DE10126798A1

DE10126798A1 - Verfahren zur Bestimmung einer Probe

Info

Publication number: DE10126798A1
Application number: DE10126798A
Authority: DE
Inventors: Hermann Gaub; Kerstin Blank; Katrin Spinnler; Thao Mai
Original assignee: NANOTYPE GmbH
Current assignee: NANOTYPE GmbH
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2002-12-19
Also published as: US20050084855A1; US7700371B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Probe, bei dem eine Sonde von einem Stempel auf eine an eine Unterlage gebundene Probe übertragen wird. Das Verfahren ist insbesondere für Protein-Microarrays geeignet. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Ligandenassays, insbesondere Ligandenassays in Form von hochparallelisierten Proteinarrays.

Es existieren zahlreiche Assays, um Probensubstanzen nachzuweisen oder ihre Konzentration zu bestimmen. Nach einer Methode werden beispielsweise spezifische Antikörper auf einer Oberfläche immobilisiert, die Probenzusammensetzung wird dann mit der Antikörper-dekorierten Oberfläche in Kontakt gebracht, schließlich wird bestimmt, wie viel der nachzuweisenden Probensubstanz an der Oberfläche gebunden ist. Der Nachweis kann dabei prinzipiell auf zwei verschiedene Arten erfolgen. Entweder wird die gesamte Probenzusammensetzung selbst direkt markiert oder es erfolgt eine sekundäre Markierung durch ein Molekül, das spezifisch die nachzuweisende Probensubstanz erkennt.

Eine wesentliche Weiterentwicklung von Ligandenassays bestand in der Einführung von hochparallelen Mikroarrays von Nukleinsäuren oder Proteinen oder anderen als Rezeptor dienenden Molekülen. Eine Übersicht gibt Ekins, Clinical Chemistry, 1998, Vol. 44: 9, 2015- 2030. Ein Proteinarray beispielsweise unterscheidet sich von herkömmlichen Immuntests durch die hochgradige Parallelisierung einzelner Nachweise und die damit einhergehende Miniaturisierung und Verkürzung der durchschnittlichen Testdauer. Der Array besteht aus einer Vielzahl verschiedener Rezeptoren (Antikörper, Peptide, andere Scaffold-Proteine, DNA, RNA, RNA-Aptamere, usw.), die jeweils auf einem eigenen kleinen Bereich immobilisiert sind, wobei die Bereiche in einem Raster auf der Oberfläche verteilt sind. Gibt man eine Probezusammensetzung auf den Array, kommt es zur spezifischen Bindung der Probemoleküle an die jeweiligen Rezeptoren.

Die Bindung von Probemolekülen auf den verschiedenen Bereichen kann direkt oder indirekt nachgewiesen werden. Beim direkten Nachweis wird die Probe mit einer Markierung versehen. Als Beispiele sind die kovalente Anbindung von Fluorophoren, die Markierung der Probenzusammensetzung durch radioaktive Isotope oder im Fall von Aptamer-Chips die Anfärbung der gesamten an der Oberfläche gebundenen Proteinsubstanz mit Coomassie-Blue zu nennen. Ein großer Nachteil hierbei ist der Umstand daß die gesamten Substanzen der Probenzusammensetzung, nachzuweisende Probesubstanzen wie auch andere Stoffe, markiert werden und damit jede unspezifisch gebundene oder an der Oberfläche adsorbierte Substanz zum Hintergrund des Auslesesignals beiträgt.

Beim indirekten Nachweis wird ein zweiter (sekundärer) Rezeptor, hier als Sonde bezeichnet, gegen die am immobilisierten (primären) Rezeptor spezifisch gebundene Probensubstanz gerichtet. Man spricht hier auch vom Sandwichformat. Diese Sonde ist zum Beispiel durch Fluorophore oder Radioaktivität markiert oder mit einem Reporterenzym versehen (ELISA-Microarray). Hierbei wird nur noch die gesuchte Probensubstanz aus einer Probenzusammensetzung markiert. Das Signal zu Hintergrund Verhältnis des Auslesesignals ist damit deutlich besser als bei der direkten Markierung.

Die Sonde kann für ein bestimmtes Protein selektiv sein oder aber ein Epitop binden, das allen Probemolekülen gemeinsam ist. Ein Beispiel für eine nicht-selektive Sonde ist die Verwendung eines Anti-His-Tag-Antikörpers. Dieser kommt zum Einsatz, wenn es sich bei den Probemolekülen um rekombinante Proteine einer cDNA-Bank handelt, die mit einem His-Tag fusioniert wurden. Als Beispiel siehe Büssow et al. Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. 21, 5007-5008. Als weiteres Beispiel ist der "one side Assay"-ELISA zu nennen, bei dem Proteine als Rezeptoren an die Unterlage gebunden sind und in der Probenzusammensetzung spezifische Antikörper zu diesen Proteinen nachgewiesen werden sollen. Die Markierung der an den Proteinen gebundenen Antikörper erfolgt dann über sekundäre Antikörper-Enzym Komplexe welche spezifisch an die konstanten Domänen der gebundenen Antikörper binden. Das Enzym erzeugt dann einen Farbstoff oder einen Fluorophor, welcher das eigentliche Detektionssignal gibt. (Siehe: Joos et al. Electrophoresis, 2000, Vol 21, 2641-2650).

Die nicht-selektive indirekte Markierung ist jedoch in den Fällen, in denen die Probesubstanzen kein gemeinsames Epitop besitzen, z. B. beim Nachweis beliebiger nicht- rekombinanter Proteine, nicht anwendbar. In diesem Fall muß jedes nachzuweisende Probemolekül mit einer eigenen selektiven Sonde nachgewiesen werden.

Ein wichtiger Vorteil der Verwendung selektiver Sonden zur indirekten Markierung besteht in der Erhöhung der Spezifität des gesamten Tests. Unspezifisch an den Rezeptoren gebundene Probesubstanz, d. h. Liganden, die zu anderen Rezeptoren gehören, werden durch die selektive Sonde nicht markiert. Auf einem Array werden bei einer selektiven Markierung genauso viele Sonden benötigt wie Rezeptoren auf dem Array vorhanden sind.

Dies bringt mehrere Probleme mit sich:
Die relative Konzentration der zu einem bestimmten Liganden bzw. Rezeptor gehörenden Sonde nimmt mit zunehmender Anzahl der verwendeten Sonden ab, es steigt also die Anzahl der Sonden, die nicht spezifisch binden können, aber dennoch zum Hintergrund durch Adsorption und/oder unspezifische Bindung beitragen.

Unspezifisch gebundene Probesubstanz wird genauso wie spezifisch gebundene markiert da auf jedem einzelnen Rezeptorbereich jede Sonde vorhanden ist.

Ebenso wird Probesubstanz, die auf der Oberfläche adsorbiert ist, markiert.

Durch die gegebene Affinität der Sonden zu ihrem jeweiligen Liganden ist eine minimale Konzentration gegeben, die nicht unterschritten werden kann. Mit der hohen Parallelisierung und der damit verbundenen großen Zahl an verschiedenen Sonden steigt die Gesamtkonzentration der Sonden an. Eine Erhöhung der Sondenkonzentration führt aber wiederum zu einem stark erhöhten Hintergrundsignal durch Adsorption und unspezifische Bindung.

Ein weiterer Störfaktor, der bei einer hohen Parallelisierung von Nachweisen auf einem Chip an Bedeutung gewinnt, ist der der Kreuzreaktivität. Mit der Anzahl der nachzuweisenden Proben bzw. ihrer Rezeptoren steigt auch die Wahrscheinlichkeit, daß eine Sonde mit anderen als den ihr zugehörigen Probenmolekülen interagiert, bzw. daß sie mit einem Rezeptor interagiert.

Durch die verschiedenen unspezifischen Wechselwirkungen und die Adsorption von Probesubstanzen und Sonden kommt es zu einem starken Hintergrundsignal und damit einem niedrigen Signal/Hintergrund-Verhältnis, bei dem schwach exprimierte Proteine bereits nicht mehr nachgewiesen werden können.

