DE10161529A1

DE10161529A1 - Biosensor zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren, Sensoranordnung mit einem Biosensor, Verfahren zur Herstellung des Biosensors und Verfahren zum Erfassen von Nukleinsäuremolekülen mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE10161529A1
Application number: DE10161529A
Authority: DE
Inventors: Franz Hofmann; Johannes Luyken; Petra Theresia Schindler-Bauer
Original assignee: Infineon Technologies AG
Current assignee: Infineon Technologies AG
Priority date: 2001-12-14
Filing date: 2001-12-14
Publication date: 2003-07-03

Abstract

Der Biosensor zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren weist ein Substrat auf, das einen Graben für eine zu untersuchende Probe aufweist. Dabei weist mindestens eine Seitenwand des Grabens mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren auf und der Graben weist ferner eine Erfassungseinheit auf, die ein optisches Signal erfasst, das von einem zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren eingesetzten Nachweismolekül ausgesandt wird. Ferner weist der Biosensor ein Abschattungselement auf, das derart ausgestaltet ist, dass zur Anregung des Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung von der Erfassungseinheit abgeschattet wird.

Description

Die Erfindung betrifft einen Biosensor zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren, eine Sensoranordnung mit einem Biosensor zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren, ein Verfahren zur Herstellung eines Biosensors zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren sowie schließlich ein Verfahren zum Erfassen von Nukleinsäuremolekülen mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von Nukleinsäuren.
Aus [1] bis [4] sind Verfahren zum Erfassen von Biopolymeren wie DNA-Moleküle bekannt, bei denen zur Erfassung Biosensoren eingesetzt werden, die auf Elektrodenanordnungen basieren.
Fig. 2a und Fig. 2b zeigen einen solchen Sensor, wie er in [1] und [4] beschrieben ist. Der Sensor 200 weist zwei Elektroden 201, 202 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 203 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die Elektroden 201, 202 sind Elektroden-Anschlüsse 204, 205 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 201, 202 anliegende elektrische Potential zugeführt werden kann. Die Elektroden 201, 202 sind als Planarelektroden angeordnet. Auf jeder Elektrode 201, 202 sind DNA-Sondenmoleküle 206 immobilisiert (vgl. Fig. 2a). Die Immobilisierung erfolgt beispielsweise gemäß der sogenannten Gold-Schwefel-Kopplung. Auf den Elektroden 201, 202 ist der zu untersuchende Analyt 207, aufgebracht. Der Analyt kann dabei beispielsweise eine elektrolytische Lösung mit DNA- Molekülen mit jeweils unterschiedlichen Sequenzen sein.
Sind in dem Analyt 207 DNA-Stränge 208 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 206 komplementär ist, so hybridisieren diese DNA-Stränge 208 mit den DNA-Sondenmolekülen 206 (vgl. Fig. 2b).
Eine Hybridisierung eines DNA-Sondenmoleküls 206 und eines DNA-Strangs 208 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 206 und des entsprechenden DNA- Strangs 208 zueinander komplementär sind. Ist dies nicht der Fall, so findet keine Hybridisierung statt. Somit ist ein DNA-Sondenmolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d. h. mit ihm zu hybridisieren.
Findet eine Hybridisierung statt, so verändert sich, wie aus Fig. 2b ersichtlich, neben anderen elektrischen Parametern auch die Kapazität zwischen den Elektroden. Diese Änderung der Kapazität kann als Messgröße für die Erfassung von DNA- Molekülen herangezogen werden.
Weiterhin ist ein Reduktions-/Oxidations-Recycling-Verfahren zum Erfassen makromolekularer Biopolymere aus [2] und [3] bekannt. Bei diesem befindet sich an beispielweise zu erfassender DNA/RNA eine redoxaktive Markierung. Nach der Bindung der zu erfassenden Proteine an Fängermoleküle wird durch diese Markierung ein Zyklus aus Oxidation und Reduktion von geeigneten Molekülen ausgelöst, der zu einem für den Nachweis der Proteine verwendeten elektrischen Kreisstrom führt.
Aus [5] ist eine weitere Vorgehensweise für die Untersuchung des Elektrolyts auf die Existenz eines DNA-Strangs mit vorgegebener Sequenz bekannt. Bei dieser Vorgehensweise werden die DNA-Stränge der gewünschten Sequenz mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert und deren Existenz wird anhand der Fluoreszenzeigenschaften der markierten Moleküle bestimmt. Hierzu wird Licht beispielsweise im sichtbaren oder ultravioletten Wellenlängenbereich auf den Elektrolyten gestrahlt und es wird das von dem Analyten, insbesondere von dem nachzuweisenden markierten DNA-Strang, emittierte Fluoreszenzlicht erfasst. Aufgrund des Fluoreszenzverhaltens, d. h. insbesondere aufgrund der erfassten, emittierten Lichtstrahlen wird bestimmt, ob der nachzuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Sequenz in dem Analyten enthalten ist oder nicht.
Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, da eine sehr genaue Kenntnis über das Fluoreszenzverhalten des entsprechenden Markermoleküls am DNA-Strang erforderlich ist und weiterhin eine Markierungsreaktion der DNA-Stränge vor Beginn des Verfahrens notwendig ist. Ferner ist eine sehr genaue Justierung des Erfassungsmittels zum Erfassen der emittierten Lichtstrahlen erforderlich, damit die Lichtstrahlen überhaupt erfasst werden können.
Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Störeinflüsse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann. Sie ist daher ferner schwer reproduzierbar und weist eine hohe Abweichung der Standardwerte auf.
Schließlich ist z. B. aus [6] und [7] ein Verfahren bekannt, das auf wie anhand Fig. 8 näher erläutert, auf dem Unterschied der Leitfähigkeit von einzelsträngigen und doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen beruht und deshalb auf eine Messung eines elektrischen Stromes oder einer Spannung zurückgreift.
Bei dem Verfahren nach [6, 7] wird ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül 802 als Fängermolekül auf einer elektrisch leitfähigen Sensor-Oberfläche 801 immobilisiert. Das Fängermolekül 802 trägt eine Markierung 803, die bei einem durch Licht induzierbaren Redoxvorgang Elektronen abgegeben oder aufnehmen kann.
