DE102013000682B3 - Verfahren zur Detektion von Molekülen - Google Patents

Abstract

Organische Moleküle werden bisher mittels elektrischer oder optischer Arrays identifiziert, die auf mehreren Arraypositionen mit jeweils einer Art Fängermoleküle bestückt sind. Unter Nutzung der biochemischen Komplexbildung wird auf diesen Positionen jeweils ein Zielanalyt spezifisch gebunden, markiert und mittels physikalischer Meßverfahren bestimmt. Das neue Verfahren soll die Zahl der messbaren Analyte pro Arrayposition vervielfachen, ohne die Zahl der Positionen zu erhöhen. Erfindungsgemäß werden Gemische von zwei oder mehr unterschiedlichen biochemischen Fängermolekülen auf jeder Positionen analytischer Arrays immobilisiert. Diese Fänger vermögen dann jeweils zwei oder mehr unterschiedliche Analytmoleküle auf jeder Arrayposition zu binden, welche nach unterschiedlicher spezifischer Markierung mittels üblicher Messeinrichtungen identifiziert werden. Das Verfahren ist in der biochemischen Analytik unter Anwendung erprobter Komplexbildungs- und Markierungsverfahren einsetzbar.

Description

• Technisches Gebiet
• Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifizierung von Biomolekülen für analytische Zwecke, sowie Verwendungen des Verfahrens.
• Stand der Technik
• Die parallele und simultane Bestimmung multipler biochemischer Analyte in einer Analysenprobe mit Hilfe der Mikroarraytechnologie ist ein in der Molekularbiologie bekanntes Verfahren (vgl. „Der Experimentator: Microarrays”, Müller, Hans J; Röder, Thomas; Spektrum Akademischer Verlag, 2004, Kap. 3–5). Diese Technik spielt beim Nachweis sowohl von Nukleinsäuren (vgl. „Applying Genomic and Proteomic Microarray Technology in Drug Discovery”, Robert S Matson, CRC Press, 2004) als auch von Proteinen (vgl. „Protein Microarray Technology”, Dev Kambhampati, Wiley-Interscience, New York., 2004 eine wichtige Rolle.
• Üblicherweise wird dazu jeweils eine Spezies von Fänger- oder Sondenmolekülen auf jeweils eine einzelne Positionen eines Mikroarrays immobilisiert und zur spezifischen Bindung von analytischen Zielen benutzt. Die Fänger- oder Sondenmoleküle binden dann vorhandene Zielmoleküle durch Affinitätsbindung. Oft werden diese Fänger-Analytkomplexe durch weitere komplexchemische Verfahren modifiziert und für die Detektion vorbereitet. Im zweiten Schritt werden solche Arraypositionen, auf denen sich z. B. durch DNA-Hybridisierung ein Affinitätskomplex gebildet hat, identifiziert. Für diese positionspezifische Identifizierung von Affinitätskomplexen nutzt man physikalische oder physikochemische Vorrichtungen (vgl. T. Vo-Dinh and B. Cullum, ”Biosensors and biochips: advances in biological and medical diagnostics” Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 2004, p. 540–551).
• In der molekularen Diagnostik werden z. B. in der Gendiagnostik verschiedene Fänger- bzw. Sonden-Oligonukleotide, die aus Sequenzen von ca. 10–20 oder mehr Nukleotiden bestehen können, auf jeweils einer Position einer Arrayanordnung immobilisiert. Sie binden ihre jeweiligen Ziel-Nukleinsäuren dann positionsspezifisch und sind dadurch zu identifizieren (vgl. „Microarray multiplex assay for the simultaneous detection and discrimination of hepatitis B, hepatitis C, and human immunodeficiency type-1 viruses in human blond samples”, CC Hsia et. al. Biochem Biophys Res Commun, 2007, Vol. 356, pp. 1017–1023).
• Bei Proteinarrays wendet man das gleiche Prinzip an, um mit Antikörpern oder Antigenen als Fänger, die jeweils auf eine Arrayposition gebunden sind, komplementäre Zielproteine zu binden (vgl. Birgit Kersten et al. ”Multiplex approaches in Protein microarray technology” Expert Review of Proteomics 2005, Vol. 2, No. 4, Pages 499–510).
• Zur Identifizierung eines Affinitätskomplexes und der zugehörigen Arrayposition wird in der Regel noch eine zusätzliche Markierung eingeführt. Am gebräuchlichsten ist die Markierung der gebildeten Affinitätskomplexe mit Farbstoffen oder farbigen oder fluoreszierenden Markermolekülen wahlweise durch kovalente Bindung, durch Intercallation oder durch zusätzliche Affinitätsbindungen. Die nachfolgende optische Identifizierung basiert auf der direkten Messung der positionsspezifischen Intensität bei spezifischen optischen Wellenlängen oder der Erzeugung oder dem Umschlag eines Farbstoffes bzw. spezifischer ortsspezifischer Emissionen von farbigen oder fluoreszierenden Markermolekülen.
• In einer typischen Anwendung für die optische Auslesung beschreiben C. C. Hsia et al., in Biochem Biophys Res Commun, Vol. 356, No. 4., 2007, pp. 1017–1023 einen Mikroarray Multiplex Assay für die simultane Detektion unterscheidlicher Viren. Sie benutzen einen Glasträger mit separierten Arraypositionen, wobei an die immobilisierten Oligonukleotide die Virus-Nukleinsäuren als analytische Ziele durch Hybridisierung gebunden werden. Der vorab mittels PCR in die Ziel-DNA eingeführte Farbstoff Cy-5 dient als optischer Indikator. Er markiert die Arrayposition, auf der eine Komplexbildung stattgefunden hat und erlaubt damit eine Identifizierung des analytischen Zieles.
• Alternativ zur direkten Farbgebung kann auch die Umwandlung des Produktes einer chemischen Reaktion direkt als Maß für die Ausbildung und Menge eines Affinitätskomplexes auf einer Arrayposition gemessen werden.
• Sehr effektiv werden affinitätsgebundene Zielmoleküle auf Arrays durch die Anbindung von Enzymen markiert. Solche Markerenzyme generieren z. B. aus messtechnisch inaktiven Substraten optisch oder elektrisch aktive Produkte. Die Messung von optisch aktiven Produkten nutzt die gleichen Prinzipien, wie vorstehend für die optische Markierung beschrieben. Bei elektrisch aktiven Produkten dient meist eine Redoxreaktion an Elektroden zur Signalerzeugung.
• Die Enzymmarkierung eines Affinitätskomplexes basiert in der Regel auf der bekannten und vielfältig genutzten ELISA-Technik. Unter Nutzung affinitätsbindender Moleküle oder Molekülgruppen wird diese Markierung in der Art von „sandwich”-Strukturen realisiert. Dabei wird das ganze Spektrum der in Molekularbiologie und Immunologie gebräuchlichen komplementären Komplexbildner benutzt. Sehr gut geeignet für solche Markierungen haben sich z. B. die Molekülpaare Biotin/Streptavidin, Digoxigenin/Anti-Digoxigenin oder auch Antikörper und anti-Antikörper erwiesen z. B. eine Fluorescein-Haftgruppe mit Anti-Fluorescein-Antikörper als Enzymkonjugat mit Peroxidaase. Ebenso geeignet sind Nukleotid Haftgruppen mit komplementärem Nukleotid-Enzymkonjugat (z. B. Aequorin).
• Dabei ist jeweils ein Bindungspartner am Affinitätskomplex gebunden, während der andere Partner am Markerenzym platziert wird. Nach erfolgter Markierung wird die Menge der auf einer Arrayposition durch ein Marker-Enzym (z. B. β-Galactosidase oder alkalische Phophatase) produzierten Produkte bestimmt. Entsprechend der Eigenschaften der enzymatisch erzeugten Produkte werden sowohl optische als auch elektrische Meßverfahren angewendet.
