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Gebiet des
Standes der Technik
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein feste Substrate mit immobilisierten
Biopolymeren. Insbesondere betrifft die Erfindung aminierte Substrate
mit adsorbierten Biopolymeren, Verfahren zu ihrer Herstellung und
Verfahren zu ihrer Verwendung in der Detektion von Targetbiopolymeren.
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Beschreibung
des Standes der Technik
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Eine
Analyse von unbekannten Biopolymertargets schließt häufig ihr spezifisches Binden
an bekannte Biopolymersonden ein. Die bekannteste Technik, die immobilisierte
Biopolymere einsetzt, ist die Southern Blot Hybridisierungstechnik,
in der eine Reihe von DNA Targets auf einer Membran immobilisiert
wird und eine Lösung,
die markierte DNA Sondenmoleküle
enthält,
verwendet wird, um die Membran unter Bedingungen, bei denen komplementäre Moleküle sich
wieder verbinden werden, zu befeuchten. In einer analogen Technik,
die als Northern Blot Hybridisierung bezeichnet wird, werden RNA
Targets an Membranen immobilisiert und verbinden sich wieder mit
komplementären
RNA Sonden. Reverse Blot Hybridisierung wendet den entgegengesetzten
Ansatz an. Anstatt eines Immobilisierens von DNA Targets, wird eine
Reihe von DNA Sonden auf einer festen Oberfläche immobilisiert, und das
unbekannte markierte DNA Target ist in der flüssigen Phase vorhanden.
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Matrices,
die durch Anheften einer Vielzahl derselben oder unterschiedlicher
Biopolymere an diskreten, isolierten Bereichen an der Oberfläche des Substrats
konstruiert werden, werden zunehmend wichtige Hilfsmittel in der
Analyse von unbekannten Biopolymeren, wie Genexpressionsanalyse,
DNA Sequenzieren, Mutati onsdetektion, Polymorphismus Screenen, Bindungsanalyse,
Genotypisieren einzelner Nucleotidpolymorphismen (engl.: single
nucleotide polymorphisms (SNPs)) und Screenen nach alternativen
Spleißvarianten
in Gentranskripten.
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Die
Genexpressionsanalyse ist ein Verfahren von entscheidender Bedeutung
für grundlegende molekulare
biologische Forschung. Da in höheren Organismen
die Auswahl von Genen, die in irgendeiner gegebenen Zelle exprimiert
werden, eine tiefgründige
Wirkung auf die Eigenschaft der Zelle aufweist, kann die Genexpressionsanalyse
einen Schlüssel
zur Diagnose, Prognose und Behandlung einer Vielfalt von Krankheiten
in Tieren, einschließlich
Menschen, und in Pflanzen bereitstellen. Zusätzlich kann die Genexpressionsanalyse
verwendet werden, um unterschiedlich exprimierte neue Gene zu identifizieren,
um eine Genexpression mit einem besonderen Phänotyp zu korrelieren, um auf
eine Krankheitsprädisposition
zu screenen und um ein Toxizitätstesten
durchzuführen.
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Typischerweise
wird in der Genexpressionsanalyse eine Matrix von Sondennucleinsäuren durch Anheften
einer Reihe von einzelnen genspezifischen Sonden in einem regelmäßigen Muster
an ein festes Substrat gebildet, so dass der Ort jeder Sonde bekannt
ist. Die Matrix wird mit einer Probe, die Targetnucleinsäuren enthält, unter
Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht. Die Hybride werden durch
Verwenden einer breiten Vielfalt von Verfahren detektiert, am häufigsten
durch Anwenden radioaktiver oder fluoreszierender Markierungen.
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Es
gibt zwei allgemeine Verfahren Polynucleotidmatrices für die Genexpressionsanalyse
zu bilden. Das erste Verfahren schließt in situ Synthese von Oligonucleotiden
an vorbestimmten Positionen eines festen Substrats ein. Das zweite
Verfahren schließt
das Anheften von vorsynthetisierten Oligonucleotiden oder Polynucleotiden
an ein festes Substrat ein. Über
in situ Synthesen von Oligonucleotiden auf Glas, das mit einem aliphatischen
Polyetherlinker modifiziert wird (Southern, E. M. et al., Genomics
13: 1008, 1992), und Polypropylen als ein festes Substrat (U.S.
Patent Nr. 5,554,501), ist berichtet worden. Das in situ Verfahren
leidet jedoch unter bestimmten Schwächen. Da zum Beispiel die Zugabe von
jedem Nucleotid eine getrennte Reaktion ist, kann die Reproduzierbarkeit
und Reaktionsausbeute zwischen unterschiedlichen Orten an dem Substrat sowie
zwischen unterschiedlichen Substraten stark variieren. Folglich
ist es schwer, genaue und reproduzierbare Daten mit Matrices, die
durch direkte Synthese gebildet werden, zu erhalten.