Durch die unerwünschte Kreuzreaktivität kann es außerdem zu "falschen" Nachweisen von unerwünschten Proben oder von Rezeptormolekülen kommen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein vorteilhaftes Verfahren zur Bestimmung einer oder mehrerer Proben bereitzustellen.

Die Aufgabe wird gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung einer Probe. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Zusammensetzung, die möglicherweise die zu bestimmende Probe enthält, mit einer ersten Oberfläche ( Unterlage) in Kontakt bringt, so daß die möglicherweise in der Zusammensetzung enthaltene Probe an die Unterlage gebunden wird; eine zweite Oberfläche (= Stempel), an die eine Sonde, die an die Probe binden kann, gebunden ist, an die Unterlage annähert, so daß Sonde und Probe interagieren können, wobei die Bindung der Sonde an die Probe und die Bindung der Probe an die Unterlage unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler ist als die Bindung der Sonde an den Stempel; Stempel und Unterlage voneinander trennt; und bestimmt, ob die Sonde an die Unterlage gebunden ist oder wieviel Sonde an die Unterlage gebunden ist.

Der Begriff "Bestimmung einer Probe" kann den qualitativen Nachweis der Anwesenheit einer Probensubstanz oder die Bestimmung der Menge und/oder Konzentration der Probensubstanz umfassen. Ebenfalls können die Identifizierung und/oder jegliche Charakterisierung einer Probensubstanz anhand bestimmter physikalischer Parameter umfaßt sein.

Die Zusammensetzung, die möglicherweise die zu bestimmende Probe enthält, kann verschiedenster Art sein. In der Regel handelt es sich um Lösungen oder Suspensionen. Es können Zellysate oder -homogenate sowie Gewebeextrakte oder -homogenate eingesetzt werden. Es kann sich auch um zu analysierende Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin, Liquor, Lymphe usw. handeln. Die Zusammensetzung kann verdünnt worden sein, ebenso können geeignete Puffersubstanzen/-lösungen oder Salze zugesetzt worden sein. Die Ionenstärke und der pH-Wert der Zusammensetzung sind nicht besonders eingeschränkt, vorzugsweise liegen die Werte in einem Bereich, der die Bindung der Probe an die Sonde nicht stark beeinträchtigt. Bevorzugte pH-Bereiche sind 1 bis 13, bevorzugter 3 bis 11, am bevorzugtesten 4 bis 10. Die Zusammensetzung kann eine einzelne Probe enthalten, es können jedoch auch zwei oder mehrere zu bestimmende Proben in der Zusammensetzung enthalten sein. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Probe oder gleichzeitig mehrere verschiedene Proben bestimmt werden.

Die Art der zu bestimmenden Probe ist nicht besonders eingeschränkt. Üblicherweise handelt es sich um organische Verbindungen, vorzugsweise um Biopolymere. Als Probe sind aber auch Kleinmoleküle denkbar. Bevorzugte Proben sind Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate oder andere Biopolymere. Diese Proben können Modifikationen aufweisen, insbesondere chemische Modifikationen. Es ist auch möglich, daß unterschiedliche Arten von Biopolymeren miteinander verbunden sind. Denkbar ist auch, daß natürlicherweise nicht vorkommende Verbindungen oder Fragmente davon mit einem der genannten Biopolymere verbunden sind.

Am bevorzugtesten handelt es sich bei der zu bestimmenden Probe um ein Protein, Polypeptid oder Peptid. Das Protein, Polypeptid oder Peptid kann ein natürlicherweise vorkommendes Molekül sein, es kann sich aber auch um Fragmente, Abwandlungen, Konjugate und/oder Derivate davon handeln. Die Proteine, Polypeptide oder Peptide können aus einer natürlichen Quelle stammen oder rekombinant hergestellt worden sein oder chemisch synthetisiert worden sein. Sie können in nativer oder in nicht-nativer Form, beispielsweise denaturiert, vorliegen. Die Proteine, Polypeptide oder Peptide können posttranslationale Modifikationen aufweisen, sie können glycosyliert, phosphoryliert, acyliert und/oder amidiert sein. Sie können ein "tag" enthalten, beispielsweise eine Peptidsequenz, die als Epitop von einem Antikörper erkannt wird. Bekannte tag- Sequenzen sind 6xHis-tag, FLAG-tag, myc-tag, HA-tag, usw. Weitere tags sind dem Fachmann bekannt. Auch nicht-peptidische tags können enthalten sein. Proteine als Proben können mehrere Untereinheiten umfassen, es können Homo- oder Heterooligomere aus Polypeptiduntereinheiten sein.

In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zusammensetzung, die möglicherweise die zu bestimmende Probe enthält, mit einer ersten Oberfläche, im folgenden als Unterlage bezeichnet, in Kontakt gebracht, so daß die möglicherweise in der Zusammensetzung enthaltene Probe an die Unterlage gebunden wird. Die Unterlage kann eine beliebige feste Phase sein, vorzugsweise handelt es sich um eine Oberfläche aus Glas, Polydimethylsiloxan (PDMS), Nylon, Polystyrol oder andere Kunststoffe mit einer glatten Oberfläche.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß die Probenmoleküle nicht direkt an die Unterlage binden, sondern über Moleküle, die auf der Unterlage immobilisiert sind. Diese immobilisierten Moleküle (= Rezeptoren) erkennen spezifisch eine bestimmte Probe. Erfindungsgemäß ist die Bindung der Probe an den Rezeptor unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler als die Bindung der Sonde an den Stempel. Am bevorzugtesten handelt es sich bei diesen Rezeptoren um Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate, die die Probe erkennen und binden können. Die Antikörper können polyklonale oder monoklonale Antikörper sein, bevorzugt sind aber monoklonale Antikörper. Ebensogut können funktionelle Fragmente von Antikörpern oder Derivate davon eingesetzt werden, solange sie die Probe noch binden können. Bekannte Fragmente und Derivate sind Fv-, Fab-, Fab'- oder F(ab')₂-Fragmente, "single-chain antibody fragments", bispezifische Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper sowie Fragmente, die CDRs (complementarity determining regions) enthalten, die ein Epitop der Probe erkennen. Weitere bevorzugte Rezeptoren stellen Nukleinsäuren wie DNA (Desoxyribonucleinsäure) oder RNA (Ribonucleinsäure) und künstliche Nukleinsäuren wie LNA (Locked Nucleic Acid) und PNA (Peptide Nucleic Acid) und dreidimensionale Strukturen aus Nukleinsäuren, bevorzugt Aptamere, dar.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß an eine Unterlage nicht nur eine, sondern mehrere Proben gebunden werden. Wenn Antikörper, Fragmente oder Derivate davon als Rezeptoren eingesetzt werden, werden verschiedene solcher Moleküle mit Spezifität für verschiedene Proben auf definierten Bereichen der Unterlage, jeweils räumlich voneinander getrennt, immobilisiert. Solche Bereiche werden als "Spots" bezeichnet. Eine Unterlage kann bis zu 10.000 Spots/cm² umfassen. Man spricht auch von einem "microarray". Durch hochparallele Anordnung von Antikörpern mit unterschiedlichen Spezifitäten können viele verschiedene in einer Zusammensetzung enthaltene Proben spezifisch an die jeweiligen Spots auf der Unterlage gebunden werden. Die Immobilisierung der Antikörper, Fragmente oder Derivate davon kann auf verschiedene Weisen erfolgen. Wichtig ist dabei, daß die Bindung des Rezeptors an die Unterlage unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler ist als die Bindung der Probenmoleküle an die Rezeptoren und Sonden. Eine naheliegende Methode besteht darin, den Rezeptor zu biotinylieren und über ein Streptavidinmolkül mit der ebenfalls biotinylierten Unterlage zu verbinden. Monoklonale Antikörper können chemisch aktiviert werden, indem man bestimmte Gruppen ihrer Glycosylierungen zu Aldehydgruppen oxidiert. Diese Aldehydgruppen können wiederum Aminogruppen oder Hydrazidgruppen einer modifizierten Oberfläche binden (siehe: Solomon et al. Journal of Chromatographie, 1990, Vol. 510, 321-329). Eine weitere Methode, die dem Fachmann geläufig ist, ist die Konjugation von Aminogruppen des Antikörpers mit Carboxygruppen einer Oberfläche durch den Einsatz von Ethyl-(Dimethylamino)-Carbodiimid/N-Hydroxy-Succinimid.

