WO2002031482A2 - Vorrichtung und verfahren zur elektrisch beschleunigten immobilisierung von molekülen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur elektrisch beschleunigten immobilisierung von molekülen Download PDF

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WO2002031482A2
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macromolecules
electrodes
sensor
electrically conductive
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Claus Escher
Günter BROMMER
Alexander Meyer
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Nanogen, Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
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    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
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    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00653—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to electrodes embedded in or on the solid supports

Definitions

  • the invention relates to a new method and a new device for the electrically accelerated immobilization of molecules and their detection or recognition.
  • the invention relates to arrays of microelectrodes on a solid substrate which are in contact with a liquid electrolyte and to methods for operating the microelectrodes by means of electrical signals.
  • the detection of one or more different molecular structures from a solution is an essential part of many biochemical studies.
  • a widely used method is to selectively immobilize the molecules to be detected and then to detect them.
  • the molecular structures to be recognized are formed from ligands that are recognized and bound by specific receptors (capture molecules).
  • capture molecules include, for example, antigen-antibody or ligand-receptor reactions or hybridizations of nucleic acids.
  • Compounds can be used as capture molecules which form stable and specific bonds with the molecules to be recognized.
  • capture molecules are mono- or polyclonal antibodies, antigens, enzymes, coenzymes, enzyme inhibitors and activators, proteins, hormones, hormone receptors, agonists and antagonists for cell membrane receptors, oligosaccharides, lectins, toxins, pathogens, bacteria, oligonucleotides, nucleic acids, nucleic acids, nucleic acids such as transcription factors, peptides or synthetic pairing systems such as PNA, p-RNA, p-DNA or CNA.
  • non-specific capture molecules such as lectins can also be used.
  • the inhibition of recognition by small molecules or the binding of small molecules to biomolecules themselves should also be mentioned in this context. The recognition of the presence of such molecular structures and in many cases also their quantification is particularly important in the
  • a chip As a rule, one wants to analyze a sample for several different target molecules at the same time.
  • the format of a chip is suitable for this, in which different sensor positions are defined on a flat substrate. Typically there are more than 10 sensor positions per cm 2 on a chip, the number can also be much larger, for example 10000 per cm 2 .
  • the maximum size of the individual sensor positions which in the latter case typically have a diameter of 50 ⁇ m, scales accordingly. Smaller sensor positions do not necessarily mean a loss of measurement accuracy, on the contrary, they can increase the sensitivity of the device if one is able to immobilize the target molecules to be detected in comparable numbers on a smaller sensor position.
  • the selective loading of the different sensor positions with specific recognition molecules can be done, for example, with the help of a dispenser.
  • electrical or other methods can also be used. Electrical processes become all the more advantageous the smaller the structures become, since the adjustment and the required reduction in the volume of liquid to be dispensed places ever higher demands. In addition, they enable a potential user to load the chip themselves with capture molecules in a very simple manner. In order to be able to efficiently detect the target molecules sought, one needs in given measurement method and chip layout in usually a minimum number of target molecules bound to the capture molecules.
  • WO 96/01836 it is further disclosed that with this method, in addition to the selective and accelerated immobilization of the molecules to be detected (target molecules), also a selective loading with biological detection systems (Capture molecules) can be made.
  • the electrical field application can also be used in the opposite direction to drive charged biomolecules away from the immediate vicinity of the electrode. In this way, for example, unspecifically bound macromolecules or macromolecules which are not completely complementary to the capture molecule (so-called mismatches) can be mobilized again, so that only the desired, precisely matching target molecules remain immobilized.
  • SNPs single nucleotide ⁇ polymorphisms
  • WO 98/02399 describes a method of how immobilization can be accelerated by avoiding direct currents by applying electrical potentials of changing polarity.
  • this method only a limited part of the electrolyte is available in the immediate vicinity of the electrode as an enrichment reservoir, so that further measures for better mixing or for producing convection in the electrolyte are necessary.
  • US 5653939 also refers to the possibility of accelerating the immobilization of oligonucleotides and their hybridization, it is not disclosed how this can be done efficiently.
  • this possibility is opened up by a special, so-called permeation layer, which has certain functional properties. there are impervious to the biomolecules to be detected and the permeability to water and small ions.
  • this layer serves to protect the biomolecules from the adverse conditions which are caused by the electrolysis products such as H + , OH ' , H 2 , 0 2 and free radicals, by typically keeping the biomolecules a few ⁇ m away from the electrode.
  • An integral part of the device disclosed in WO 96/01836 is therefore an attachment layer for binding the biomolecules, which is either integrated into the permeation layer or applied to it as a separate layer.
  • Electrolysis requires relatively high voltages and must be conducted very precisely so that the gases formed do not lead to the formation of bubbles and isolate the electrode or damage the permeation layer. Furthermore, the aggressive electrolysis products require a high stability of the permeation layer and, despite all precautionary measures, pose a danger to the biomolecules.
  • the application of electrically conductive polymers in biosensors is described in Polymer films in sensor applications ed. By Gabor Harsanyi (1995), 205 and in a large number of other papers.
  • the advantages here are the simple method of electrode deposition, which enables easy structuring and layer thickness control, the variety of functionalisability and the biocompatibility of the electrode deposition given with many polymers (Synthetic Metals 102 (1999), 1363 and Biosensors & Bioelectronics 14 (199), 443) ,
  • the electrode is coated with an electrically conductive polymer.
  • this coating can maintain an electrical direct current without electrolytic decomposition of the solution until a massive electrophoretic enrichment of the biomolecules with only a relatively low mobility is made possible at the electrode.
  • the invention relates to an electrically addressable device comprising at least one solid support with one or more sensor positions located thereon, each comprising at least one electrode surface and provided with surfaces on which macromolecules can be immobilized; a control unit which can apply electrical signals to the electrodes independently of one another via electrical feed lines; an electrically conductive polymer layer on at least one electrode surface of at least a part of the sensor positions; an electrolyte which is in contact with at least part of the sensor surface coated with the electrically conductive polymer and which contains or could contain the macromolecules to be immobilized.
  • the electrically conductive polymer layer has at least one of the following properties:
  • the electrically conductive polymer in an oxidized or reduced initial state.
  • the decisive factor for the efficiency of an electrolysis-free and purely electrophoretic enrichment of the biomolecules from a given electrolyte is the length of time over which a given direct current can be generated without the occurrence of an electrolytic decomposition of the
  • the electrically conductive polymer applied to the underlying electrode is wetted at room temperature with a monomer-free electrolyte (aqueous 0.1 M sodium perchlorate solution).
  • An electrochemical characterization of this electrode coated in this way is then carried out by means of cyclic voltammography, in which a triangular voltage is applied against a reference electrode at a feed rate of 100 mV / s. The amplitude of the triangular voltage is chosen so that the polymer is charged and discharged as completely as possible without causing irreversible effects such as overoxidation.
  • the current flowing over a half-period, ie the rising or falling edge of the triangular voltage, integrated over time represents the total charge capacity of the polymer layer.
  • charge capacity the total charge capacity related to the unit area. Electrolytes with low electrical conductivity or zwitterion buffers are preferred, as are examined, for example, in Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4907.
  • the increased immobilization rate of the appropriate target molecules due to the enrichment can be increased even further by the temporary application of a repulsive voltage, which exposes non-specific or incorrectly documented capture epitopes.
  • the purely electrophoretic enrichment can be supported by measures which are carried out simultaneously or alternately and which improve the mixing of the electrolyte or a mass transport of the electrolyte via the
  • the electrically conductive polymer layers can be used to guide, direct and condense electrically charged macromolecules at desired locations. Because of the mild conditions, e.g. pH-sensitive molecules or those that are sensitive to free radicals can be transported without damage.
  • the electrically conductive polymer can be modified, e.g. by incorporating binding groups such as avidin or streptavidin or by covalent functionalization with chemically reactive groups such as carboxylic acid esters or amino groups.
  • capture molecules are already covalently bound to the monomer units of the electrically conductive polymer, as described, for example, in Nucleic Acids Res. 22, (1994), 2915 or Am. Chem. Soc, 119X1997), 7388.
  • Another possibility is to coat the electrically conductive polymer with a further layer which contains such binding sites. Examples of such layers are agarose with embedded avidin or streptavidin or polyacrylamide.
  • a whole series of methods can be used to detect the target molecules immobilized on the associated capture molecules, such as autoradiography, optical reading by means of fluorescence spectroscopy, electromechanical methods (quartz balance) or electrical detection methods.
  • Electrical readout methods are particularly advantageous since they are less complex in terms of equipment and are easier to miniaturize. In addition, they do not necessarily require radioactive or fluorescent labeling of the molecules. In addition, the electrical readout is universal with regard to the chip format - regardless of the chip format, a direct digital position assignment is possible. Cumulative measurements and repeat measurements, which can be problematic due to the bleaching effect in fluorescence detection, can be carried out with electrical detection without any problems.
  • Examples of electrical methods and devices of this type are e.g. B. disclosed in WO 88/09499, EP 0543550, US 5653939, WO 97/21094 and WO 97/34140.
  • the molecules to be detected are immobilized either directly on or between the measuring chip equipped with electrodes or on a layer provided for this purpose on the chip.
  • US 5653939, WO 97/21094 and WO 97/34140 describe very fine electrodes structured in the sub- ⁇ m range, which have great advantages through higher sensitivity in the
  • Electrical detection is particularly useful if, for the purpose of electrically accelerated immobilization, one works with chip formats that are provided with electrodes and are coupled to electrical control units. This results in structural (electrical contacts, conductor tracks, electrodes) as well as functional (electrical signal generators and measuring instruments) synergies.
  • Electrodes which are coated with an electrically conductive polymer and with the help of which the molecules to be detected are enriched electrophoretically above the relevant sensor position, with the result of accelerated immobilization on a second set of electrodes (sensor electrodes) on the same sensor position, which is responsible for a highly sensitive Detection is used.
  • the carrier material of the device according to the invention preferably consists of silicon, silicon dioxide, glass, ceramic or plastic, or of a composite of these substances.
  • An active semiconductor chip with electrical circuits or with CMOS components is integrated into the carrier material.
  • the electrodes of the device according to the invention consist independently of one another of metallic materials such as gold, platinum, palladium, silver, copper, aluminum or of carbon.
  • the electrically conductive polymer coated on at least one electrode surface is preferably selected from the group consisting of polyacetylene, polythiophene, polypyrrole, polyparaphenylene, polyaniline or polyparaphenylene vinylene or modifications of these polymers.
  • the conductive polymer can also contain functional groups for binding macromolecules, which can be physically enclosed in the conductive polymer or covalently bonded to it. Preferred functional groups are avidin or streptavidin. Carboxylic acid groups or their derivatives such as active esters or amino groups can also be used as covalently bonded groups. Another possibility is that capture molecules are already covalently bound to the monomer units of the electrically conductive polymer, as described, for example, in Nucleic Acids Res.
  • a variant of the device according to the invention is that a bonding layer is applied to the electrically conductive polymer, which does not need to be electrically conductive, but is permeable to water and small ions and which contains functional groups for binding macromolecules.
  • Binding layer can preferably be selected from the group of agarose, polyacrylamide or polyurethane.
  • the sensor positions have at least one further electrode surface, so-called sensor electrodes, which are not coated with an electrically conductive polymer. Rather, the sensor electrodes are advantageously directly equipped with macromolecules, which are bonded to the electrode with an SH group in the case of sensor electrodes made of gold. However, the sensor electrodes can also be covered with a binding layer which contains functional groups for binding macromolecules. Examples of such bonding layers are agarose, polyacrylamide or polyurethane or else electrically conductive polymers.
  • the device according to the invention can be designed such that the electrodes covered with the electrical polymer and the sensor electrodes are offset in height from one another. The height offset can e.g. be of the order of magnitude of the thickness of the conductive polymer on the mobilization electrodes, the mobilization electrodes preferably being lowered. This ensures a defined lateral expansion of the electrical polymer layer.
  • a preferred embodiment consists in that the sensor positions are equipped with three independent electrodes, one coated with the electrical polymer and two sensor electrodes.
  • the two sensor electrodes form narrow, long, finger-like structures with a finger width of less than 2 ⁇ m. If the sensor electrodes represent interdigital electrodes, at least some interstices can be covered by an electrically conductive polymer Electrode to be filled.
  • the sensor positions are arranged in a two-dimensional array and generally have a grid size of 10 to 1000 ⁇ m.
  • the electrodes of the sensor positions are coupled to an electrical control and readout unit.
  • This usually requires one or more counter electrodes and a reference electrode, which are located independently of one another on the chip or at another location, this location also being wetted by the electrolyte, so that they are in an electrochemical connection to the electrodes of the Sensor position.
  • Silver, platinum, silver / silver chloride or other standard systems known from the literature can be used as reference electrodes.
  • the reference electrode will preferably be flat on the chip.
  • material for the counterelectrode all materials from which the mobilizing electrode can also be made are in particular and independently of this.
  • the counterelectrode preferably has an area which is at least as large as that of the mobilizing electrode, when it is coated by means of electrode deposition it serves as a counterelectrode or for which it serves as a counterelectrode in the electrophoretic enrichment; with, for example, ten or a hundred times the area of the mobilization electrode.
  • the counterelectrode has an area which is at least as large as the total area of the mobilization electrodes to be coated, and an even larger area is very particularly preferred .
  • mobilization electrodes can also serve as counterelectrode or counterelectrodes, which should not be coated even during the process under consideration or which should be enriched with macromolecules.
  • the position of the counter electrode or the positions of the counter electrodes for the electrophoretic enrichment is advantageously chosen so that that the greatest possible radius of action arises.
  • the counter electrodes can be located, for example, on the periphery of the electrolyte to be examined.
  • the counter electrodes for the electrode deposition and for the enrichment by means of electrophoresis can of course be selected differently.
  • the device according to the invention must have sensor positions which can be wetted with a liquid electrolyte which contains the molecules to be detected. This can expediently take place in a flow chamber.
  • the device according to the invention can also be designed such that the sensor electrodes of the various sensor positions are selectively equipped with macromolecules as specific recognition systems.
