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Die Erfindung bezieht sich auf ein
Verfahren zum Transport bzw. zur bindungspezifischen Trennung elektrisch
geladener Moleküle
in einer wässrigen
Lösung,
insbesondere beim Betrieb eines DNA-Sensors mit einem Redox-Cycling-Prozess
zwischen zwei Messelektroden. Daneben bezieht sich die Erfindung
auf die zugehörigen
Vorrichtungen.
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Bei zahlreichen Verfahren der Molekularbiologie
spielt der Transport von geladenen Teilchen im elektrischen Feld
(Migration) eine wichtige Rolle. Die Wanderungsgeschwindigkeit v
der geladenen Teilchen im flüssigen
Medium ist dabei proportional der Feldstärke E und der Ionenladung Q
und umgekehrt proportional dem Teilchenradius r und der Viskosität η der Suspension.
Es ergibt sich für
die Geschwindigkeit v: v
= QE/6πrη (1)
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Bei der Elektrophorese z.B. werden
Biomoleküle,
d.h. vor allem Proteine und DNA, die sich bezüglich ihrer Größe und/oder
Ladung unterscheiden, voneinander getrennt. Die Anwesenheit von
anderen beweglichen, geladenen Teilchen ist bei bestimmten Formen
der elektrophoretischen Trennung (z.B. isoelektrische Fokussierung)
zu vermeiden, da sonst der Ladungstransport teilweise oder ganz
von diesen und nicht von den zu trennenden Molekülen übernommen wird. Als Puffer
werden daher oft Aminosäuren
verwendet, die ihren isoelektrischen Punkt beim gewünschten
pH-Wert haben. Das heißt,
beim eingestellten pH-Wert haben die Puffermoleküle selbst keine Nettoladung
und unterliegen daher nicht der Migration.
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Auch beim Transport von geladenen
Molekülen,
z.B. um die Konzentration an einem bestimmten Ort zu erhöhen oder
zu ernied niedrigen, werden elektrische Felder eingesetzt. Insbesondere
bei Mikrosensoren, z.B. zur DNA-Analyse, kann die Empfindlichkeit
gesteigert werden, wenn die zu detektierenden DNA-Fragmente (Zielmoleküle) am Ort
der Fängermoleküle (Sensoroberfläche) konzentriert
werden. Gemäß dem Massenwirkungsgesetz
steigt damit die Zahl der Fänger-/Zielmolekülbindungen.
In jedem Fall werden bei einer solchen Reaktion aber nicht nur Fänger-/Zielmolekülpaare gebildet,
die exakt zueinander passen, sondern auch solche, deren Sequenz
an einigen Stellen nicht exakt miteinander korrespondieren (Mismatches).
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Da die Größe der Bindungsenergie mit
der Zahl der nicht korrespondierenden Basen abnimmt, können durch
die Anwendung entsprechender Kräfte selektiv
solche Bindungen wieder getrennt werden, die eine bestimmt Zahl
von Mismatches besitzen (Stringenzbehandlung). Als Kraft kann hier
ein elektrisches Feld wirksam werden, das im Gegensatz zum ersten
Prozess, dem Konzentrieren der Moleküle, eine entgegengesetzte Polarität aufweist.
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Vorraussetzung für den Transport von geladenen
Teilchen im elektrischen Feld ist ein Feldgradient, der innerhalb
des Elektrolyten bzw. der Transportstrecke, streng monoton verläuft. Das
heißt,
der Feldgradient darf sein Vorzeichen nicht ändern und nicht zu Null werden.
Das Anlegen einer beliebigen Spannung ist dazu für wässrige Systeme nicht zwangläufig ausreichend.
In Abwesenheit einer chemischen Reaktion vor den Elektroden fällt die
Spannung über
die elektrochemische Doppelschicht ab und der Feldgradient zwischen
den Elektroden wird zu Null. Wenn allerdings eine Reduktions- bzw.
Oxidationsreaktion an den Elektroden stattfindet, wird die Doppelschicht
vor den Elektroden depolarisiert und das elektrische Feld verläuft streng
monoton innerhalb des Elektrolyten. Ein Ionentransport im wässrigen
Elektrolyten ist die Folge.