Wird Licht geeigneter Wellenlänge, wie durch den Pfeil 806 symbolisiert, auf den Sensor 800 gestrahlt, so setzt die redoxaktive Markierung 803, durch das eingestrahlte Licht angeregt, kontinuierlich Elektronen frei. Falls die Markierung in einem doppelsträngigen Hybrid aus DNA- Fängermolekül 802 und zu erfassender Nukleinsäure 805 vorliegt, wirkt dieses doppelsträngige Hybrid als eine Art Elektronenpumpe und leitet Elektronen, wie durch den Pfeil 807 veranschaulicht, von der Markierung 803 zur leitfähigen Oberfläche 801, so dass an dieser ein Strom mittels eines Messgeräts 804 gemessen werden kann (vgl. Fig. 8a, b). Falls jedoch keine Hybridisierung erfolgt, stellen einzelsträngige Fängermoleküle 802 näherungsweise einen Isolator dar, es fließt folglich kein Strom an der Oberfläche 801.
Nachteilig an dem aus [6] bekannten Verfahren ist erstens, dass es ebenfalls einen erheblichen apparativen Aufwand erfordert und zweitens, dass für seine Durchführung die Nukleinsäuremoleküle einer Markierungsreaktion unterworfen werden müssen.
Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein alternatives Verfahren sowie eine Vorrichtung für die Erfassung von Nukleinsäuremolekülen bereitzustellen.
Das Problem wird durch den Biosensor, die Sensoranordnung sowie das Verfahren zur Verfahren zum Erfassen von Nukleinsäuremolekülen mit den Merkmalen gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst.
Ein solcher Biosensor ist ein Biosensor mit einem Substrat, das einen Graben für eine darin aufzunehmende Probe aufweist, wobei mindestens eine Seitenwand des Grabens mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren aufweist. Ferner weist der Graben eine Erfassungseinheit auf, die ein optisches Signal erfasst, das von einem zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren eingesetzten Nachweismolekül ausgesandt wird. Des weiteren weist der Biosensor ein Abschattungselement auf, das derart ausgestaltet ist, dass zur Anregung des Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung von der Erfassungseinheit abgeschattet wird.
Das Verfahren der Erfindung zum Erfassen von Nukleinsäuremolekülen wird mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von Nukleinsäuren durchgeführt.
Bei dem Verfahren wird zunächst die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von Nukleinsäuren mit ersten Nukleinsäuremolekülen versehen, wobei die ersten Nukleinsäuremoleküle die zu erfassende Nukleinsäuremoleküle oder Fängermoleküle für zu erfassende Nukleinsäuremoleküle sind. Die ersten Moleküle liegen als einzelsträngige Moleküle vor und können (somit) komplementäre zweite Nukleinsäuremoleküle binden. Dann wird bei dem Verfahren eine vorzugsweise zu untersuchende Probe mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren von Nukleinsäuren in Kontakt gebracht. Dabei kann die Probe zweite Nukleinsäuremoleküle enthalten, die zu erfassende Nukleinsäuremoleküle oder Fängermoleküle sind, die an die zu erfassenden Nukleinsäuremoleküle binden können (d. h. Moleküle, die mit immobilisierten zu erfassenden Nukleinsäuremoleküle hybridisieren können). Dadurch werden in der Probe enthaltene zweite Nukleinsäuremoleküle an den ersten Nukleinsäuremolekülen gebunden und somit doppelsträngige Hybridmoleküle gebildet.
Dann wird bei dem Verfahren die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren mit einem Nachweismolekül in Kontakt gebracht, wobei das Nachweismolekül doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle spezifisch bindet und ein optisches Signal aussenden kann. Anschließend wird das Nachweismolekül zur Aussendung eines optischen Signals angeregt und die doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle werden mittels des durch das Nachweismolekül verursachten Signals erfasst werden. Durch die Erfassung der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle werden somit auch entweder die zu erfassenden ersten Moleküle oder die zweiten Moleküle, je nachdem, welche Moleküle erfasst werden sollen, erfasst.
Dieses Erfassungsverfahren wird zwar vorzugsweise mit dem hier offenbarten Biosensor durchgeführt, kann allerdings auch mit einer beliebigen anderen Sensoreinheit durchgeführt werden, solange diese eine Einheit zum Immobilisieren von Nukleinsäuren sowie eine Einheit wie einen externen Detektor aufweist, der das von den Nachweismolekülen ausgesandte Signal erfassen kann.
Anschaulich ausgedrückt beruht die Erfindung zum einen auf der Erkenntnis, dass für den Nachweis von (immobilisierten) Nukleinsäuremolekülen Moleküle wie Fluoreszenz-Farbstoffe verwendet werden können, die - ohne kovalent mit einem Nukleinsäurestrang verknüpft zu sein - selektiv an doppelsträngige Nukleinsäuren binden, d. h. Moleküle, die einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle nicht oder mit vernachlässigbar kleiner Affinität binden. Die Verwendung solcher vorzugsweise ausschließlich an doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle bindenden Nachweis- oder Markierungs- Moleküle besitzt die folgenden Vorteile. Erstens ist keine vorherige Markierungsreaktion für die Erfassung von Nukleinsäuren notwendig. Zweitens ist ein etwaiges durch einzelsträngige Moleküle verursachtes Hintergrundsignal minimal oder möglicherweise gar nicht vorhanden. Drittens muss daher auch kein markiertes einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das entweder ein Fängermolekül oder ein zu erfassendes Nukleinsäuremolekül sein kann, für die Messung z. B. durch einzelstrang-spezifischen Nuklease-Abbau entfernt werden.
Verbunden mit der Erkenntnis, das z. B. selektiv an doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle bindende Nachweismoleküle wie bestimmte Fluoreszenz-Farbstoffe zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen eingesetzt werden können, ist die hier ebenfalls genutzte Erkenntnis, dass die Genauigkeit eines solchen Verfahrens erhöht werden kann, indem ein hier offenbarter Biosensor mit einem Abschattungselement eingesetzt wird. Denn durch die im Rahmen der Erfindung aufgefundene Ausgestaltung, bei der eine Erfassungseinheit für ein optisches Signal unterhalb ("im Schatten") eines Abschattungselementes angeordnet wird, wird erreicht, dass überwiegend oder vorzugsweise nur das optische Signal von den Nachweismolekülen zu der Erfassungseinheit gelangt, jedoch z. B. Anregungsstrahlung, die zur Erzeugung von Fluoreszenzstrahlung im Nachweismolekül eingestrahlt wird, oder Streustrahlung aus der Umgebung des Sensors ausgeblendet oder ferngehalten wird. Dadurch kann die Größe eine Hintergrundssignal bei der Messung deutlich verringert werden. Weitere Vorteile des hier offenbarten Biosensors sind sein einfacher Aufbau und sein entsprechend einfaches Herstellungsverfahren, das vorzugsweise auf standardisierten Prozessen bei der Herstellung von halbleitenden Bauelementen, d. h. allgemein gesagt der Halbleiter-Technologie, beruht. Ein weiterer Vorteil des hier offenbarten Biosensors besteht darin, dass bei Messungen keine elektrische Kontaktierung einer zu untersuchenden Probe bzw. allgemein des Elektrolyten notwendig ist.