  • Fig. 1 Basic structure of the biochip according to the invention
  • Fig. 2 Sensor fields with an electrical field applied to the mobilization electrodes of the middle sensor field
  • Fig. 3 Section from a sensor position with interdigital and mobilization electrodes
  • Fig. 4 Different embodiments of the height offset of mobilization and interdigitating sensor electrodes
  • Fig. 5 Potentiodynamic polymerization of 3,4-ethylenedioxythiophene on gold in acetonitrile (0.1 M NaCl0 4 ) - film 1
  • Fig. 6 Cyclic voltammogram of poly (3,4-ethylenedioxythiophene) - film 1 on gold in acetonitrile (0.1 M NaCl0 4 )
  • Fig. 7 Cyclic voltammogram of poly (3,4-ethylenedioxythiophene) - film 2 on gold in acetonitrile (0.1 M NaCl0 4 )
  • Fig. 8 Potentiodynamic polymerization of 3,4-ethylenedioxythiophene on platinum in aqueous solution (0.1 M NaCl0)
  • Fig. 9 Microscopic image of a poly (3,4-ethylenedioxythiophene) coated platinum electrode (dark field)
  • AbbJO Cyclic voltamogram of poly (3,4-ethylenedioxythiophene) - on platinum in aqueous solution (0.1 M NaCI04) at different feed rates
  • Fig. 11 Imposed current with resulting voltage and fluorescence intensity with a platinum electrode coated with poly (3,4-ethylenedioxythiophene)
  • Fig. 12 Imprinted current with resulting voltage and fluorescence intensity with an uncoated platinum electrode
  • Fig. 13 Imprinted current with resulting voltage and fluorescence intensity in a platinum electrode coated with poly (3,4-ethylenedioxythiophene) after exposure to charge and discharge cycles
  • Fig. 14 Imposed current with resulting voltage and fluorescence intensity with an uncoated platinum electrode
  • Fig. 1 shows a device according to the invention. So-called mobilization electrodes (3) and detection or sensor electrodes (4) are located on a solid support (1) and an insulation layer (2) lying above it. An electrically conductive polymer layer (5) is located above the mobilization electrodes. FigJ also shows an enlarged section of a set of the mobilization and sensor electrodes.
  • Fig. 2 illustrates how when the middle set of mobilization electrodes is acted upon with a suitable electrical potential, the area above the electrolyte (6) is enriched (7) with the molecules to be detected.
  • optical, electromechanical or radiometric methods can also be used to detect the immobilized molecules.
  • the molecules to be detected can also be labeled with electrically active labein or electrically active reporter groups such as ferrocene, PQQ or porphyrins in order to increase the sensitivity of the electrochemical or electrical analysis.
  • the molecules to be detected are preferably immobilized on the sensor electrodes.
  • the detection is preferably carried out electrically or electrochemically, e.g. Using cyclic voltammetry, impedance analysis and redox recycling are very particularly preferred.
  • Impedance spectroscopy is preferred for impedance analysis.
  • An alternating voltage of different frequency is applied to the sensor electrodes.
  • the frequency of the AC voltage and the strength of the AC voltage applied are freely selectable.
  • a typical frequency range goes from 0.1 Hz to 20 MHz, a range from 1 Hz to 5 MHz is preferred.
  • On typical voltage range extends from 0.1 mV to 10 V, preferred is 1 to 100 mV.
  • the geometric arrangement and size of the electrodes can also be freely selected, by means of which the choice of the most advantageous frequency and voltage can also be controlled.
  • the molecules to be detected can also be labeled with electrically active labels in order to increase the sensitivity of the impedance analysis.
  • the sensor electrodes are so-called interdigital electrodes which are distinguished by particularly high sensitivity (Sensors & Actuators B49 (1998) 73-80).
  • Fig.3 shows such an embodiment for the example shown in FigJ in side view and in top view.
  • the sensor electrodes (1) protrude into one another in the manner of fingers, it being possible for adjacent fingers to be electrically connected to one another. They are separated by insulating areas and one or more mobilization electrodes.
  • the mobilization electrodes are covered with an electrically conductive polymer layer (2) which has been partially exposed to make the mobilization electrode (3) visible.
  • Fig. 4 (a) to (c) illustrate various embodiments of the height offset of mobilization and interdigitating sensor electrodes.
  • an insulation layer for example (photostructurable) polyimide (2) is applied to the continuous mobilization electrode (1), photostructured and the raised areas are metallized (3).
  • the lateral structuring can also be done in other ways customary in photolithography.
  • the insulation layer which was initially still unstructured on the mobilization electrode can also be metallized and then the metal layer and insulation layer can be structured by means of photolithographic processes.
  • Fig.4 (b) shows an embodiment in which the mobilization electrode (1) is structured and areas (2) not covered with the mobilization electrode are provided with a conductive web (3) insulated from the mobilization electrode, on which a conductive coating consisting of a suitable material is provided (4) is applied.
  • Fig.4 (c) shows the possibility of achieving a height offset through depressions (1) in the Si0 2 layer, which isolates the top of the chip from the Si substrate. Such depressions can, for example, be etched into the Si0 2 layer.
  • the mobilization electrodes (2) are located in the recesses, while the sensor electrodes (3) are located on the raised areas.
  • Fig.4 (d) shows an embodiment in which a plurality of interdigitating fingers (1) are arranged close to one another on a raised location (2) without an intervening mobilization electrode (3).
  • This variant is particularly preferred in applications where high sensitivity is important and is also particularly preferred in redox recycling.
  • the number of immediately adjacent fingers can be chosen as desired, a number from 1 to 10 fingers is particularly preferred.
  • the electrically conductive polymer layer is preferably applied by electropolymerization. If mobilization and sensor electrodes consist of different metallic materials, their selective binding behavior can be used for the selective application of an electrically conductive polymer layer.
  • Photolithographic structuring can be carried out, for example, by means of a lift-off process or by direct structuring of a photosensitive, electrically conductive polymer layer.
  • Photo-induced polymerization of suitable mono- and oligomers can also be used for the structured coating of the chip with an electrically conductive polymer layer. The entire chip is coated with a solution, for example by means of spin coating, which next to a polymerizable building block contains a photosensitive initiator component for the polymerization. Exposure using appropriate masks then leads to a laterally structured polymerization. The unpolymerized areas are then freed from the unpolymerized monomer or oligomer building blocks using a suitable solvent.
  • Catcher molecules can be connected directly to the sensor electrodes via functional groups that are covalently bound to the catcher molecules, such as thiollinkers in gold electrodes or via an upstream functionalization of the metal surface, e.g. in the form of aminopropyltriethoxysilane to which capture molecules functionalized with active ester are bound.
  • any remaining absorption capacity of the electrode surface after the capture molecules have been attached can be completely saturated with molecules that do not bind to molecules in the following steps that come into contact with the sensor position, so that no further unspecific bonds to the electrode are possible.
  • These molecules are preferably very reactive as far as the connection to the electrode is concerned, so that as far as possible all remaining free reaction sites are occupied and they are preferably smaller than the actual capture molecules so as not to interfere with the subsequent recognition process.
  • a high-resistance electrolyte is preferably chosen, which leads to a higher current-induced compression of the nucleic acids in the vicinity of the sensor position.
  • the electrolyte must of course support the hybridization process.
  • buffers are low-concentration standard buffers such as phosphate buffers or zwitterion buffers such as histidine.
  • the melting temperature of the hybridized oligonucleotides in the selected electrolyte is sufficiently stable.
  • Mg ++ as cations are particularly suitable for stabilizing the duplexes and accelerating the hybridization without greatly increasing the electrical conductivity of the electrolyte.
  • Example 5 shows how the electrolyte can be optimized for different requirements.
  • Electrolytes are used with a particularly large molecular weight of the anions, such as borates, tartrates, citrates or with anions bound to microscopic beads, such as polystyrene beads provided with carboxylate groups.
  • the method according to the invention for the accelerated immobilization of macromolecules comprises the following steps:
  • an electrically addressable sensor position with at least one electrode coated with an electrically conductive polymer, the polymer being designed such that it can bind the macromolecules to be detected specifically or non-specifically; b) wetting the sensor position with an electrolyte which contains or could contain the macromolecules to be immobilized in dissolved form; c) applying a sufficiently high potential of suitable polarity to the electrode coated with the electrically conductive polymer to compress the charged macromolecules in the immediate vicinity of the sensor position; d) Immobilization of the macromolecules to be detected on the electrically conductive polymer.
  • the binding sites for the macromolecules to be immobilized are not directly in the electrically conductive polymer, but in a further layer with which the electrically conductive polymer is coated. This layer must be permeable to water and small ions.
  • the macromolecules are also detected by an electrical method, either by means of adjacent sensor electrodes, which is particularly preferred in redox recycling or by means of the same electrode, which is particularly preferred in the case of cyclic voltammetry impedance analysis, in the latter case in particular in impedance spectroscopy ,
  • Another method according to the invention for immobilizing macromolecules comprises the following steps:
  • Mobilization electrode and a sensor electrode to which the macromolecules can bind non-specifically or specifically f) wetting the sensor position with an electrolyte which contains or could contain the macromolecules to be immobilized in dissolved form; g) applying a sufficiently high potential of suitable polarity to the electrode coated with the electrically conductive polymer to compress the charged macromolecules in the immediate vicinity of the sensor position; h) Immobilization of the macromolecules to be detected on the
  • Sensor electrodes either directly or on a binding layer on the sensor electrodes.
  • such a layer can also consist of a first layer of immobilized macromolecules, which can specifically bind a second layer of macromolecules.
  • Step h) of this method is generally the result of carrying out steps e) to g), with a waiting time for increasing the number of immobilized molecules possibly following after step g). If necessary, step g) is repeated a number of times, in each case the electrically conductive polymer having to be regenerated beforehand (ie to be discharged or loaded).
  • the immobilized macromolecules are detected electrically using the sensor electrodes covered with the macromolecules, the methods of redox recycling, cyclic voltammetry and impedance analysis being very particularly preferred, in the latter case in particular impedance spectroscopy
  • the invention also relates to a method for electrically assisted specific selection of macromolecules, comprising the steps: i) providing an electrically addressable sensor position with at least one electrode coated with an electrically conductive polymer, the polymer being designed such that it contains the macromolecules to be detected (Target molecules) specific to a first type of macromolecule
  • Capture molecules can bind; ii) wetting the sensor position with an electrolyte, which optionally contains or could contain the target molecules to be immobilized in dissolved form; iii) immobilization of a second type of macromolecule, which may optionally comprise different species and which contains or may contain the target molecules, at the specific binding sites in the electrically conductive polymer; iv) Applying a sufficiently high electrical potential of suitable polarity and a sufficiently long duration, possibly also pulsating, to the electrodes to release all bonds of macromolecules of the second type, which are not target molecules, on the sensor position.
  • step iv If the electrolyte does not contain any target molecules, all bound macromolecules are released again by step iv).
  • step iv If the electrolyte contains target molecules, only those bound macromolecules which are not target molecules are released again by step iv); i.e. only the molecules with the strongest bonds remain on the sensor position.
  • the binding strength of the target molecules to be detected is expediently determined by comparison with a reference electrolyte which, as the macromolecule of the second type, contains only the target molecule.
  • the specific binding sites on the electrically conductive polymer are usually formed by an immobilized first type of macromolecule (capture molecule), which e.g. can be bound to the electrical polymer by means of a dispenser or by means of the electrically accelerated immobilization described above.
  • an immobilized first type of macromolecule capture molecule
  • the target molecules are preferably bound to the capture molecules by means of electrically accelerated immobilization before the specific selection of target molecules described above is carried out.
  • the binding sites for the first type of macromolecules to be immobilized are not directly in the electrically conductive polymer, but in a further layer with which the electrically conductive polymer is coated. This layer must be permeable to water and small ions.
  • Selection of macromolecules comprises the following steps: v) Provision of an electrically addressable sensor position with at least one coated with an electrically conductive polymer
  • Mobilization electrode and a sensor electrode to which the macromolecules can specifically bind vi) wetting the sensor position with an electrolyte which contains the macromolecules to be immobilized in dissolved form vii) immobilization of the macromolecules to be detected (target molecules) on the sensor electrode (s), either directly or on one binding layer on the sensor electrodes.
  • a layer can also consist of a first layer of immobilized macromolecules, which can specifically bind a second layer of macromolecules, which may contain further species in addition to the target molecules, viii) exposure of the sensor electrodes to a sufficiently high electrical potential of suitable polarity and sufficient long duration, possibly also pulsating, to loosen all bonds of macromolecules in the second layer on the sensor position except for the
  • the specific binding sites on the sensor electrodes are generally formed by an immobilized first type of macromolecules (capture molecules), which can be bound to the sensor electrodes, for example by means of a dispenser or by means of the electrically accelerated immobilization described above.
  • the target molecules are preferably bound to the capture molecules by means of electrically accelerated immobilization before the electrically supported specific selection described above is carried out.
  • the unwanted bonds can also be released by applying a suitable electrical potential to the mobilizing electrode or can be supported thereby.
  • a gold electrode (CH Instruments, Inc., TX, USA, 0.2 mm) was used as the working electrodes.
  • a silver wire served as the reference electrode.
  • the counter electrode consisted of a platinum wire.
  • the surface of the working electrode was polished with a 0.3 ⁇ m alumina suspension and rinsed with Millipore water. The electrode surface was then electrochemically cleaned in 0.2 M NaOH solution. For this purpose, the electrode was treated cyclically with 5 potential cycles between - 0.5 V and + 1.8 V (against the silver reference electrode) and then with 3 potential cycles between - 0.3 V and + 1.1 V each at a feed rate of 50 mV / s.
  • the electrically conductive polymer was deposited on the surface of the working electrode in a potentiodynamic manner.
  • a conventional electrochemical cell with a three-electrode arrangement was used for this.
  • An IM6 workstation (Zahner measurement technology, Kronach, Germany) served as the potentiostat.
  • the electrolyte consisted of a 0JM solution of sodium perchlorate in acetonitrile.
  • the cell volume was 2 ml. 8 mg of 3,4-ethylenedioxythiophene (Baytron M, Bayer AG, Leverkusen, CAS: 126213-50-1) were added to the electrolyte as a monomer (corresponding to a 0.028 molar solution).
  • a dark blue poly (3,4-ethylenedioxythiophene) film (conductivity: - 200 mS / cm [Q. Pei, G. Zuccarello, M. Ahlskog, O. Inganäs, Polymer 1994, 35, 1347-1351]) deposited on the working electrode (film 1).
  • the formation of the polymer film can be followed in the cyclic voltammogram using the current increase after each cycle (Fig. 5).
  • the modified working electrode (with film 1) was rinsed with acetonitrile.