• Eine typische Anwendung für die elektrische Arraydetektion von DNA und Proteinen mittels enzymarkierter Affinitätskomplexe beschreiben R. Hintsche et. al. in „Fully electrical microarrays” in Electrochemistry of Nucleic acids and Proteins, Editors: E. Palecek, F. Scheller and J. Wang, 2005, Elsevier, Amsterdam, pp. 247–271. Das gleiche Prinzip wenden B. Elsholz et al., ”Automated detection and quantitation of bacterial RNA by using electrical microarrays” Anal. Chem. 2006, 78, S. pp. 4794–4802 zur RNA-Identifizierung an. Hier wird mit interdigitalen Elektroden auf jeder Arrayposition das elektrisch aktive p-Aminophenol gemessen, das durch Enzymmarkierung mit β-Galactosidase oder alkalischer Phophatase nach Ausbildung von Affinitätskomplexen ortsspezifisch erzeugt wird.
• Charakteristisch für alle bekannten Arrayanwendungen und unabhängig von der Art der Markierung oder der Auslesung ist, dass jeweils nur eine Spezies Fängermoleküle auf einer Arrayposition immobilisiert wird und damit jeweils eine Arrayposition nur einem Affinitätskomplex zugeordnet ist. Die Erweiterung der Zahl der mit einem Array zu identifizierenden Zielmoleküle wird bisher durch die Vergrößerung der Zahl der Arraypositionen erreicht. Weit fortgeschritten in dieser Richtung sind die so genannten hochdichten Mikroarrays mit denen umfangreiche genetische Informationen simultan untersucht werden können (vgl. Maitra et al. „The Human MitoChip: a high throughput sequencing Microarray for mitochrondrial mutation detection”,, Genome Res. 2004, 14: 812–819). Erreicht wird dies vorzugsweise durch Verkleinerung der Fläche der Arraypositionen und Auslesen mit Hilfe leistungsfähiger Laseroptiken (vgl. R Vairavan, ”An Automated Multiplexing Platform for Genomic and Proteomic Analyses,” IVD Technology 2008, 14, no. 1, 29–35).
• Einen anderen Weg zur Erhöhung der Zahl der Arrayposition pro Mikroarray zeigen Thewes et al. in Biosensors and Bioelectronics 2005, 20, 2435–2453 auf. Dies erreichten sie durch Integration von CMOS-Schaltungen unter die Arraypositionen von Si-Chips, wodurch der Platzbedarf für einzelne Arraypositionen verringert und die Gesamtzahl der Arraypositionen erhöht werden kann.
• Alle beschriebenen biochemischen Arrays gestatten keine Bestimmung mehrerer Analyte auf einer Arrayposition.
• Ein Verfahren um vier Fänger auf der Oberfläche eines Gefäßes im Gemisch zu immobilisieren danach unterschiedlich zu markieren und anschließend durch sequentielle Reaktionen zu identifizieren, beschreiben D. S. Elinis et al. in „Quadrupole-Analyte Chemiluminometric Hybridzation Assay. Application to double Quantitative Competitive Polymerase Chain Reaction”, Anal. Chem. 2007, 79, 9433–9440, auf. Dazu werden in einer mit Streptavidin beschichteten Kavität einer Mikrotiterplatte gleichzeitig vier unterschiedliche Nukleotidfänger immobilisiert. Nach der Hybridisierung von Zielmolekülen werden diese durch gebräuchliche Komplexbildungsreaktion mit vier verschiedenen Enzymen selektiv markiert und danach sequentiell vier verschiedene Enzymrektionen induziert. Jedes Enzym erzeugt dann Chemilumineszenz im Volumen des Gefäßes und ermöglicht das jeweils im Komplex gebundene Zielmolekül zu identifizieren. Für Arrays ist auch dieses Verfahren ungeeignet, da im überstehenden Flüssigkeitsvolumen vermessen wird.
• Aufgabe der Erfindung
• Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein effizientes und kostengünstiges Verfahren bereitzustellen, welches mehrere Analyte auf jeder physischen Arrayposition zu messen gestattet. Damit soll auf allen Arten von biochemischen Arrays, sowohl solchen mit optischen als auch solchen mit elektrischen Ausleseprinzipien die Anzahl der analytischen Ziele vervielfacht werden, ohne die physische Zahl der vorhandenen Arraypositionen erhöhen zu müssen.
• Erfindungsgemäße Lösung
• Die Aufgabe wird gelöst durch Bereitstellung eines Verfahrens zur multiplen Detektion von biochemischen Affinitätskomplexen in Arrayanordnungen umfassend die Schritte:
• • Immobilisierung von jeweils zwei oder mehr biochemischen Fängermolekülen im stochastischen Gemisch auf mindestens zwei Positionen analytischer Arrays unter Verwendung gebräuchlicher Techniken zur Immobilisierung
• • Bindung von jeweils zwei oder mehr unterschiedlichen Analytmolekülen an ihre komplementären Fänger auf jeder Arrayposition.
• • Spezifische und unterschiedliche Markierung von jeweils zwei oder mehr Analytmolekülen auf jeder Arrayposition mit chemisch oder physikalisch detektierbaren Gruppen.
• • Identifizierung von zwei oder mehr Analytmolekülen auf jeder Arrayposition mittels einer oder mehreren Messeinrichtungen.
• Der Erfindungsgedanke liegt darin, gebräuchliche biochemische Arrays, die nach Stand der Technik jeweils nur ein Zielmolekül pro Arrayposition zu identifizieren gestatten, mittels der erfindungsgemäßen Lösung nun für zwei oder mehr Ziele pro Arrayposition zu erweitern. Erfindungsgemäß werden dazu jeweils Gemische von zwei oder mehr Fängern auf einer gegebenen Arrayposition immobilisiert, die nach Anbindung ihrer jeweiligen Zielmoleküle durch biochemische Komplexbildung unterschiedlich markiert werden und somit auch im Gemisch leicht zu unterscheiden und zu identifizieren sind. Damit wird erstmals die Idee einer Art biochemischen Multiplexings realisiert. Dies vervielfacht die Zahl der mit gegebenen analytischen Arrays identifizierbaren analytischen Ziele, ohne dass die apparative Technik erweitert werden muß. Erfindungsgemäß werden mit der gleichen apparativen Technik die unterschiedlichen Markierungen auf den Arraypositionen sequentiell detektiert. Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft, weil es die erfindungsgemäße Aufgabe durch Kombination von prinzipiell gut bekannten Markierungsreaktionen und gebräuchlichen Reagenzien löst. Es ist besonders für den Einsatz in Durchflussvorrichtungen, z. B. Kartuschen geeignet, in welchen die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte rasch auszuführen sind.
• Erfindungsgemäß wird die Aufgabe insbesondere durch das Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Verfahrensansprüchen angegeben. Zugehörige Anordnungen und Varianten zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der Patentansprüche 2–10.
• Das erfindungsgemäße Verfahren laut Anspruch 1 wird auf gebräuchlichen analytischen Arrays ausgeführt, auf welchen lokal voneinander abgegrenzt verschiedene Positionen auf sogenannten Trägern angeordnet sind. Für die erfindungsgemäße Ausführung des Verfahrens ist grundsätzlich jedes Material geeignet auf welchem zwei oder mehrere Arraypositionen anzuordnen und messtechnisch zu erfassen sind. Bevorzugt besteht der Träger aus Silizium, Siliziumverbindungen, Glas, Keramik, Metall, Papier, einem oder mehreren Polymeren oder Kombinationen oder Schichten daraus. Des Weiteren kann der Träger insgesamt oder auf Teilen zusätzliche Beschichtungen aufweisen z. B. hydrophob-hydrophil abgegrenzte Bereiche, die eine lokalisierte Immobilisierung der Fängermoleküle in Arrayanordnung unterstützen. Auch strukturiert aufgebrachte Beschichtungen aus Metallen, wie Gold oder Polymeren oder Biopolymeren sind geeignet.