Betont sei an dieser Stelle, dass der Biosensor der Erfindung nicht nur für das hier offenbarte Verfahren Einsatz finden kann. Vielmehr kann er für jedes Verfahren eingesetzt werden, bei dem z. B. (makromolekulare) Biopolymeren wie Proteine aber auch chemischen Verbindungen im allgemeinen mittels optischer Nachweisverfahren wie Fluoreszenzmessungen nachgewiesen oder erfasst werden sollen und bei denen mindestens ein Bindungspartner auf einer Oberfläche immobilisiert wird. Beispielsweise kann auf der Einheit zum Immobilisieren des Biosensors ein Hormon oder ein Arzneimittelmolekül wie ein Antidepressivum immobilisiert werden, das dann mittels eines Fluoreszenz-markierten spezifischen Antikörpers erfasst wird.
Unter Erfassen wird im Sinne der Erfindung sowohl der qualitative als auch quantitative Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einem zu untersuchenden Analyten verstanden. Dies bedeutet, dass der Begriff "Erfassen" ebenfalls einschließt, die Abwesenheit von Nukleinsäuremolekülen in dem Analyten festzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform des Erfassungsverfahrens wird eine quantitative Erfassung der Nukleinsäuremoleküle durchgeführt.
Dabei kann bei dem vorliegenden Verfahren ein zu erfassendes Nukleinsäuremolekül einerseits ein Molekül sein, das von einem Fängermolekül, das sich auf der Einheit zum Immobilisieren (von makromolekularen Biopolymeren) befindet, gebunden und somit auf diese Weise mittels des Fängermoleküls erfasst wird. Andererseits kann ein zu erfassendes Molekül auch aus einer Probe/einem Analyt heraus zuerst auf die Einheit zum Immobilisieren aufgebracht werden und dann mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül, das mit dem zu erfassenden Molekül zu einem doppelsträngigen Molekül hybridisiert, mittels des vorliegenden Verfahren und/oder unter Verwendung des hier offenbarten Biosensors nachgewiesen werden.
Zur Ausbildung der doppelsträngigen Hybridmoleküle sind die, vorzugsweise als Fängermoleküle dienenden, ersten Nukleinsäuremoleküle vorzugsweise einzelsträngige Moleküle. Es ist allerdings auch möglich, doppelsträngige Moleküle als Fängermoleküle zu verwenden, die nur einen einzelsträngigen Bereich aufweisen, dessen Sequenz komplementär zu der Nukleotidsequenz der zu erfassenden Nukleinsäuremoleküle ist. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Bildung des doppelsträngigen Hybrids durch Induktion einer Fluidbewegung senkrecht zu der mindestens einer Einheit zum Immobilisieren, wie z. B. in [8] beschrieben, zu bewirken. In diesem Fall kann das Fängermolekül zunächst auch vollständig als Doppelstrang vorliegen. Bei dieser Ausgestaltung werden in Lösung befindliche doppelsträngige Moleküle vor der Erfassung z. B. mittels eines Waschschrittes entfernt. Eine weitere Möglichkeit der Hybridbildung besteht in einer Verdrängungsreaktion, bei der einzelsträngiges Molekül im Überschuss zugegeben wird.
An dieser Stelle sei angemerkt, dass im allgemeinen eine Komplexbildung zwischen einem ersten Nukleinsäuremolekül, das z. B. ein Fängermolekül ist, und einem dazu komplementären zweiten Nukleinsäuremolekül, das in diesem Fall dann ein zu erfassendes Molekül ist, nicht nur bei einer perfekten (100%igen) Komplementarität erfolgen kann, sondern auch bei niedriger Komplementarität der jeweiligen Sequenz. Z. B. kann unter niedrig stringenten Bedingungen wie beispielsweise unter Niedrig-Salzbedingungen, zwei Nukleinsäuremoleküle zu einem doppelsträngigen Molekül hybridisieren, auch wenn sie keine vollständig zueinander komplementären Sequenzen aufweisen. Bei dem hier offenbarten Verfahren können daher die Hybridisierungs- oder Puffer-Bedingungen so gewählt werden, dass z. B. entweder nur perfekt komplementäre Nukleinsäuremoleküle miteinander hybridisieren (z. B. durch Verwendung von Puffern mit hoher Ionen-Stärke) oder aber auch so, dass Moleküle mit geringerer Komplementarität zwischen den Basensequenzen doppelsträngige Moleküle miteinander ausbilden können.
Unter "Einheit zur Immobilisierung" wird im Sinne der Erfindung eine Anordnung verstanden, die eine Oberfläche aufweist, auf der erste vorstehend definierte Moleküle immobilisiert werden können; d. h. eine Anordnung, die eine Oberfläche aufweist, an die erste Moleküle durch physikalische oder chemische Wechselwirkungen binden können. Diese Wechselwirkungen schließen hydrophobe oder ionische (elektrostatische) Wechselwirkungen und kovalente Bindungen ein.
Beispiele für geeignete Oberflächen-Materialien, die für die mindestens eine Einheit zur Immobilisierung verwendet werden können, sind Metalle wie Gold oder Silber, Kunststoffe wie Polyethylen- oder Polypropylen oder anorganische Stoffe wie Siliziumdioxid.
Ein Beispiel für eine physikalische Wechselwirkung, die eine Immobilisierung der Fängermoleküle bewirkt, ist eine Adsorption an der Oberfläche. Diese Art der Immobilisierung kann beispielsweise stattfinden, wenn das Mittel zur Immobilisierung Glas oder ein Kunststoffmaterial ist, das für die Herstellung von Mikrotiterplatten verwendet wird (z. B. Polypropylen). Allerdings ist eine kovalente Verknüpfung der Fängermoleküle an die Einheit zum Immobilisieren bevorzugt, weil dadurch die Orientierung der Fängermoleküle gesteuert werden kann. Die kovalente Verknüpfung kann über jede geeignete Verknüpfungschemie ("Linker-Chemie") erfolgen.
Mit Hilfe des Erfassungsverfahren können beliebige Nukleinsäuremoleküle erfasst werden, d. h. sowohl DNA- und RNA-Moleküle als auch DNA-Mimetika wie Peptidnukleinsäuren (PNA), solange sie in der Lage sind, mit einem komplementären Fängermolekül ein doppelsträngiges Hybridmolekül wie ein DNA/DNA-, DNA/RNA-, PNA/DNA- oder aber auch ein RNA/RNA- oder PNA/RNA-Hybridmolekül auszubilden, das von einem geeigneten Nachweismolekül spezifisch gebunden wird. Folglich können sowohl DNA als auch RNA-Moleküle oder PNA-Moleküle als Fängermoleküle, d. h. vorliegend als Bindungspartner zur Ausbildung eines doppelsträngigen Nukleinsäurekomplexes eingesetzt werden. Da im vorliegenden Verfahren einzelstängige, nicht hybridisierte Nukleinsäuren nicht von der Einheit zum Immobilisieren z. B. mittels Nukleaseabbau entfernt werden müssen, können PNA-Moleküle, die allgemein inert gegenüber Nukleasen und somit vielseitig einsetzbare Antisense-Agenzien sind, hier problemlos als Fängermoleküle eingesetzt werden.