  • the characterization was carried out in monomer-free electrolyte solution (acetonitrile, 0J M sodium perchlorate).
  • the solution was degassed with argon for 5 minutes before the measurement.
  • Cyclic voltammograms were recorded at various feed speeds (50 to 250 mV / s) in a potential range from - 0.6 V to + 0.7 V.
  • the current varies linearly with the feed rate, thus showing the presence of a surface film on the electrode.
  • a peak current of the polymer film of about 40 ⁇ A was obtained (Fig. 6).
  • the gold electrode modified with film 2 was treated in the same way. In this case the peak current is approximately 20 ⁇ A (Fig. 7)
  • the biochip was removed from a commercially available cartridge from Nanogen, Inc., San Diego, USA (NanoChip TM cartridge) and the coating over the platinum electrodes was removed. For this purpose, the chip was immersed in 1 MH 2 S0 4 and treated with ultrasound at 80 ° C. for 30 minutes. The chip was then rinsed with water. Finally, it was repeated several times with abs. Rinsed ethanol and dried the chip in a stream of argon. The chip surface was checked with a microscope; if the coating remains, the cleaning procedure is repeated.
  • the polymer film was prepared on the platinum electrodes of the biochip in aqueous solution with 0JM sodium perchlorate as the electrolyte.
  • sodium dodecyl sulfate (0.07 M)
  • the 3,4-ethylenedioxythiophene (0.015 M) was converted into a dispersion and made accessible for polymerization.
  • the dispersion was fed into a flow cell for wetting the biochip.
  • the flow cell is designed so that it allows electrical contacting of the chip.
  • a small platinum electrode was used as the working electrode and a larger segment outside the chip as the counter electrode.
  • a silver wire was inserted as a reference electrode via a supply line for the electrolyte.
  • the potentiodynamic polymer formation took place with 15 potential cycles in a potential range from - 0.4 V to + 0.9 V at a feed rate of 100 mV / s (Fig. 8). Characterization of the conductive Poivmer film
  • an intensity of 20 SKT scale divisions
  • an intensity of 640 SKT is measured.
  • the corresponding values 35 and 150 were measured. The intensity quotient for positive and negative potential was therefore for the polymer-coated electrode larger by a factor of 7.5 and therefore also the compression or depletion of the oligonucleotides on the electrode.
  • platinum electrodes with an area of approximately 0.005 mm 2 were coated.
  • the polymer film was prepared in aqueous solution with 0.1 M sodium perchlorate as the electrolyte.
  • sodium dodecyl sulfate (0.07 M)
  • the 3,4-ethylenedioxythiophene (0.02 M) was converted into a dispersion and made accessible for polymerization.
  • the dispersion was fed into a flow cell for wetting the biochip. The flow cell is designed so that it allows electrical contacting of the chip.
  • a small platinum electrode was used as the working electrode and a larger segment outside the chip as the counter electrode.
  • a silver wire was inserted as a reference electrode via a supply line for the electrolyte.
  • the potentiodynamic polymer formation took place with 35 potential cycles in a potential range from - 0.4 V to + 0.9 V at a feed rate of 100 mV / s.
  • the polymer-coated electrode was, together with the surrounding unused electrodes, using a transparent flow cell with a 1 ⁇ M solution of the oligonucleotide labeled with the fluorescent dye Texas Red at the 5 'end: 5' - CCA TTT TCA GAA TTG GGT GT - 3 'wetted.
  • a 50 mM solution of L-histidine was used as the electrolyte (Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4907).
  • the size of the flow chamber was approximately 0.5 ⁇ L with a height above the electrodes of approximately 70 ⁇ m.
  • a silver wire was introduced as a reference electrode via a supply line for the solution.
  • the electrodes were connected to the IM6 workstation and examined optically in incident light in a fluorescence microscope (Zeiss Axioplan) with the excitation and emission color filters suitable for Texas Red.
  • the intensity of the fluorescence signal from a measuring field focused exclusively on the electrode under consideration by means of a measuring field diaphragm was measured by means of a photomultiplyer.
  • a current of 50 nA was first applied between the working and counter electrodes for 30 s as an electrical signal. After 30 s the current was then reversed to -50 nA and brought back to 0 after a further 30 s.
  • the voltage between the working and reference electrodes and the signal from the photomultiplyer were recorded throughout.
  • Fig. 11 The result is shown in Fig. 11; the arrows indicate the axis reference of the three curves.
  • the voltage reached a maximum value of approx. +1 V and a minimum value of approx. -0.5V. In no case did electrolysis occur.
  • the accumulation can be recognized by the value of the fluorescence intensity, which increases from the neutral value to approximately 10 times the value and in the repulsive case drops to approximately 1/10 of the neutral value.
  • the enrichment and impoverishment immediately above the The electrode is even more pronounced, since one must take into account that the measured fluorescence intensity represents the total value of a column about 70 ⁇ m high above the electrode and the part of this column remote from the electrode shows a significantly less pronounced fluorescence stroke than the part near the electrode.
  • the optimal electrolyte is then to be selected in individual cases.
  • An Mg ++ ion concentration between 0.02 and 10 mM is advantageous, and particularly advantageously between 0.1 and 1 mM.
  • the value of the hybridization rate for electrolyte A was not measured itself, but rather was estimated from literature values (for example J. Mol. Biol. (1971), 62, 361-381, Biochemistry, 1995, 34, 9774-9783).

Abstract

Es wird eine elektrisch adressierbare Vorrichtung und ein Verfahren zur beschleunigten Immobilisierung von elektrisch geladenen Makromolekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen beschrieben. Die Vorrichtung umfaßt dabei einen Träger mit einer oder mehreren darauf befindlichen Sensorpositionen, die jeweils wenigstens eine Elektrodenoberfläche umfassen sowie mit Flächen versehen sind, an denen Makromoleküle immobilisiert werden können; eine Steuereinheit, welche über elektrische Zuleitungen an die Elektroden unabhängig voneinander elektrische Signale applizieren kann; ein elektrisch leitfähiges Polymer auf wenigstens einer Elektrodenoberfläche wenigstens eines Teiles der Sensorpositionen; einen Elektrolyten, der in Kontakt mit wenigstens einem Teil der mit dem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Sensorflächen ist und der die zu immobiliserenden Makromoleküle enthält oder enthalten könnte. In einer Ausführungsform befinden sich auf dem Träger (1) und einer darüberliegenden Isolationsschicht (2) Mobilisierungs-elektroden (3) und Sensorelektroden (4). Über den Mobilisierungselektroden befindet sich eine elektrisch leitfähige Polymerschicht (5). Über dem Träger (1) befindet sich der Elektrolyt (6).

Description

Beschreibung
Vorrichtung und Verfahren zur elektrisch beschleunigten Immobilisierung von Molekülen
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren und eine neue Vorrichtung zur elektrisch beschleunigten Immobilisierung von Molekülen und ihrer Detektion bzw. Erkennung. Die Erfindung bezieht sich auf Arrays von Mikroelektroden auf einem festen Substrat, die in Kontakt mit einem flüssigen Elektrolyten sind und auf Verfahren zum Betreiben der Mikroelektroden mittels elektrischer Signale.
Die Detektion einer oder mehrerer unterschiedlicher Molekülstrukturen aus einer Lösung heraus ist ein essentieller Bestandteil vieler biochemischer Untersuchungen. Eine weit verbreitete Methode besteht darin, die zu detektierenden Moleküle selektiv zu immobilisieren und anschließend zu detektieren. Typischerweise werden die zu erkennenden Molekülstrukturen (Zielmoleküle) aus Liganden gebildet, die durch spezifische Rezeptoren (Fängermoleküle) erkannt und gebunden werden.Zu solchen Systemen gehören z.B. Antigen-Antikörper- oder Ligand-Rezeptor-Reaktionen oder Hybridisierungen von Nukleinsäuren. Als Fängermoleküle können Verbindungen eingesetzt werden, die stabile und spezifische Bindungen mit den zu erkennenden Molekülen eingehen. Beispiele von Fängermolekülen sind mono- oder polyklonale Antikörper, Antigene, Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren und -aktivatoren, Proteine, Hormone, Hormonrezeptoren, Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Oligosaccharide, Lectine, Toxine, Pathogene, Bakterien, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Nukleinsäure bindende Proteine wie z.B. Transkriptionsfaktoren, Peptide oder auch synthetische Paarungssysteme, wie PNA, p-RNA, p-DNA oder CNA. Aber auch unspezifisch wirkende Fängermoleküle, wie z.B. Lectine sind verwendbar. Auch die Inhibierung der Erkennung durch kleine Moleküle oder die Bindung kleiner Moleküle an Biomoleküle selbst ist in diesem Zusammenhang zu nennen. Die Erkennung der Präsens solcher Molekülstrukturen und in vielen Fällen auch ihre Quantifizierung ist insbesondere in der
Wirkstoffentwicklung der pharmazeutischen Industrie, der Therapieverfolgung bei medizinischer Behandlung, der medizinischen Diagnostik aber auch in den Agrarwissenschaften und der Forensik von Bedeutung.
In der Regel will man eine Probe auf mehrere verschiedenartige Zielmoleküle hin gleichzeitig analysieren. Dazu bietet sich das Format eines Chips an, bei dem auf einem ebenen Substrat verschiedene Sensorpositionen definiert sind. Typischerweise befinden sich mehr als 10 Sensorpositionen pro cm2 auf einem Chip, die Anzahl kann auch sehr viel größer sein, z.B. 10000 pro cm2. Entsprechend skaliert die maximale Größe der einzelnen Sensorpositionen, die in letzerem Fall typischerweise eine Durchmesser von 50 μm haben. Kleiner werdende Sensorpositionen bedeuten jedoch keineswegs notwendigerweise einen Verlust an Meßgenauigkeit, sondern können im Gegenteil die Sensitivität der Vorrichtung steigern, wenn man es vermag, die zu detektierenden Zielmoleküle in vergleichbarer Anzahl auf einer kleineren Sensorposition zu immobilisieren.
Die selektive Beladung der verschiedenen Sensorpositionen mit spezifischen Erkennungsmolekülen (Fängermoleküle) kann z.B. mit Hilfe eines Dispensers geschehen. Es können jedoch auch elektπsche oder andere Verfahren genutzt werden. Elektrische Verfahren werden umso vorteilhafter, je kleiner die Strukturen werden, da die Justage und die erforderliche Verkleinerung der zu dispensierenden Flüssigkeitsvolumina immer höhere Ansprüche stellt. Außerdem ermöglichen sie es einem möglichen Anwender, den Chip auf recht einfache Weise selbst mit Fängermolekülen zu beladen. Um die gesuchten Zielmoleküle effizient detektieren zu können, benötigt man bei gegebenem Meßverfahren und gegebenem Chiplayout in der Regel eine Mindestanzahl von an den Fängermolekülen gebundenen Zielmolekülen. Um den zeitraubenden Immobilisierungsprozeß gebührend kurz zu halten, benötigt man bei konventionellen passiven Immobilisierungsverfahren eine hohe Anzahl von Zielmolekülen im Analyten, da in der zur Verfügung stehenden Zeit nur ein Bruchteil der passenden Zielmoleküle gebunden werden. Bei der Nukleinsäurediagnostik erfordert dies in vielen Fällen die Vorschaltung von Amplifikationsverfahren wie der Polymerasekettenreaktion (PCR). Eine größere Effizienz bei der Immobilisierung würde die Anforderung an die Zahl bzw. Konzentration der Nukleinsäuren im Analyten senken und in vielen Fällen eine PCR überflüssig machen.
In US 4787963 und WO 96/01836 wird ein Verfahren vorgestellt, wie die Immobilisierung der zu detektierenden Moleküle in wässriger Lösung elektrisch gesteuert und beschleunigt werden kann. Dabei nutzt man die Tatsache aus, daß die meisten der interessierenden Moleküle in der Lösung in ionischer Form, also elektrisch geladen, vorliegen. Zur Steuerung und Beschleunigung der Immobilisierung werden die Moleküle mittels Elektrophorese nahe der Elektrode angereichert und so die Immobilisierungsrate erhöht. Dies verkürzt die zur Immobilisierung der Zielmoleküle notwendige Inkubationszeit der Elektrode bzw. des gesamten Chips deutlich. Dabei wird insbesondere darauf hingewiesen, daß eine elektrolytische Zersetzung des wässrigen Lösungsmittels notwendig ist, um den erforderlichen Gleichstrom aufrecht erhalten zu können. Dies erfordert seinerseits einen Schutz der Zielmoleküle vor den daraus resultierenden chemischen Folgeprodukten, was durch eine für diese Moleküle undurchlässige Schicht über der Elektrode erreicht wird. Auf der anderen Seite muß diese Schicht durchlässig für Wasser und kleine Ionen sein.
In WO 96/01836 wird weiterhin offenbart, daß mit diesem Verfahren neben der selektiven und beschleunigten Immobilisierung der zu detektierenden Moleküle (Zielmoleküle) auch eine selektive Beladung mit biologischen Erkennungssystemen (Fängermoleküle) vorgenommen werden kann. Darüberhinaus kann die elektrische Feldapplikation auch in umgekehrter Richtung zum Wegtreiben geladener Biomoleküle aus der unmittelbaren Umgebung der Elektrode genutzt werden. Auf diese Weise können z.B. unspezifisch gebundene Makromoleküle oder zum Fängermolekül nicht ganz komplementäre Makromoleküle (sog. Mismatches) wieder mobilisiert werden, so daß nur die gewünschten genau passenden Zielmoleküle immobilisiert übrigbleiben. Bekanntestes Beispiel hierfür ist bei der Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen die Diskriminierung zwischen genau passenden komplementären Nukleotidsträngen und solchen, bei denen eine Base nicht das entsprechende passende Pendant vorfindet, also die Detektion von sog. Single Nucleotidθ Polymorphisms (SNPs). Diese Diskriminierungsmöglichkeit wird gemeinhin als Stringenzkontrolle bezeichnet und ist z.B. beschrieben in WO 96/01836 und in Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 1119-1123, Feb. 1997.
In WO 98/02399 wird eine Methode beschrieben, wie die Immobilisierung unter Vermeidung von Gleichströmen durch Anlegen von elektrischen Potentialen wechselnder Polarität beschleunigt werden kann. Allerdings steht mit diesem Verfahren allein nur ein begrenzter Teil des Elektrolyten in unmittelbarer Nähe der Elektrode als Anreicherungsreservoir zur Verfügung, so daß weitere Maßnahmen zur besseren Durchmischung bzw. zur Erzeugung von Konvektion im Elektrolyten notwendig sind.