• Geeignet sind auch Arrays mit Oberflächen oder Schichten mit zusätzlichen optischen Eigenschaften zur Erfassung oder Generierung von optischen Signalen.
• Weiterhin geeignet sind auch Träger mit Arraypositionen, die durch mechanische Barrieren definiert sind. Eine weitere bevorzugte Form der Ausbildung besonders von elektrischen Arrays ist die Verwendung von Dünnfilm-metallelektroden z. B. kreisförmige oder strukturierte Goldflächen, wie z. B. Interdigitalelektroden.
• Die Immobilisierung der Sonden oder Fängermoleküle erfolgt laut Anspruch 1a) auf einem Träger auf zwei oder mehr separierten Arraypositionen. Die lokalisierte Beschichtung der Positionen wird dadurch erreicht, dass man die gelösten oder dispergierten Sonden oder Fängermoleküle in Tropfenform auf die vorbestimmten Arraypositionen aufbringt. Eine geeignete Aufbringung gelingt in besonderen Fällen auch durch Drucktechniken oder photolithographische Verfahren. Das erfindungsgemäß Neue ist dabei die Verwendung von zwei oder mehr Arten von Fänger- oder Sondenmolekülen, die jeweils als Gemische auf einer Position immobilisiert werden. Die Fängermoleküle binden dann jeweils molekülspezifisch zwei oder mehr unterschiedliche Zielanalyte auf der gleichen Position, wenn solche in der Analyseprobe vorhanden sind. Da alle Arraypositionen zwei oder mehr Fängermoleküle tragen, steigt erfindungsgemäß die analytische Kapazität, d. h. die Gesamtzahl der mit dem so vorbereiteten Array bestimmbaren analytischen Ziele wächst auf das Doppelte oder Mehrfache der Zahl der physisch vorhandenen Arraypositionen.
• Als Sonden oder Fängermoleküle können prinzipiell alle chemischen und biochemischen Moleküle genutzt werden, die Affinitätskomplexe ausbilden. Dies sind vor allem Nukleinsäuren und Oligonukleotide des DNA- oder RNA-Typs oder Proteine oder Peptide oder Haptene oder Kombinationen aus diesen.
• Die Immobilisierung der Sonden oder Fängermoleküle gelingt dadurch, daß diese auf den Arraypositionen durch chemisch-kovalente Bindungen oder chemische Wechselwirkungen wie van der Waalsche Kräfte oder polare Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrücken gebunden werden. Dazu werden gegebenenfalls Zwischenschichten aus anorganischen oder organischen Molekülen oder Polymeren oder Biopolymeren als Bindungsvermittler oder Haftschichten benutzt. Bevorzugt auf Arraypositionen mit Siliziumdioxid- oder Siliziumnitrid-Oberflächen oder Polymeren werden z. B. Verbindungen mit reaktiven Aldehyd- oder Carboxyl- oder Aminogruppen als Haftschichten aufgebracht, an welche die Sonden oder Fängermoleküle chemisch binden.
• Eine andere Art der Immobilisierung ist die Bindung der Fängermoleküle mittels Thiolgruppen an strukturierte Goldoberflächen. Allein das Auftropfen eines thiol-modifizierten Moleküls auf goldbeschichtete Positionen führt zur spontanen Bindung an eine solche Arrayposition. Ebenso gelingt die direkte Immobilisierung von Proteinen, wie Antikörpern auf Gold unter Beteiligung deren intrinsischer Schwefelgruppen und hydrophober Molekülteile.
• Hier setzt das erfindungsgemäße Verfahren an, indem die zwei oder mehr verschiedenen Fängermoleküle, die auf einer Position gebunden werden, gleiche reaktive Gruppen zur Immobilisierung aufweisen. Für die Fänger oder Sonden im Gemisch werden bevorzugt aber nicht notwendig anteilig gleiche Mengen gewählt.
• Die Bindung von Zielmolekülen an die Fänger gemäß Anspruch 1b, auch Komplexbildung genannt, erfolgt nach dem bekannten Schloß-Schlüssel-Prinzip von Biomolekülen, indem sich komplementäre Potentialfelder dieser Moleküle zu hochspezifischen Affinitätskomplexen verbinden.
• Zur Realisierung solcherart Komplexbildung werden die Arrays mit analytischen Proben in wässrigen Lösungen in Kontakt gebracht. Wenn in den Proben Zielmoleküle enthalten sind, binden diese ausschließlich mit „ihrem Fänger” auf einer Position des Arrays Affinitätskomplexe aus. Die spezifische Komplexbildung erfolgt z. B. im Falle von Nukleinsäuren oder deren Sequenzen als Fänger- und Ziele in Form der bekannten Hybridisierung mit der Ausbildung von Doppelsträngen. Bei Proteinen bzw. Peptidsequenzen als Fänger bzw. Ziele beruht das Erkennungs- und Bindungsprinzip bevorzugt auf den bekannten Antigen-Antikörper-wechselwirkungen. Bei kleineren Molekülen wie z. B. Haptenen, die sowohl als Fänger- als auch als Zielmolekül genutzt werden, dienen komplementäre Bindungsareale an Proteinen (z. B. an hapten-spezifischen Antikörpern) oder an Nukleinsäuren (z. B. Aptameren) als Bindungsstellen.
• In einem weiteren erfindungsgemäßen Schritt werden die entstandenen Affinitätskomplexe mit spezifischen Markern gem. Anspruch 1c markiert. Die Markermoleküle werden dazu entweder direkt oder mit Hilfe von Komplexbildnern an die Affinitätskomplexe aus Fänger und Analyten gebunden.
• Die Markierung der Affinitätskomplexe aus Fänger und Zielprotein oder aus Fänger und Zielnukleinsäuren nutzt unterschiedliche bekannte biochemische Reaktionen, die singulär auch in der ELISA-Technik oder der Histologie und anderen bekannten analytischen Methoden mit Molekülmarkierungen verwendet werden.
• Ein Hauptmerkmal der Erfindung besteht darin, diese im Prinzip bekannten und erprobten Markierungsverfahren in neuer Weise mit den arraygemäßen Detektionsverfahren zu kombinieren und damit mehrere Analyte im Gemisch auf einer physischen Arrayposition detektierbar zu machen. Bei zwei Arten von Fängermolekülen, die pro Arrayposition im Gemisch immobilisiert sind, werden dann zwei unterschiedliche für jeden Fänger selektive Markierungen benutzt. Die Zahl der Analyte pro Arrayposition läßt sich weiter erhöhen, indem man jeweils einen dritten Fänger pro Arrayposition verwendet und den korrespondierenden Analyten mit einem zusätzlichen Komplexbildner verknüpft. Auf vier oder mehr Analyte pro Arrayposition kann man erweitern, indem man in gleicher Weise weitere Fänger zumischt, die dann mit zusätzlichen Komplexbildnern wie z. B. spezifischen Nukleotidsequenzen mit 10–30 Basen verknüpft sind.
• Sie ist nur durch Verfügbarkeit von unterschiedlichen Markermolekülen im Zusammenwirken mit selektiv ausführbaren Markierungsverfahren begrenzt. Die mit der Erhöhung der Anzahl Fänger auf einer Position einhergehende Verdünnung ist selbstverständlich mit der Empfindlichkeit der Nachweisverfahren zu korrelieren. Sie ist gegebenenfalls durch Flächenvergrößerung zu kompensieren.
• Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet jede Art von Molekülen, Molekülresten oder Molekülkomplexen als Markierung zu benutzen, wenn sie auf einer Arrayposition unterscheidbar und damit einem Analyten spezifisch zuordenbar sind.