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Ein häufig angewendetes Verfahren
zur Erzeugung solcher elektrischer Felder in wässrigen Systemen ist das Anlegen
der Zersetzungsspannung von Wasser. Dabei wird an der Anode Sauerstoff
und an der Kathode Wasserstoff entwickelt. Bei der experimentelle
Durchführung
muss darauf geachtet werden, dass die Gase und insbesondere ihre
radikalischen Vorstufen nicht mit den zu untersuchenden Molekülen in Kontakt
kommen, da diese sonst chemisch verändert würden. In makroskopischen Systemen
geschieht dies durch Trennung der Elektrolyträume direkt vor den Elektroden
vom Elektrolytraum zwischen den Elektroden, z.B. durch Diaphragmen. Für Mikrosensoren
ist diese Lösung
problematisch, da Diaphragmen nicht praktikabel sind.
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Eine Möglichkeit zur Elektrophorese
in Mikrosystemen besteht darin, dass sogenannte Permeationslayer
aus hydrophilem Polymer vor den Elektroden eingeführt werden,
wozu auf die
US 5 605
662 A verwiesen wird. Die Beweglichkeit von Reaktionsprodukten
der Wasserelektrolyse und der zu transportierenden DNA ist in dieser
Schicht stark gehemmt, so dass eine Durchmischung quasi nicht stattfindet.
Der Ladungstransport im Permeationslayer wird von kleineren Ionen übernommen.
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Obwohl das bekannte Verfahren praktikabel ist,
wird durch die Einführung
neuer Polymer-Schichten die Herstellung des Mikrosensorchips deutlich aufwändiger und
damit teurer.
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Aufgabe der Erfindung ist es daher,
ein geeignetes Verfahren zum Transport der geladenen Moleküle mittels
eines elektrischen Feldes anzugeben, bei denen an der Elektrode
keine Wasserstoff- bzw. Sauerstoffentwicklung eintritt. Insbesondere sollen
mit unter Ausnutzung des Elektrophoreseverfahrens entsprechende
Mikrosysteme geschaffen werden, welche mit Standard-Materialien
und Schichten der Chipherstellung auskommen.
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Die Aufgabe ist bezüglich des
Verfahrens durch die Merkmale alternativ des Patentanspruches 1
oder des Patentanspruches 12 gelöst.
Eine zugehörige
Vorrichtung ist im Patentanspruch 15 angegeben. Weiterbildungen
des Verfahrens bzw. der Vorrichtung sind Gegenstand der jeweils
abhängigen Ansprüche.
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Bei der Erfindung können mit
prinzipiell einem Aufbau fakultativ die erfindungsgemäßen Verfahren
gemäß Patentanspruch
1 oder Patentanspruch 11 ausgeführt
werden. Vorteilhaft ist es, beide Verfahren miteinander zu kombinieren,
beispielsweise auch zyklisch.
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Die Erfindung macht sich bei der
Anwendung des Elektrophoreseverfahrens zunutze, dass zur Erzeugung
des elektrischen Feldes in der Analytlösung außer der Elektrolyse von Wasser
auch andere Reaktionen eingesetzt werden können. Gemäß der Erfindung wird ein Metall/Metallionkomplex,
z.B. Kupfer/Kupferhistidinkomplex, als Depolarisator vor den Elektroden
vorgeschlagen. Bei positiver Polarisierung einer mit Kupfer beschichteten
Elektrode zwecks Aufkonzentrierung negativ geladener Ionen wird
dann nicht Sauerstoff entwickelt, statt dessen geht das Kupfer als
Ion in Lösung.
Ist dort ein Komplexbildner für
das Metall, z.B. Histidin für
Kupfer, vorhanden, so bleibt das Metallion stabil in Lösung. Da
z.B. der Kufer-Histidin-Komplex sehr stabil ist, bleibt die Konzentration
der freien Kupferionen sehr klein und nahezu konstant. Ein Einfluss
der Kupferionen auf die DNA-Hybridisierung wird dadurch vermieden.
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Soll die Elektrode negativ polarisiert
werden, um z.B. die Selektivität
der Fänger-/Zielmolekülbindung
zu erhöhen
(Stringenzbehandlung), d.h. unspezifisch gebundene, nicht-komplementäre Proben-DNA
von der Fänger-DNA
zu entfernen, werden bei Anwesenheit eines Metallionenkomplexes
eines hinreichend edlen Metalls, z.B. Kupfer, die Metallionen reduziert
und dabei auf den Elektroden (in diesem Fall den Mess-Elektroden) abgeschieden.