In US 5653939 wird zwar auch auf die Möglichkeit einer Beschleunigung der Immobilisierung von Oligonukleotiden und deren Hybridisierung hingewiesen, jedoch wird nicht offenbart, wie dies effizient geschehen kann. In WO 96/01836 und z.B. in Electrophoresis 2000, 21, 157-164 wird dargelegt, daß dazu die Aufrechterhaltung eines Stromes notwendig ist, was seinerseits durch das Aufrechterhalten einer laufenden Elektrolyse erreicht wird. Diese Möglichkeit wird, wie in WO 96/01836 offenbart wird, durch eine besondere, sogenannte Permeation Layer oder Permeationsschicht eröffnet, die bestimmte funktionelle Eigenschaften besitzt. Dabei sind unabdingbar die Undurchlässigkeit für die zu detektierenden Biomoleküle und die Durchlässigkeit für Wasser und kleine Ionen. Des weiteren dient diese Schicht zum Schutz der Biomoleküle vor den adversen Bedingungen, die durch die Elektrolyseprodukte wie H+, OH', H2, 02 und freie Radikale hervorgerufen werden, indem sie die Biomoleküle typischerweise einige μm von der Elektrode entfernt hält. Integraler Bestandteil der in WO 96/01836 offenbarten Vorrichtung ist deshalb eine sogenannte Attachment Layer zum Anbinden der Biomoleküle, die entweder in die Permeationsschicht integriert oder als separate Schicht auf sie aufgebracht wird.
Die oben geschilderten Verfahren und Vorrichtungen haben eine Reihe von Nachteilen.
Die Elektrolyse erfordert relativ hohe Spannungen und muß sehr genau geführt werden, damit die dabei gebildeten Gase nicht zur Blasenbildung führen und die Elektrode isolieren oder die Permeationsschicht schädigen. Des weiteren erfordern die agressiven Elektrolyseprodukte eine hohe Stabilität der Permeationsschicht und bilden trotz aller Vorsichtsmaßnahmen eine Gefahr für die Biomoleküle.
Bei der Detektion mittels elektrischer Verfahren ist es außerdem oft vorteilhaft, die Biomoleküle möglichst nahe an der Elektrode zu immobilisieren, was wegen der oben geschilderten Maßnahmen zum Schutz der Biomoleküle stark limitiert ist.
In Polymer films in sensor applications ed. by Gabor Harsanyi (1995), 205 sowie in einer Vielzahl anderer Arbeiten wird die Applikation elektrisch leitfähiger Polymere in Biosensoren beschrieben. Vorteile sind hier die einfache Methode der Elektrodeposition, die eine leichte Strukturierbarkeit und Schichtdickenkontrolle ermöglicht, die Vielfalt der Funktionalisierbarkeit und die bei vielen Polymeren gegebene Biokompatibilität der Elektrodeposition (Synthetic Metals 102 (1999), 1363 und Biosensors & Bioelectronics 14 (199), 443). In dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren bzw. zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird die Elektrode mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichtet. Überraschend wurde festgestellt, daß mit dieser Beschichtung unter geeigneten Bedingungen ein elektrischer Gleichstrom ohne elektrolytische Zersetzung der Lösung solange aufrecht erhalten werden kann, daß eine massive elektrophoretische Anreicherung der nur eine relativ geringe Beweglichkeit aufweisenden Biomoleküle an der Elektrode ermöglicht wird. Dabei sind keine zusätzlichen Redox-Spezies, wie Ferrocene, Ferrocyanide, Übergangsmetallkomplexe oder ähnliches nötig, wie sie in WO 99/67628 verwendet werden.
Gegenstand der Erfindung ist eine elektrisch adressierbare Vorrichtung, umfassend mindestens einen festen Träger mit einer oder mehreren darauf befindlichen Sensorpositionen, die jeweils wenigstens eine Elektrodenoberfläche umfassen sowie mit Flächen versehen sind, an denen Makromoleküle immobilisiert werden können; eine Steuereinheit, welche über elektrische Zuleitungen an die Elektroden unabhängig voneinander elektrische Signale applizieren kann; eine elektrisch leitfähige Polymerschicht auf wenigstens einer Elektrodenfläche wenigstens eines Teiles der Sensorpositionen; einen Elektrolyten, der in Kontakt mit wenigstens einem Teil der mit dem elektrisch leitfähigen Polymeren beschichteten Sensorfläche ist und der die zu immobilisierenden Makromoleküle enthält oder enthalten könnte.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung besitzt die elektrisch leitfähige Polymerschicht wenigstens eine der folgenden Eigenschaften:
- eine Schichtdicke größer als 1 μm, bevorzugt größer als 2μm, besonders bevorzugt größer als 5μm, ganz besonders bevorzugt größer als 10μm oder - eine Ladungskapazität größer als OJmC/mm2, bevorzugt größer als 0,5mC/mm2, besonders bevorzugt größer als 1 mC/mm2 und ganz besonders bevorzugt größer als 1 OmC/mm2.
Entsprechend des Vorzeichens der Ladung der anzureichernden Biomoleküle kann es zweckmäßig sein, das elektrisch leitfähige Polymere in oxidiertem oder reduzierten Anfangszustand einzusetzen. Entscheidend für die Effizienz einer elektrolysefreien und rein elektrophoretischen Anreicherung der Biomoleküle aus einem gegebenen Elektrolyten ist die Länge der Zeitdauer, über die man einen gegebenen Gleichstrom ohne Auftreten einer elektrolytischen Zersetzung der
Lösung aufrechterhalten kann. Diese Zeitdauer wächst mit der Ladungskapazität des elektrisch leitfähigen Polymers und infolgedessen bei unveränderten anderen Parametern mit seiner Schichtdicke. Von daher sind dicke Schichten, deren Dicke typischerweise im Bereich von 1 μm bis zu 100 μm oder mehr liegen, bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Schichtdicken von 10 bis 20 μm.
Die Ladungskapazität ermitteln wir auf folgende Weise: das auf die unterliegende Elektrode aufgebrachte elektrisch leitfähige Polymer wird bei Raumtemperatur mit einem monomerfreien Elektrolyten (wässrige 0,1 M Natriumperchloratlösung) benetzt. Dann wird eine elektrochemische Charakterisierung dieser derart beschichteten Elektrode mittels Cyclovoltammographie vorgenommen, bei der gegen eine Referenzelektrode eine Dreiecksspannung mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 100 mV/s appliziert wird. Die Amplitude der Dreiecksspannung wird so gewählt, daß das Polymer möglichst vollständig geladen und entladen wird, ohne daß es zu irreversiblen Effekten, wie Uberoxidationen kommt. Der über eine Halbperiode, also der ansteigenden oder abfallenden Flanke der Dreiecksspannung fließende Strom über die Zeit aufintegriert stellt die gesamte Ladungskapazität der Polymerschicht dar. Als Ladungskapazität bezeichnen wir die auf die Flächeneinheit bezogene gesamte Ladungskapazität. Bevorzugt sind Elektrolyte mit niedriger elektrischer Leitfähigkeit oder Zwitterionenpuffer, wie sie z.B. in Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4907 untersucht werden. Die aufgrund der Anreicherung erhöhte Immobilisierungsrate der passenden Zielmoleküle kann noch gesteigert werden durch die zeitweise Applikation einer repulsiven Spannung, die unspezifisch oder fehlerhaft belegte Fängerepitope wieder freilegt.
Die rein elektrophoretische Anreicherung kann unterstützt werden durch gleichzeitig oder alternierend vorgenommene Maßnahmen, die einer besseren Durchmischung des Elektrolyten oder einem Massentransport des Elektrolyten über die
Sensorpositionen hinweg dienen, wie sie in WO 98/02399 beschrieben werden. Das ebenfalls in WO 98/02399 beschriebene periodische Aufheizen der Elektrode kann die Immobilisierung beschleunigen.
Ganz allgemein können die elektrisch leitfähigen Polymerschichten dazu verwendet werden, elektrisch geladene Makromoleküle zu führen, zu dirigieren und an gewünschten Stellen zu verdichten. Wegen der milden Bedingungen können auch z.B. pH-Wert empfindliche Moleküle oder solche, die empfindliche gegenüber freien Radikalen sind, unbeschadet transportiert werden.
Zur Immobilisierung der aufkonzentrierten Biomoleküle (Fängermoleküle) kann das elektrisch leitfähige Polymer modifiziert werden, z.B. durch Einlagerung von Bindungsgruppen wie Avidin oder Streptavidin oder durch kovalente Funktionalisierung mit chemisch reaktiven Gruppen wie Carbonsäureestern oder Aminogruppen.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß Fängermoleküle schon an die Monomerbausteine des elektrisch leitfähigen Polymers kovalent gebunden werden wie z.B. beschrieben in Nucleic Acids Res. 22, (1994), 2915 oder Am. Chem. Soc, 119X1997), 7388. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das elektrisch leitfähige Polymer mit einer weiteren Schicht zu belegen, welche solche Bindungsstellen enthält. Beispiele für solche Schichten sind Agarose mit eingelagertem Avidin oder Streptavidin oder Polyacrylamid.
Eine wiederum andere Möglichkeit besteht darin, daß in unmittelbarer räumlicher Nähe der mit dem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Elektrode Flächen implementiert sind, auf denen unmittelbar oder über eine darauf befindliche Anbindungsschicht die Biomoleküle angebunden werden können. Diese Flächen können ihrerseits selbst Elektroden darstellen oder mit Elektroden unterlegt sein.
Zur Detektion der auf den zugehörigen Fängermolekülen immobilisierten Zielmolekülen kann eine ganze Reihe von Verfahren verwendet werden, wie Autoradiographie, optische Auslesung mittels Fluoreszenzspektroskopie, elektromechanische Verfahren (Quarzwaage) oder elektrische Detektionsverfahren.
Besonders vorteilhaft sind elektrische Ausleseverfahren, da sie apparativ weniger aufwendig und leichter zu miniaturisieren sind. Zudem bedürfen sie nicht notwendigerweise einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung der Moleküle. Außerdem ist die elektrische Auslesung universell bzgl. des Chipformates - unabhängig vom Chipformat ist eine direkte digitale Positionszuordnung möglich. Kumulierende Messungen und Wiederholungsmessungen, die wegen des Bleaching-Effektes bei Fluoreszenzdetektion problematisch werden können, können bei elektrischer Detektion problemlos durchgeführt werden.
Beispiele für elektrische Verfahren und Vorrichtungen dieser Art sind z. B. offenbart in WO 88/09499, EP 0543550, US 5653939, WO 97/21094 und WO 97/34140. Bei allen diesen Verfahren werden die zu detektierenden Moleküle entweder direkt auf oder zwischen den mit Elektroden bestückten Meßchip oder auf einer dafür vorgesehenen Schicht auf dem Chip immobilisiert. In US 5653939, WO 97/21094 und WO 97/34140 werden sehr feine, im sub-μm-Bereich strukturierte Elektroden beschrieben, die große Vorteile durch höhere Sensitivität bei der
Impedanzspektroskopie und dem Redox-Recycling besitzen. Die Methode des Redox-Recycling wird auch beschrieben in Sensors and Actυators B 26-27 (1995) 394-397.
Insbesondere bietet sich eine elektrische Detektion an, wenn man zum Zwecke der elektrisch beschleunigten Immobilisierung ohnehin mit Chipformaten arbeitet, die mit Elektroden versehen sind und an elektrische Steuereinheiten gekoppelt sind. Hier ergeben sich sowohl strukturelle (elektrische Kontakte, Leiterbahnen, Elektroden) als auch funktionelle (elektrische Signalgeneratoren und Meßinstrumente) Synergien.
Nachteil der z.B. in US 4787963 und WO 96/01836 geschilderten Verfahren und Vorrichtungen ist, daß mit den vorgeschlagenen Vorrichtungen eine Kopplung von elektrisch beschleunigter Immobilisierung und Hybridisierung auf der einen Seite und elektrischer Detektion auf der anderen Seite nicht oder nur in ungenügender Weise möglich ist. Dies liegt u.a. darin begründet, daß die beschleunigte Immobilisierung und Hybridisierung ein Fernhalten der zu detektierenden Moleküle von den Elektroden erfordert (Electrophoresis 2000, 21, 157-164), eine hohe Sensitivität beim Auslesen mittels Impedanzspektroskopie oder Redox-Recycling jedoch möglichst kleiner Elektrodenstrukturen im μm oder sub-μm-Bereich bedarf, wobei die zu detektierenden Moleküle möglichst nahe an der Elektrode immobilisiert werden müssen (Sensors and Actuators B 49, (1998) 73-80), um hohe Sensitivität zu erhalten.
In der vorliegenden Erfindung wird dieser Konflikt dadurch gelöst, daß zur elektrisch beschleunigten Immobilisierung keine Elektrolyse betrieben werden muß und die Biomoleküle in unmittelbarer Nähe der stromführenden Elektrode immobilisiert werden können. Es kann jedoch auch eine Arbeitsteilung vorgenommen werden zwischen einer Elektrode oder einem Satz von Elektroden
(Mobilisierungselektroden), die mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichtet sind und mit deren Hilfe die zu detektierenden Moleküle elektrophoretisch über der betreffenden Sensorposition angereichert werden mit der Folge einer beschleunigten Immobilisierung auf einem zweiten Satz von Elektroden (Sensorelektroden) auf derselben Sensorposition, der für eine hochsensitive Detektion genutzt wird.
Das Trägermaterial der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht vorzugsweise aus Silicium, Siliziumdioxid, Glas, Keramik oder Kunststoff, oder aus einem Verbund dieser Stoffe. In das Trägermaterial ist ein aktiver Halbleiterchip mit elektrischen Schaltkreisen oder mit CMOS-Bausteinen integriert.
Die Elektroden der erfindungsgemäßen Vorrichtung bestehen unabhängig voneinander aus metallischen Materialien wie Gold, Platin, Palladium, Silber, Kupfer, Aluminium oder aus Kohlenstoff.