• Besonders geeignet sind dazu unterschiedliche Farbstoffe oder unterschiedliche Enzyme. Bei unterschiedlichen Farbstoffen, wie sie für die Markierung von Biomolekülen üblicherweise benutzt werden, gelingt die erfindungsgemäße Unterscheidung z. B. durch Messung bei unterschiedlichen Wellenlängen ihrer Absorptions- oder Emissionsspektren. Geeignet zur unterschiedlichen Markierung von zwei bis fünf verschiedenen Affinitätskomplexen im Gemisch sind z. B. die Fluoreszensfarbstoffe Cy 2 (Emission bei 506 nm), Cy 3 (Emission bei 570 nm), Cy 5 (Emission bei 667 nm), Cy 7 (Emission bei 767 nm). Beispielsweise wird die Anwesenheit und Menge eines mit Farbstoff CY 2 markierten Affinitätskomplexes mit einem Exzitationsmaximum bei 490 nm und einem Emissionsmaximum bei 508 nm bestimmt und danach die Anwesenheit und Menge eines mit Farbstoff CY 5 markierten Affinitätskomplexes mit einem Exzitationsmaximum bei 650 nm und einem Emissionsmaximum bei 674 nm. Dies ermöglicht auf der gleichen Arrayposition beide Farbstoffen zu bestimmen und sicher zu unterscheiden. Mit einem gebräuchlichen Laserscanner werden dabei alle Arraypositionen ortsbestimmt vermessen und somit auf jeder Position zwei unterschiedliche Affinitätskomplexe entweder mit Cy 2 oder mit Cy 5 markiert erkannt. Dies erlaubt in dieser beispielhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens die doppelte Zahl an analytischen Zielen zu identifizieren.
• Eine unterscheidbare Markierung der Affinitätskomplexe wird vorteilhaft auch durch unterschiedliche Markerenzyme wie Peroxidasen, Pseudoperoxidasen und Katalasen erreicht, die unterscheidbare Chemolumiszenz katalysieren oder optisch unterscheidbare Reaktionsprodukte bilden.
• In Analogie zur voranstehenden Chemilumeszenz gelingt die Unterscheidung von zwei oder mehr verschiedenen Affintätskomplexen im Gemisch auch durch Elektro-chemilumeszenz. Hierbei bewirken unterschiedliche Markermoleküle, wie anorganische halbleitende Komplexe mit [Ru(bpy)₃]²⁺(PF₆ ^–)₂, nach vorangegangener elektrischer Induktion frequenzspezifische optische Emissionen.
• Eine unterschiedliche Markierung gelingt erfindungsgemäß auch durch Bindung unterschiedlicher Enzyme an die Analyten auf jeder Arrayposition, wobei das aus der ELISA-Technik bekannte Prinzip der Komplexbildung angewendet wird. Geeignete Enzyme und deren Gebrauch als biochemische Marker sind Katalasen und Oxidasen wie z. B. alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase und Meerettich-Peroxidase. Die Identifizierung der Analyte nach der Markierung mit diesen Enzymen gelingt erfindungsgemäß durch Messung ihrer unterschiedlichen Produkte. Realisiert wird dies dadurch, daß man zeitlich nacheinander das gesamte Array zuerst mit Substrat für ein Enzym A (z. B. alkalische Phosphatase) und nach einem Waschritt dann mit Substrat für ein Enzym B (z. B. und β-Galaktosidase) in Kontakt bringt. Dabei erzeugt Enzym A ein anderes Produkt als Enzym B und wird durch deren Detektion und die sequentielle Abfolge der Meßschritte unterscheidbar und ist dadurch dem zugehörigen Analyten zuzuordnen.
• Einzelne Produkte von verschiedenen Enzymen lassen sich sehr gut elektrochemisch unterscheiden. Der an einzelnen Arrayelektroden gemessene Strom korreliert dann linear mit der Zahl der an der Elektrodenoberfläche dieser Arrayposition umgesetzten Enzymprodukte. Alternativ zu elektrochemischen Methoden sind diese Enzym-Analytkomplexe auch durch Enzymprodukte mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften beispielsweise im sichtbaren oder ultravioletten optischen Spektrum unterscheidbar. Wie vorstehend bei der elektrochemischen Detektion beschrieben werden die unterschiedlichen Substrate zeitlich nacheinander und durch Waschschritte getrennt dem Array zugeführt und die jeweils gebildeten Produkte spektroskopisch gemessen und positionsspezifisch identifiziert.
• Für die elektrochemische Detektion wird im Falle des Markerenzyms alkalische Phosphatase gewöhnlich p-Amino-phenyl-phosphat als Substrat angeboten, welches nach Abspaltung der Phosphatgruppe als p-Amino-phenol an Elektroden zu Chinonimin reagiert und amperometrisch gemessen wird.
• Als weiterer erfindungsgemäß geeigneter Enzymmarker wird β-Galactosidase an die Affinitätskomplexe gekoppelt, für die eine Varietät von Substraten verfügbar sind. Für elektrische Nachweisverfahren setzt sie aus elektrisch inaktiven p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid das p-Amino-phenol frei, das in analoger Weise elektrisch detektiert wird wie vorstehend für die Phosphatase beschrieben.
• Für optische Nachweise wird beispielsweise o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosidase, Naphthol-AS-BI-β-D-galactopyranosidase und 4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactopyranosidase eingesetzt.
• Für Nukleinsäuren als analytische Ziele bietet sich auch eine direkte Markierung mittels komplementärer Oligonukleotide an. Dazu werden diese Oligonukleotide, die schon Markermoleküle, wie Farbstoffe, Enzyme oder komplexbildende Molekülreste tragen durch Hybridisierung an eine vorab definierte komplementäre Stelle des jeweiligen Zielanalyten gebunden. Dies erreicht man z. B. durch den Einbau von komplexbildenden Molekülresten, wie Digoxigenin oder Biotin. Dazu werden diese als Molekülreste während der meist notwendigen Vervielfältigung der Zielanalyte durch PCR-Reaktionen diese Gruppen eingebaut. Dazu werden den PCR-Reaktionsmischungen (sogenannter Mastermix) mit solchen Molekülresten modifizierte Nukleoside (z. B. digoxigeninmodifiziertes Desoxyuridintriphosphat (dUTP)) beimischt. Die Detektion dieses Digoxigenins gelingt dann durch einen Anti-Digoxigenin-Antikörper, der mit einem der vorstehend beschriebenen Marker-Enzyme gekoppelt ist. Dieses setzt dann wiederum wie oben beschrieben eines der unterschiedlich detektierbaren Produkte frei.
• Das Komplexbildungsprinzip bei Biotin nutzt dessen Affinität zu Streptavidin, welches jeweils mehrere Bindungsstellen für Biotin besitzt. Dabei wird analog zu Digoxigenin verfahren. Auch Proteine, wie Antigene oder Antikörper oder Polypeptidkomplexe sind erfindungsgemäß detektierbar. Dafür stehen alternativ eine größere Zahl eingeführter Markierungsverfahren zur Verfügung. So wird beispielsweise nach der Ausbildung von Affinitätskomplexen aus Fängern auf dem Array und komplementären Zielanalyten ein zweiter spezifischer Antikörper, auch Detektions- oder Sekundärantikörper genannt, verwendet. Dieser wiederum ist mit einem Markerenzym oder Farbstoff gekoppelt (konjugiert). Solcherart markertragender Antikörper bindet komplementär ebenfalls an den Analyten im Affinitätskomplex, während nicht gebundener Antikörper abgewaschen wird. Dem Enzym wird in einem weiteren Schritt dann sein Substrat angeboten, das wie vorstehend beschrieben mit dem Enzym reagiert. Der Farbstoff oder das elektrodenaktive Produkt bildet sich lokalisiert dort, wo die immunchemische Reaktion stattgefunden hat und identifiziert so den Zielanalyten auf der spezifischen Arrayposition.