Unter Nukleinsäuremolekülen werden in diesem Zusammenhang beispielsweise (längerkettige) DNA-Moleküle und RNA-Moleküle, PNA-Moleküle, cDNA-Moleküle, oder auch kürzere Oligonukleotide mit beispielsweise 10 bis 50 Basenpaaren (bp), insbesondere 10 bis 30 Basenpaaren, verstanden. Die Nukleinsäuren können, wie bereits oben erwähnt, doppelsträngig sein, jedoch auch zumindest einzelsträngige Bereiche aufweisen oder, zum Beispiel durch vorangehende thermische Denaturierung (Strangtrennung) für ihren Nachweis, als Einzelstränge vorliegen. Die Sequenz der zu erfassenden Nukleinsäuren kann dabei zumindest teilweise oder vollständig vorgegeben, d. h. bekannt sein.
Wenn Nukleinsäuremoleküle einer vorgegebenen Nukleotidsequenz mit dem hier beschriebenen Verfahren erfasst werden sollen, so werden sie vorzugsweise in einzelsträngiger Form erfasst, d. h. sie werden ggf. vor der Erfassung durch Denaturierung in Einzelstränge überführt. In diesem Fall werden als Fängermoleküle vorzugsweise Nukleinsäuremoleküle mit einer zu dem einzelsträngigen Bereich komplementären Sequenz verwendet. Diese Nukleinsäure-Fängermoleküle können wiederum Nukleinsäuremoleküle mit ca. 20 bp bis ca. 50 bp sein oder auch längere Nukleotidsequenzen mit bis zu ca. 500 bp oder länger besitzen, solange sie keine intermolekularen Strukturen ausbilden, die eine Hybridisierung des Fängermoleküls mit der zu erfassenden Nukleinsäure verhindern.
Bei dem Verfahren kann jedes geeignete Nachweismolekül eingesetzt werden, das einen Nukleinsäuredoppelstrang spezifisch durch nicht kovalente Wechselwirkungen bindet und das nach Bindung an den Doppelstrang ein optisches Signal z. B. im IR-, UV- oder im sichtbaren Spektralbereich erzeugen kann, aufgrund dessen die Erfassung durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nachweismolekül ein doppelsträngiges Nukleinsäuremoleküle spezifisch bindender Fluoreszenzfarbstoff (Fluorochrom). Beispiele für geeignete derartige Fluoreszenz-Farbstoffe, die im hier beschriebenen Verfahren eingesetzt werden können, sind die Farbstoffe Hoechst 33258, Hoechst 33342, PicoGreen (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA), oder die momoneren und dimeren Cyan-Farbstoffe der TOTO, YOYO, BOBO oder POPO-Reihe (z. B. TOTO-1, YOYO-1, BOBO-1, POPO-1, TO-PRO-1, YO-PRO-1, BO- PRO-1 oder PO-PRO-1) die ebenfalls von der Firma Molecular Probes erhältlich sind. Die Eigenschaften dieser Farbstoffe und insbesondere ihre Spezifität für doppelsträngige Nukleinsäuren sind in [9] bis [11] beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens, bei der die zu erfassenden Nukleinsäuren DNA-Moleküle sind, wird als Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen verwendet. Falls mittels des Verfahrens die Menge eines Nukleinsäuremoleküls quantitativ bestimmt werden soll, wird es vorzugsweise unter Verwendung des Biosensors der Erfindung durchgeführt, da dieser durch sein Abschattungselement die vorzugsweise senkrecht zum planar ausgestalteten Boden des Grabens eingestrahlte Anregungsstrahlung, die z. B. im Falle von PicoGreen vorzugsweise bei ca. 500 nm liegt, von der Erfassungseinheit fernhält, und deshalb nur die vom Fluorophor emittierte Fluoreszenzstrahlung, die für PicoGreen bei ca. 525 nm ihr Maximum aufweist, auf die Erfassungseinheit fällt.
Eine Erfassungseinheit im Sinne der Erfindung ist eine Einheit, die ein optisches Signal, das von einer hier verwendeten Markierung erfassen und weiterleiten kann. Beispiele für Erfassungseinheiten sind Photodioden oder Charge Coupled Devices (CCDs), CCD-Kameras oder CMOS-Kameras. In einer bevorzugten Ausgestaltung des Biosensors ist die Erfassungseinheit eine Photodiode. Die zur Erfassung der Biopolymere herangezogene Messgröße ist dann vorzugsweise der Photostrom, dessen Stärke über einen vorgegebenen Zeitraum integriert wird.
Unter einem Abschattungselement wird im Sinne der Erfindung eine Einheit verstanden, die derart ausgestaltet und/oder angeordnet ist, dass die verwendete Anregungsstrahlung, die zur Anregung des optischen Signals verwendet wird, von der Erfassungseinheit abgeschirmt wird, so dass vorzugsweise der größte Teil der Anregungsstrahlung, idealerweise die gesamte Anregungsstrahlung von der Erfassungseinheit ferngehalten wird. Das Abschattungselement kann aus jedem beliebigen Material ausgebildet werden, das undurchlässig für die jeweils verwendete Anregungsstrahlung ist.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Biosensors ist das Abschattungselement oberhalb der Erfassungseinheit angeordnet. Bezogen auf die Lage zur mindestens einen Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren kann sich das Abschattungselement in einer Schnittansicht gesehen sowohl auf gleicher Höhe mit der Einheit zum Immobilisieren befinden oder sich auch oberhalb der Einheit zum Immobilisieren. Letzteres ist bevorzugt, wenn sichergestellt werden soll, dass die gesamte Fläche der Einheit zum Immobilisieren für die Erfassung herangezogen wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des Biosensors ist auf der Erfassungseinheit ein Filter für die zur Anregung des Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung aufgebracht. Durch diesen Filter wird somit eventuell vom Abschattungselement nicht abgehaltene Anregungsstrahlung wenigstens zum Teil vom Erfassungselement ferngehalten und der Biosensor durch das nochmals verbesserte Verhältnis von Signal zu Hintergrund noch empfindlicher gemacht werden kann.
In einer weiteren Ausgestaltung des Biosensors sind die Erfassungseinheit und die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren an sich gegenüberliegenden Seitenwänden des Grabens angeordnet. Dabei befinden sich beide Einheiten vorzugsweise auf der gleichen Höhe. Vorzugsweise sind die sich gegenüberliegenden Seitenwände parallel zueinander angeordnet. In diesem Zusammenhang sei angemerkt, dass sich Erfassungseinheit und Immobilisierungseinheit auch seitlich versetzt oder in einem kleineren Winkel als 180° zueinander oder auf unterschiedlicher Höhe zueinander befinden können, solange ein ausreichender Teil der mittels der Nachweismoleküle emittierten Strahlung zur der Erfassungseinheit gelangt. Es ist auch daher auch nicht notwendig, dass die Seitenwände des Grabens perfekt parallel zueinander ausgebildet sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist ferner eine andere Anordnung mit einem säulenartigen Aufbau denkbar. Dies bedeutet, dass der Graben eines oder mehrere säulenartige Strukturen aufweist, die zum einen eine Erfassungseinheit aufweisen und auf denen zum anderen ein Abschattungselement angeordnet ist. Diese Strukturen können prinzipiell jede beliebige Form aufweisen, d. h. sie können eine runde, quaderförmige oder z. B. auch hexagonale Querschnittsfläche aufweisen. Bei dieser Ausgestaltung kann die Einheit zum Immobilisieren auf einer Seitenwand des Graben angeordnet sein, möglich ist jedoch auch die Einheit zum Immobilisieren auf einer der säulenartige Strukturen auszubilden. Bei Verwendung eines Sensors, der auf Halbleiter-Substraten beruht, können diese säulenartigen Strukturen durch die Verwendung von entsprechenden Ätz/Lithographie-Masken ausgebildet werden.