Das auf wenigstens eine Elektrodenfläche aufgeschichtete elektrisch leitfähige Polymere wird vorzugsweise aus der Gruppe Polyacetylen, Polythiophen, Polypyrrol, Polyparaphenylen, Polyanilin oder Polyparaphenylenvinylen oder Modifikationen dieser Polymere ausgewählt. Das leitfähige Polymere kann auch funktionelle Gruppen zur Bindung von Makromolekülen enthalten, die physikalisch im leitfähigen Polymer eingeschlossen oder kovalent daran gebunden sein können. Bevorzugte funktionelle Gruppen sind Avidin oder Streptavidin. Es können auch als kovalent gebundene Gruppen Carbonsäuregruppen oder deren Derivate wie Aktivester oder Aminogruppen eingesetzt werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß Fängermoleküle schon an die Monomerbausteine des elektrisch leitfähigen Polymers kovalent gebunden werden wie z.B. beschrieben in Nucleic Acids Res. 22, (1994), 2915 oόer Am. Chem. Soc, 119, (1997), 7388. Eine Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass auf das elektrisch leitfähige Polymere eine Bindungsschicht aufgetragen wird, die elektrisch nicht leitfähig zu sein braucht, aber durchlässig für Wasser und kleine Ionen ist und die funktionelle Gruppen zur Anbindung von Makromolekülen enthält. Diese
Bindungsschicht kann vorzugsweise aus der Gruppe Agarose, Polyacrylamid oder Polyurethan ausgewählt werden.
Eine weitere Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass die Sensorpositionen wenigstens eine weitere Elektrodenfläche, sog. Sensorelektroden, aufweisen, die nicht mit einem elektrisch leitfähigen Polymeren beschichtet sind. Die Sensorelektroden sind vielmehr vorteilhafterweise direkt mit Makromolekülen bestückt, diese werden bei aus Gold bestehenden Sensorelektroden mit einer SH- Gruppe an die Elektrode gebunden. Die Sensorelektroden können aber auch mit einer Bindungsschicht belegt sein, die funktionelle Gruppen zur Anbindung von Makromolekülen enthält. Beispiele solcher Bindungsschichten sind Agarose, Polyacrylamid oder Polyurethan oder auch elektrisch leitfähige Polymere. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann so ausgestaltet sein, dass die mit dem elektrischen Polymeren belegten Elektroden und die Sensorelektroden zueinander höhenversetzt sind. Der Höhenversatz kann z.B. in der Größenordnung der Dicke des leitfähigen Polymers auf den Mobilisierungselektroden sein, wobei die Mobilisierungselektroden dabei vorzugsweise abgesenkt sind. Damit wird eine definierte laterale Ausdehnung der elektrischen Polymerschicht gewährleistet.
Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass die Sensorpositionen mit drei unabhängigen Elektroden, einer mit dem elektrischen Polymer beschichteten und zwei Sensorelektroden bestückt sind. Dabei bilden die beiden Sensorelektroden schmale, lange, fingerähnliche Strukturen mit einer Fingerbreite unter 2 μm. Wenn die Sensorelektroden Interdigitalelektroden darstellen, können zumindest einige Zwischenräume durch eine mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichtete Elektrode ausgefüllt werden. Die Sensorpositionen sind in einem zweidimensionalen Array angeordnet und weisen im Allgemeinen ein Rastermaß von 10 bis 1000 μm auf.
Die Elektroden der Sensorpositionen sind an eine elektrische Steuerungs- und Ausleseeinheit angekoppelt. Dazu werden in der Regel noch eine oder mehrere Gegenelektroden und eine Referenzelektrode benötigt, die sich unabhängig voneinander auf dem Chip oder an anderer Stelle befinden, wobei diese Stelle auch von dem Elektrolyten benetzt wird, so daß sie sich in einer elektrochemischen Verbindung zu den Elektroden der Sensorposition befinden. Als Referenzelektroden kommen Silber, Platin, Silber/Silberchlorid oder andere literaturbekannte Standardsysteme in Betracht. Auf dem Chip wird die Referenzelektrode bevorzugt flächig ausgebildet sein. Als Material für die Gegenelektrode kommen insbesondere und unabhängig von dieser alle Materialien in Frage, aus der auch die Mobilisierungselektrode bestehen kann. Bevorzugt besitzt die Gegenelektrode eine Fläche, die mindestens ebenso groß ist wie die der Mobilisierungselektrode, bei deren Beschichtung mittels Elektrodeposition sie als Gegenelektrode dient oder für die sie bei der elektrophoretischen Anreicherung als Gegenelektrode dient, ganz besonders bevorzugt ist eine Gegenelektrode mit einer noch wesentlich größeren Fläche mit z.B. dem zehn- oder hundertfachen Flächeninhalt der Mobilisierungselektrode. Für den Fall, daß gleichzeitig mehrere Mobilisierungselektroden cyclovoltammetrisch mit einem leitfähigen Polymer belegt werden sollen, ist es vorteilhaft, wenn die Gegenelektrode eine Fläche besitzt, die mindestens ebenso groß ist, wie die Gesamtfläche der zu beschichtenden Mobilisierungselektroden, ganz besonders bevorzugt ist eine noch größere Fläche. Als Gegenelektrode oder Gegenelektroden können jedoch auch Mobilisierungselektroden dienen, die selbst während des betrachteten Prozesses nicht beschichtet oder mit einer Anreicherung von Makromolekülen beaufschlagt werden sollen. Die Position der Gegenelektrode oder die Positionen der Gegenelektroden für die elektrophoretisch Anreicherung wird vorteilhaft so gewählt, daß ein möglichst großer Wirkungsradius entsteht. Dazu können die Gegenelektroden z.B. an der Peripherie des zu untersuchenden Elektrolyts liegen. Die Gegenelektroden für die Elektrodeposition und für die Anreicherung mittels Elektrophorese können natürlich verschieden gewählt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung muss Sensorpositionen aufweisen, die mit einem flüssigen Elektrolyten benetzt werden können, der die zu detektierenden Moleküle enthält. Das kann zweckmäßigerweise in einer Durchflusskammer stattfinden.
Schließlich kann die erfindungsgemäße Vorrichtung auch so ausgestaltet sein, dass die Sensorelektroden der verschiedenen Sensorpositionen selektiv mit Makromolekülen als spezifischen Erkennungssystemen bestückt sind.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnungen in den Figuren 1 bis 14 näher erläutert. Eine Beschränkung der Erfindung in irgendeiner Weise ist dadurch nicht beabsichtigt.
Es zeigt
Abb 1 : Prinzipaufbau des erfindungsgemäßen Biochips
Abb 2: Sensorfelder bei angelegtem elektrischem Feld an die Mobilisierungselektroden des mittleren Sensorfeldes
Abb 3: Ausschnitt aus einer Sensorposition mit Interdigital- und Mobilisierungselektroden
Abb. 4: Verschiedene Ausführungsformen des Höhenversatzes von Mobilisierungsund interdigitierenden Sensorelektroden Abb. 5: Potentiodynamische Polymerisation von 3,4-Ethylendioxythiophen auf Gold in Acetonitril (0,1 M NaCI04) - Film 1
Abb 6.: Cyclovoltammogramm von Poly(3,4-ethylendioxythiophen) - Film 1 auf Gold in Acetonitril (0,1 M NaCI04)
Abb. 7.: Cyclovoltammogramm von Poly(3,4-ethylendioxythiophen) - Film 2 auf Gold in Acetonitril (0,1 M NaCI04)
Abb. 8: Potentiodynamische Polymerisation von 3,4-Ethylendioxythiophen auf Platin in wässriger Lösung (0,1 M NaCI0 )
Abb. 9: Mikroskopische Aufnahme einer poly(3,4-ethylendioxythiophen)- beschichteten Platinelektrode (dunkles Feld)
AbbJO: Cyclovoltamogramm von Poly(3,4-ethylendioxythiophen) - auf Platin in wässriger Lösung (0,1 M NaCI04) bei verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten
Abb. 11 : Aufgeprägter Strom mit resultierender Spannung und Fluoreszenzintensität bei einer mit PoIy(3,4-ethylendioxythiophen) beschichteten Platinelektrode
Abb. 12: Aufgeprägter Strom mit resultierender Spannung und Fluoreszenzintensität bei einer unbeschichteten Platinelektrode
Abb. 13: Aufgeprägter Strom mit resultierender Spannung und Fluoreszenzintensität bei einer mit Poly(3,4-ethylendioxythiophen) beschichteten Platinelektrode nach Belastung durch Ladungs- und Entladungszyklen Abb. 14: Aufgeprägter Strom mit resultierender Spannung und Fluoreszenzintensität bei einer unbeschichteten Platinelektrode
Abb. 1 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung . Auf einem festen Träger (1) und einer darüberliegenden Isolationsschicht (2) befinden sich sogenannte Mobilisierungs-elektroden (3) und Detektions- oder Sensorelektroden (4). Über den Mobilisierungs-elektroden befindet sich eine elektrisch leitfähige Polymerschicht (5). AbbJ zeigt auch einen vergrößerten Ausschnitt eines Satzes der Mobilisierungsund Sensorelektroden.
Abb. 2 illustriert, wie bei Beaufschlagung des mittleren Satzes von Mobilisierungselektroden mit einem geeigneten elektrischen Potential der darüberliegende Bereich des Elektrolyten (6) mit den zu detektierenden Molekülen angereichert (7) wird.
Zur Detektion der immobilisierten Molekülen können neben elektrochemischen bzw. elektrischen auch optische, elektromechanische oder radiometrische Verfahren eingesetzt werden. Gegebenenfalls können die zu detektierenden Moleküle auch mit elektrisch aktiven Labein oder elektrisch aktiven Reportergruppen, wie Ferrocen, PQQ oder Porphyrine markiert werden, um die Sensitivität der elektrochemischen oder elektrischen Analyse zu erhöhen. Bevorzugt werden die zu detektierenden Moleküle auf den Sensorelektroden immobilisiert.
Bevorzugt erfolgt die Detektion elektrisch bzw. elektrochemisch, z.B. mittels Cyclovoltammetrie, ganz besonders bevorzugt sind dabei die Impedanzanalyse und das Redox-Recycling.
Bei der Impedanzanalyse wird bevorzugt die Impedanzspektroskopie verwendet. Dabei wird an die Sensorelektroden eine Wechselspannung unterschiedlicher Frequenz angelegt. Die Frequenz der Wechselspannung sowie die Stärke der angelegten Wechselspannung sind frei wählbar . Ein typischer Frequenzbereich geht dabei von 0,1 Hz bis 20 MHz, bevorzugt ist ein Bereich von 1 Hz bis 5 MHz. Ein typischer Spannungsbereich reicht von 0,1 mV bis zu 10 V, bevorzugt ist hier 1 bis 100 mV. Ebenso frei wählbar ist die geometrische Anordnung und Größe der Elektroden, durch die auch die Wahl der vorteilhaftesten Frequenz und Spannung gesteuert werden kann. Gegebenenfalls können die zu detektierenden Moleküle auch mit elektrisch aktiven Labein markiert werden, um die Sensitivität der Impedanzanalyse zu erhöhen.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellen die Sensorelektroden sog. Interdigitalelektroden da, die sich durch besonders hohe Sensitivität auszeichnen (Sensors & Actuators B49 (1998) 73-80).
Abb.3 zeigt eine solche Ausführungsform für das in AbbJ gezeigte Beispiel in Seitenansicht und in Aufsicht. Die Sensorelektroden (1 ) ragen fingerförmig ineinander, wobei benachbarte Finger elektrisch gegeneinander geschaltet werden können. Sie sind getrennt durch isolierende Bereiche und eine oder mehrere Mobilisierungs-elektroden. Die Mobilisierungselektroden sind mit einer elektrisch leitfähigen Polymerschicht (2) belegt, die zur Sichtbarmachung der Mobilisierungselektrode (3) teilweise freigelegt wurde.
In Abb.4(a) bis (c) sind verschiedene Ausführungsformen des Höhenversatzes von Mobilisierungs- und interdigitierenden Sensorelektroden illustriert. In (a) wird eine Isolationsschicht, z.B. (photostrukturierbares) Polyimid (2) auf die durchgehende Mobilisierungselektrode (1) aufgebracht, photostrukturiert und die erhabenen Bereiche metallisiert (3). Die laterale Strukturierung kann auch auf andere in der Photolitographie übliche Weisen geschehen. So kann z.B. auch die zunächst noch unstrukturiert auf der Mobilisierungselektrode aufgebrachte Isolationsschicht metallisiert werden und anschließend Metallschicht und Isolationsschicht durch photolithographische Verfahren strukturiert werden. Abb.4(b) zeigt eine Ausführungsform bei der die Mobilisierungselektrode (1) strukturiert ist und nicht mit Mobilisierungselektrode belegte Bereiche (2) mit einem von der Mobilisierungselektrode isolierten leitfähigen Steg (3) versehen sind, auf dem eine aus geeignetem Material bestehende leitfähige Beschichtung (4) aufgebracht ist.
Abb.4(c) zeigt die Möglichkeit der Erzielung eines Höhenversatzes durch Vertiefungen (1) in der Si02-Schicht, die die Oberseite des Chips vom Si-Substrat isoliert. Solche Vertiefungen können z.B. in die Si02-Schicht geätzt werden. In den Vertiefungen liegen die Mobilisierungselektroden (2) während sich die Sensorelektroden (3) auf den erhabenen Stellen befinden.
Abb.4(d) stellt eine Ausführungsform dar, bei der mehrere interdigitierende Finger (1) auf einer erhabenen Stelle (2) ohne zwischenliegende Mobilisierungselektrode (3) eng benachbart nebeneinander angeordnet sind. Diese Variante ist besonders bevorzugt bei Anwendungen, bei denen es auf hohe Sensitivität ankommt und auch besonders bevorzugt beim Redox-Recycling. Die Anzahl der unmittelbar benachbarten Finger kann dabei beliebig gewählt werden, besonders bevorzugt ist eine Anzahl von 1 bis 10 Finger.
Die Aufbringung der elektrisch leitenden Polymerschicht erfolgt bevorzugt durch Eiektropolymerisation. Bestehen Mobilisierungs- und Sensorelektroden aus verschiedenen metallischen Materialien, kann deren selektives Bindungsverhalten zu einer selektiven Aufbringung einer elektrisch leitfähigen Polymerschicht genutzt werden. Eine photolitographische Strukturierung kann z.B. durch ein lift-off-Verfahren oder durch eine direkte Strukturierung einer photoempfindlichen elektrisch leitfähigen Polymerschicht vorgenommen werden. Es kann auch eine photoinduzierte Polymerisation von geeigneten Mono- und Oligomeren zur strukturierten Belegung des Chips mit einer elektrisch leitfähigen Polymerschicht verwendet werden. Dabei wird der ganze Chip z.B. mittels Spin Coating mit einer Lösung beschichtet, die neben einem polymerisierbaren Baustein eine photosensitive Initiatorkomponente zur Polymerisation enthält. Eine Belichtung mittels entsprechender Masken führt dann zu einer lateral strukturierten Polymerisation. Die nicht polymerisierten Bereiche werden dann mit einem geeigneten Lösungsmittel von den nicht polymerisierten Monomer- oder Oligomerbausteinen befreit.