Eine Wasserstoffentwicklung wird dadurch vermieden. Der Komplexbildner
für das
Metallion kann u.U. auch gleichzeitig als Puffer dienen. Histidin
wird beispielsweise als Puffer bei pH = 7 eingesetzt. Das auf den Mess-Elektroden
abgeschiedene Kupfer kann in einem Wasch-Schritt durch erneutes Anlegen von negativem
Potenzial entfernt werden. Ein Abstoßen der Zielmoleküle wird
dadurch verhindert, dass eine Waschlösung mit hoher Ionenstärke eingesetzt
wird, so dass nur z.B. Kupfer in Form von Cu2+-Ionen
entfernt wird, die Ziel-DNA jedoch nicht bewegt wird.
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Der Vorteil eines auf Metall/Metallionkomplex
basierenden Elektrophoreseverfahrens liegt in der geringeren Spannung,
die zur Erzeugung des elektrischen Feldes notwendig ist. Sie ist
niedriger als die Elektrolysespannung von Wasser, so dass die aggressiven
Produkte der Wasserelektrolyse nicht entstehen können. Damit wird eine Trennung
von Elektrolyse- und Elektrophoreseraum unnötig. Trotzdem reicht das erzeugte
Feld aus, um die gewünschten Moleküle im Analyten
zu transportieren.
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Kupfer wird bereits heute für Leiterbahnen verwendet
und kann künftig
als Elektrodenmaterial für
Sensoranwendungen bzw. mikrosystemtechnische Anwendungen wie Mikro-Elektrophorese
eingesetzt werden. Bei der Herstellung eines solchen Mikrosystems
kann daher auf kostengünstige
Standardverfahren der Halbleitertechnik zurückgegriffen werden.
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Weitere Einzelheiten und Vorteile
der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung
von Ausführungsbeispielen
anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen. Es
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1 einen
prinzipiellen Aufbau zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
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2 bis 4 Querschnitte unterschiedlich ausgebildeter
Anordnungen,
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5a und 5b bei Anordnungen gemäß 3 verfahrensmäßig das
Anreichern von Zielmolekülen
von geringer zu hoher Konzentration,
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6a und 6b verfahrensmäßig eine
Situation gemäß 5b, bei der jedoch auch
unspezifische, d.h. nicht-komplementäre Proben-DNR vorliegen, die
einer sogenannten Stringenz-Behandlung unterliegen,
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7 den
Elektroden-Prozess bei der erfindungsgemäßen Verwendung einer Opferelektrode, sowie
eines Komplexbildners,
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8 bis 10 Draufsichten auf unterschiedliche
Messelektroden-Konfigurationen
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11 eine
Messanordnung mit nebeneinander angeordneten Messpositionen im Querschnitt und
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12 eine
aus Einzelpositionen entsprechend der 8 gebildete
Arrayanordnung in der Draufsicht.
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Die Figuren werden teilweise gemeinsam beschrieben.
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Aus 1 ist
der prinzipielle Aufbau einer allgemeinen Anordnung zur Durchführung von
biochemischen Messungen ersichtlich. Mit 1 ist ein planares
Substrat, z.B. aus Silicium, bezeichnet, auf dem eine dünne Isolatorschicht 2,
z.B. aus Siliciumoxid (SiO2) aufgebracht
ist. Auf dieser Anordnung befinden sich zwei Messelektroden 20 und 30,
die vorzugsweise aus Edelmetall, insbesondere Gold, bestehen. Die
gesamte Messanordnung befindet sich in Kontakt mit einer wässrigen
Lösung 15.
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In der wässrigen Lösung 15 befinden sich negativ
geladene Makro-Moleküle,
was in 1 durch die Knäuel-Struktur
verdeutlicht wird, und die weiter unten in 5 im Einzelnen mit 200, 200' beziffert sind.
Die negativ geladenen Moleküle
sollen zu den Messelektroden 20, 30 transportiert
werden und werden nachfolgend auch als Zielmoleküle bezeichnet. Im Falle einer
DNA-Analyse sind die Zielmoleküle
die zu untersuchende DNA. Über
Fängermoleküle, die
z.B. in einer Hydrogelschicht 35 immobilisierbar sind,
kann die Ziel-DNA zwecks Messung in der Nähe der Elektroden 20, 30 angelagert
werden.
