurde in eine Lösung, die 12,5% (w/v) Glutaraldehyd in einem Kupplungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7) und 6 g/l NaCNBH₃ enthielt, für 4 Stunden eingetaucht. Dann wurde die Elektrode gründlich mit Kupplungspuffer gewaschen und in die Proteinlösung (0,04 mg/ml) mit 6 g/l NaCNBH₃ für 4 Stunden eingetaucht. Schließlich wurde die Elektrode gründlich mit Kupplungspuffer vor der Verwendung gewaschen.
Kapazitanzmessungen: Der Biosensor wurde als die Arbeitselektrode in einem Drei-Elektrodensystem, das an einen schnellen Potentiostaten, wie in der 1 gezeigt, angeschlossen war, eingerichtet. Es wurde in eine Fliesszelle mit einem Todvolumen von 10 μl, welche im Haus hergestellt worden war, platziert. Eine Platinfolie diente als die Hilfs- und ein Platindraht als die Referenzelektrode. Eine zusätzliche Referenzelektrode (Ag/AgCl) wurde in den Auslassstrom platziert, da das Platin nicht ein definiertes Potential aufweist. Die Pufferlösung wurde durch eine peristaltische Pumpe mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durch die Fliesszelle gepumpt. Proben wurden in den Fluss über eine 250 μl-Probenschleife injiziert. Der verwendete Puffer war 10 mM Borat, pH 8,75. Vor seiner Verwendung wurde er durch einen 0,22 μm-Millipore-Filter filtriert und entgast.
Die Arbeitselektrode wies ein Ruhepotential von 0 mV gegenüber der Ag/AgCl-Referenzelektrode auf. Bei der Messung wurde eine Potentialstufe von 50 mV angelegt und von dem Stromübergang, der folgte, wenn das Potential zunahm, wurde angenommen, dass er der folgenden Gleichung folgt: i(t) = u/RSexp(– t/RS*C1) (1)wobei i(t) der Strom bei der Zeit t ist, u ist die Amplitude des angelegten Potentialpulses, R ist der Widerstand zwischen der Goldelektrode und der Referenzelektrode, C₁ ist die Gesamtkapazitanz über der immobilisierten Schicht und t ist die Zeit, die verstrichen ist, nachdem der Potentialpuls angelegt wurde. Die Stromwerte wurden mit einer Frequenz von 50 kHz gesammelt und die ersten zehn Werte wurden bei der Bewertung der Kapazitanz verwendet. Jeder Kapazitanzwert wurde als das Mittel von zehn Messungen berechnet.
Bei Kapazitanzmessungen wird die Grenzfläche zwischen einer leitenden Elektrode und der Probenlösung untersucht. Diese Grenzfläche wird als die elektrische Doppelschicht bezeichnet, da Ladungen und Dipole sich mit entgegengesetzten Vorzeichen auf der leitenden Oberfläche und in der Lösung orientieren. Falls das Schwermetall-spezifische Protein auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert ist, wird es die Pufferlösung an der Oberfläche austauschen und eine Ladungstrennung wird stattfinden, was zu einer Abnahme der Kapazitanz führt. Das Detektionsprinzip, das in dieser Arbeit verwendet wird, basiert auf der Beobachtung einer konformellen Änderung, die sich aus einer spezifischen Bindung eines gewissen Schwermetallions an ein immobilisiertes Protein auf der Elektrodenoberfläche ergibt (siehe die 2). Da der Sensor die Veränderungen bezüglich der Konformation misst, ist es wichtig, die Immobilisierungsbedingungen zu optimieren.