Die Anbindung von Fängermolekülen kann direkt auf den Sensorelektroden erfolgen über funktionelle Gruppen, die kovalent an die Fängermoleküle gebunden sind, wie Thiollinkern bei Elektroden aus Gold oder über eine vorausgeschaltete Funktionalisierung der Metalloberfläche z.B. in Form von Aminopropyltriethoxysilan an das mit Aktivester funktionalisierte Fängermoleküle gebunden werden.
Eine gegebenenfalls verbleibende Aufnahmekapazität der Elektrodenoberfläche nach Anbindung der Fängermoleküle kann vollständig mit Molekülen abgesättigt werden, die in den folgenden Schritten keine Bindung mit Molekülen eingehen, die mit der Sensorposition in Kontakt kommen, so daß keine weiteren unspezifischen Bindungen an die Elektrode möglich sind. Diese Moleküle sind vorzugsweise sehr reaktiv, was die Anbindung an die Elektrode betrifft, damit möglichst alle verbleibenden freien Reaktionsstellen besetzt werden und sie sind vorzugsweise kleiner als die eigentlichen Fängermoleküle, um den nachfolgenden Erkennungsprozeß nicht zu stören.
Für die Immobilisierung von Nukleinsäuren aufgrund von Hybridisierung mit passenden Fängeroligonukleotiden auf der Sensorposition wird vorzugsweise ein hochohmiger Elektrolyt gewählt, der zu höherer strominduzierter Verdichtung der Nukleinsäuren in der Nähe der Sensorposition führt. Andererseits muß der Elektrolyt natürlich den Hybridisierungsprozeß stützen. Beispiele solcher Puffer sind niedrigkonzentrierte Standardpuffer, wie Phosphatpuffer oder Zwitterionenpuffer, wie Histidin. Für die praktische Anwendung ist es von besonderem Vorteil, wenn die Schmelztemperatur der hybridisierten Oligonukleotide in dem gewählten Elektrolyten genügend stabil ist. Bei den Versuchen hat sich gezeigt, dass Mg++ als Kationen besonders geeignet sind, die Duplexe zu stabilisieren und die Hybridisierung zu beschleunigen, ohne die elektrische Leitfähigkeit des Elektrolyten sehr stark zu erhöhen. Im Beispiel 5 wird gezeigt, wie der Elektrolyt für die verschiedenen Anforderungen optimiert werden kann.
Im Falle der elektrisch beschleunigten Hybridisierung von (anionischen) Nukleinsäuren kann man zur Verminderung des Anteils der anderen Anionen im Elektrolyt am elektrischen Strom im Vergleich zu den Nukleinsäuren Elektrolyten verwenden mit Anionen, die besonders geringe Beweglichkeiten aufweisen. Dazu können z.B. Elektrolyte eingesetzt werden mit besonders großem Molekulargewicht der Anionen, wie Borate, Tartrate, Citrate oder mit an mikroskopische Kügelchen gebundene Anionen, wie mit Carboxylatgruppen versehene Polystyrolbeads.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur beschleunigten Immobilisierung von Makromolekülen umfaßt in einer Ausführungsform die folgenden Schritte:
a) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition mit wenigstens einer mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Elektrode, wobei das Polymer so ausgebildet ist, dass es die zu detektierenden Makromoleküle spezifisch oder unspezifisch binden kann; b) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, der die zu immobilisierenden Makromoleküle in gelöster Form enthält oder enthalten könnte; c) Beaufschlagung der mit dem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Elektrode mit einem genügend hohen Potential geeigneter Polarität zur Verdichtung der geladenen Makromoleküle in der unmittelbaren Umgebung der Sensorposition; d) Immobilisierung der zu detektierenden Makromoleküle am elektrisch leitfähigen Polymer.
In einer modifizierten Ausführungsform befinden sich die Bindungsstellen für die zu immobilisierenden Makromoleküle nicht direkt im elektrisch leitfähigen Polymer, sondern in einer weiteren Schicht, mit der das elektrisch leitfähige Polymer beschichtet ist. Diese Schicht muß durchlässig sein für Wasser und kleine Ionen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform geschieht die Detektion der Makromoleküle ebenfalls durch eine elektrische Methode, entweder mittels benachbarter Sensorelektroden, was beim Redox Recycling ganz besonders bevorzugt ist oder mittels derselben Elektrode, was bei Cyclovoltammetrie Impedanzanalyse ganz besonders bevorzugt ist, im letzteren Fall insbesondere bei der Impedanzspektroskopie.
Eine weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Immobilisierung von Makromolekülen umfaßt die folgenden Schritte:
e) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition mit wenigstens einer mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten
Mobilisierungselektrode und einer Sensorelektrode an die die Makromoleküle unspezifisch oder spezifisch anbinden können; f) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, der die zu immobilisierenden Makromoleküle in gelöster Form enthält oder enthalten könnte; g) Beaufschlagung der mit dem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Elektrode mit einem genügend hohen Potential geeigneter Polarität zur Verdichtung der geladenen Makromoleküle in der unmittelbaren Umgebung der Sensorposition; h) Immobilisierung der zu detektierenden Makromoleküle auf der/den
Sensorelektroden, entweder direkt oder auf einer auf den Sensorelektroden befindlichen Bindungsschicht.
Insbesondere kann eine solche Schicht auch aus einer ersten Lage von immobilisierten Makromolekülen bestehen, die eine zweite Lage von Makromolekülen spezifisch binden kann.
Schritt h) dieses Verfahrens ergibt sich in der Regel als Folge der Durchführung der Schritte e) bis g), wobei sich nach Schritt g) gegebenenfalls eine Wartezeit zur Erhöhung der Anzahl der immobilisierten Moleküle anschließen kann. Erforderlichenfalls wird Schritt g) mehrfach wiederholt, wobei das elektrisch leitende Polymere jeweils vorher zu regenerieren (also zu entladen oder zu beladen) ist.
Die Detektion der immobilisierten Makromomoleküle geschieht mit Hilfe der mit den Makromolekülen belegten Sensorelektroden elektrisch, ganz besonders bevorzugt sind dabei die Methoden des Redox-Recyclings, der Cyclovoltametrie und der Impedanzanalyse, im letzteren Fall insbesondere der Impedanzspektroskopie
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur elektrisch gestützten spezifischen Selektion von Makromolekülen, umfassend die Schritte: i) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition mit wenigstens einer mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Elektrode, wobei das Polymer so ausgebildet ist, dass es die zu detektierenden Makromoleküle (Zielmoleküle) spezifisch an eine erste Sorte von Makromolekülen
(Fängermoleküle), binden kann; ii) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, der gegebenenfalls die zu immobilisierenden Zielmoleküle in gelöster Form enthält oder enthalten könnte; iii) Immobilisierung einer zweiten Sorte von Makromolekülen, die gegebenenfalls unterschiedliche Spezies umfassen kann, und die die Zielmoleküle enthält oder enthalten kann, an den spezifischen Bindungsstellen im elektrisch leitfähigen Polymer; iv) Beaufschlagung der Elektroden mit einem genügend hohen elektrischen Potential geeigneter Polarität und genügend langer Dauer, gegebenenfalls auch pulsierend, zur Lösung aller Bindungen von Makromolekülen der zweiten Sorte, die keine Zielmoleküle sind, auf der Sensorposition.
Enthält der Elektrolyt keine Zielmoleküle, so werden durch Schritt iv) alle gebundenen Makromoleküle wieder gelöst.
Enthält der Elektrolyt Zielmoleküle, so werden durch Schritt iv) nur diejenigen gebundenen Makromoleküle wieder gelöst, die keine Zielmoleküle sind; d.h., nur die Moleküle mit den stärksten Bindungen verbleiben auf der Sensorposition.
Die Bindungsstärke der zu detektierenden Zielmoleküle wird zweckmäßigerweise durch Vergleich mit einem Referenzelektrolyten ermittelt, der als Makromolekül der zweiten Sorte ausschließlich das Zielmolekül enthält.
Die spezifischen Bindungsstellen auf dem elektrisch leitfähigen Polymer werden in der Regel durch eine immobilisierte erste Sorte von Makromolekülen (Fängermoleküle) gebildet, die z.B. mittels eines Dispensers oder mittels der weiter oben beschriebenen elektrisch beschleunigten Immobilisierung an das elektrische Polymer gebunden werden können.
Bevorzugt werden die Zielmoleküle mittels elektrisch beschleunigter Immobilisierung an die Fängermoleküle gebunden bevor die oben beschriebene spezifische Selektion von Zielmolekülen vorgenommen wird. In einer modifizierten Ausführungsform befinden sich die Bindungsstellen für die zu immobilisierende erste Sorte von Makromolekülen nicht direkt im elektrisch leitfähigen Polymer, sondern in einer weiteren Schicht, mit der das elektrisch leitfähige Polymer beschichtet ist. Diese Schicht muß durchlässig sein für Wasser und kleine Ionen.
Eine weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur elektrisch gestützten spezifischen
Selektion von Makromolekülen umfaßt folgende Schritte: v) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition mit wenigstens einer mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten
Mobilisierungselektrode und einer Sensorelektrode an die die Makromoleküle spezifisch anbinden können vi) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, der die zu immobilisierenden Makromoleküle in gelöster Form enthält vii) Immobilisierung der zu detektierenden Makromoleküle (Zielmoleküle) auf der/den Sensorelektroden, entweder direkt oder auf einer auf den Sensorelektroden befindlichen Bindungsschicht. Insbesondere kann eine solche Schicht auch aus einer ersten Lage von immobilisierten Makromolekülen bestehen, die eine zweite Lage von Makromolekülen, die neben den Zielmolekülen gegebenenfalls weitere Spezies enthalten kann, spezifisch binden kann viii) Beaufschlagung der Sensorelektroden mit einem genügend hohen elektrischen Potential geeigneter Polarität und genügend langer Dauer, gegebenenfalls auch pulsierend, zur Lösung aller Bindungen von Makromolekülen der zweiten Lage auf der Sensorposition bis auf die
Bindungen mit der höchsten Bindungsstärke.
Enthält der Elektrolyt keine Zielmoleküle, so werden durch Schritt viii) alle gebundenen Makromoleküle wieder gelöst. Die spezifischen Bindungsstellen auf den Sensorelektroden werden in der Regel durch eine immobilisierte erste Sorte von Makromolekülen (Fängermoleküle) gebildet, die z.B. mittels eines Dispensers oder mittels der weiter oben beschriebenen elektrisch beschleunigten Immobilisierung an die Sensorelektroden gebunden werden können.
Bevorzugt werden die Zielmoleküle mittels elektrisch beschleunigter Immobilisierung an die Fängermoleküle gebunden bevor die oben beschriebene elektrisch gestützte spezifische Selektion vorgenommen wird.
Die Lösung der unerwünschten Bindungen (alle bis auf die mit der höchsten Bindungsenergie) kann auch durch Beaufschlagung der Mobilisierungselektrode mit einem geeigneten elektrischen Potential geschehen oder dadurch unterstützt werden.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 :
Abscheidung eines elektrisch leitfähiqen Poivmerfilms auf einer Goldelektrode
Als Arbeitselektroden wurde eine Goldelektrode (CH Instruments, Inc., TX, USA, 0 2 mm) verwendet. Als Referenzelektrode diente ein Silberdraht. Die Gegenelektrode bestand aus einem Platindraht. Vor Benutzung wurde die Oberfläche der Arbeitselektrode mit einer 0.3 μm-Tonerde-Suspension poliert und mit Millipore-Wasser gespült. Anschließend wurde die Elektrodenoberfäche elektrochemisch in 0.2 M NaOH-Lösung gereinigt. Dazu wurde die Elektrode cyclovoltammetrisch mit 5 Potentialzyklen zwischen - 0.5 V und + 1.8 V (gegen die Silber-Referenzelektrode) und anschließend mit 3 Potentialzyklen zwischen - 0.3 V und + 1.1 V jeweils bei einer Vorschubgeschwindigkeit von 50 mV/s behandelt. Das elektrisch leitfähige Polymer wurde potentiodynamisch auf der Oberfläche der Arbeitselektrode abgeschieden. Dazu wurde eine herkömmliche elektrochemische Zelle mit einer Dreielektrodenanordnung verwendet. Als Potentiostat diente eine IM6-Workstation (Zahner-Meßtechnik, Kronach, Deutschland). Der Elektrolyt bestand aus einer 0J M Lösung von Natriumperchlorat in Acetonitril. Das Zellvolumen betrug 2 ml. Als Monomer wurden 8 mg 3,4-Ethylendioxythiophen (Baytron M, Bayer AG, Leverkusen, CAS: 126213-50-1) zum Elektrolyten hinzugegeben (entsprechend einer 0.028 molaren Lösung).
Mittels 30 Potentialzyklen zwischen - 0.4 und + 1.1 V wurde bei einer Vorschubgeschwindigkeit von 100 mV/s ein dunkelblauer Poly(3,4-ethylendioxythiophen)-Film (Leitfähigkeit: - 200 mS/cm [Q. Pei, G. Zuccarello, M. Ahlskog, O. Inganäs, Polymer 1994, 35, 1347-1351]) auf der Arbeitselektrode abgeschieden (Film 1). Im Cyclovoltammogramm kann die Bildung des Polymerfilms anhand des Stromanstiegs nach jedem Zyklus verfolgt werden (Abb. 5).
Mit demselben Verfahren wurde mittels 10 Zyklen ein dünnerer Polymerfilm auf der Elektrode abgeschieden (Film 2).