Um unspezifische Wechselwirkungen der Probenmoleküle und Sonden mit der Unterlage zu minimieren wird die Oberfläche durch die Anbindung von Proteinsubstanzen oder Polymeren, bevorzugt durch die Anbindung von Polyethylenglycol passiviert.

Die Zusammensetzung, die möglicherweise die zu bestimmende Probe enthält, wird so lange mit der Unterlage in Kontakt gebracht, daß eine ausreichend hohe Effizienz der Bindung von Probensubstanzen an die Rezeptoren bei gleichzeitiger möglichst geringer unspezifischer Adsorption erreicht wird. Anschließend wird die Zusammensetzung entfernt, und die Unterlage wird gewaschen, um überschüssige Substanzen zu entfernen.

In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahren wird eine zweite Oberfläche, nachfolgend als Stempel bezeichnet, an die Unterlage angenähert. An den Stempel ist eine Sonde gebunden, die an die Probe binden kann. Die Annäherung von Stempel und Unterlage erfolgt dabei so, daß Sonde und Probe interagieren können. Anschließend werden Stempel und Unterlage voneinander getrennt und es wird bestimmt, ob die Sonde an die Unterlage gebunden ist bzw. wieviel Sonde an die Unterlage gebunden ist. Durch die Anbindung der Sonden an eine zweite Oberfläche gewährleistet die vorliegende Erfindung, daß im angenäherten Zustand zur Markierung der Probe die maximal mögliche Konzentration an Sonden vorhanden ist.

Üblicherweise bindet die Sonde selektiv an die Probe, sie ist spezifisch für eine bestimmte Probe. Vorzugsweise ist die Sonde ein Antikörper, ein Fragment oder Derivat davon. Die obenstehend in Bezug auf die Rezeptoren für die Probe angeführten Varianten von Antikörpern, Fragmenten und Derivaten davon sowie Nukleinsäuren sind ebenfalls als Sonden denkbar. Üblicherweise enthält die Sonde eine Markierung. Die Markierung kann von einer Detektionseinrichtung nachgewiesen werden. Vorzugsweise handelt es sich bei der Markierung um einen Fluoreszenzfarbstoff, beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Fluorescein, Rhodamin, Tetramethyl-Rhodamin-5-(und-6)-Isothiocyanat (TRITC), Texas Red, Cyaninfarbstoffe (CY3 oder CY5) usw. Fluoreszenzfarbstoffe sind vorteilhaft, da sie in sehr geringer Menge nachgewiesen werden können. In der Regel ist die Markierung kovalent mit der Sonde verbunden. Als weitere Möglichkeiten einer Markierung sind Reporterenzyme (ELISA) oder der Einsatz radioaktiver Isotope zu nennen. Der Stempel besitzt mechanische Eigenschaften, die einen guten Kontakt mit der Unterlage über die gesamte Fläche des Stempels ermöglichen. Der Begriff "guter Kontakt" beinhaltet den richtigen Abstand zwischen Unterlage und Stempel, der gewährleistet, daß die gebundenen Proben und Sonden sich nah genug aneinander befinden, daß sie interagieren können, jedoch gewährleistet ist, daß sie nicht durch mechanische Druckbelastung geschädigt werden. Zugleich muß gewährleistet sein, daß der Kontakt mit der Unterlage über die gesamte Fläche des Stempels gleich ist.

Der Stempel besteht in der Regel aus einem nicht zu steifen Material, das einen guten Kontakt mit der Unterlage gewährleistet. Bevorzugt werden polymere Materialien verwendet. Bevorzugtes Material des Stempels ist Polydimethylsiloxan (PDMS), das elastische Eigenschaften zeigt. Es sind verschiedene andere flexible Materialien oder Mischungen davon möglich. Ein anderes mögliches Stempelmaterial ist Polyacrylamidgel, dessen elastische Eigenschaften durch das Molekulargewicht und den Vernetzungsgrad den experimentellen Bedürfnissen angepaßt werden können. Der Stempel kann aus einem einzigen Material, einem Gemisch von Materialien oder auch einem System von Elementen aus einem oder verschiedenen Materialien aufgebaut sein.

Wesentlich für die vorliegende Erfindung ist, daß die Bindung der Sonde an die Probe und die Bindung der Probe an die Unterlage unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler ist als die Bindung der Sonde an den Stempel. Eine bevorzugte technische Umsetzung besteht darin, daß die Sonde nicht unmittelbar an das Stempelmaterial gebunden ist, sondern über zwei Bindungspartner, die einen Sensorkomplex bilden. Dabei ist der Stempel fest mit einem ersten Bindungspartner verbunden und die Sonde fest mit einem zweiten Bindungspartner. Der erste Bindungspartner kann kovalent mit dem Stempel verbunden sein, der zweite Bindungspartner kann kovalent mit der Sonde verbunden sein. Der erste und der zweite Bindungspartner können spezifisch oder unspezifisch aneinander binden, wobei die Bindung üblicherweise nicht kovalent ist. Dabei ist die Bindung der Sonde an die Probe und die Bindung der Probe an die Unterlage unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler als die Bindung des ersten Bindungspartners an den zweiten Bindungspartner.

Eine andere mögliche Umsetzung besteht darin, daß die Sonde über nur einen Binder an die Stempeloberfläche gebunden ist. Dieser Binder kann kovalent mit der Sonde verbunden sein. Der Binder bindet unspezifisch direkt an die Stempeloberfläche. Dabei ist die Bindung der Sonde an die Probe und die Bindung der Probe an die Unterlage unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler als die Bindung des Binders an den Stempel.

Vorzugsweise hat der erste Bindungspartner eine hohe Affinität bzw. eine geringe Dissoziationsrate zum zweiten Bindungspartner, bzw. der Binder eine hohe Affinität bzw. eine geringe Dissoziationsrate zur Stempeloberfläche. Dadurch wird verhindert, daß die Sonde frei in Lösung gelangt und vom Stempel abdissoziiert. Eine hohe Affinität bzw. eine geringe Dissoziationsrate bei gleichzeitig geringer Stabilität unter einer von außen angelegten Zugkraft kann durch die Variation der Bindungsweite der Bindung des ersten Bindungspartners an den zweiten Bindungspartner bzw. des Binders an die Oberfläche erreicht werden. Wird die Bindungsweite bei gleicher Bindungsenergie bzw. Aktivierungsenergie größer, vermindert sich die Kraft, die ausreicht um die Bindung zu trennen. In der Regel ist unter einer von außen angelegten Zugkraft die Bindung einer unspezifisch an einen Rezeptor gebundenen oder an die Unterlage adsorbierten Probensubstanz schwächer als die spezifische Bindung an einen Rezeptor. Damit läßt sich die Stabilität der Bindung der Sonde an den Stempel unter einer von außen angelegten Zugkraft so einstellen, daß sie stärker ist als die Bindung einer unspezifisch an einen Rezeptor gebundenen oder an die Unterlage adsorbierten Probensubstanz, aber schwächer als die spezifische Bindung der Sonde an die Probensubstanz und schwächer als die Bindung der Probensubstanz an den Rezeptor. Das hat den Vorteil, daß bei einer Interaktion der Sonde mit einer unspezifisch gebundenen oder adsorbierten Probensubstanz die Sonde nicht an die Unterlage gebunden wird, sondern an den Stempel gebunden bleibt. Bei herkömmlichen Verfahren, in denen eine die markierte Sonde enthaltende Lösung mit der Unterlage inkubiert wird, bindet die Sonde auch an die Unterlage, wenn sie an unspezifisch gebundene Probensubstanzen bindet, was zu einem erhöhten Hintergrund führt. Das kann durch die vorliegende Erfindung vermieden werden.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner natürliche oder künstliche Nukleinsäuren sind, bevorzugter handelt es sich um einzelsträngige DNA und/oder einzelsträngige RNA und/oder einzelsträngige LNA und/oder einzelsträngige PNA.