Immobilisierung des Erkennungselements: Eine Goldelektrode wurde als leitende Edelmetalloberfläche in dieser Arbeit verwendet. Um die Erkennungselemente, die verschiedene Fusionsproteinen waren, zu immobilisieren, musste die Goldoberfläche etwas modifiziert werden. Ein gut bekanntes und einfaches Verfahren ist es, selbstordnende Thiol-, Sulfid- oder Disulfidverbindungen auf der Goldoberfläche anzuwenden. Die Selbstordnung ist ein spontaner Prozess, der gutgeordnete Monoschichten von Molekülen erzeugt. Weiter ist die Bindung zwischen dem Schwefel und dem Gold recht fest, was ein wichtiger Stabilitätsaspekt bei dem Design von Biosensoren ist, wo das Ablösen des Erkennungselements zu einem Verlust an Aktivität führt. Drei verschiedene Immobilisierungsverfahren wurden untersucht, um eine optimale Oberfläche für die Kapazitanzmessungen zu erzeugen, nämlich die EDC-vermittelte Kupplung, das PEGDGE-Einfangen und die Glutaraldehyd-Kupplung. In allen Fällen wurde zuerst eine kurze Verbindung, die ein oder mehrere Schwefelgruppen enthielt, auf der Goldoberfläche selbstangeordnet. Die EDC-vermittelte Kupplung erzeugt eine Monoschicht von Proteinmolekülen auf der Oberfläche ohne jedwede Quervernetzung zwischen den einzelnen Molekülen. Von diesem Verfahren wurde früher gezeigt, dass es erfolgreich bei der Immobilisierung von Antikörpern auf Goldelektroden mit selbstgeordneter Thioctsäure auf der Oberfläche ist [Duan, C.; Meyerhoff, M. E., Anal. Chem., 66, 1994, 1369–1377]. Bei der PEGDGE-Immobilisierung wird das Protein in einem Polymernetzwerk eingefangen, wobei die Schwermetalle in die Poren des Polymeren eindiffundieren können. Kalibrationskurven für Kupfer sind in der 3 für die EDC-Kupplung (obere Kurve) und für das PEGDGE-Einfangen (untere Kurve) des Proteins gezeigt. Es wurde gefunden, dass die Empfindlichkeit sehr viel größer für die EDC-aktivierte Elektrode war. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass das PEGDGE-Einfangen die konformelle Änderung des Fusionsproteins etwas behindert. Die Reproduzierbarkeit war auch bei den PEGDGE-Elektroden aufgrund der Schwierigkeit, exakt die gleiche Menge des Proteins/Quervernetzers für jede Elektrode abzuscheiden, geringer. Weitere Experimente werden mit einer geringeren Konzentration an PEGDGE durchgeführt, um die Quervernetzung zu verringern und dadurch eine weniger starre Proteinschicht zu erzeugen. Glutaraldehyd ist auch ein Quervernetzer, jedoch wurde in diesem Fall die Oberfläche zuerst durch Glutaraldehyd aktiviert, bevor das Protein zugegeben wurde. Auch in diesem Falle ist es sehr wichtig, die Menge des Quervernetzers zu optimieren, um nicht zuviel Protein querzuvernetzen, was es starr und nicht für die konformelle Änderungen empfänglich macht. Alle weiteren Experimente wurden mit Elektroden durchgeführt, die durch das EDC-Verfahren hergestellt worden waren.
Beispiel 2
Cyclische Voltamogramme wurden in 5 mM K₃[Fe(CN)₆], 1 M KCl in einer Chargenzelle mit der unmodifizierten/modifizierten Goldelektrode als die Arbeitselektrode, einer SCE als Referenz und einem Platinfläggchen als Hilfselektrode aufgezeichnet. Die Scangeschwindigkeit betrug 50 mV/s. Die Elektroden wurden an einen Princeton-Applied-274-A-Potentiostaten, der an einen Computer angeschlossen war, angeschlossen.
Um einen empfindlichen Affinitätssensor, der auf Kapazitanzmessungen basiert, zu entwickeln, muss die Immobilisierungsschicht so dünn wie möglich und gut geordnet sein. Deffektstellen in der Monoschicht könnten zur Penetration von Lösungsmolekülen durch die Schicht und nahe an die Metalloberfläche führen, was zu Kurzschlüssen der Erkennungsschicht mit den hochleitfähigen wässrigen Kanälen führt. Das Ergebnis ist, dass die Kapazitanzänderungen für solche defekten Sensoren kleiner oder nicht vorhanden sein werden. Die Wichtigkeit einer guten Isolierung der Elektrodenoberfläche ist bereits früher gezeigt worden [Berggren, C.; Johansson, G., Anal. Chem., eingereicht]. Das Ausmaß der Isolierung kann untersucht werden, indem ein kleines permeables Redoxpaar in Lösung vorhanden ist. In der 4 wird gezeigt, wie die Blockierung für jede weitere Schicht zunimmt. Bei einer reinen Goldoberfläche wird das Redoxpaar K₃[Fe(CN)₆] an der Metalloberfläche oxidiert und reduziert. Eine Oberfläche, die mit selbstgeordneter Thioctsäure bedeckt ist, verringert die Zugänglichkeit an die Oberfläche. Die Immobilisierung des Proteins isoliert weiter die Oberfläche, jedoch verschwinden erst ab der Behandlung mit 1-Dodecanthiol die Oxidations-/Reduktions-Peaks vollständig. Alle Elektroden in den folgenden Experimenten wurden daher zwanzig Minuten mit 1-Dodecanthiol behandelt.