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Alternativ
können
vorsynthetisierte Polynucleotide auf einem Substrat durch ultraviolette
Vernetzung, chemische Adhäsion
oder kovalentes Binden immobilisiert werden. Typischerweise werden
ein Polynucleotid, ein festes Substrat oder beides derivatisiert,
um solche Immobilisierung einzuleiten. Für gewöhnlich ist es bevorzugt, dass
das feste Substrat fähig
ist, Sonden DNA zu immobilisieren, während es im Wesentlichen inert
gegenüber
jeglicher anderer DNA ist. Glas ist ein häufig verwendetes, festes Substrat,
da es kostengünstig
und von guter optischer Qualität
ist. Verschiedene Typen von vorderivatisierten Glassubstraten sind
kommerziell verfügbar,
einschließlich
Mikroskopträger,
die mit Poly-L-Lysin oder Aminopropylsilan beschichtet sind, oder
Glasträger mit
exponierten Aldehydfunktionalitäten.
Jedoch bildet die Derivatisierung einer Glasoberfläche eine
positive elektrostatische Nettoladung, die zu unerwünschtem
nicht spezifischem, elektrostatischem Binden von Nucleinsäuren an
das feste Substrat während
anschließender
Hybridisierungsverfahren führt.
Zahlreiche andere Oberflächenbeschichtungen für effiziente
Immobilisierung von Polynucleotiden sind vorgeschlagen worden und
schließen
ein Isolat des natürlich
vorkommenden Muscheladhäsivproteins
(U.S. Pat. Nr. 5,024,933), Nucleosidphosphat (U.S. Pat. Nr. 4,818,681)
und Salz oder kationisches Detergens (U.S. Pat. Nr. 5,610,287),
um einige zu nennen, ein. Diese Verfahren führen jedoch auch zu unspezifischem
Binden von Nucleinsäuren
an die Substrate. Solch unspezifisches Binden von DNA macht eine
Interpretation der Hybridisierungsergebnisse schwierig.
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Polynucleotide
selbst können
vor dem Binden an ein festes Substrat derivatisiert werden. Zum Beispiel
beschreibt das U.S. Pat. Nr. 6,048,695 Epoxid-modifizierte DNA,
die an einem unmodifizierten festen Substrat, wie einer nicht derivatisierten
Glasoberfläche,
leicht befestigt werden kann. Schließlich können sowohl ein Polynucleotid
als auch ein festes Substrat modifiziert werden, um effizientes
kovalen tes Binden zu gestatten. Zum Beispiel offenbart das U.S.
Pat. Nr. 5,215,882 ein Modifizieren einer Nucleinsäure mit
einem primären
Amin oder einem Äquivalent,
gefolgt durch die Reaktion der modifizierten Nucleinsäure mit
dem festen Substrat, das freie Aldehydgruppen aufweist, in der Anwesenheit
eines Reduktionsmittels. Jedoch sind die Derivatisierung von Polynucleotiden
und ihr anschließendes
kovalentes Binden an feste Substrate lange und mühsame Verfahren. Folglich sind
Matrices, die durch konventionelle Techniken hergestellt werden,
ziemlich teuer ($6–$36
pro Träger). Ähnliche
Probleme bestehen bezüglich
Immobilisierung anderer Biopolymere an festen Substraten.
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Zusammenfassend
stellen die konventionellen Immobilisierungsverfahren keine erwünschte schnelle
Hybridisierung und hohe Bindungsspezifität von Targets an Sonden bereit.
Zusätzlich
sind derzeit verfügbare
Verfahren zum Herstellen von Assaygegenständen zur Verwendung in der
Biopolymerdetektion langsam, mühsam
und ökonomisch
ungünstig.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Dementsprechend
ist es ein Ziel der Erfindung ein kosteneffizientes, schnelles und
zweckmäßiges Verfahren
zur Herstellung eines Assaygegenstands und ein Verfahren zur Verwendung
eines solchen Assaygegenstands für
eine Biopolymerdetektion bereitzustellen. Insbesondere ist es ein
Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines
Assaygegenstands durch direkte Adsorption von Biopolymeren an feste
Substrate zu entwickeln.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass modifizierte
Substrate und insbesondere Plasma aminierte Polypropylensubstrate
fähig sind
zur direkten und stabilen Adsorption von Nucleinsäuren, Proteinen,
Polypeptiden und ihren Analoga ohne chemische Vernetzung. Folglich
stellt ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
eines Assaygegenstands zur Verwendung in der Biopolymerdetektion
bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte:
- (a)
Bereitstellen eines Biopolymers;
- (b) Bereitstellen eines aminierten Substrats; und
- (c) Kontaktieren des Biopolymers mit einer Oberfläche des
aminierten Substrats unter einer Bedingung, welche für eine direkte
Adsorption des Biopolymers an der Oberfläche des Substrats ausreichend
ist.