• Die Markierungsverfahren sind bekannt alle genannten Reagenzien sind handelsüblich. Die erfindungsgemäße unterschiedliche Markierung auf einer Arrayposition nutzt wie vorstehend beschrieben Spül- oder Waschschritte zur Aktivierung und Identifizierung der unterschiedlichen Marker auf jeder Arrayposition. Die Ausführung dieses Verfahrens erfolgt vorzugsweise in Durchflusseinrichtungen, wobei das jeweilige Array mit den wechselnden Flüssigkeiten in Kontakt gebracht wird, so dass sequentielle und aufeinander folgende Reaktionen die unterschiedliche Markierung auf den Arraypositionen zu realisieren sind.
• Prinzipiell ist aber das Verfahren auch in beliebigen Gefäßen, in denen Flüssigkeit ein Array benetzt, durchzuführen. Dazu werden die erforderlichen Flüssigkeiten sequentiell und manuell oder automatisch gewechselt.
• Für die Identifizierung der Analyte, die laut Anspruch 1c) auf den Arraypositionen erfindungsgemäß unterschiedlich markiert werden, werden verschiedene optische oder elektrische Verfahren.
• Für das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet sind übliche optisch wirkende Wandler und Messeinrichtungen, die die optischen Eigenschaften von Molekülen auf Trägern in Arrayformaten erfassen. Sehr gut geeignet sind dafür auch planare Arrays mit optisch aktiven Beschichtungen, die durch Wechselwirkung mit benachbarten Molekülen z. B. die ortsspezifische optische Identifizierung mittels „evanescent waves” gestatten.
• Zur optischen Detektion benutzt werden handelsübliche Meßgeräte mit Dioden und/oder Transistoren und/oder Lasern und anderen optischen Einrichtungen, die in der Lage sind die Arrays ortsspezifisch so zu vermessen, daß jede einzelne Arrayposition identifizierbar ist und die benutzten Markierungen unterscheidbar sind. Ein gut geeignetes Meßgerät ist z. B. ein strahlgeführter Laser, der erlaubt, Affinitätskomplexe, die z. B. mit fluoreszierenden Molekülresten markiert sind, auf üblichen Arrays zu lokalisieren und gegebenenfalls ihre Menge zu bestimmen. Ebenfalls gut geeignet sind Meßgeräte mit CCD- oder CMOS-Sensoren.
• Für das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignet sind elektrochemische Messgeräte. Die Arrays sind in diesem Fall z. B. als Gold oder Kohlenstoffelektroden ausgebildet. Die Arraypositionen werden einzeln mit amperometrischen oder voltametrischen oder impidimetrischen Messgeräten detektiert. Auch sogenanntes „imaging”, d. h. das simultane Abbilden aller Positionen des Arrays im auflösbaren Bild ist einsetzbar.
• Vorteilhaft sind insbesondere Siliziumchips mit Elektrodenarrays aus Gold, auf denen die Fänger oder Sondenmoleküle spontan oder mittels Linkern gebunden bzw. immobilisiert werden. Die elektrochemischen Signale von Markermolekülen und/oder ortsspezifisch gebildete Produkte von Enzymen werden besonders vorteilhaft mit externen Meßanordnungen oder mittels im gleichen Chip integrierten Halbleiterschaltungen vermessen. Besonders vorteilhaft ist hier wiederum eine amperometrische Messung der oben beschriebenen redoxaktiven Reaktionsprodukte von Markerenzymen. Dabei korreliert die Zahl der Analytmoleküle auf einer Arrayposition mit dem gemessenen elektrischen Redoxstrom.
• Ausführungsbeispiele
• Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Figurenbeschreibung im Zusammenhang mit den Ausführungsbeispielen und anhand der angehängten Zeichnungen, welche lediglich beispielhaft und veranschaulichend sind.
• 1a–c zeigen schematisch den Grundgedanken des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem schrittweisen Vorgehen auf zwei beispielhaften Positionen eines analytischen Arrays. Als schematisches Beispiel wird die Immobilisierung von Fängergemischen des Nukleinsäuretyps sowie die Bindung und Markierung der entsprechenden Analyten dargestellt. 1a zeigt eine Anordnung zur Durchführung des ersten Schrittes mit immobilisierten Nukleotidsequenzen als Fängermoleküle auf einem Array. Auf Arrayposition 1 wird ein Gemisch der Nukleotidsequenzen 3 + 4 und auf Arrayposition 2 ein Gemisch der Nukleotidsequenzen 5 + 6 immobilisiert. Die Immobilisierungstechnik ist Stand der Technik. Als Träger von Arrays werden hier insbesondere Gläser oder Siliziumchips oder Polymere verwendet, wobei die abgegrenzten Arraypositionen 1 und 2 z. B. durch eine konturierte Beschichtung mit Gold gebildet werden. Die Nukleotidsequenzen als Fängermoleküle 3, 4, 5, 6, binden mit einer am Ende der Kettenmoleküle befindlichen Thiolgruppe spontan auf Goldflächen. Dazu werden Gemische aus 3 + 4 durch Auftropfen oder Spotten auf die Arrayposition 1 aufgebracht. Gleiches geschieht mit dem Gemisch aus 5 + 6 auf Arrayposition 2. Diese beispielhafte Ausführung ist in analoger Weise mit zusätzlichen Arraypositionen und weiteren Fängergemischen erweiterbar.
• 1b zeigt die Anordnung mit den immobilisierten Nukleotidsequenzen wie in 1a nach Erkennung und Bindung der jeweils komplementären Analyte aus einer Analyselösung. Durch die bekannte hochspezifische Doppelstrangausbildung bei Hybridisierung erkennen und binden die Fänger-Nukleotidsequenzen selektiv nur ihren Zielanalyten, falls er in der speziell gepufferten Analyselösung vorhanden ist. Sind entsprechende Analyten in der Analyselösung vorhanden, binden Fänger-Nukleotidsequenz 3 selektiv den Zielanalyten 7, Fänger-Nukleotidsequenz 4 den Zielanalyten 8, Fänger-Nukleotidsequenz 5 den Zielanalyten 9, Fänger-Nukleotidsequenz 6 den Zielanalyten 10. Wesentlich für die Durchführung des erfindunsgemaßen Verfahrens ist, daß die Analyten, vorab kovalent mit komplexbildenden Molekülresten verknüpft worden sind. Dies wird vorab durch übliche PCR-Reaktion ausgeführt, mit denen die Analytmoleküle vor der eigentlichen Analyse routinemäßig vervielfältigt werden. Dabei werden die jeweiligen komplexbildenden Molekülreste an Nukleotide gebunden und durch Beimischung im Mastermix der PCR-Reaktion in die Analytmoleküle eingeführt.
• Wesentlich für die Erfindung ist, daß jeder der Analyte auf einer Arrayposition mit einem anderen Komplexbildner verknüpft ist. In 1b sind dies der Zielanalyt 7 mit kovalent verknüpftem Komplexbildner 11 und der Zielanalyt 8 mit kovalent verknüpftem Komplexbildner 12. Die gleichen Komplexbildner werden analog zur Markierung der Analyten auf allen anderen Arraypositionen verwendet. So trägt Zielanalyt 9 wieder den Komplexbildner 11 und der Zielanalyt 10 den Komplexbildner 12. Als Komplexbildner 11 und 12 sind beispielsweise Biotin und Digoxigenin geeignet.
• 1c zeigt eine Anordnung von hybridisierten Nukleotid-Analytkomplexen wie in 1b, wobei die Komplexbildner sogenannte Markerenzyme gebunden haben.
• Für den Fall, daß als Komplexbildner 11 Biotin verwendet wird, ist Streptavidin das Komplementärmolekül 13, welches vorab kovalent an Markerenzym 14 gebunden wurde. Als Markerenzym 14 eignet sich z. B. β-Galaktosidase sehr gut, die als Konjugat mit Streptavidin handelsüblich ist. Damit erreicht man eine zielgenaue und ausschließliche Bindung des Markerenzyms 14 nur an Biotin tragende Moleküle.