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In der wässrigen Lösung 15 ist weiterhin
ein Material vorhanden, das in der wässrigen Lösung beständig und unedler als das Metall
der Messelektroden ist. Im allgemeinsten Fall ist das Material eine Metall/Metallion(Me/Me+)-Kombination, beispielsweise Cu/Cu2+. Dies bedeutet, dass entsprechend den vorgegebenen
Potenzialverhältnissen
entweder metallisches Kupfer Cu° unter
Abgabe von zwei Elektronen aufgelöst wird oder Kupfer(II)-Ionen
Cu2+ unter Aufnahme von zwei Elektronen
abgeschieden werden können,
wobei gilt: Cu° ⇔ Cu++ + 2e (2)
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Bei der Anordnung gemäß 5 kann bei einer Kupferelektrode
als Opfer-Anode 40 durch Anlegen eines positiven Potenzials
Cu2+ in Lösung gehen. Dadurch werden
dort die negativen Zielmoleküle 200 zur
Kupferelektrode 40 bewegt und reichern sich in deren Nähe und damit
auch im Bereich der Messelektroden 20, 30 an.
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Sofern bei Anwesenheit von Cu2+-Ionen in der wässrigen Lösung an die Messelektroden 20,30 gemäß 6 ein geeignetes negatives
Potenzial angelegt wird, lösen
sich diejenigen Fängermolekül/Ziel-DNA-Bindungen,
die aufgrund nicht vollständiger
Komplementarität
eine verminderte Bindungsstärke
aufweisen. Dabei werden gleichzeitig Kupfer(II)-Ionen (Cu2+) an den Messelektroden zu metallischem
Kupfer (Cu°)
reduziert.
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Anhand der 5a, 5b einerseits
und 6a, 6b andererseits sowie 7 werden die methodischen Prozesse gemäß den in 1 nur prinzipiell aufgezeigten
Alternativen verdeutlicht. Speziell in den 5a bis 6b ist über den
Messelektroden 20 und 30, welche Sensoroberflächen 21 und 31 haben,
jeweils eine Hydrogelschicht 35 aufgebracht, in welcher
Fängermoleküle 100 für Zielmoleküle 200,
die sich außerhalb
der Hydrogelschicht 35 befinden, eingeschlossen sind. Wesentlich
ist dabei, dass die Fängermoleküle 100 die
Zielmoleküle
200 einfangen bzw.
binden und damit der Analyse an der Sensorfläche 21 bzw. 31 zuführen. Zu
dieser Methodik wird beispielsweise auf die ältere Anmeldung PCT/DE 02/01982
der Anmelderin verwiesen.
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Die Fänger-Moleküle 100 können beispielsweise
spezielle thiolmodifizierte Oligonukleotide sein. Ziel-Moleküle 200,
die von den Fänger-Molekülen 100 gebunden
werden sollen, sind die zu analysierenden DNA's.
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Im Allgemeinen liegt bei einer bekannten Messanordnung
ein Zustand gemäß 5a vor, bei dem die Ziel-DNA
nur in geringer Konzentration über der
Fänger-DNA
vorliegt. Hier ist es schwierig, zu sicheren Messergebnissen zu
kommen. Bei einer Anordnung gemäß 5b liegt dagegen die Ziel-DNA in
hoher Konzentration über
der Fänger-DNA
vor, was durch eine DNA-Anreicherung erreicht wird. In diesem Zustand
können
gute Messergebnisse erzielt werden.
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An der Fänger-DNA binden entsprechend der 6a außer der komplementären Ziel-DNA 200 auch
nicht vollständig
komplementäre
DNA-Fragmente 200'.
Durch eine Stringenz-Behandlung lässt sich unspezifisch gebundene
DNA durch Beaufschlagen der Elektroden mit jeweils geeigneten Potentialen
selektiv entfernen. Die unspezifisch gebundene DNA wird dann aufgrund
ihrer schwächeren
Bindungskräfte
abgestoßen.
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Aus der 1 sowie den Teilfiguren 5a und 5b ist
ersichtlich, dass durch Anlegen spezifischer Potenziale an die Hilfselektrode 40 eine
gewünschte Anreicherung
der Ziel-DNA erreicht wird. Im Einzelnen wird dazu eine Hilfselektrode 40 aus
unedlem Metall, beispielsweise Kupfer, gewählt und an die Hilfselektrode 40 ein
positives Potential angelegt. Sofern sich die gesamte Anordnung
in einer wässrigen Lösung befindet,
gehen Cu2+-Ionen in Lösung. Dadurch entsteht ein
Feldgradient und die negativ geladenen DNA-Moleküle werden angezogen.