In einer weiteren Ausführungsform, in der die Sonde nur über einen Binder an die Stempeloberfläche gebunden ist, besteht dieser bevorzugt aus einem Polymer, das mit der Stempeloberfläche wechselwirkt. Das Polymer ist bevorzugt ein Biopolymer, eine Polyaminosäure oder ein Polyzucker, das bevorzugt über geladene oder polare Seitengruppen die Wechselwirkung mit der Unterlage vermittelt.

In einer besonderen Ausführungsform ist der erste Bindungspartner eine natürliche oder künstliche Nukleinsäure, deren 5'-Ende mit dem Stempel verbunden ist. Der zweite Bindungspartner ist eine natürliche oder künstliche Nukleinsäure, die mit dem ersten Bindungspartner hybridisieren kann und einen Nukleinsäureduplex ausbilden kann. In dieser Ausführungsform ist das 3'-Ende des zweiten Bindungspartners mit der Sonde verbunden. Eine entsprechend umgekehrte Anordnung ist ebenfalls möglich, nämlich daß das 3'-Ende des ersten Bindungspartners mit dem Stempel verbunden ist und das 5'-Ende des zweiten Bindungspartners mit der Sonde verbunden ist.

In einer weiteren Ausführungsform ist die Sonde ein Polypeptid, an dessen C-terminalem Ende kovalent eine Nukleinsäure gekoppelt ist. Derartige Verbindungen können beispielsweise durch die in WO 01/04265 offenbarten Verfahren hergestellt werden. Das Verfahren arbeitet mit mRNA Molekülen, die mit einem Puromycin-Tag modifiziert werden, und die an den C-Terminus ihres Polypeptids binden, nachdem sie in vitro exprimiert wurden.

In einer weiteren Ausführungsform wird die Sonde durch das 3'-Ende des zweiten Bindungspartners bzw. in der umgekehrten Anordnung das 5'-Ende des zweiten Bindungspartners dargestellt.

Die Sonde ist somit über die Wechselwirkung des Nukleinsäureduplex an den Stempel gebunden. Wird nun der Stempel an die Unterlage angenähert, reagiert die Sonde mit der Probe. Werden anschließend Stempel und Unterlage voneinander getrennt, so dissoziiert die Bindung zwischen erstem Bindungspartner und zweitem Bindungspartner. Die Kraft, die erforderlich ist, um diese Bindung zu trennen, ist verhältnismäßig gering, da der Nukleinsäureduplex gleichsam wie ein Reißverschluß auseinandergezogen wird. Während die Bindungsenergie und damit die Bindungsaffinität mit der Länge des Nukleinsäureduplexes wächst, bleibt die Kraft, die nötig ist um den Nukleinsäureduplex wie einen Reißverschluß zu trennen, konstant. Die große Bindungsaffinität zwischen den Nukleinsäuresträngen gewährleistet dabei, daß der Komplex nicht dissoziiert, ohne daß eine äußere Kraft an ihm anliegt bzw. daß die Sonde nicht frei in Lösung gelangen kann und an dem Stempel gebunden bleibt, solange sie nicht mit einer spezifisch an der Unterlage gebundenen Probe interagiert hat.

Ein weiterer Vorteil von Nukleinsäureduplexen als "Aufhängung" für die Sonde besteht darin, daß durch Variationen der Basen, insbesondere des GC-Gehalts, die Trennkraft des Duplexes genau eingestellt werden kann. Dem Fachmann ist bewußt, daß neben den Basen A, T, G, C und U auch andere Basen wie zum Beispiel Inosin oder künstliche Nukleinsäuren wie PNA und/oder LNA verwendet werden können und so die Trennkraft weiter variiert werden kann. Ebenfalls kann die Trennkraft durch Modifikationen von Basen variiert werden. Dadurch kann der Fachmann ein "Feintuning" der Trennkraft vornehmen.

Es ist nicht immer notwendig, die exakten Trennkräfte von erstem Bindungspartner/zweitem Bindungspartner und Sonde/Probe zu kennen. Es ist in der Regel ausreichend, die Größenordnung zu kennen, wenn sich die Trennkräfte der zwei Komplexe stark unterscheiden. So ist beispielsweise die Trennkraft zwischen Antigen und Antikörper in der Regel deutlich höher als die Kraft, die erforderlich ist, um einen Nukleinsäureduplex in der oben beschriebenen Weise "reißverschlußartig" zu trennen.

Die Trennkräfte zwischen zwei Molekülen lassen sich mit einem Kraftmikroskop direkt messen. In verschiedenen wissenschaftlichen Veröffentlichungen wurde diese Technik im Detail beschrieben. Antikörper-Antigen Trennkräfte liegen im Bereich von 50 pN bis 150 pN (Schwesinger et al., PNAS, 2000, Vol. 97, 18, 9972-9977); um einen Nukleinsäureduplex "reißverschlußartig" zu trennen müssen bei einer reinen A/T Sequenz 9 ± 3 pN und bei einer reinen C/G Sequenz 20 ± 3 pN aufgewendet werden (Rief et al., nature structural biology, 1999, Vol 6, 4, 346-349). Um dagegen einen Nukleinsäureduplex zu trennen, indem man eine Kraft an das 5'-Ende des Ersten und am 5'-Ende des zweiten Stranges bzw. auf die 3'-Enden ausübt, müssen je nach Anzahl der beteiligten Basenpaare 30-150 pN aufgebracht werden. Eine unter äußerer Kraft besonders stabile Bindung bildet Biotin zu Avidin aus. Um diese Bindung zu trennen müssen 160 ± 20 pN aufgebracht werden (Florin et al., Science, 1994, Vol 264, 415-417).

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß der Stempel mehrere voneinander getrennte Bereiche aufweist, in denen Sonden mit unterschiedlicher Spezifität für unterschiedliche Probemoleküle gebunden sind. Die Unterlage ist dabei in Form eines Microarrays ausgebildet, vorzugsweise in Form eines Proteinmicroarrays. Der Stempel wird mit dem Proteinarray in Kontakt gebracht, wobei die Sonden so angebracht sind, daß sie die Anbindungsfläche der korrespondierenden Probe bzw. des korrespondierenden Rezeptors überdecken. Gebundene Probemoleküle werden so mit der Sonde interagieren. Bei herkömmlichen Techniken, bei denen die Sonden als Gemisch in einer Lösung auf die Unterlage gegeben werden, kann jede Sonde auf jeder Anbindungsfläche mit den gebundenen Probensubstanzen wechselwirken. Es wird dabei die Probensubstanz markiert, unabhängig davon, ob sie spezifisch oder unspezifisch gebunden ist oder ob sie nur an der Oberfläche adsorbiert ist. Dies kann durch die vorliegende Erfindung vermieden werden. Da die Sonden so angebracht sind, daß sie nur die Anbindungsfläche der korrespondierenden Probe bzw. des korrespondierenden Rezeptors überdecken, wird dort nur die korrespondierende Probe nachgewiesen. Alle anderen dort unspezifisch gebundenen oder an die Oberfläche adsorbierten Probesubstanzen werden nicht markiert. Diese Art der direkten Adressierung einer Sonde an die Probemoleküle, die ihr zugehören, verhindert außerdem die eventuelle Kreuzreaktion der Sonde mit anderen Probemolekülen oder Rezeptoren.

Microarrays können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Vergleiche hierzu McBeath et al., Science, 2000, Vol. 289, 1760-1763 oder Lueking et al. Analytical Biochemistry, 1999, Vol. 270, 103-111. Der Nachweis der an die Unterlage gebundenen Sonde erfolgt ebenfalls durch Nachweis der Markierung mit an sich im Stand der Technik bekannten Methoden. Beispielsweise werden Fluoreszenzmarker durch Scannen mit einem Standard-Fluoreszenzscanner nachgewiesen.