Elektrochemische Charakterisierung des leitfähiqen Poivmerfilms
Die modifizierte Arbeitselektrode (mit Film 1) wurde mit Acetonitril gespült. Die Charakterisierung erfolgte in monomerfreier Elektrolytlösung (Acetonitril, 0J M Natriumperchlorat). Die Lösung wurde vor der Messung 5 Minuten mit Argon entgast. Es wurden Cyclovoltammogramme bei verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten (50 bis 250 mV/s) in einem Potentialbereich von - 0.6 V bis + 0.7 V aufgenommen. Der Strom variiert dabei linear mit der Vorschubgeschwindigkeit, und zeigt damit das Vorliegen eines Oberflächenfilms auf der Elektrode. Bei einer Vorschubgeschwindigkeit von 100 mV/s erhielt man einen Peakstrom des Polymerfilms von etwa 40 μA (Abb. 6). Auf gleiche Weise wurde die mit Film 2 modifizierte Goldelektrode behandelt. In diesem Fall beträgt der Peakstrom etwa 20 μA (Abb. 7)
Beispiel 2:
Abscheidunq eines elektrisch leitfähigen Polymers auf einem Siliziumchip mit Platinelektroden
Einer kommerziell erhältlichen Kartusche der Firma Nanogen, Inc., San Diego, USA (NanoChip™ cartridge) wurde der Biochip entnommen und die Beschichtung über den Platinelektroden entfernt. Dazu wurde der Chip in 1 M H2S04 getaucht und bei 80 °C für 30 Minuten mit Ultraschall behandelt. Der Chip wurde danach mit Wasser gespült. Zum Abschluß wurde noch mehrere Male mit abs. Ethanol gespült und der Chip im Argonstrom getrocknet. Die Chipoberfläche wurde mit einem Mikroskop überprüft; bei Rückständen der Beschichtung wurde die Reinigungsprozedur wiederholt.
Die Präparation des Polymerfilms auf den Platinelektroden des Biochips erfolgte in wässriger Lösung mit 0J M Natriumperchlorat als Elektrolyt. Durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (0,07 M) unter Rühren wurde das 3,4-Ethylendioxythiophen (0.015 M) in eine Dispersion überführt und einer Polymerisation zugänglich gemacht. Die Dispersion wurde in eine Durchflußzelle zur Benetzung des Biochips eingespeist. Die Durchflußzelle ist so ausgelegt, daß sie eine elektrische Kontaktierung des Chips zuläßt. Eine kleine Platinelektrode wurde als Arbeits- und ein größeres im Außenbereich des Chips liegendes Segment als Gegenelektrode geschaltet. Über eine Zuleitung für den Elektrolyten wurde ein Silberdraht als Referenzelektrode eingebracht. Die potentiodynamische Polymerbildung erfolgte mit 15 Potentialzyklen in einem Potentialbereich von - 0.4 V bis + 0.9 V bei einer Vorschubgeschwindigkeit von 100 mV/s (Abb. 8). Charakterisierung des leitfähiqen Poivmerfilms
Unter dem Mikroskop war die Arbeitselektrode infolge des aufgebrachten dunkelblauen Polymerfilms eindeutig von den freien Platinelektroden unterscheidbar (Abb. 9). Die elektrochemische Charakterisierung dieser derart beschichteten Elektrode erfolgte in monomerfreiem Elektrolyt (wässrige 0J M Natriumperchloratlösung). Dazu wurden 5 Potentialzyklen zwischen - 0.5 V und + 0.8 V bei unterschiedlichen Vorschubgeschwindigkeiten (50, 100, 150, 200, 250 mV/s) aufgenommen. Der Peakstrom variiert linear mit der Vorschubgeschwindigkeit und bestätigt das Vorliegen eines Oberflächenfilms (Abb. 10).
Elektrisch induzierte Verdichtung von Oligonukleotiden an der Arbeitselektrode Die in Abb. 9 gezeigte mit Polymer belegte Elektrode wurde zusammen mit dem Feld der umgebenden unbelegten Elektroden mittels einer transparenten Durchflußzelle mit einer 1 μM Lösung des mit dem am 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff Texas Red markierten Oligonukleotids: 5' - CCA TTT TCA GAA TTG GGT GT - 3' in Wasser benetzt. Über eine Zuleitung für die Lösung wurde ein Silberdraht als Referenzelektrode eingebracht. Die Elektroden wurden an die IM6-Workstation angeschlossen und in Auflicht im Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axioplan) mit den für Texas Red passenden Anregungs- und Emissionsfarbfiltern untersucht. Über einen Photomultiplyer wurde die Intensität des Fluoreszenzsignals aus einem mittels Meßfeldblende ausschließlich auf die betrachtete Elektrode fokussierten Meßfeld gemessen.
Bei Applikation eines symmetrischen Rechteckpotentials der Amplitude 0,5 V und nach Dunkelstromabzug wurde für die mit Polymerschicht belegte Elektrode bei
Vorliegen des negativen Potentialwertes eine Intensität von 20 SKT (Skalenteile) und bei Vorliegen des positiven Potentialwertes eine Intensität von 640 SKT gemessen. Für eine benachbarte identische, jedoch ohne Polymer beschichtete Elektrode wurden als entsprechende Werte 35 bzw. 150 gemessen. Der Intensitätsquotient für positives und negatives Potential war mithin bei der polymerbeschichteten Elektrode um den Faktor 7,5 größer und damit entsprechend auch die Verdichtung bzw. Verarmung der Oligonukleotide an der Elektrode.
Beispiel 3:
Elektrophoretische Anreicherung eines Oligonukleotids über einer mit einem elektrisch leitfähiqen Polymer beschichteten Platinelektrode unter qalvanostatischen Bedingungen
In diesem Beispiel wurden Platinelektroden mit einer Fläche von ca. 0,005 mm2 beschichtet. Wie im Beispiel 2 erfolgte die Präparation des Polymerfilms in wässriger Lösung mit 0.1 M Natriumperchlorat als Elektrolyt. Durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (0,07 M) unter Rühren wurde das 3,4-Ethylendioxythiophen (0.02 M) in eine Dispersion überführt und einer Polymerisation zugänglich gemacht. Die Dispersion wurde in eine Durchflußzelle zur Benetzung des Biochips eingespeist. Die Durchflußzelle ist so ausgelegt, daß sie eine elektrische Kontaktierung des Chips zuläßt. Eine kleine Platinelektrode wurde als Arbeits- und ein größeres im Außenbereich des Chips liegendes Segment als Gegenelektrode geschaltet. Über eine Zuleitung für den Elektrolyten wurde ein Silberdraht als Referenzelektrode eingebracht. Die potentiodynamische Polymerbildung erfolgte mit 35 Potentialzyklen in einem Potentialbereich von - 0.4 V bis + 0.9 V bei einer Vorschubgeschwindigkeit von 100 mV/s.
Charakterisierung des leitfähigen Poivmerfilms
Unter dem Mikroskop war die Arbeitselektrode infolge des aufgebrachten dunkelblauen Polymerfilms eindeutig von den freien Platinelektroden .unterscheidbar. Die elektrochemische Charakterisierung dieser derart beschichteten Elektrode erfolgte in monomerfreiem Elektrolyt (wässrige 0J M Natriumperchloratlösung). Dazu wurden einige Potentialzyklen zwischen - 0.5 V und + 0.6 V bei einer Vorschubgeschwindigkeit von 100 mV/s aufgenommen. Der durch die Spannungsänderung induzierte Strom betrug dabei ca. +200 nA beim aufsteigenden und -200 nA beim fallenden Ast. Dies entspricht einer Ladungskapazität von etwa 0,5 mC/mm2. Unter der Annahme, daß ein Ladungsträger je vier Monomereinheiten für die Oxidation zur Verfügung steht und das Polymer eine Dichte von etwa 1 g/cm3 besitzt, läßt sich eine Dicke von 2 bis 3 μm abschätzen.
Elektrisch induzierte Verdichtung von Oligonukleotiden an der Arbeitselektrode Die mit Polymer belegte Elektrode wurde zusammen mit den umgebenden unbelegten Elektroden mittels einer transparenten Durchflußzelle mit einer 1μM Lösung des mit dem am 5'-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff Texas Red markierten Oligonukleotids: 5' - CCA TTT TCA GAA TTG GGT GT - 3' benetzt. Um gute Hybridisierungsbedingungen zu simulieren, wurde als Elektrolyt eine 50 mM Lösung von L-Histidin verwendet (Nucleic Acids Research, 1997, 25, 4907). Die Größe der Durchflußkammer betrug etwa 0,5μL bei einer Höhe über den Elektroden von ca. 70 μm. Über eine Zuleitung für die Lösung wurde ein Silberdraht als Referenzelektrode eingebracht. Die Elektroden wurden an die IM6-Workstation angeschlossen und optisch in Auflicht im Fluoreszenzmikroskop (Zeiss Axioplan) mit den für Texas Red passenden Anregungs- und Emissionsfarbfiltern untersucht. Über einen Photomultiplyer wurde die Intensität des Fluoreszenzsignals aus einem mittels Meßfeldblende ausschließlich auf die betrachtete Elektrode fokussierten Meßfeld gemessen. Als elektrisches Signal wurde zur Anziehung der TR-markierten Oligonukleotide zunächst für 30 s ein Strom von 50 nA zwischen Arbeits- und Gegenelektrode angelegt. Nach 30 s wurde der Strom dann auf -50 nA umgepolt und nach weiteren 30 s wieder auf 0 gebracht. Während der ganzen Zeit wurde die Spannung zwischen Arbeits- und Referenzelektrode und das Signal des Photomultiplyers registriert. Das Ergebnis ist in Abb. 11 dargestellt; die Pfeile geben den Achsenbezug der drei Kurven an. Die Spannung erreichte einen Maximalwert von ca. +1 V und einen Minimalwert von ca. -0,5V. In keinem Fall trat Elektrolyse auf. Die Anreicherung ist erkennbar an dem Wert der Fluoreszenzintensität, der vom Neutralwert auf ca. den 10-fachen Wert ansteigt und im repulsiven Fall auf ca. 1/10 des Neutralwertes abfällt. Die Anreicherung und Verarmung unmittelbar über der Elektrode ist noch ausgeprägter, da man berücksichtigen muß, daß die gemessene Fluoreszenzintensität den Gesamtwert einer ca. 70μm hohe Säule über der Elektrode darstellt und der elektrodenferne Teil dieser Säule einen wesentlich weniger ausgeprägten Fluoreszenzhub zeigt als der elektrodennahe Teil.
Vergleichsbeispiel 1 :
Elektrophoretische Anreicherung eines Oligonukleotids über einer unbeschichteten Platinelektrode unter galvanostatischen Bedingungen Dieselbe experimentelle Anordnung für die elektrisch induzierte Verdichtung von Oligonukleotiden an der Arbeitselektrode wie in Beispiel 3 wurde an einer unbeschichteten Elektrode desselben Chips gemacht. Das Ergebnis zeigt Abb. 12 mit einer Achsenzuordnung zu den Kurven analog AbbJ 1. Wie zu erwarten, stieg die Spannung auf ca. + 1 ,6V an und fiel nach Stromumpolung auf -0,7V, was die elektrolytische Zersetzung der wässrigen Lösung an der Platinoberfläche anzeigt. Die Anreicherung und Verarmung an TR-markierten Oligonukleotiden verhielt sich analog zu Beispiel 1.
Beispiel 4:
Elektrophoretische Anreicherung eines Oligonukleotids über einer mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Platinelektrode unter galvanostatischen Bedingungen nach Belastung mit Redox-Zyklen
Um zu überprüfen, ob das Polymer genügend stabil gegenüber Belastungen durch Ladungs- und Entladungsvorgängen ist, wurde es einer Anzahl von Redox-Zyklen ausgesetzt und dann wieder galvanostatisch untersucht, analog Beispiel 3, nur daß vor Umpolung des Stromes das System zunächst stromlos geschaltet wurde. Das Ergebnis des Versuchs ist in Abb. 13 dargestellt. Die Spannung stieg zwar stärker an und fiel weiter ab als im unbelasteten Zustand - eine Zeichen dafür, daß die Ladungskapazität durch die Belastung geringer geworden ist - dennoch trat wieder keine Elektrolyse auf und die Anreicherung und Verarmung an Oligonukleotiden war ähnlich effektiv.
Vergleichsbeispiel 2:
Elektrophoretische Anreicherung eines Oligonukleotids über einer unbeschichteten Platinelektrode unter galvanostatischen Bedingungen
Dieselbe experimentelle Anordnung für die elektrisch induzierte Verdichtung von Oligonukleotiden an der Arbeitselektrode wie in Beispiel 4 wurde an einer unbeschichteten Elektrode desselben Chips gemacht. Das Ergebnis war praktisch dasselbe wie in Vergleichsbeispiel 1, wie AbbJ 4 zeigt. Spannungen von ca. + 1 ,6V an und-0,7V zeigen wieder die elektrolytische Zersetzung der wässrigen Lösung an der Platinoberfläche an.
Beispiel 5:
Die beiden komplementären Oligonukleotid-Einzelstränge
5'-CCA TTT TCA GAA TTG GGT GT-5' und
3'-GGT AAA AGT CTT AAC CCA CA-5'
wurden in einer Konzentration von je 1 ,3 μM in verschiedenen Elektrolyten gelöst. Sodann wurden gemessen:
- die elektrische Leitfähigkeit mit Hilfe einer Meßküvette
- die Hybridisierungsgeschwindigkeit bei Raumtemperatur mit Hilfe der Zeitabhängigkeit der Absorption bei 260 nm (Stop Flow Methode) und
- die Schmelztemperatur aufgrund der Temperaturabhängigkeit der Absorption bei 260 nm Die Ergebnisse für vier verschiedene Elektrolyte sind in Tabelle 1 zusammengefaßt, wobei die Bezeichnungen für folgende Elektrolyte stehen:
A HO mM NaCI
Figure imgf000035_0001
D 0,1 mM Mg(CI04)2 + 10 mM Histidin
Der optimale Elektrolyt ist dann im Einzelfall zu wählen. Vorteilhaft ist eine Mg++- lonenkonzentration zwischen 0,02 und 10 mM, besonders vorteilhaft eine solche zwischen 0,1 und 1 mM. Der Wert der Hybridisierungsrate für Elektrolyt A wurde nicht selbst gemessen , sondern aus Literaturwerten (z.B. J. Mol. Biol. (1971), 62, 361-381 , Biochemistry, 1995, 34, 9774-9783) abgeschätzt.