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In Übereinstimmung
mit den erfindungsgemäßen Ausführungsformen
kann das Substrat in einer Form von Schäumen, Filamenten, Fäden, Blättern, Filmen,
Trägern,
Gelen, Membranen, Kügelchen
oder Platten hergestellt werden. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
schließt
der Schritt des Bereitstellens des Biopolymers das Bereitstellen einer
Lösung
des Biopolymers ein; und der Schritt des Kontaktierens des Biopolymers
umfasst:
- (a) Platzieren eines Aliquots der
Biopolymerlösung
an dem Substrat; und
- (b) Lufttrocknen des Substrats, um das Biopolymer direkt an
der Oberfläche
des Substrats zu adsorbieren.
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In Übereinstimmung
mit einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
kann eine Vielzahl von Biopolymeren an der Oberfläche des
aminierten Polypropylensubstrats in einer Matrix platziert und adsorbiert
werden.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum
Detektieren eines Targetbiopolymers, welches in einer Probe enthalten
ist, bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte:
- (a)
Bereitstellen eines aminierten Substrats;
- (b) Bereitstellen eines Sondenbiopolymers, welches einen Komplex
mit dem Targetbiopolymer bilden kann;
- (c) Kontaktieren von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer
mit einer Oberfläche
des aminierten Substrats unter einer Bedingung, welche für eine direkte
Adsorption von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer an
der Substratoberfläche
geeignet ist, um einen Sondenassaygegenstand bzw. einen Targetassaygegenstand
zu bilden;
- (d) Kontaktieren des Sondenassaygegenstands mit dem Targetbiopolymer
oder Kontaktieren des Targetassaygegenstands mit dem Sondenbiopolymer
unter einer Bedingung, welche die Bildung eines Komplexes, umfassend
die Sonden und die Targetbiopolymere, gestattet; und
- (e) Detektieren und Bestimmen der Anwesenheit des Komplexes
als eine Messung der Anwesenheit oder der Menge des Targetbiopolymers,
welches in der Probe enthalten ist.
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Der
Komplex des Sonden- und des Targetbiopolymers kann auch einen Reporter
einschließen. Der
Reporter kann aus der Gruppe, bestehend aus: Farbstoffen, chemilumineszierenden
Verbindungen, Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, Metallkomplexen,
magnetischen Teilchen, Biotin, Hapten, Radiofrequenztransmittern
und Radiolumineszenzverbindungen, ausgewählt werden. Ein Assaygegenstand
kann durch Anheften derselben oder unterschiedlicher unmodifizierter
Sonden oder Targetbiopolymere an diskrete, isolierte Bereichen des
Substrats gebildet werden, um eine Matrix herzustellen. Das Signal,
das durch die Reportermoleküle,
die an der Matrix immobilisiert sind, hergestellt wird, kann durch
eine Anzahl von Mitteln, wie einen Laser mit einem Konfokalmatrixleser,
Phosphorimager oder eine CCD-Kamera detektiert und aufgezeichnet
werden.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen Assaygegenstand
zum Detektieren von Biopolymeren bereit. Der Assaygegenstand umfasst
ein Substrat und ein Biopolymer, welches direkt an der Oberfläche des
Substrats adsorbiert ist. In einer Ausführungsform wird eine Vielzahl
derselben oder unterschiedlicher Biopolymere an diskreten, isolierten
Bereichen des Substrats durch direkte Adsorption angeheftet, um
einen Matrix zu bilden.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Testkit zum
Detektieren eines Targetbiopolymers, das in einer Probe enthalten
ist, bereit. Das Kit umfasst ein aminiertes Polypropylensubstrat und
ein Sondenbiopolymer, das direkt an einer Oberfläche des Substrats adsorbiert
ist. Wenn das Sondenpolymer mit dem Targetbiopolymer in Kontakt
gebracht wird, bilden sie einen Komplex, der durch Verwenden von
Reportern und Signaldetektionsvorrichtungen detektiert werden kann.
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Die
vorliegende Erfindung ist gut geeignet zur Verwendung in der Entwicklung
von Biopolymermatrices und Polynucleotidmatrices, wie insbesondere
Genexpressionsmikromatrices zur Verwendung in der Genexpressionsanalyse.