Die Sonde dient insbesondere der Markierung der auf der Unterlage immobilisierten Probe. Eine Besonderheit der Erfindung liegt darin, daß die Sonde lokal der Stelle zugeführt wird, an der die zu ihr gehörende Probe gebunden ist. Der Vorteil ist, daß die Sonde dabei nicht frei in Lösung gelangt. Dies geschieht vorzugsweise dadurch, daß die Sonde auf einem Stempel mit geringer Kraft aber hoher Affinität angebunden wird. Der Stempel wird mit dem Protein-Array in Kontakt gebracht, wobei die Sonde so angebracht wird, daß sie die Anbindungsfläche der korrespondierenden Probe überdeckt. Probensubstanzen, die an einem Rezeptor gebunden sind, werden so auch mit der zugehörigen Sonde interagieren.

Trennt man den Stempel nun von der Unterlage, so kommt es zur Trennung der Bindung der Sonde zum Stempel, die Sonde verbleibt auf dem Protein-Array und markiert somit die zu ihr spezifische Probe. Trifft die Sonde beim Kontakt des Stempels mit der Unterlage auf kein Probemolekül, zu der sie spezifisch ist, so verbleibt sie am Stempel. Durch den beschriebenen Ablauf wird gewährleistet, daß nur diejenigen Probenmoleküle mit einer Sonde markiert werden, die spezifisch an eine Sonde gebunden haben. Alle Probenmoleküle, die unspezifisch an die Unterlage gebunden haben, bleiben unmarkiert und tragen so nicht mit zum Hintergrund bei.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine Vorrichtung zur Bestimmung einer Probe. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt eine Oberfläche (Stempel), an die eine Sonde gebunden ist, die an die zu bestimmende Probe binden kann, wenn sie mit ihr in Kontakt kommt, wobei die Bindung der Sonde an die Probe unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler ist als die Bindung der Sonde an den Stempel. Die bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung entsprechen den bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und wurden obenstehend erläutert.

Vorzugsweise ist ein erster Bindungspartner fest mit dem Stempel verbunden und ein zweiter Bindungspartner fest mit der Sonde verbunden, wobei der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner nicht kovalent aneinander binden können. Vorzugsweise sind der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner Nukleinsäuren wie DNA und/oder RNA.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erste Bindungspartner eine Nukleinsäure, dessen 5'-Ende mit dem Stempel verbunden ist, der zweite Bindungspartner ist ebenfalls eine Nukleinsäure, wobei das 3'-Ende des zweiten Bindungspartners mit der Sonde verbunden ist. Ebenso kann das 3'-Ende des ersten Bindungspartners mit dem Stempel verbunden sein und das 5'-Ende des zweiten Bindungspartners mit der Sonde verbunden sein.

Vorzugsweise weist der Stempel mehrere abgegrenzte Bereiche auf, in denen verschiedene Sonden mit unterschiedlicher Spezifität für verschiedene Proben gebunden sind. Der Stempel dieser Vorrichtung kann dann an eine entsprechende Unterlage angenähert werden, auf der verschiedene Proben in Form eines Arrays gebunden sind.

Die Vorrichtung kann weiterhin eine weitere Oberfläche (Unterlage) umfassen, auf der eine oder mehrere Proben immobilisiert werden können. Ebenfalls kann sie eine Einrichtung zum Annähern und Trennen von Unterlage und Stempel und/oder eine Einrichtung zur Bestimmung, ob die Sonde an die Unterlage gebunden ist, umfassen.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung einer Probe zur Verfügung, durch das eine hochspezifische Markierung immobilisierter Probenmoleküle erreicht wird. Dadurch kann eine Reduktion des Signal/Hintergrund-Verhältnisses erzielt werden, was zu einer höheren Spezifität führt.

Die Erfindung kann vielfältig eingesetzt werden: Es können Expressionsprofile von Zellen oder Geweben verglichen werden. Beispielsweise ist es möglich, das Expressionsprofil von Krebszellen und "normalen" Zellen zu vergleichen. Solche Vergleiche können auch diagnostisch eingesetzt werden. Es ist auch möglich, den Einfluß bestimmter Stoffe auf die Expression von Zellen zu untersuchen.

Eine wichtige Anwendung ist auch der Nachweis von Erkrankungen. Bestimmte Körperflüssigkeiten können durch ein Array verschiedener Antikörper untersucht werden, die Anwesenheit bzw. Konzentration eines spezifischen Antigens in der Probenzusammensetzung kann dann auf eine bestimmte Erkrankung hindeuten. So können in einem Experiment zahlreiche Aussagen gewonnen werden. Für den Fachmann sind weitere mögliche Anwendungen denkbar.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt das Prinzip eines Ligandenassays, bei dem eine Probenzusammensetzung mit einer Unterlage in Kontakt gebracht wird. Neben spezifischer Bindung an einen Rezeptor kommt es zu unspezifischer Bindung von Proben an die Unterlage. Unterhalb ist eine Erklärung der verwendeten Symbole angegeben, die für alle Figuren gilt.

Fig. 2 zeigt einen "Spot" auf einer Unterlage mit spezifisch an die Probe gebundener markierter Sonde, unspezifisch gebundenen Proben und unspezifisch gebundener Sonde.

Fig. 3 zeigt eine Unterlage mit drei "Spots" auf einer Unterlage. Jeder "Spot" trägt einen Antikörper, der spezifisch für ein Probenmolekül ist. Durch viele "Spots", zahlreiche verschiedene Proben und zahlreiche verschiedene spezifische markierte Sonden steigt der Hintergrund stark an. Der Hintergrund wächst proportional zur Anzahl der "Spots".

Fig. 4 zeigt schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.

A) Auf einer Unterlage befinden sich drei "Spots", auf denen jeweils Antikörper mit einer bestimmten Spezifität immobilisiert sind. Nach Inkubation mit einer Probenzusammensetzung sind die Antikörpermoleküle von zwei "Spots" mit Probenmolekülen dekoriert, das Antikörpermolekül des dritten "Spots" weist keine Bindung auf, da die Probenzusammensetzung keine entsprechende Probe enthielt. Auf den "Spots" befinden sich ebenfalls unspezifisch gebundene Probenmoleküle. Oberhalb ist ein Stempel gezeigt, der drei komplementäre "Spots" aufweist, die mit einem ersten Bindungspartner verbunden sind. Daran gebunden ist ein zweiter Bindungspartner, der fest mit einer markierten Sonde verbunden ist. Die markierten Sonden eines jeden "Spots" weisen ebenfalls eine bestimmte Spezifität für das Probenmolekül auf. Die Stempeloberfläche wird nun so angeordnet und an die Unterlage angenähert, daß die markierten Sonden mit den immobilisierten Probenmolekülen interagieren können.
B) Anschließend werden Stempel und Unterlage voneinander getrennt. Die beiden linken "Spots" der Unterlage enthalten nun Probenmoleküle, an die markierte Sonden gebunden sind, da die Kraft, die erforderlich ist, um die Sonde von der Probe zu trennen, höher ist, als die Kraft, die erforderlich war, um den ersten Bindungspartner vom zweiten Bindungspartner zu trennen. Bei dem dritten "Spot" (rechts) konnte die Sonde nicht mit einer spezifisch gebundenen Probe interagieren. Deshalb wurde der Komplex aus erstem und zweitem Bindungspartner nicht getrennt. In einem weiteren Schritt kann nun bestimmt werden, ob die Sonden bzw. wieviel der jeweiligen Sonden an die entsprechenden "Spots" der Unterlage gebunden ist.