Beispiel 3
Charakteristika, wie die Empfindlichkeit, die Selektivität, die Ansprechzeit, die Stabilität und die Regenerationsmöglichkeit der Elektrodenoberfläche wurden in dieser Arbeit untersucht. Jedoch wurden die auf GST-SmtA basierenden Elektroden gründlicher untersucht, aber einige Charakteristika wurden auch für die auf dem MerR-Protein basierenden Elektroden untersucht, und die erhaltenen Ergebnisse wurden bewertet und verglichen. Die Affinität des GST-SmtA-Proteins wurde für Kupfer, Cadmium, Quecksilber und Zink untersucht (siehe die 5). Die Elektroden antworteten auf alle vier Metallionen mit abnehmender Empfindlichkeit für Cu > Cd > Hg > Zn, was in guter Übereinstimmung mit zuvor berichteten Ergebnissen ist, die mit einer Lösung dieses technologisch prozessierten Proteins erhalten wurden [Shi, J.; Lindsay, W. P.; Huckle, J. W.; Morby, A. P.; Robinson, N. J. FEBS, 303, 1992 159–163]. Die Detektionsgrenze lag im femtomolaren Molarbereich oder darunter für jedes der untersuchten Schwermetalle. Referenzelektroden, die gleich unter Verwendung von BSA anstelle von GST-SmtA hergestellt wurden, führten zu kaum detektierbaren Signalen für Cu und zu keinen Signalen für alle anderen Ionen (siehe die 6). Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn ein anderes Protein, Urease, von der gut bekannt ist, dass sie Schwermetalle bindet, verwendet wurde. Für den letzteren Fall wurde angenommen, dass die Abwesenheit von jedweden detektierbaren Signalen auf das Fehlen von konformellen Änderungen bei der Exponierung gegenüber einem Schwermetall zurückzuführen ist.
Die Aktivität einer GST-SmtA-Elektrode wurde für einen ausgedehnten Zeitraum untersucht. Kupferproben mit Konzentrationen von 10^–15 M bis 0,1 M wurden injiziert und die Kapazitanzänderungen wurden bestimmt. Eine langsame Zunahme des Signals wurde bis ungefähr 10^–5 M erhalten, anschließend war die Signalzunahme bis ungefähr 10^–2 M sehr viel schneller, woraufhin eine Sättigung eintrat (siehe die 7). Es wird angenommen, dass die Zunahme im ersten Teil der Kurve sich auf die spezifische Bindung des Schwermetalls zurückführen lässt, und dass sie sich in dem Zweiten auf die Denaturierung des Proteins auf der Elektrodenoberfläche zurückführen lässt. Die Unmöglichkeit, die Elektrode nach der Injizierung von 1 mM Kupfer zu regenerieren, könnte diese Annahme unterstützen. Die Stabilität des auf GST-SmtA basierenden Biosensors wurde für 16 Tage untersucht. Eine Kalibrationskurve zwischen 10^–15 M und 10^–10 M Cu wurde jeden Tag gemessen und die Gesamtkapazitanzänderung gegenüber der Zeit wird in der 8 aufgetragen. Zwischen den Messungen wurde der Sensor bei 4°C in 100 mM Boratpuffer, pH 8,75, gelagert. Ein Aktivitätsverlust wurde nach 10 Tagen beobachtet und sie nahm mit ungefähr 40% nach 16 Tagen ab.
Die Oberfläche des Biosensors konnte regeneriert werden, indem 250T1, 1 mM EDTA injiziert wurde. Es wurde gefunden, dass, falls EDTA unmittelbar vor der Lagerung injiziert wurde, der Biosensor über Nacht die Aktivität verlor, aber falls die Elektrode mit einem Schwermetall gelagert wurde und das Regenerationsverfahren unmittelbar vor der Messung am nächsten Tag stattfand, ein Aktivitätsverlust nicht beobachtet werden konnte. Das beobachtete Phänomen wurde mit der Annahme begründet, dass das Protein eine offenere Struktur aufweist, wenn das Schwermetallion abwesend ist, und somit wird diese Struktur leichter denaturiert. Die Regeneration mit EDTA nach der Injektion einer Probe, die bis zu 1 mM Cu²⁺ enthielt, war nicht erfolgreich, was der irreversiblen Oberflächendenaturierung bei dieser hohen Metallionenkonzentration zugeschrieben wurde.
Beispiel 4
sBiosensoren wurden unter Verwendung des zweiten technologisch prozessierten Proteins, MerR, konstruiert, und die Signale wurden für Cu, Cd, Hg und Zn aufgezeichnet. Von diesem Protein wurde berichtet, dass es hochspezifisch gegenüber Quecksilber(II)-Ionen ist [Frantz, B.; O'Hallaran, T. V.; Biochemistry, 29, 1990 4747–4751]. Das Protein wurde auf der Goldoberfläche nur durch Verwendung des EDC-Kupplungsverfahrens immobilisiert. Die erhaltenen Ergebnisse waren in guter Übereinstimmung mit den berichteten Eigenschaften, die auf MerR basierenden Elektroden zeigten die höchste Selektivität für Quecksilber, und diese Elektrode zeigte eine höhere Selektivität als die auf GST-SmtA basierenden Elektroden (siehe die 9).