• In analoger Weise verfährt man mit der Enzymmarkierung der Analyte, die den Komplexbildner 12 tragen. Für den Fall, daß als Komplexbildner 12 Digioxigenin verwendet wird, wird Anti-Digoxigenin-Antikörper als Komplementärmolekül 15 verwendet. Komplementärmolekül 15 wird vorab kovalent an Markerenzym 16 gebunden. Als Markerenzym 16 ist alkalische Phosphatase sehr gut geeignet.
• Für das schrittweise Verfahren nach 1a–c spielt es keine Rolle, ob und wie viele Analyte in einer zu detektierenden Lösung vorhanden sind. Das Fehlen von einzelnen oder allen Analyten bewirkt dann nur, das die jeweiligen Fängermoleküle keinen Bindungspartner finden und somit unbesetzt bleiben. Nichtbesetzte Fängermoleküle bleiben unbeteiligt am weiteren Reaktionsgeschehen. Die weiteren Schritte des Verfahrens finden nur auf Positionen und an Molekülen statt, wo Fänger ihren spezifischen Analyten erkannt und gebunden haben.
• 2a und 2b zeigen schematisch die elektrische Detektion und Unterscheidung von Molekülkomplexen auf Arraypositionen wie in 1c ausgeführt.
• Die Enzymmarkierung auf Arrays mit einem Enzym und die ortsspezifische elektrische Detektion der Produkte zur Unterscheidung der einzelnen Arraypositionen ist gängige Praxis.
• Die erfindungsgemäße Enzymmarkierung und Arraydektion mit Gemischen von Fänger/Analyt-molekülen auf Arraypositionen stellt erfindungsgemäß ein neues Verfahren dar. Der neue Verfahrensschritt ist die Unterscheidung des jeweils zweiten Analyten mit seiner anderen Markierung mit Hilfe von zwei zeitlich aufeinander folgenden Schritten der Detektion, wobei zur Ausführung der Einzelschritte wiederum bekannte komplexchemische Methoden und Detektionsprinzipien angewendet werden.
• 2a zeigt den Verfahrensschritt A zur elektrischen Identifizierung von enzymmarkierten Fänger/Analytkomplexen wie in 1c. Dazu wird eine Lösung mit Enzymsubstrat 14ES über das gesamte Array gegeben. In Molekülkomplexen, in denen Markerenzym 14 vorhanden ist, bildet dieses daraus sein spezielles Produkt 14EP. Im Beispiel ist dies das elektrodenaktive Produkt p-Chinon-imin, welches aus dem Substrat 4-Aminophenyl β-D-galactopyranosid durch die β-Galactosidase gebildet wird. Zur eigentlichen Detektion wird mittels der auf Arrayposition 1 integrierten Elektrode 1E die amperometrische Oxidation des gebildeten Enzymproduktes 14EP gemessen.
• Ein elektrischer Arraydetektor, der als Multipotentiostat ausgeführt ist, misst den Strom ortsspezifisch an Arrayposition 1 in Milisekunden. Örtlich entstehendes Substrat 14EP kann auf der benachbarten Arrayelektrode 2E oder anderen Arrayelektroden wegen abstandsbedingter Diffusion und Verdünnung von 14EP keine amperometrischen Ströme verursachen. Damit wird das Analytmolekül 7 auf Arrayposition 1 sicher und selektiv identifiziert. Mögliches Markerenzym 14 auf Arrayposition 2 oder auf anderen Arraypositionen wird bei der Detektion auf Position 1 nicht wahrgenommen.
• Ein gleichzeitig vorhandener oder möglicher Komplex aus Fänger 4 und Analyt 8 markiert mit Markerenzym 16 auf der Arrayposition 1 bleibt ohne Reaktion, weil das Enzym nur mit seinem spezifischen Substrat zu reagieren vermag und 14ES nicht umsetzen kann.
• Nach der Messung an Elektrode 1E vermisst der Arraydetektor mittels sogenanntem Multiplexing die Elektrode 2E auf der Arrayposition 2. Falls bei vorhandenem Analyten 9 ein Molekülkomplex mit Fänger 5 entsteht, der wie auf Position 1 mit Markerenzym 14 markiert ist, entsteht auch auf Arrayposition 2 das elektrodenaktive Produkt 14EP aus dem über dem gesamten Array vorhandenen Substrat 14ES. Es wird ein Stromsignal an 2E gemessen und damit zweifelsfrei der Analyt 9 als vorhanden identifiziert.
• Auch auf Position 2 bleibt ein gleichzeitig vorhandener Komplex aus Fänger 6 und Analyt 10 markiert mit Markerenzym 16 ohne Reaktion.
• 2b zeigt den Verfahrensschritt B zur elektrischen Identifizierung von enzymmarkierten Fänger/Analytkomplexen wie in 1c.
• Nach dem Verfahrensschritt A wird die gesamte Reaktionsflüssigkeit über dem Array durch Spülung entfernt. Danach wird eine Lösung mit Enzymubstrat 16ES über das Array gespült. Der Enzymmarker 16, im Beispiel die alkalische Phosphatase, produziert aus dem Substrat 16ES dem 4-Aminophenyl-phosphat mono-natrium-hydrat das Produkt 16EP das p-Chinon-imin. Alle Molekülkomplexe mit dem Markerenzym 16 wandeln 16ES in das Enzymprodukt 16EP um. Mit dem Arraydetektor wird nun der amperometrische Strom durch Oxidation des Substrates 16EP mit Elektrode 1E und danach im Multiplexing folgend mit Elektrode E2 gemessen. Auf diese Weise werden auf Arrayposition 1 der von Fänger 4 gebundene Analyt 8 und auf Arrayposition 2 der von Fänger 6 gebundene Analyt 10 zweifelsfrei identifiziert. Analog aber umgekehrt zu Verfahrensschritt A in 2a bleiben im Verfahrensschritt B vorhandene Molekülkomplexe markiert mit Markerenzym 14 ohne Reaktion.
• Das in 1 und 2 schematisch beschriebene Ausführungsbeispiel mit β-Galaktosidase als Markerenzym 14 und alkalischer Phosphatase als Markerenzym 16 wird in einfacher Weise mit gebräuchlichen Reagenzien für die Enzymmarkierung ausgeführt. Man verwendet Biotin als Komplexbildner 11 und Digoxigenin als Komplexbildner 12. Das Streptavidin als Komplementärmolekül 13 ist mit β-Galaktosidase kovalent verknüpft und bindet nur an Biotin (11). Die alkalische Phosphatase ist mit Anti-Digoxigenin als Komplementärmolekül 15 kovalent verknüpft und bindet nur an Digoxigen (12). Beide Enzyme sind in dieser Form als sogenannte Konjugate handelsüblich.
• Da die Markeremzyme β-Galactosidase 14 und alkalischen Phosphatase 16 nur spezifisch mit ihrem eigenen, nicht aber mit dem Substrat des jeweils anderen reagieren, lassen sich die detektierten Signale jedem Fängermolekül und jeder Arrayposition sicher zuordnen.
• 3 zeigt das erfindungsgemäße Prinzip angewandt für Proteine oder Peptide oder Haptene als Zielanalyte. Das Ausführungsbeispiel zeigt die Verwendung von immobilisierten Antikörpern als Fängermoleküle und unterschiedliche optische Chromophore als Marker in den Affinitätskomplexen nach der Analytbindung.
• Dabei zeigt 3a eine Anordnung von Fängermolekülen, wobei auf Arrayposition 1 ein Gemisch der Antikörper 17 + 18 und auf Arrayposition 2 ein Gemisch der Antikörper 19 + 20 immobilisiert sind.
• 3b zeigt eine Anordnung von immobilisierten Fänger-Antikörpern wie in 3a, die ihre komplementären Analyten als Affinitätskomplex gebunden haben. Dabei bindet der Antikörper 17 den Zielanalyten 21, der Antikörper 18 den Zielanalyten 22, der Antikörper 19 den Zielanalyten 23 und der Antikörper 20 den Zielanalyten 24.
• 3c zeigt eine Anordnung von immobilisierten Antikörpern mit affinitätsgebundenen Analyten wie in 3b. Der Analyt bindet 21 einen weiteren Detektionsantikörper 25 der vorab kovalent mit dem Komplexbildner 11 verknüpft wurde. In analoger Weise bindet Analyt 22 den A Detektionsantikörper 26 mit kovalent verknüpftem Komplexbildner 12, Analyt 23 wiederum den Detektionsantikörper 27 mit kovalent verknüpftem Komplexbildner 11 sowie Analyt 24 den Detektionsantikörper 28 mit kovalent verknüpftem Komplexbildner 12.