Die Darstellungen der Fig. 1 bis 4 sind nicht maßstabsgetreu, um die Klarheit zu erhöhen. Der Übersichtlichkeit halber ist nur ein Antikörpermolekül pro "Spot" gezeigt. Die zur Beschreibung der Erfindung verwendeten Begriffe werden folgendermaßen definiert:
Adsorption: Bindung eines Liganden oder einer Sonde an die Chip-Oberfläche, wobei die Bindung nicht über einen Rezeptor vermittelt wird.
Rezeptor: Ein Molekül, das einen Liganden spezifisch bindet, insbesondere ein Molekül, das eine Probe spezifisch bindet.
Ligand: Ein Molekül, das einen Rezeptor spezifisch bindet.
Spezifisch: Eine Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen, die auf einem hohen Maß an molekularer Erkennung beruht, ist spezifisch. Eine molekulare Erkennung, wie sie etwa für die Wechselwirkung eines Enzyms mit einem Substrat in der Substratbindungstasche, eines Antikörpers mit einem Antigen über seine "complementarity determining regions" (CDR) oder eines DNA-Einzelstrangs mit einem weiteren komplementären Einzelstrang über Watson-Crick-Basenpaarung typisch ist. Ein Rezeptor mit hoher Spezifität bindet innerhalb einer Population verschiedener Liganden nur einen oder wenige, wobei ein Rezeptor geringer Spezifität innerhalb der gleichen Population mehrere oder viele Liganden bindet.
Unspezifisch: Eine Wechselwirkung eines Moleküls mit einem anderen Molekül oder einem Körper, die nicht auf einem hohen Maß molekularer Erkennung beruht, ist unspezifisch.
Selektive Sonde: Eine Sonde, die nur einen oder sehr wenige Liganden eines Probegemischs bindet.
Direkte Markierung: Eine Markierung, die direkt und nicht mittels einer Sonde an eine Probe angebracht wird.
Indirekte Markierung: Eine Markierung, die mittels einer Sonde an eine Probe angebracht wird.
Kreuzreaktion: Unerwünschte, spezifische Wechselwirkung einer Sonde oder eines Rezeptors mit einer Probe oder einer Sonde mit einem Rezeptor.
Sonde: Ein Molekül, das einen Liganden, der eine Probe darstellt, bindet und zur Markierung dieses Liganden verwendet wird.
Bindungsweite: Die Wegstrecke, über welche die Bindungsenergie aufgebracht werden muß, wenn man den Komplex trennt.

Durchführungsbeispiele Beispiel 1 Biotin-Streptavidin

Zur Demonstration des gerichteten Aufbringens der fluoreszenzmarkierten Sonden wurden die Probenmoleküle über Polymerspacer kovalent an der Unterlage angebunden. Als Probe wurde Biotin und als Sonde fluoreszenzmarkiertes Streptavidin verwendet. Die Bindung der Probe an die Unterlage über Rezeptoren wurde hier durch eine kovalente Bindung ersetzt. Der Sensorkomplex wird durch eine Streptavidin-Iminobiotin Bindung dargestellt. Iminobiotin wird auf dem Stempel spiegelbildlich zu den Biotin-Spots der Unterlage so an den Stempel gekoppelt, daß die Iminobiotin-Streptavidin-Spots auf dem Stempel während des Kontakts der Oberflächen auf den Biotin-spots zu liegen kommen.

Da die Streptavidin-Iminobiotin Bindung schwächer ist als die Streptavidin-Biotin Bindung und diese schwächer als die kovalente Bindung des Biotins an die Unterlage, läßt sich das auf der Unterlage gebundene Biotin durch einen gezielten Übertrag des Streptavidins von den Iminobiotinspots auf die Probe nachweisen.

Herstellung des Stempels

Es wurde ein mikrostrukturierter Stempel aus PDMS (Polydimethylsiloxan) gefertigt. Die Strukturen bestanden dabei aus Stempelfüßchen von ca. 100 × 100 µm, die durch Vertiefungen von ca. 25 µm Breite und 1 µm Tiefe getrennt wurden. Hierzu wurde ein Ansatz aus einer 1 : 10 Mischung von Silikonelastomer und Vernetzungsreagenz (Sylgard 184, Dow Corning) nach mehrfachem Entgasen auf einen entsprechend strukturierten Silikonwafer gegossen und für 24 h bei RT inkubiert. Nach der Polymerisierung wurde die strukturierte Oberfläche des Stempel bei 1 mbar in einem Plasmaofen für 15 s einem H₂O- Plasma ausgesetzt.

Beschichtung des Stempels

Die oxidierte Stempeloberfläche wurde mit 2% Triethoxyaldehydsilan (Amchro, Hattersheim, Deutschland) in 10% H₂O und 88% Ethanol für 30 min inkubiert. Die silanisierte Oberfläche wurde mit Ethanol und mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen. An die Aldehydgruppen des Silans wurde ein bifunktionales PEG angebunden dessen eines Ende über Aminogruppe, das andere über eine Carboxygruppe verfügte. 20 µl einer Lösung mit 20 mg/ml NH2-PEG-COOH (Shearwater, Huntsville) wurden unter einem Deckglas für 1 h auf einem Stempel mit einer Fläche von 1 cm² inkubiert. Es wurde mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen. Anschließend wurden die Schiffschen Basen mit 1%gew Natriumborhydrid in H2O, 15 min reduziert.

Iminobiotinhydrazid (Sigma, St. Louis) wurde aus einer PBS Lösung (Phosphate Saline Buffer; Sigma) mit 5 mg/ml mit 5 mg/ml EDC (1-Ethyl-3-(3-Dimethylamino-propyl)carbiimide; Sigma) und 5 mg/ml NHS (N-hydroxy-succinimid; Sigma, St. Louis) an die Carboxygruppen des PEGs angebunden. Die Unterlage wurde mit Reinstwasser gespült und mit Stickstoff trocken geblasen.

Der Stempel mit dem immobilisierten Iminobiotin wurde mit 0,1 mg/ml Alexa-Fluor®-546- Streptavidin-Konjugat in PBS mit 0.02%Vol Tween20 inkubiert, mit Reinstwasser gespült und mit Stickstoff trocken geblasen.

Beschichtung der Unterlage

Als Unterlage wurden Aldehydsilan beschichtete Glasobjektträger (Genpak, Brighton, UK) verwendet. An die Aldehydgruppen des Silans wurde ein bifunktionales PEG angebunden, dessen eines Ende über eine Aminogruppe, das andere über eine Carboxygruppe verfügte. 20 µl einer Lösung mit 20 mg/ml NH2-PEG-COOH (Shearwater, Huntsville) wurden unter einem Deckglas für 1 h auf einem Stempel mit einer Fläche von 1 cm² inkubiert. Es wurde mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen. Anschließend wurden die Schiffschen Basen mit 1%gew Natriumborhydrid in H2O, 15 min reduziert.

Biotinhydrazid (Sigma, St. Louis) wurde aus einer PBS Lösung (Phosphate Saline Buffer; Sigma) mit 5 mg/ml mit 5 mg/ml EDC (1-Ethyl-3-(3-Dimethylamino-propyl)carbiimide; Sigma) und 5 mg/ml NHS (N-hydroxy-succinimid; Sigma, St. Louis) an die Carboxygruppen des PEGs angebunden. Die Unterlage wurde mit Reinstwasser gespült und mit Stickstoff trocken geblasen.

Übertragen der Sonde

Die Oberflächen wurden unter PBS Lösung so einander angenähert, daß das auf dem Stempel gebundene Streptavidin mit der an der Unterlage gebundenen Probe, dem kovalent gebundenen Biotin, interagieren kann. Nach einer Inkubationszeit von 30 min wurden die Oberflächen voneinander getrennt.

Messung

Die Unterlage wurde mit einem Laser-Scanner (Perkin Eimer GeneTac LS IV) nach der übertragenen Sonde, dem Alexa-Fluor®-546 markierten Streptavidin abgescannt.