In einer weiteren Ausführungsform weist das Substrat des Biosensors Substrat eines oder mehrere Halbleitermaterialien auf.
In einer anderen Weiterbildung des Biosensors ist in das Substrat eine Auswerteeinheit für das von Erfassungseinheit erfasste Signal integriert. Diese Auswerteeinheit summiert, z. B. wenn eine Photodiode als Erfassungseinheit verwendet wird, den durch die Fluoreszenzstrahlung der Nachweismoleküle hervorgerufenen Photostrom, verstärkt danach z. B. durch einen Vorverstärker das erhaltene Messsignal und wandelt diesen beispielsweise mittels eines Analog/Digitalwandlers in ein digitalen Signal für die weitere Datenverarbeitung um, sorgt somit kurz gesagt für eine "on-chip" Signalverarbeitung.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind CMOS-Bauelemente in das Substrat des Biosensors integriert.
In einer anderen Ausgestaltung weist die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren zumindest ein Material auf, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Gold, Hydroxylgruppen, Epoxidgruppen, Amingruppen oder Acetoxgruppen aufweisenden Materialien besteht. Hierbei sei nochmals betont, dass die Einheit zum Immobilisieren jedes Material aufweisen kann, auf dem Biopolymere wie Proteine, Peptide, Poly- oder Oligosaccharide oder auch kleinere chemische Verbindungen wie Haptene, Hormone, Pharmazeutika und allgemein niedermolekulare Liganden kovalent oder nicht kovalent immobilisiert werden können.
In einer Ausführungsform des Biosensors sind auf der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren Fängermoleküle angeordnet, die makromolekulare Biopolymere spezifisch binden können.
In einer anderen Ausgestaltung des Biosensors sind eine Vielzahl von Gräben in dem Substrat ausgebildet. Dabei können die einzelnen Gräben parallel oder in einer beliebigen anderen Orientierung zueinander angeordnet sein. Diese Ausgestaltung ist für Parallel- oder Mehrfachbestimmungen bevorzugt. An dieser Stelle sei angemerkt, dass es mit dem vorliegenden Erfassungsverfahren selbstverständlich möglich ist, nicht nur eine einzige Art von Nukleinsäuremolekülen in einer einzelnen Messreihe zu erfassen. Vielmehr können mehrere Nukleinsäuremoleküle gleichzeitig oder auch nacheinander erfasst werden. Dazu können z. B. in mehreren Gräben jeweils eine Art von Fängermolekülen verwendet werden, von denen jedes eine (spezifische) Bindungsaffinität für ein bestimmtes zu erfassendes Nukleinsäuremolekül aufweist, und/oder es können in einem Graben mehrere Einheiten zum Immobilisieren eingesetzt werden, wobei an jeder von diesen Einheiten nur eine Art von Fängermolekül gebunden wird.
Der Biosensor kann durch das folgende Verfahren hergestellt werden. Auf einem Substrat wird zunächst ein Graben für eine darin aufzunehmende Probe ausgebildet. Danach wird mindestens auf einer ersten Seitenwand des Grabens mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren ausgebildet und auf einer zweiten Seitenwand des Grabens wird mindestens eine Erfassungseinheit ausgebildet, die ein optisches Signal erfasst, das von einem zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren eingesetzten Nachweismolekül ausgesandt wird. Ferner wird ein Abschattungselement oberhalb des Erfassungselementes ausgebildet, das derart ausgestaltet ist, dass es zur Anregung des Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung von der Erfassungseinheit abhält.
Ferner wird hier eine Sensoranordnung zur Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mit einem Biosensor offenbart, wobei der Biosensor einen Graben für eine darin aufzunehmende Probe aufweist. Dabei weist mindestens eine Seitenwand des Grabens mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren auf, und der Graben weist eine ferner Erfassungseinheit auf, die ein optisches Signal erfasst, das von einem zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren eingesetzten Nachweismolekül ausgesandt wird. Schließlich weist der Biosensor ein Abschattungselement aufweist, das derart ausgestaltet ist, dass zur Anregung des Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung von der Erfassungseinheit abgehalten wird. Die Sensoreinheit weist ferner eine Einheit zur Erzeugung von optischer Strahlung auf, die in den Graben eingestrahlt werden kann.
Vorzugsweise ist die Einheit zur Erzeugung von optischer Strahlung ein Laser, eine UV-Lampe oder eine Diode.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im weiteren näher erläutert.
Es zeigen
Fig. 1 eine Ausführungsform eines Biosensors gemäß der Erfindung sowie diesen Biosensor in einem Verfahrenszustand des hier offenbarten Erfassungsverfahren;
Fig. 2a und 2b eine Skizze zweier Planarelektroden, mittels derer die Existenz zu erfassender DNA-Stränge in einem Elektrolyt (Fig. 2a) bzw. deren Nichtexistenz (Fig. 2b) nachgewiesen werden können;
Fig. 3 bis 7 unterschiedliche Verfahrensstadien eines hier offenbarten Herstellungsverfahren des Biosensors gemäß der Erfindung;
Fig. 8a und 8b das aus [6] und [7] bekannte Verfahren für die Erfassung von Nukleinsäuren.
Fig. 1 zeigt einen Ausschnitt aus einem Biosensor 100, mit dem ein Ausführungsbeispiel des hier beschriebenen Erfassungsverfahrens für Nukleinsäuremoleküle durchgeführt werden kann.
Fig. 1 zeigt den Biosensor 100, der ein Substrat 101 aus pdotierten Silizium aufweist, in dem ein Graben 102 zur Aufnahme eines Analyten ausgebildet ist. Der Biosensor weist ferner eine Photodiode mit einem n-dotierten Halbleitermaterial (z. B. n-dotiertes Silizium) auf, die als Erfassungseinheit 103 dient. Die Erfassungseinheit 103 ist über einen nicht dargestellten elektrischen Anschluss mit einer ebenfalls nicht dargestellten Auswerteeinheit verbunden. Der Biosensor weist ferner eine Einheit 104 zum Immobilisieren von Biopolymeren wie Nukleinsäuren auf sowie ein Abschattungselement 105.
Die Einheit zum Immobilisieren 104 des Sensors 100 ist aus Gold hergestellt.
Alternativ kann die Einheit 104 zum Immobilisieren auch aus Siliziumoxid hergestellt sein und mit einem Material beschichtet werden, das geeignet ist, Fängermoleküle zu immobilisieren.
Beispielsweise können bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie

- 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,
- 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,
- 3-Aminopropyltriethoxysilan,
- 4-(Hydroxybutyramido)propyltriethoxysilan,
- 3-N,N-bis(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilan,

Alternativ kann beispielsweise Poly-L-Lysin verwendet werden.
Reagiert ein zu immobilisierendes Fängermolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Beschichtung auf der Einheit zum Immobilisieren gebunden.
Auf der Einheit zum Immobilisieren 104 werden einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle, die vorliegend DNA-Sondenmoleküle 106 sind, als Fängermoleküle aufgebracht. Dabei besitzen die DNA- Sondenmoleküle 106 eine zu einer vorgegebenen ersten DNA- Sequenz komplementäre Sequenz. Die Immobilisierung der Fängermoleküle 106 erfolgt über die sogenannte Gold-Schwefel- Kopplung, für die eine nicht darstellte monomolekulare Schicht aus Molekülen wie längerkettigen Alkylsilanen auf der Einheit 103 zum Immobilisieren aufgebracht wird (vgl. [12]).
An die Purinbasen Adenin (A), Guanin (G), und die Pyrimidinbasen Thymin (T) oder Cytosin (C) können jeweils zu den Sequenzen der Sondenmoleküle komplementäre Sequenzen der DNA-Stränge in der üblichen Weise, d. h. durch Basenpaarung über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen A und T bzw. zwischen C und G, hybridisieren. Bei Verwendung anderer Nukleinsäuremoleküle werden entsprechend andere Basen, im Falle eines RNA-Moleküls beispielsweise Uridin (U), verwendet.
Fig. 1 zeigt den Biosensor 100 für den Fall, dass in einem Analyten (nicht dargestellt), der mit dem Graben 102 in Kontakt gebracht wurde, d. h. vorzugsweise in den Graben 102eingebracht wurde, DNA-Moleküle 107 enthalten sind, die eine vorgegebene erste Nukleotidsequenz aufweisen, die komplementär zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 106 ist. In diesem Fall hybridisieren die zu den DNA-Sondenmolekülen 106 komplementären DNA-Stränge 107 mit den DNA- Sondenmolekülen 106, die auf der Einheit 104 aufgebracht sind, d. h. es bilden sich doppelsträngige DNA-Moleküle.
Nachdem eine ausreichende Zeit abgewartet worden ist, um eine Komplexbildung zwischen den Nukleinsäuremolekülen 106 und 107 sicherzustellen, wird der Elektrolyt entfernt und der Graben, d. h. somit auch die Einheit zum Immobilisieren 104, ggf. mit einer Waschlösung gespült.
Danach wird eine weitere Lösung in den Graben 102 gegeben, die ein Nachweismolekül 109 enthält, das selektiv an doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle bindet. In diesem Fall wird der Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen als Nachweismolekül 109 verwendet. Dieser bindet nach in Kontaktbringen mit der Einheit 104 zum Immobilisieren an die doppelsträngigen Moleküle aus den Fängermolekülen 106 und den zu erfassenden Molekülen 107.
Nachdem wiederum eine ausreichende Zeitdauer abgewartet worden ist und ggf. nicht gebundene Farbstoffmoleküle 109 mittels eines weiteren optionalen Spülschritts entfernt worden sind, wird anschließend durch die Pfeile 110 symbolisierte Anregungsstrahlung in den Graben 102 eingestrahlt. Die Einstrahlung erfolgt vorzugsweise senkrecht in Bezug auf den Boden des Grabens 102 gesehen oder parallel zur Detektionsfläche der Erfassungseinheit 103. Durch die Ausgestaltung des Abschattungselements 105 wird dabei erreicht, dass die Anregungsstrahlung 110 vom der Erfassungseinheit 103 angehalten wird.
Durch die Strahlung 110 wird der an die doppelsträngigen DNA- Moleküle gebundene Farbstoff zur Emission von Fluoreszenz- Strahlung, die durch die geschwungenen Pfeile 111 symbolisiert wird, angeregt. Diese emittierte Strahlung 111 gelangt zu der Photodiode 103, wo sie einen elektrischen Photostrom hervorruft. Die Größe dieses elektrischen Signals wird für einen zuvor bestimmten Zeitraum gemessen und mit einem Wert verglichen, der für eine zuvor durchgeführte Referenzmessung (die z. B. nur mit dem verwendeten Elektrolyten vorgenommen wurde) erhalten wurde.
Durch den Vergleich der bei den zwei Messungen erhaltenen Werte wird die Anwesenheit bzw. Abwesenheit der DNA-Moleküle 107 ermittelt. Übersteigt die ermittelte Differenz einen (vorgegebenen) Schwellenwert, so wird daraus geschlossen, dass die DNA-Moleküle 107 in der Probe vorhanden waren und ggf. in welcher Konzentration. Bei einer Differenz unterhalb des Schwellenwertes, bezogen auf Referenzmessungen mit bekannten Inhalt (Positiv- und Negativ-Kontrolle) wird daraus geschlossen, dass keine DNA-Moleküle 107 vorhanden waren. Diese Klassifizierung nach Schwellenwert kann auch bei allen anderen mit dem Biosensor der Erfindung durchführbaren Verfahren vorgenommen werden.
Im Weiteren wird bezugnehmend auf Fig. 3 bis Fig. 7 ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung eines Biosensors zum Erfassen von makromolekularen Biomolekülen beschrieben.
Um die in Fig. 3 gezeigte erste Schichtenfolge 300 zu erhalten, wird auf einem p-dotierten Silizium-Substrat 301 ein Graben 302 für eine zu untersuchende Probe ausgebildet. Hierfür wird auf dem p-dotierten Silizium-Substrat 301 unter Verwendung eines CVD-Verfahrens ("chemical vapour deposition") eine Siliziumnitrid-Hartmaske 303 abgeschieden. Dann wird unter Verwendung eines Lithographie- und eines Ätz- Verfahrens der Graben 302 generiert. Hierfür wird auf der Oberfläche der aus den Schichten 301, 303 gebildeten Schichtenfolge Photoresist abgeschieden und unter Verwendung eines Lithographie-Verfahrens strukturiert. Danach wird die Siliziumnitrid-Hartmaske 303 geätzt. Nachfolgend wird der Photoresist von der auf diese Weise erhaltenen Schichtenfolge entfernt. Anschließend wird das Silizium-Substrat 301 zurückgeätzt, wodurch der Graben 302 generiert wird.
Um die in Figur gezeigte zweite Schichtenfolge 400 zu erhalten, wird optional zunächst ein Teil der Schichtenfolge 300 mit einem Schutzlack (nicht gezeigt) bedeckt, um entsprechende Oberflächenbereiche der Schichtenfolge 400 vor einem unerwünschten Implantieren mit Implantations-Ionen bei einem nachfolgenden Ionenimplantations-Verfahren zu schützen. Dann wird ein n-dotierter Implantations-Bereich 402 in einem gemäß Fig. 4 rechten Seitenwand-Bereich des Grabens 302 in dem p-dotierten Silizium-Substrat 301 erzeugt, indem Implantations-Ionen 401 unter einem vorgebbaren Winkel α zu der Normalenrichtung der Oberfläche des Silizium-Substrats 301 auf die Schichtenfolge 300 gerichtet werden. Hierzu wird ein Dotierstoff des n-Leitungstyps verwendet, beispielsweise Arsen- oder Phosphor-Atome. Dadurch wird der n-dotierte Implantationsbereich 402 ausgebildet, der in Fig. 5 in einem fortgeschrittenen Stadium nach Durchführung eines (optionalen) thermischen Ausheil-Verfahrens gezeigt ist. Es ist zu betonen, dass die Implantations-Ionen 401 schräg, d. h. unter dem vorgebbaren Winkel α auf die Schichtenfolge 300 gerichtet werden, so dass anschaulich ein Teil der Schichtenfolge 300 zum Abschatten bestimmter Oberflächen- Bereiche der Schichtenfolge dient, um ein unerwünschtes Implantieren von Dotierstoff in diesen Oberflächen-Bereichen zu vermeiden. In einem weiteren Verfahrensschritt wird der Schutzlack von der Oberfläche entfernt.