Sequenzauflistung

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Metallion-spezifischen Kapazitäts-Affinitäts-Sensors geeignet für die Bestimmung des Vorkommens eines bestimmten Schwermetallions durch Kapazitanzmessung umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Edelmetallsstücks, wobei das Stück optional ein Stab sein kann oder alternativ ein Stück isolierenden Materials wie z. B. Glas, Silicium oder Quarz, auf das ein Edelmetall aufgedampft oder gedruckt wurde; b) Bereitstellen eines ersten selbstordnenden Molekül, das eine Monoschicht ausbildet, umfassend eine Kupplungsgruppe; c) Kontaktieren des Stücks aus Schritt a) mit dem ersten selbstordnenden Molekül, das eine Monoschicht ausbildet aus Schritt b), um damit eine selbstordnende Monoschicht auf der Edelmetalloberfläche zu erhalten; d) Kontaktieren der selbstordnenden Monoschicht auf dem Edelmetallstück mit einem Molekül, welches spezifisch das Schwermetallion bindet, um damit das Molekül an die selbstordnende Monoschicht zu kuppeln; e) Kontaktieren des Stücks erhalten in Schritt d) mit einem zweiten selbstordnenden Molekül, das eine Monoschicht ausbildet, um eine Edelmetalloberfläche zu erhalten, die wenigstens 90%, bevorzugt mindestens 95%, stärker bevorzugt wenigstens 97% und am stärksten bevorzugt wenigstens 99% mit einer selbstordnenden Monoschicht bedeckt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplungsreaktion in Schritt d) in Gegenwart von PEGDGE ausgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Stück einer Lösung, enthaltend eine quervernetzende Substanz wie z. B. Glutaraldehyd, vor Schritt d) ausgesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das erste selbstordnende Molekül, das eine Monoschicht ausbildet, D/L-Thioctsäure ist, und dass die D/L-Thioctsäure mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid aktiviert wird, bevor Schritt d) ausgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite selbstordnenden Molekül, das eine Monoschicht ausbildet, ein Thiol ist, das 3–25 Kohlenstoffatome in einer geraden gesättigten Kette umfasst, und bevorzugt 1-Dodecanthiol ist.
Ein Metallion-spezifischer Kapazitäts-Affinitäts-Sensor umfassend ein Stück eines Edelmetalls, wobei das Stück optional ein Stab sein kann oder alternativ ein Stück eines isolierenden Materials wie z. B. Glas, Silicon oder Quarz, auf das ein Edelmetall aufgedampft ist, wobei auf das Stück Gruppen gebunden wurden, die spezifisch zu einem gewissen interessierendem Schwermetallion binden, dadurch gekennzeichnet, dass die Gruppen, welche spezifisch zu dem Schwermetallion binden, an eine selbstordnende Monoschicht, welche mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, stärker bevorzugt mindestens 97% und am stärksten bevorzugt wenigstens 99% der Edelmetalloberfläche bedeckt, gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–6 hergestellt wurde.
Sensor gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass spezifische Schwermetallion bindende Gruppen gewählt sind aus der Gruppe von Proteinen mit den Sequenzen SEQ ID. Nr. 1, SEQ ID. Nr. 2, SEQ ID. Nr. 3 oder SEQ ID. Nr. 4, oder funktionellen Derivaten davon mit äquivalenten Bindungscharakteristiken.
Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung des Vorkommens eines gewissen interessierenden Schwermetallions in einer flüssigen Probe umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Sensors gemäß Anspruch 6, wobei die Affinitätsgruppen spezifisch zu dem interessierenden Schwermetallion binden; b) Kontaktieren des Sensors mit einer Referenzflüssigkeit, welche kein interesierendes Schwermetallion enthält und Bestimmung der Kapazitanz mit an sich bekannten Methoden; c) Kontaktieren des Sensors mit einer Probe, welche in Verdacht steht, das interessierende Schwermetallion zu enthalten und Bestimmung der Kapazitanz mit an sich bekannten Methoden; und d) Berechnung der Differenz zwischen der Kapazitanz der Probe und der Kapazitanz des Referenzbeispiels, und optional Berechnung der Menge der Verbindung unter Verwendung vorab aufgenommener Eichdaten.
Verfahren gemäß Anspruch 8 zur Bestimmung des Vorkommens von Ionen gewählt aus der Gruppe von Zn²⁺, Hg²⁺, Cd^2–, Cu²⁺ und Pb²⁺.
Verwendung eines Sensors gemäß Anspruch 6 zur Bestimmung des Vorkommens von Ionen ausgewählt aus der Gruppe von Zn²⁺, Hg²⁺, Cd^2–, Cu²⁺ und Pb²⁺.