Beispiel 2 DNA-DNA

Es sollen verschiedene nicht markierte DNA Moleküle in einem Probengemisch nachgewiesen werden. Die Rezeptoren werden durch DNA Moleküle dargestellt, die mit dem 3' Ende an die Unterlage gebunden sind. Diese hybridisieren jeweils spezifisch mit einem Bereich am 5' Ende des DNA Probenmoleküls. Die zugehörigen Sonden werden durch markierte DNA Moleküle dargestellt, die mit einem am 3' Ende des Probenmoleküls liegenden Bereich hybridisieren können. Der erste Bindungspartner des Sensorkomplexes ist ein DNA Molekül, dessen 5'-Ende mit dem Stempel verbunden ist. Der zweite Bindungspartner des Sensorkomplexes wird durch einen Bereich am 5' Ende des DNA Sondenmoleküls dargestellt. Durch diese Anordnung greift die Zugkraft beim Auseinanderziehen der Oberflächen an den beiden 3'-Enden des Rezeptor/Probe- Duplexes und an den beiden 5'-Enden des Sonde/Probe-Komplexes an. Beim Sensorkomplex greift die Kraft hingegen an dem freien 3'-Ende und dem freien 5'-Ende an, was eine reißverschlußartige Auftrennung des Sensorkomplexes ermöglicht.

Die Sonden werden auf dem Stempel spiegelbildlich zu den Rezeptor-Spots der Unterlage gekoppelt, daß die Spots mit den Sonden während des Kontakts der Oberflächen stets auf den Spots mit den zugehörigen Rezeptoren zu liegen kommen. Ist eine Probe an den Rezeptoren gebunden, kann in der Kontaktphase die zugehörige Sonde an das 3' Ende der Probe binden. Da der reißverschlußartig hybridisierte Sensorkomplex eine geringere Stabilität unter einer an das gesamte Konjugat angelegten Zugkraft besitzt, öffnet sich beim Trennen der Oberflächen der Sensorkomplex, während die fluoreszenzmarkierte Sonde an der Probe gebunden bleibt.

Herstellung des Stempels

Beschichtung des Stempels

Die oxidierte Stempeloberfläche wurde mit 3% Aminopropyldimethylethoxysilan (ABCR, Karlsruhe, Deutschland) in 10% H₂O und 87% Ethanol für 30 min inkubiert. Die silanisierte Oberfläche wurde mit Ethanol und mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen. An die Aminogruppen des Silans wurde ein bifunktionales NHS-PEG-Biotin (Shearwater, Huntsville) angebunden. 20 µl einer Lösung mit 20 mg/ml des PEG wurden unter einem Deckglas für 1 h auf einem Stempel mit einer Fläche von 1 cm² inkubiert. Es wurde mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen.

An das Biotin wurde Streptavidin (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) 0,1 mg/ml in PBS angebunden. Die Anbindung des Biotin-Oligos erfolgte aus 25 µM in PBS, 20 µl unter einem Deckglas in 30 min. Die fluoreszenzmarkierten (Cy3) Sonden wurden aus 25 µM in 20% SSC20 mit 80% H2O bei 70C° in 3 µl Tröpfchen je Spot angebunden. Während des Anbindens konnte die Probe innerhalb von 30 min auf RT abkühlen.

Beschichtung der Unterlage

Als Unterlage wurden Aldehydsilan beschichtete Glasobjektträger (Genpak, Brighton, UK) verwendet. An die Aldehydgruppen des Silans wurde ein bifunktionales PEG angebunden, dessen eines Ende über Aminogruppe, das andere über eine Carboxygruppe verfügte. 20 µl einer Lösung mit 20 mg/ml NH2-PEG-COOH (Shearwater, Huntsville) wurden unter einem Deckglas für 1 h auf einem Stempel mit einer Fläche von 1 cm² inkubiert. Es wurde mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen. Anschließend wurden die Schiffschen Basen mit 1%gew Natriumborhydrid in H2O, 15 min reduziert.

Die Carboxygruppen des angebundenen PEG wurden mit 5 mg/ml EDC (1-Ethyl-3-(3- Dimethylamino-propyl)carbiimide; Sigma) und 5 mg/ml NHS (N-hydroxy-succinimid; Sigma, St. Louis) in PBS (Phosphate Saline Buffer; Sigma) 30 min aktiviert. Das Anbinden des Oligos erfolgte aus 25 µM in PBS, 1 µl Tröpfchen je Spot innerhalb von 30 min unter gesättigter Wasseratmosphäre bei RT.

Die Proben wurden aus einem Probengemischs 20 µl unter Deckglas 20% SSC20 mit 80% H2O bei 70C° anhybridisiert. Während des Anbindens konnte die Probe innerhalb von 30 min auf RT abkühlen.

Übertragen der Sonde

Die Oberflächen wurden in 750 mM NaCl so einander angenähert, daß die auf dem Stempel gebundenen DNA Sonden mit den an der Unterlage gebundenen Proben, hybridisieren konnten. Nach einer Inkubationszeit von 45 min wurden die Oberflächen voneinander getrennt.

Messung

Die Unterlage wurde mit einem Laser-Scanner (Perkin Eimer GeneTac LS IV) nach der fluoreszenzmarkierten übertragenen Sonde abgescannt.

Beispiel 3 Antikörper-Antigen

Es sollen verschiedene nicht markierte Proteine in einem Probengemisch nachgewiesen werden. Die Rezeptoren werden durch biotinylierte Antikörper dargestellt, die über Streptavidin an die Unterlage gebunden sind. Die zugehörigen Sonden werden durch DNA-Antikörperfragment Konjugate dargestellt, die eine Fluoreszenzmarkierung tragen. Der Sensorkomplex wird durch zwei reißverschlußartig hybridisierte DNA Moleküle dargestellt. Der erste Bindungspartner des Sensorkomplexes ist ein DNA Molekül, dessen 5'-Ende über eine Aminogruppe mit dem Stempel verbunden ist. Der zweite Bindungspartner des Sensorkomplexes wird durch ein fluoreszenzmarkiertes DNA Molekül dargestellt, das eine Thiolgruppe am 3' Ende besitzt und darüber an ein freies C- terminales Cystein des Antikörper Fragments gekoppelt wird.

Die Sonden werden auf dem Stempel spiegelbildlich zu den Rezeptor-Spots der Unterlage lokalisiert, so daß die Spots mit den Sonden während des Kontakts der Oberflächen stets auf den Spots mit den zugehörigen Rezeptoren zu liegen kommen. Ist eine Probe an dem Rezeptoren gebunden, kann in der Kontaktphase die zugehörige Sonde an die Probe binden. Da der reißverschlußartig hybridisierte Sensorkomplex eine geringere Stabilität unter einer an das gesamte Konjugat angelegten Zugkraft besitzt als die Antikörper(Fragment)-Antigen Bindung, öffnet sich beim trennen der Oberflächen der Sensorkomplex während die fluoreszenzmarkierte Sonde an der Probe gebunden bleibt.

Herstellung des Stempels

Beschichtung des Stempels

Die oxidierte Stempeloberfläche wurde mit 2% Triethoxyaldehydsilan (Amchro, Hattersheim, Deutschland) in 10% H₂O und 88% Ethanol für 30 min inkubiert. Die silanisierte Oberfläche wurde mit Ethanol und mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen. An die Aldehydgruppen des Silans wurde ein bifunktionales PEG angebunden, dessen eines Ende über Aminogruppe, das andere über eine Carboxygruppe verfügte. 20 µl einer Lösung mit 20 mg/ml NH2-PEG-COOH (Shearwater, Huntsville) wurden unter einem Deckglas für 1 h auf einem Stempel mit einer Fläche von 1 cm² inkubiert. Es wurde mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen. Anschließend wurden die Schiffschen Basen mit 1%gew Natriumborhydrid in H₂O, 15 min reduziert.

Der erste Bindungspartner des Kraftsensors wurde über eine Aminogruppe aus 25 µM Lösung in PBS(Phosphate Saline Buffer; Sigma) mit 5 mg/ml mit 5 mg/ml EDC (1-Ethyl-3- (3-Dimethylamino-propyl)carbiimide; Sigma) und 5 mg/ml NHS (N-hydroxy-succinimid; Sigma, St. Louis) aus 20 µl pro cm2 unter einem Deckglas für 30 min an die Carboxygruppen des PEGs angebunden.