Die in Fig. 5 gezeigte dritte Schichtenfolge 500 wird erhalten, indem zunächst der Graben 302 in gemäß Fig. 5 vertikaler Richtung weitergeätzt wird, wodurch ein vertiefter Graben 501 ausgebildet wird. Dadurch wird erreicht, dass der n-dotierte Implantations-Bereich 402 aus dem vorangegangenen Ionenimplantations-Verfahren eine geringere vertikale Ausdehnung aufweist als der vertiefte Graben 501. Nachfolgend wird unter Verwendung eines Ätz-Verfahrens die Siliziumnitrid-Hartmaske 303 von der Oberfläche der Schichtenfolge entfernt.
Es ist anzumerken, dass der pn-Übergang 502 zwischen dem n- dotierten Implantations-Bereich 402 und dem p-dotierten Silizium-Substrat 301 erfindungsgemäß als Photodiode, d. h. als Erfassungseinheit verwendet wird.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird beispielsweise unter Verwendung eines CVD-Verfahrens ("chemical vapour deposition") ein Siliziumdioxid-Bereich in dem vertieften Graben 501 und auf der Schichtenfolge abgeschieden. Unter Verwendung eines CMP-Verfahrens ("chemical mechanical polishing") wird der Siliziumdioxid-Bereich 503 derart zurückgeätzt, dass die dritte Schichtenfolge 300 mit einer planaren Oberfläche erhalten wird.
Um die in Fig. 6 gezeigte vierte Schichtenfolge 600 zu erhalten, wird ein anschaulich als Abschattungselement zu bezeichnender Polysilizium-Bereich 601 oberhalb des Erfassungselements (Bezugsziffern 402, 502) ausgebildet, wobei das Abschattungselement derart ausgestaltet ist, dass zur Anregung eines Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung von der Erfassungseinheit abgehalten wird (siehe Beschreibung Fig. 1). Hierfür wird zunächst auf der dritten Schichtenfolge 500 eine Polysilizium-Schicht unter Verwendung des CVD-Verfahrens abgeschieden und unter Verwendung eines Lithographie- und eines Ätz-Verfahrens derart strukturiert, dass dadurch der Polysilizium-Bereich 601 auf einem gemäß Fig. 6 rechten Oberflächen-Bereich der vierten Schichtenfolge 600 zurückbleibt.
Um die in Fig. 7 gezeigte fünfte Schichtenfolge 700 zu erhalten, wird zunächst auf der vierten Schichtenfolge 600 ein weiterer Siliziumdioxid-Bereich 701 abgeschieden. Ferner wird die Oberfläche der derartig erhaltenen Schichtenfolge mit Photoresist bedeckt (nicht gezeigt) und unter Verwendung eines Lithographie-Verfahrens strukturiert. Dann wird unter Verwendung der dadurch erhaltenen Maske ein weiterer Graben 702 in die Schichtenfolge eingebracht. Ferner wird an einer gemäß Fig. 7 linken Seitenwand des weiteren Grabens 702 eine Gold-Seitenwandschicht 703 aufgebracht. Um die Gold- Seitenwandschicht 703 gezielt auf der gemäß Fig. 7 linken Seitenwand des weiteren Grabens 702 aufzubringen, wird ein anisotropes, gerichtetes Bedampfungsverfahren zum Aufbringen von Gold-Material verwendet. Mit anderen Worten wird das Goldmaterial schräg, d. h. unter einem vorgegebenen Winkel aufgebracht. Der Photoresist wird nachfolgend entfernt.
Dadurch wird die Herstellung des Biosensors der Erfindung abgeschlossen.
Die Seitenwandschicht aus Gold 703 bildet eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biomolekülen. Es ist bekannt, dass eine Kopplung zwischen einer schwefelhaltigen Endgruppe eines Biomoleküls (beispielsweise einer Thiol- Gruppe) und Gold-Material mit etablierten Techniken durch die Ausbildung einer monomolekularen Schicht aus geeigneten Molekülen erzielt werden kann (vgl. [12]).
Auf der als Einheit zum Immobilisieren dienenden Gold- Seitenwandschicht 703 können daher Nukleinsäuremoleküle wie einzelsträngige DNA-Moleküle 704 als Fängermoleküle für die Durchführung des anhand Fig. 1 beschriebenen Verfahrens immobilisiert werden.
In diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert:
[1] R. Hintsche et al., Microbiosensors Using Electrodes Made in Si-Technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al., Dirk Hauser Verlag, Basel, S. 267-283, 1997
[2] R. Hintsche et al., Microelectrode arrays and application to biosensing devices, Biosensors & Bioelectronics, Vol. 9, S. 697-705, 1994
[3] M. Paeschke et al., Voltammetric Multichannel Measurements Using Silicon Fabricated Microelectrode Arrays, Electroanalysis, Vol. 7, Nr. 1, S. 1-8, 1996
[4] P. von Gerwen, Nanoscaled Interdigitated Electrode Arrays for Biochemical Sensors, IEEE, International Conference on Solid-State Sensors and Actuators, Chicago, S. 907-910, 16.-19. Juni 1997
[5] N. L. Thompson, B. C. Lagerholm, Total Internal Reflection Fluoresence: Applications in Cellular Biophysics, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 8, S. 58-64, 1997.
[6] DE 199 01 761
[7] WO 00/42217 A1
[8] E. Braun et al., DNA-templated assembly and electrode attachment of a conducting silver wire, Nature, Vol. 391, S. 775-778, 1998
[9] S. J. Ahn et al., PicoGreen quantitation of DNA: Effective evaluation of samples pre- or post-PCR. Nucleic Acid Research Vol. 24, Nr. 13, S. 2623-2625, 1996
[10] V. L. Singer et al., Characterization of PicoGreen: reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantification. Analytical Biochemistry Vol. 249, S. 228-238, 1997
[11] H. P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and research chemicals, S. 144-156; 161-173, Molecular Probes, Eugene Oregon, USA, 6. Auflage 1996 (ISBN: 0-9652240)
[12] Mirsky et al., Capacitive monitoring of protein immobilization and antigen-antibody reactions on monomolecular alkylthiol films on gold electrons, Biosensors & Bioelectronics Vol. 12, Nr. 9-10, S. 977-989, 1997 Bezugszeichenliste 100 Biosensor
101 Substrat
102 Graben
103 Erfassungseinheit
104 Einheit zum Immobilisieren aus Gold
105 Abschattungselement
106 DNA-Sondenmoleküle
107 zu erfassende DNA-Moleküle
109 Nachweismolekül
110 durch Pfeil symbolisierte Anregungsstrahlung
111 durch Pfeil symbolisierte von Nachweismolekül ausgesandtes Signal
300 erste Schichtenfolge
301 Silizium-Substrat
302 Graben
303 Siliziumnitrid-Hartmaske
400 zweite Schichtenfolge
401 Implantations-Ionen
402 n-dotierter Implantations-Bereich
500 dritte Schichtenfolge
501 vertiefter Graben
502 pn-Übergang
503 Siliziumdioxid-Bereich
600 vierte Schichtenfolge
601 Polysilizium-Bereich
700 fünfte Schichtenfolge
701 weiterer Siliziumdioxid-Bereich
702 weiterer Graben
703 Gold-Seitenwandschicht
704 DNA-Einzelstränge