• 3d zeigt eine Anordnung von immobilisierten Antikörpern mit affinitätsgebundenen Analyten und weiteren affinitätsgebundenen Antikörperkonjugaten wie in 3c in einer als „sandwich” bezeichneten Anordnung. Dabei werden als Komplexbildner 11 wiederum Biotin und als Komplexbildner 12 Digoxigenin verwendet. Strepavidin ist Komplementärmolekül 13, welches mit Markerenzym 14 der β-Galaktosidase kovalent verknüpft ist. Als Markerenzym 16 dient die alkalische Phosphatase, welche mit Anti-Digoxigenin entsprechend Komplementärmolekül 15 verknüpft ist. Im Detail bindet dann der an die Analyten gebundene Komplexbildner 11 jeweils sein Komplementärmolekül 13 welches kovalent mit Markerenzym 14 verknüpft ist. Alle Affintätskomplexe mit Komplexbildner 12 binden Komplementärmolekül 15, welches kovalent mit Markerenzym 16 verknüpft ist.
• Die Detektion der Zielanalyte in 3d erfolgt analog dem Verfahrensschema wie in 2a und 2b für Nukleinsäurekomplexe dargestellt. Dabei bildet die β-Galactosidase wieder das elektrodenaktive Enzymprodukt p-Chinon-imin 14EP aus dem Substrat 4-Aminophenyl β-D-galactopyranosid 14ES. Damit werden im ersten Verfahrensschritt (analog zu Schritt A in 2a) die Analyte 21 und 23 sequentiell detektiert. Im einem zweiten Verfahrensschritt (analog zu Schritt B in 2b) wird durch die alkalische Phosphatase das Produkt p-Chinon-imin 16EP aus dem Substrat 4-Aminophenyl-phosphat mono-natrium-hydrat 16ES gebildet und auf diese Weise die Analyte 22 und 24 sequentiell detektiert.
• Da in diesem Ausführungsbeispiel in Analogie zu 2 das Markeremzym β-Galactosidase nicht mit dem Phenyl-phosphat und die alkalische Phosphatase nicht mit dem Galactopyranosid reagieren und damit wechselseitig im jeweiligen Schritt A oder B kein Signal erzeugen, lassen sich auch hier die detektierten Signale jedem Fängermolekül und jeder Arrayposition sicher zuordnen.
• Für die Detektion von Proteinen ist es ebenso, wie für die Nukleinsäuredetektion, unerheblich, welche und wie viele Analyten in den Analyselösungen vorhanden sind. Ist kein Analyt als bindender Komplexpartner für alle oder einige Fängerantikörper auf dem Arrray vorhanden, nehmen diese an weiteren Reaktionen nicht teil und sind dann nicht detektierbar.
• Das in 3a, b, c, d schematisch beschriebene Ausführungsbeispiel für Proteine wird in Analogie zu dem in 1a, b, c beschriebenen Ausführungsbeispiel für Nukleinsäuren mit gebräuchlichen Reagenzien für die Enzymmarkierung ausgeführt. Beide Enzyme sind in der beschriebenen Form als sogenannte Konjugate mit den genannten Komplementärmolekülen handelsüblich oder gebräuchlich herzustellen.
• 4 zeigt ein Ausführungsbeispiel zur Anwendung optischer Detektionsverfahren für die erfindungsgemäße Mehrfachdetektion auf Arrays. Beispielhaft verwendet wird eine Anordnung von immobilisierten Nukleotidsequenzen wie in 1a. Wesentlich für diese Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die Analyten, vorab kovalent mit spezifischen chromophoren Molekülgruppen verknüpft worden sind. Dies erreicht man, wie schon für die Komplexbildner 11 und 12 beschrieben, mittels Polymerase-Reaktionen. Durch Beimischung entsprechender Nucleotide mit chromophoren Gruppen im Mastermix von PCR-Reaktionen werden diese in die Analytmoleküle eingeführt, so daß jeder der Analyte auf einer Arrayposition mit einem anderen Chromophoren kovalent verknüpft ist. Diese Maßnahme macht sie erfindungsgemäß auch im Gemisch optisch unterscheidbar.
• Auf dem Array bindet dann auf Arrayposition 1 die Fänger-Nukleotidsequenz 3 den Zielanalyten 7 mit kovalent verknüpftem Chromophor 29, die Fänger-Nukleotidsequenz 4 den Zielanalyten 8 mit kovalent verknüpftem Chromophor 30. Auf der Arrayposition 2 binden die Fänger-Nukleotidsequenz 5 den Zielanalyten 9 mit kovalent verknüpftem Chromophor 29 und Fänger-Nukleotidsequenz 6 den Zielanalyten 10 mit kovalent verknüpftem Chromophor 30.
• In einer praktischen Ausführung verwendet man als Chromophor 29 den Fluoreszensfarbstoff Cy 2 mit einem Exzitationsmaximum bei 490 nm und einem Emissionsmaximum bei 508 nm und als Chromophor 30 den Farbstoff CY 5 mit einem Exzitationsmaximum bei 650 nm und einem Emissionsmaximum bei 674 nm.
• 5 zeigt das Meßverfahren zur optischen Identifizierung von Analytgemischen auf Arrays mit einer Anordnung von Molekülen wie in 4.
• Beide Flureszenzfarbstoffe werden auf der gleichen Arrayposition ohne gegenseitige Beeinflussung angeregt und bei ihrer Emissionsfrequenz vermessen. Die optische Messung mit einem gebräuchlichen Laserscanner erfolgt ortsbestimmt und seuentiell wie folgt:
• – Schritt I: Anregen und positionssspezifisch Messen von Frequenzen des Chromophoren 29 auf Arrayposition 1
• – Schritt II: Anregen und positionssspezifisch Messen von Frequenzen des Chromophoren 29 auf Arrayposition 2
• – Schritt III: Anregen und positionssspezifisch Messen von Frequenzen des Chromophoren 30 auf Arrayposition 1
• – Schritt IV: Anregen und positionssspezifisch Messen von Frequenzen des Chromophoren 30 auf Arrayposition 2
• Dieses Vorgehen erlaubt in dieser beispielhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens die doppelte Zahl an analytischen Zielen zu identifizieren, als der physischen Menge der vorhandenen Arraypositionen entsprechen.
• Auch alternative image- oder chipbasierte optische Detektionsverahren mit geeigneter Ortsauflösung sind geeignet, ein Array wie in 4 schrittweise nach dem gleichen Prinzip zu vermessen. Dabei werden auf allen Arraypositionen alle Chromohoren 29 angeregt und positionsaufgelöst vermessen. Im folgenden zweiten Schritt geschieht gleiches mit Chromophor 30.
• Die optischen Meßverfahren sind besonders geeignet die Zahl der Fänger und Analyte pro Arrayposition mit zusätzlichen Chromophoren zu erhöhen, weil die Zahl chemischer Verfahrensschritte gering und das optische Meßverfahren mit geringerem Aufwand erweiterbar ist.
• Vorrichtungen, in denen mittels naßchemischer Verfahren das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt wird sind übliche chemische Gefäße oder Durchflußeinrichtungen, die es gestatten den Arrays die erforderlichen Reaktions- oder Spülflüssigkeiten zuzuführen. Besonders geeignet sind Durchflußeinrichtungen, wie z. B. Kammern, Röhren, Kassetten oder Schläuche, die es gestatten Flüssigkeitswechsel besonders rasch und effektiv vorzunehmen.
• 6 zeigt eine Vorrichtungen zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf einem planaren Arrayträger 31 der in einer Durchflußeinrichtung 32 plaziert ist. Der Wechsel von Flüssigkeiten 33 für die erfindungsgemäßen chemischen und biochemischen Reaktionen erfolgt durch Ein- und Ausleiten der Reaktionslösungen mit üblicher Technik. Eine elektrochemische Detektion entsprechend 2b ist leicht durchführbar, indem z. B. Elektrodenableitungen aus flüssigkeitsführenden Teilen herausgeführt werden.
• Es wird betont, dass die beschriebenen Ausführungsbeispiele lediglich beispielhaft sind, und vielerlei weitere Variationen bezüglich Komplexbildung, der Art der Detektion und der Reaktionsführung denkbar sind.
• Bezugszeichenliste