Die folgende Tabelle 1 zeigt charakteristische Werte für die einzelnen Elektrolyten
Figure imgf000035_0002
Elektrische Leitfähigkeit, Schmelztemperatur und Hybridisierungsrate für ein komplementäres Oligonukleotidpaar in verschiedenen Elektrolyten

Claims

Patentansprüche
1 . Elektrisch adressierbare Vorrichtung umfassend
- mindestens einen festen Träger mit einer oder mehreren darauf befindlichen Sensorpositionen, die jeweils wenigstens eine Elektrodenfläche umfassen sowie mit Flächen versehen sind, an denen Makromoleküle immobilisiert werden können,
- eine Steuereinheit, welche über elektrische Zuleitungen an die Elektroden unabhängig von einander elektrische Signale applizieren kann, - eine elektrisch leitfähige Polymerschicht auf wenigstens einer
Elektrodenfläche wenigstens eines Teils der Sensorpositionen, und
- einen Elektrolyten, der in Kontakt mit wenigstens einem Teil der mit dem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Sensorflächen ist und der die zu immobilisierenden Makromoleküle enthält oder enthalten könnte.
2. Eine elektrisch adressierbare Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch leitfähige Polymerschicht wenigstens eine der folgenden Eigenschaften besitzt: a) eine Schichtdicke größer als 1 μm, bevorzugt größer als 2μm, besonders bevorzugt größer als 5μm, ganz besonders bevorzugt größer als 10μm oder b) eine Ladungskapazität größer als 0,1 mC/mm2, bevorzugt größer als 0,5mC/mm2, besonders bevorzugt größer als 1 mC/mm2 und ganz besonders bevorzugt größer als 10mC/mm2.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der elektrisch leitfähigen Polymerschicht zwischen 1 und 100μm, bevorzugt zwischen 2 und 50, besonders bevorzugt zwischen 5 und 20μm liegt.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die elektrisch leitfähige Polymerschicht diese Leitfähigkeit intrinsisch, also ohne gesonderte, nachträgliche Dotierungsmaßnahmen zeigt.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein im wesentlichen ebenes Substrat darstellt.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial aus Silizium, Siliziumoxid, Glas, Keramik oder Kunststoff besteht oder einen Verbund dieser Stoffe darstellt.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger einen aktiven Halbleiterchip mit elektrischen Schaltkreisen oder mit CMOS-Bausteinen beinhaltet.
8. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden unabhängig voneinander aus metallischen Materialien bestehen.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden unabhängig voneinander aus den Materialien Gold, Platin, Palladium, Silber, Kupfer, Aluminium oder aus Kohlenstoff gewählt sind.
10. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die elektrisch leitfähige Polymerschicht mindestens ein elektrisch leitfähiges Polymer umfasst, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polyacethylen, Polythiophen, Polypyrrol, Polyparaphenylen, Polyanilin oder Polyparalphenylen-vinylen oder
Modifikationen dieser Polymere.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das elektrisch leitfähige Polymer funktionelle Gruppen zur Bindung von Makromolekülen enthält.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen kovalent an das elektrisch leitfähige Polymer gebunden sind.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die funktioneilen Gruppen Carbonsäuren deren Derivate oder Aminogruppen darstellen.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Derivate der Carbonsäuren Aktivestergruppen sind.
15. Vorrichtung nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen physikalisch im elektrisch leitfähigen Polymer eingeschlossen sind.
16. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle Gruppen Avidin, Streptavidin oder Biotin darstellen.
17. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrisch leitfähige Polymerschicht kovalent gebundene spezifische Fängermoleküle enthält.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Fängermolekülen um Oligonukleotide handelt.
19. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß auf die elektrisch leitfähige Polymerschicht eine Bindungsschicht aufgetragen ist, die durchlässig ist für Wasser und kleine Ionen und die funktionelle Gruppen zur Anbindung von Makromolekülen enthält.
20. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsschicht aus der Gruppe Agarose, Polyacrylamid oder Polyurethan ausgewählt ist.
21. Vorrichtung nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, daß die funktionellen Gruppen Avidin, Streptavidin oder Biotin darstellen.
22. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorpositionen wenigstens eine weitere Elektrodenfläche (Sensorelektrode) aufweisen, die nicht mit einem elektrisch leitfähigen Polymer belegt sind.
23. Vorrichtung nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorelektroden mit Makromolekülen bestückt sind.
24. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die
Sensorelektroden aus Gold bestehen und Makromoleküle mittels einer SH- Gruppe daran gebunden sind.
25. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Makromolekülen um Oligonukleotide handelt.
26. Vorrichtung nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorelektroden mit einer Bindungsschicht belegt sind, die funktionelle Gruppen zur Anbindung von Makromolekülen enthält.
27. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsschicht aus der Gruppe Agarose, Polyacrylamid oder Polyurethan ausgewählt ist.
28. Vorrichtung nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die mit der elektrisch leitfähigen Polymerschicht belegten Elektroden und die Sensorelektroden zueinander höhenversetzt sind.
29. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der elektrisch leitfähigen Polymerschicht versehenen Elektroden tiefer liegen als die
Sensorelektroden.
30. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der elektrisch leitfähigen Polymerschicht versehenen Elektroden etwa um die Größe der Schichtdicke des elektrisch leitfähigen Polymers tiefer liegen als die
Sensorelektroden, bevorzugt noch etwas tiefer.
31. Vorrichtung nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorpositionen mit drei unabhängigen Elektroden, einer mit dem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten und zwei Sensorelektroden bestückt sind.
32. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Sensorelektroden schmale, lange, fingerähnliche Strukturen bilden mit einer Fingerbreite unter 2 μm.
33. Vorrichtung nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorelektroden Interdigitalelektroden darstellen, bei denen zumindest einige Zwischenräume durch eine mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteteten Elektrode ausgefüllt werden.
34. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorpositionen in einem zweidimensionalen Array auf dem Träger angeordnet sind.
35. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden der Sensorpositionen an eine elektrische Steuerungs- und Ausleseeinheit angekoppelt ist.
36. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Träger noch eine oder mehrere Referenzelektroden flächig aufgebracht sind.
37. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß an anderer Stelle als auf dem Träger, jedoch in Kontakt mit dem Elektrolyten, eine oder mehrere Referenzelektroden angebracht sind.
38. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß auf dem Träger noch eine oder mehrere Gegenelektroden aufgebracht sind mit einer im Vergleich zu den Sensorpositionen großen Fläche.
39. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß an anderer Stelle als auf dem Träger, jedoch in Kontakt mit dem Elektrolyten, eine oder mehrere Gegenelektroden angebracht sind mit einer im Vergleich zu den Sensorpositionen großen Fläche.
40. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die
Sensorpositionen mit einem flüssigen Elektrolyten benetzt sind, der die zu immobilisierenden Moleküle enthält.
41. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorpositionen mit einem flüssigen Elektrolyten benetzt sind, der die zu detektierenden Moleküle enthält.
42. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Elektrolyten um einen relativ hochohmigen Elektrolyten handelt.
43. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Benetzung mit dem Elektrolyten in einer Durchflußkammer stattfindet.
44. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die, verschiedenen Sensorpositionen selektiv mit Makromolekülen als spezifischen
Erkennungssystemen bestückt sind.
45. Verfahren zur beschleunigten Immobilisierung von elektrisch geladenen und mit geeigneten Bindungsfunktionen versehenen Makromolekülen, wie Nukleinsäuren und Proteinen, umfassend die Schritte: a) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition gemäß
Anspruch 1 , die wenigstens eine mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichtete Elektrode enthält und eine Fläche an die die Makromoleküle binden können, b) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, der das zu bindende
Makromolekül enthält, c) Beaufschlagung der mit dem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Elektrode mit einem elektrischen Potential oder einem elektrischen Strom zur Verdichtung der geladenen Makromoleküle in der unmittelbaren Umgebung der Sensorposition, d) Immobilisierung der Makromoleküle an den dafür vorgesehenen Bindungsstellen.
45. Verfahren zur beschleunigten Immobilisierung von zu erkennenden elektrisch geladenen Makromolekülen, wie Nukleinsäuren und Proteinen, umfassend die
Schritte: e) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition gemäß Anspruch 1 , die wenigstens eine mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichtete Elektrode enthält und eine Fläche, die die zu den Makromolekülen spezifisch passenden Erkennungsepitope enthält, f) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, der das zu erkennende Makromolekül enthält oder enthalten könnte, ' g) Beaufschlagung der mit dem elektrisch leitfähigen Polymer beschichteten Elektrode mit einem elektrischen Potential oder einem elektrischen Strom zur Verdichtung der geladenen Makromoleküle in der unmittelbaren Umgebung der Sensorposition, h) Immobilisierung der passenden Makromoleküle an den dafür vorgesehenen spezifischen Erkennungsstellen.
46. Verfahren nach einem der Ansprüche 44 und 45, dadurch gekennzeichnet, daß als Elektrolyt eine wässrige Lösung verwendet wird und das zur Verdichtung der Makromoleküle zur Anwendung kommende elektrische Potential niedriger als das zur Elektrolyse von Wasser notwendige Potential ist.
47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei einem applizierten Strom um einen Gleichstrom handelt
48. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß der Gleichstrom ein oder mehrere Male durch einen im Verhältnis zur Gesamtdauer des Gleichstroms kurzen Strompuls in entgegengesetzter Richtung unterbrochen wird
49. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkennungsepitopen um Proteine oder Polypeptide handelt.
50. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkennungsepitopen um Nukleinsäuren bzw. Oligonukleotide handelt.
51. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkennungsepitopen um Oligonukleotide mit 10 bis 25 Basen handelt.
52. Verfahren nach einem der Ansprüche 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Moleküle mittels optischer, radiographischer, elektrischer oder elektrochemischer Verfahren qualitativ oder quantitativ analysiert werden.
53. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem elektrischen Verfahren um Impedanzspektroskopie handelt.
54. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem elektrischen Verfahren um Cyclovoltammetrie handelt.
55. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß die zu detektierenden Makromoleküle enzymatisch markiert sind und es sich bei dem elektrischen Verfahren um Redox-Recycling handelt.
56. Verfahren nach einem der Ansprüche 53 oder 54, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion mittels elektrochemisch aktiver Reportergruppen, wie Ferrocen, PQQ oder Porphyrine erfolgt oder verstärkt wird.
57. Verfahren zur elektrisch gestützten spezifischen Selektion von Zielmolekülen, wie bestimmten Nukleinsäuren und Proteinen, umfassend die Schritte: i) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition nach Anspruch 1 , welche mit wenigstens einer Elektrode mit darüberliegendem elektrisch leitfähigen Polymer versehen ist, das fest mit einer ersten Sorte von Erkennungsmolekülen versehen ist, welche eine zweite Sorte von gegebenenfalls unterschiedlichen Makromolekülen reversibel gebunden haben, j) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, k) Beaufschlagung der Elektrode mit einem genügend hohen elektrischen Potential geeigneter Polarität zur Lösung aller Bindungen von Makromolekülen der zweiten Sorte bis auf die Bindungen der Zielmoleküle mit der ersten Sorte der Erkennungsmoleküle.
58. Verfahren zur elektrisch gestützten spezifischen Selektion von Zielmolekülen, wie Nukleinsäuren und Proteinen, umfassend die Schritte: I) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition nach Anspruch 1 mit wenigstens einer Elektrode, die mit einem elektrisch leitfähigen Polymer beschichtet ist, das seinerseits mit einem strukturell nicht leitfähigen Polymer beschichtet ist, welches durchlässig ist wenigstens für Wasser und kleine Ionen und welches fest mit einer ersten Sorte von Erkennungsmolekülen versehen ist welche eine zweite Sorte von gegebenenfalls unterschiedlichen
Makromolekülen reversibel gebunden haben, m) Benetzung der Sensorposition mit einem Elektrolyten, n) Beaufschlagung der Elektrode mit einem genügend hohen elektrischen Potential geeigneter Polarität zur Lösung aller Bindungen von Makromolekülen der zweiten Sorte bis auf die Bindungen der Zielmoleküle mit der ersten Sorte der Erkennungsmoleküie.
59. Verfahren zur elektrisch gestützten spezifischen Selektion von Zielmolekülen, wie Nukleinsäuren und Proteinen, umfassend die Schritte: A) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition nach Anspruch 1 mit einer oder mehreren Mobilisierungs- und Sensorelektroden, wobei o) die Mobilisierungselektroden mit einem leitfähigen Polymer beschichtet sind p) die Sensorposition mit einem Elektrolyt benetzt ist q) die Sensorelektroden fest mit einer ersten Sorte von Erkennungsmolekülen versehen sind welche eine zweite Sorte von gegebenenfalls unterschiedlichen Makromolekülen reversibel gebunden haben B) Beaufschlagung der Mobilisierungselektroden mit einem genügend hohen elektrischen Potential geeigneter Polarität zur Lösung aller Bindungen von Makromolekülen der zweiten Sorte auf den Sensorelektroden bis auf die Bindungen der Zielmoleküle mit der ersten Sorte der Erkennungsmoleküle.
60. Verfahren zur elektrisch gestützten spezifischen Selektion von Zielmolekülen, wie Nukleinsäuren und Proteinen, umfassend die Schritte:
C) Bereitstellung einer elektrisch adressierbaren Sensorposition nach Anspruch 1 mit einer oder mehreren Mobilisierungs- und Sensorelektroden, wobei r) die Mobilisierungselektroden mit einem leitfähigen Polymer beschichtet sind s) die Sensorposition mit einem Elektrolyt benetzt ist t) die Sensorelektroden fest mit einer ersten Sorte von Erkennungsmolekülen versehen an welche nach Anspruch 44 eine zweite Sorte von gegebenenfalls unterschiedlichen Makromolekülen reversibel gebunden wurde
D) Beaufschlagung der Sensorelektroden mit einem genügend hohen elektrischen Potential geeigneter Polarität zur Lösung aller Bindungen von Makromolekülen der zweiten Sorte auf den Sensorelektroden bis auf die Bindungen der
Zielmoleküle mit der ersten Sorte der Erkennungsmoleküle.
61. Verfahren nach einem der Ansprüche 57 bis 60, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Erkennungs- und Makromolekülen um Antigen-Antikörper oder um Nukleinsäuresequenzen handelt.
62. Verfahren nach einem der Ansprüche 57 bis 60, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Sorte von Makromolekülen mittels einer der in den Ansprüchen 52 bis 56 genannten Methoden detektiert wird.
63. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das elektrisch leitfähige Polymer durch Elektrodeposition aufgebracht wird.
64. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch* gekennzeichnet, daß das elektrisch leitfähige Polymer durch Elektropolymerisation aufgebracht wird
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