Claims

1. Biosensor zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mit einem Substrat, das einen Graben für eine aufzunehmende Probe aufweist,
wobei mindestens eine Seitenwand des Grabens mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren aufweist,
wobei der Graben eine Erfassungseinheit aufweist, die ein optisches Signal erfasst, das von einem zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren eingesetzten Nachweismolekül ausgesandt wird,
wobei der Biosensor ein Abschattungselement aufweist, das derart ausgestaltet ist, dass zur Anregung des Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung von der Erfassungseinheit abgeschattet wird.

2. Biosensor nach Anspruch 1, bei dem das Abschattungselement oberhalb der Erfassungseinheit angeordnet ist.

3. Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Erfassungseinheit eine Photodiode ist.

4. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem auf der Erfassungseinheit ein Filter für die zur Anregung des Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung aufgebracht ist.

5. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Erfassungseinheit und die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren an sich gegenüberliegenden Seitenwänden des Grabens angeordnet sind.

6. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Substrat ein Halbleitermaterial aufweist.

7. Biosensor nach Anspruch 6, bei dem in das Substrat eine Auswerteeinheit für das von Erfassungseinheit erfasste Signal integriert ist.

8. Biosensor nach Anspruch 6 oder 7, bei dem CMOS-Bauelemente in das Substrat integriert sind.

9. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren zumindest ein Material aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Gold, Hydroxylgruppen, Epoxidgruppen, Amingruppen oder Acetoxgruppen aufweisenden Materialien besteht.

10. Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem auf der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren Fängermoleküle angeordnet sind, die makromolekulare Biopolymere spezifisch binden können.

11. Sensoranordnung zur Erfassen von makromolekularen Biopolymeren mit einem Biosensor, der aufweist:
einen Graben für eine zu aufzunehmende Probe,
wobei mindestens eine Seitenwand des Grabens mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren aufweist, und
wobei der Graben eine Erfassungseinheit aufweist, die ein optisches Signal erfasst, das von einem zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren eingesetzten Nachweismolekül ausgesandt wird, und
der Biosensor ein Abschattungselement aufweist, das derart ausgestaltet ist, dass zur Anregung des Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung von der Erfassungseinheit abgehalten wird, und
wobei die Sensoreinheit eine Einheit zur Erzeugung von optischer Strahlung aufweist, die in den Graben eingestrahlt werden kann.

12. Sensoranordnung nach Anspruch 11, bei der die Einheit zur Erzeugung von optischer Strahlung ein Laser, eine UV-Lampe oder eine Diode ist.

13. Verfahren zur Herstellung eines Biosensors zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren,
bei dem auf einem Substrat ein Graben für eine darin aufzunehmende Probe ausgebildet wird,
mindestens auf einer ersten Seitenwand des Grabens mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren ausgebildet wird,
auf einer zweiten Seitenwand des Grabens eine Erfassungseinheit ausgebildet wird, die ein optisches Signal erfasst, das von einem zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren eingesetzten Nachweismolekül ausgesandt wird,
ein Abschattungselement oberhalb des Erfassungselementes ausgebildet wird, wobei das Abschattungselement derart ausgestaltet ist, dass zur Anregung des Nachweismoleküls eingestrahlte Anregungsstrahlung von der Erfassungseinheit abgehalten wird.

14. Verfahren zum Erfassen von Nukleinsäuremolekülen mittels mindestens einer Einheit zum Immobilisieren von Nukleinsäuren,
bei dem die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von Nukleinsäuren mit ersten Nukleinsäuremolekülen versehen wird, die zu erfassende Nukleinsäuremoleküle oder Fängermoleküle für zu erfassende Nukleinsäuremoleküle sind, wobei die ersten Nukleinsäuremoleküle als einzelsträngige Moleküle vorliegen und zweite Nukleinsäuremoleküle binden können,
bei dem eine Probe mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren von Nukleinsäuren in Kontakt gebracht wird, wobei die Probe zweite Nukleinsäuremoleküle enthalten kann, wobei die zweiten Moleküle zu erfassende Nukleinsäuremoleküle oder Fängermoleküle sind, die an die zu erfassenden Nukleinsäuremoleküle binden können,
bei dem in der Probe enthaltene zweite Nukleinsäuremoleküle an den ersten Nukleinsäuremolekülen gebunden werden, wodurch doppelsträngige Hybridmoleküle gebildet werden,
bei dem die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren mit einem Nachweismolekül in Kontakt gebracht wird, wobei das Nachweismolekül doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle spezifisch bindet und ein optisches Signal aussenden kann,
bei dem das Nachweismolekül zur Aussendung eines optischen Signals angeregt wird,
bei dem die doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle mittels des durch das Nachweismolekül verursachten Signals erfasst werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Nachweismolekül ein Fluoreszenzfarbstoff ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem als Fluoreszenzfarbstoff PicoGreen eingesetzt wird.