1

abgegrenzte Arrayposition 1 auf Arrayträger

1E

Elektrode mit Ableitung

2

abgegrenzte Arrayposition 2 auf Arrayträger

2E

Elektrode mit Ableitung

3

Fängermolekül mit Nukleotidsequenz 3

4

Fängermolekül mit Nukleotidsequenz 4

5

Fängermolekül mit Nukleotidsequenz 5

6

Fängermolekül mit Nukleotidsequenz 6

7

Analyt mit Nukleotidsequenz 7

8

Analyt mit Nukleotidsequenz 8

9

Analyt mit Nukleotidsequenz 9

10

Analyt mit Nukleotidsequenz 10

11

Komplexbilder 11

12

Komplexbilder 12

13

Komplementärmolekül 13

14

Markerenzym 14

14ES

Substrat des Markerenzyms 14

14EP

Produkt des Markerenzyms 14

15

Komlementärmolekül 15

16

Markerenzym 16

16ES

Substrat des Markerenzyms 16

16EP

Produkt des Markerenzyms 16

17

Fänger-Antikörper 17

18

Fänger-Antikörper 18

19

Fänger-Antikörper 19

20

Fänger-Antikörper 20

21

Zielanalyt 21

22

Zielanalyt 22

23

Zielanalyt 23

24

Zielanalyt 24

25

Detektionsantikörper 25 mit kovalent verknüpftem Komplexbildner 11

26

Detektionsantikörper 26 mit kovalent verknüpftem Komplexbildner 12

27

Detektionsantikörper 27 mit kovalent verknüpftem Komplexbildner 11

28

Detektionsantikörper 28 mit kovalent verknüpftem Komplexbildner 12

29

optischer Chromophor 29

30

optischer Chromophor 30

31

planarer Arrayträger

32

Durchflußeinrichtung

33

Flüssigkeit im Durchfluß

Claims (10)

1. Verfahren zur Detektion von Molekülen gekennzeichnet durch: a) Immobilisierung von Gemischen zweier oder mehr unterschiedlichen biochemischen Fängermolekülen auf zwei oder mehr Positionen analytischer Arrays. b) Bindung von jeweils zwei oder mehr unterschiedlichen Analytmolekülen auf jeder Arrayposition. c) Spezifische Markierung von jeweils zwei oder mehr Analytmolekülen auf jeder Arrayposition. d) Identifizierung der Analytmoleküle auf jeder Arrayposition mittels einer oder mehrerer Messeinrichtungen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei als Fängermoleküle Nukleinsäuren oder Oligonukleotide oder Proteine oder Peptide oder Haptene oder Kombinationen aus diesen immobilisiert werden.
3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1–2, wobei die Messeinrichtungen molekülspezifische Merkmale nach elektrischen und/oder optischen Prinzipien erfassen und diese den gebundenen Analytmolekülen auf den jeweiligen Positionen zugeordnet werden.
4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1–3, wobei die Messeinrichtungen Bestandteil der verwendeten Arrays sind.
5. Verfahren gemäß Ansprüchen 1–4, wobei die Arraypositionen als Teil von oder im Verbund mit optischen Wandlern oder Messeinrichtungen wirken und aus Gläsern, Metallen, Nichtmetallen, Polymeren oder deren Kombinationen bestehen und gegebenenfalls mit Beschichtungen aus diesen ausgestattet sind.
6. Verfahren gemäß Ansprüchen 1–5, wobei die Molekülkomplexe für jeden Analyten auf einer Arrayposition mittels unterschiedlichen Molekülen, Molekülresten oder Molekülkonjugaten markiert werden und dadurch unterscheidbar sind.
7. Verfahren nach Ansprüchen 1–6, wobei die Markierungen durch unterschiedliche Enzyme erfolgen.
8. Verfahren nach Ansprüchen 1–7, wobei die Markierungen durch Moleküle oder Molekülreste mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften erfolgen.
9. Verfahren gemäß Ansprüchen 1–8, wobei die Analytmoleküle in einem separaten Markierungs- oder Amplifikationsverfahren vorab mit einer spezifischen Haftgruppe oder einem Markermolekül versehen werden.
10. Verfahren nach Ansprüchen 1–9, das in einem Gefäß oder in einer Durchflusseinrichtung ausgeführt wird.

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