Die Sonde wurde durch Koppeln des zweiten Bindungspartners des Kraftsensors, einem mit Cy3 fluoreszenzmarkierten Oligo über eine Thiolgruppe an das C-terminale Cystein des Antikörperfragments hergestellt.

Die Sonden wurden aus 3 µl Tröpfchen je Spot aus einer 25 µM Lösung in in 750 mM NaCl bei 40C° anhybridisiert. Während des Anbindens konnte die Probe innerhalb von 30 min auf RT abkühlen.

Beschichtung der Unterlage

Die Oberfläche wurde mit NaOH 10 g in 40 ml H2O und 60 ml Ethanol für 2 Stunden Behandelt. Die Stempeloberfläche wurde mit 3% Aminopropyldimethylethoxysilan (ABCR, Karlsruhe, Deutschland) in 10% H₂O und 87% Ethanol für 30 min inkubiert. Die silanisierte Oberfläche wurde mit Ethanol und mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen. An die Aminogruppen des Silans wurde ein bifunktionales NHS-PEG-Biotin (Shearwater, Huntsville) angebunden. 20 µl einer Lösung mit 20 mg/ml des PEG wurden unter einem Deckglas für 1 h auf einem Stempel mit einer Fläche von 1 cm² inkubiert. Es wurde mit Reinstwasser gewaschen und mit Stickstoff trocken geblasen.

An das Biotin wurde Streptavidin (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) aus 0,1 mg/ml in PBS mit 0.05%Vol Tween angebunden. An das Streptavidin wurden biotinylierte Antikörper 0.5 mg/ml in PBS mit 0.05%Vol Tween und 40% Glycerin angebunden. Das Anbinden der Proben erfolgte aus einem Probengemisch in PBS mit 0.05%Vol Tween 20 µl unter einem Deckglas.

Übertragen der Sonde

Die Oberflächen wurden unter PBS mit 0.05%Vol Tween so einander angenähert, daß die auf dem Stempel gebundenen Sonden mit den auf der Unterlage gespotteten Proben binden können. Nach einer Inkubationszeit von 30 min wurden die Oberflächen voneinander getrennt.

Messung

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Zusammensetzung, die möglicherweise die zu bestimmende Probe enthält, mit einer ersten Oberfläche (= Unterlage) in Kontakt bringt, so daß die möglicherweise in der Zusammensetzung enthaltene Probe an die Unterlage gebunden wird;
eine zweite Oberfläche (= Stempel), an die eine Sonde, die an die Probe binden kann, gebunden ist, an die Unterlage annähert, so daß Sonde und Probe interagieren können, wobei die Bindung der Sonde an die Probe und die Bindung der Probe an die Unterlage unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler ist als die Bindung der Sonde an den Stempel;
Stempel und Unterlage voneinander trennt; und
bestimmt, ob die Sonde an die Unterlage gebunden ist oder wieviel Sonde an die Unterlage gebunden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Unterlage Moleküle, die die Probe binden können (= Rezeptoren), immobilisiert sind, wobei die Bindung der Probe an den Rezeptor unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler ist als die Bindung der Sonde an den Stempel.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rezeptoren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antikörperfragmenten und Antikörperderivaten.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Nukleinsäuren, modifizierten Nukleinsäuren, Nukleinsäure ähnlichen Molekülen wie Peptide Nucleic Acid (PNA) oder Locked Nucleic Acid (LNA), dreidimensionalen Nukleinsäurestrukturen, Aptameren, Kohlenhydraten und modifizierten Varianten davon.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ein Protein, Polypeptid oder Peptid ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde spezifisch an die Probe bindet.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antikörperfragmenten und Antikörperderivaten.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde eine Markierung enthält.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Stempel fest mit einem ersten Bindungspartner verbunden ist und die Sonde fest mit einem zweiten Bindungspartner verbunden ist, wobei der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner nicht kovalent aneinander binden können.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner Nukleinsäuren sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngiger DNA und/oder einzelsträngiger RNA.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das 5'-Ende des ersten Bindungspartners mit dem Stempel verbunden ist und das 3'-Ende des zweiten Bindungspartners mit der Sonde verbunden ist oder daß das 3'-Ende des ersten Bindungspartners mit dem Stempel verbunden ist und das 5'-Ende des zweiten Bindungspartners mit der Sonde verbunden ist.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Stempel mehrere voneinander getrennte Bereiche aufweist, in denen Sonden mit unterschiedlicher Spezifität für unterschiedliche Proben gebunden sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterlage mehrere voneinander getrennte Bereiche aufweist, in denen Rezeptoren mit unterschiedlicher Spezifität für unterschiedliche Proben gebunden sind.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterlage mehrere voneinander getrennte Bereiche aufweist, in denen Rezeptoren mit unterschiedlicher Spezifität für unterschiedliche Proben gebunden sind, derart daß sie symmetrisch zu den sich auf dem Stempel befindenden Bereichen sind, so daß bei dem Annähern von Stempel und Unterlage jeweils die Bereiche der Sonden und Rezeptoren, die für die selbe Probe spezifisch sind, zur Deckung kommen.

16. Vorrichtung zur Bestimmung einer Probe umfassend eine Oberfläche (= Stempel), an die eine Sonde gebunden ist, die an die zu bestimmende Probe binden kann, wenn sie mit ihr in Kontakt kommt, wobei die Bindung der Sonde an die Probe unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler ist als die Bindung der Sondean den Stempel.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde spezifisch an die zu bestimmende Probe bindet.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß ein erster Bindungspartner fest mit dem Stempel verbunden ist und ein zweiter Bindungspartner fest mit der Sonde verbunden ist, wobei der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner nicht kovalent aneinander binden können.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner Nukleinsäuren sind.

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Bindungspartner und der zweite Bindungspartner ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einzelsträngiger DNA und/oder einzelsträngiger RNA.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das 5'-Ende des ersten Bindungspartners mit dem Stempel verbunden ist und das 3'-Ende des zweiten Bindungspartners mit der Sonde verbunden ist oder daß das 3'-Ende des ersten Bindungspartners mit dem Stempel verbunden ist und das 5'-Ende des zweiten Bindungspartners mit der Sonde verbunden ist.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Stempel mehrere abgegrenzte Bereiche aufweist, in denen verschiedene Sonden mit unterschiedlicher Spezifität für verschiedene Proben gebunden sind.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine weitere Oberfläche (= Unterlage), an die eine Probe gebunden werden kann, umfaßt, wobei die Bindung der Sonde an die Probe und die Bindung der Probe an die Unterlage unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler ist als die Bindung der Sonde an den Stempel.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Unterlage Moleküle, die die Probe binden können (= Rezeptoren), immobilisiert sind, wobei die Bindung der Probe an den Rezeptor unter einer von außen angelegten Zugkraft stabiler ist als die Bindung der Sonde an den Stempel.

25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung weiterhin eine Einrichtung zum Annähern und Trennen von Unterlage und Stempel umfaßt.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung weiterhin eine Einrichtung zur Bestimmung, ob und/oder in welcher Menge die Sonde an die Unterlage gebunden ist, umfaßt.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Stempel mehrere voneinander getrennte Bereiche aufweist, in denen Sonden mit unterschiedlicher Spezifität für unterschiedliche Proben gebunden sind.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterlage mehrere voneinander getrennte Bereiche aufweist, in denen Rezeptoren mit unterschiedlicher Spezifität für unterschiedliche Proben gebunden sind.

29. Vorrichtung nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterlage mehrere voneinander getrennte Bereiche aufweist, in denen Rezeptoren mit unterschiedlicher Spezifität für unterschiedliche Proben gebunden sind, derart, daß sie symmetrisch zu den sich auf dem Stempel befindenden Bereichen sind, so daß bei dem Annähern von Stempel und Unterlage jeweils die Bereiche der Sonden und Rezeptoren, die für die selbe Probe spezifisch sind, zur Deckung kommen.