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Letzterer Prozess wird im Wesentlichen durch 7 verdeutlicht. Insbesondere
ist hier ersichtlich, dass das in Lösung gebrachte Kupfer-Ion komplexiert
wird, wozu Histidin-Moleküle 70 verwendet
werden.
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Aus der 1 sowie den Teilfiguren 6a und 6b ist
ersichtlich, dass durch Anlegen spezifischer Potenziale an die Messelektroden 20 30
und Hilfselektroden 40, 45 eine gewünschte Selektion
der DNA erreicht wird. Im Einzelnen werden die Messelektroden negativ,
die Hilfselektroden positiv polarisiert. Sofern sich die gesamte
Anordnung in einer wässrigen
Lösung
befindet, die Kupfer(II)-Ionen (Cu2+) enthält, werden
diese auf den Messelektroden 20,30 zu metallischem
Kupfer (Cu°)
reduziert. Dadurch entsteht ein Feldgradient und die negativ geladene,
nicht vollständig
komplementäre
DNA wird abgestoßen.
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Beide Alternativen können separat
oder aber kombiniert ablaufen. Zunächst werden Zielmoleküle angereichert
und dann selektiert. Es kann aber auch nur eine Selektion vorgenommen
werden.
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In den 2 bis 4 sind unterschiedliche Varianten
von Sensoranordnungen dargestellt. In 2 haben
die aus Gold gebildeteten Messelektroden 20, 30 freie
Gold-Sensorflächen 21, 31,
an die die Fänger-DNA 100 gebunden
sind. Alternativ ist in 3 ein
Hydrogel 35 vorhanden, welches Fänger-DNA 100 enthält. Speziell
in 4 ist eine Anordnung
dargestellt, bei der neben den eigentlichen Messelektroden 20 und 30 weiterhin
eine freie Reaktionsfläche 50 aus
Gold vorhanden ist, an welcher die Fänger-DNA 100 in einer
dichten Anordnung gebunden sind. Dies hat den Vorteil einer großen Dichte
von Fänger-DANN.
Allerdings müssen
bei der Herstellung der Reaktionsfläche 50 zunächst die
Messelektroden 20, 30 durch Kupfer oder dergleichen
abgedeckt werden, um dort eine Anlagerung der Fänger-DNA 100 zu verhindern.
In 4 sind dafür Kupfer-Schichten 22 bzw.
32 vorhanden. Bei allen Anordnungen gemäß den 2 bis 4 ist
jeweils die Opferelektrode 40 in der Nähe der Messelektroden 20 und 30 angeordnet,
um durch das Inlösunggehen
von Kupfer den Feldgradienten aufzubauen und damit die Anreicherung
der Ziel-DNA 200 in der Nähe der Messelektroden 20 und 30 zu
bewirken. Im Ergebnis kann somit die Messgenauigkeit erheblich verbessert werden.
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In den 8 bis 10 sind die verschiedene Varianten
von Messsensoren gemäß den 2 bis 4 in der Draufsicht dargestellt. Speziell
in 8 ist ein Messsensor 80 vorhanden,
der aus zwei Kammelektroden 82 und 83 mit ineinander
greifenden Elektrodenfingern besteht, wobei eine einzige Opferelektrode 84 ringartig
um die Kammelektroden angeordnet sind.
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Entsprechendes ergibt sich aus 9, wobei hier der Bereich
der Kammelektroden mit der Hydrogelschicht 85 abgedeckt
ist. Eine derartige Hydrogelschicht kann sich über der gesamte Messanordnung
befinden. Speziell in 10 sind
zusätzlich noch
Reaktionsflächen 86 zum
Anlagern von Fängermolekülen vorhanden.
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Aus den Einzelsensoren gemäß den 8 bis 10 können
Arrays konzipiert werden, die n-Zeilen und m-Spalten haben. Aus
den 11 und 12 ist eine Komplettanordnung
mit einer Vielzahl von Messsensoren 80, 80',... die das
n·m-Array
darstellen. Dabei ist es prinzipiell möglich, das Array mit Einzelpositionen
entsprechend einer der 8 bis 10 aufzubauen, bei der jede
Einzelposition eine ringartige Kupfer-Opferanode 84 hat. Um die gesamte
m·n-Anordnung
mit den Einzelpositionen ist dabei als weiterer Ring die Hilfselektrode 185 angeordnet.
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Gemäß 11 befindet sich die Komplettanordnung 180 in
einem Behälter,
z.B. einem Durchflusskanal 150, mit einem Deckel 120,
einem Zufluss 121 und einem Abfluss 122.