Die Polynucleotidmatrices können
für die
Evaluierung oder Identifikation von biologischer Aktivität verwendet
werden. Die vorliegende Erfindung kann auch in der Entwicklung von Polynucleotidmatrices
zum Zweck des Polynucleotidsequenzierens verwendet werden. Ferner
können die
erfindungsgemäßen Assaygegenstände eine Reihe
von adsorbierten Biopolymeren enthalten und können in Hybridisierungsassays
und Immunassays verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt viele Vorteile bereit. Da die Erfindung
die Adsorption von Biopolymeren direkt an ein festes Substrat ohne
chemische Vernetzung gestattet, kann eine kostspielige Herstellung
modifizierter Biopolymere, wie Thiol- oder Amino-modifizierter DNA vermieden
werden. Die Aufgabe der Herstellung von Matrices wird auch sehr
vereinfacht, und die Herstellungskosten werden signifikant reduziert,
da die Biopolymere einfach an dem Substrat luftgetrocknet werden.
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Beschreibung
der Figuren
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Die
oben erwähnten
und andere Merkmale dieser Erfindung und die Weise, sie zu erhalten,
wird offensichtlicher und am besten verstanden unter Bezugnahme
auf die folgende Beschreibung zusammen mit der beigefügten 1.
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1 zeigt
die Hybridisierungsergebnisse von markierter Target cDNA von Aktin, β-Mikroglobulin,
G3PDH und p53 mit ihrer zugehörigen
Sonden cDNA, die an Polypropylensubstraten immobilisiert sind. TNF-α, der an
dem Substrat immobilisiert ist, wurde als eine Kontrolle für eine nicht
spezifische Hybridisierung verwendet.
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2 zeigt
eine Anheftung von humanem IgG an aminierte Polyproylenträger.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung
eines Assaygegenstands zur Verwendung in der Biopolymerdetektion bereit.
Das Verfahren umfasst die Schritte:
- (a) Bereitstellen
eines Biopolymers;
- (b) Bereitstellen eines aminierten Substrats; und
- (c) Kontaktieren des Biopolymers mit einer Oberfläche des
aminierten Substrats unter einer Bedingung, welche für eine direkte
Adsorption des Biopolymers an der Oberfläche des Substrats ausreichend
ist.
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Der
Begriff "Biopolymer" wie hier verwendet, bezieht
sich auf Nucleinsäuren,
Polynucleotide, Polypeptide, Proteine und Analoga davon. Wie hier
verwendet bezieht sich "Polynucleotid" auf ein Polymer aus
Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden in der Form eines getrennten
Fragments oder als Bestandteil eines größeren Gebildes. "Polynucleotid", wie hier verwendet,
kann DNA, RNA oder ein DNA Analogon, wie PNA (Peptidnucleinsäure (engl.:
peptide nucleic acid)), sein. Die DNA kann eine einzel- oder doppelsträngige DNA
oder eine DNA, die durch PCR Technik amplifiziert wurde, sein. Die
RNA kann eine mRNA sein. Die Länge
der Polynucleotide kann von ungefähr 20 bp bis ungefähr 10 kb
reichen. In Übereinstimmung
mit einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist das Polynucleotid eine komplementäre DNA (engl.: complementary
DNA (cDNA)). Die Länge
eines cDNA Polynucleotids kann im Bereich von ungefähr 100 bp
bis ungefähr
10 kb, vorzugsweise 200 bp bis 1000 bp, liegen.
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Wie
hier verwendet bezieht sich "Polypeptid" auf ein Polymer
von Aminosäuren,
wobei die α-Carboxylgruppe
jeder Aminosäure
mit der α-Aminogruppe einer
anderen Aminosäure
durch eine Peptidbindung verbunden ist. Ein Protein kann ein Polypeptid
oder mehrere Polypeptide umfassen, die durch Disulfidbindungen mitein ander
verbunden werden. Beispiele von Protein schließen Antikörper, Antigene, Liganden oder
Rezeptoren ein.
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Es
ist eine Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass Biopolymere
an Substrate durch direkte Adsorption und ohne jegliche chemische
Vernetzung mit dem Substrat angeheftet werden können. Wir stellten fest, dass
Polypropylensubstrate besonders nützlich zur direkten Adsorption
sind. Die direkte Adsorption wird durch Modifizieren der Substrate
vor deren Kontaktieren mit Biopolymeren weiter verbessert. Die Substrate
können
durch Einführen
einer Funktionalität,
ausgewählt
aus einer Gruppe, bestehend aus: Amino, Carboxyl, Thiol und deren
Derivate, modifiziert werden. In einer Ausführungsform wird das Substrat
durch Einführen
einer Amingruppe modifiziert.
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Das
Verfahren zum Einführen
von Amingruppen auf die Polypropylenoberfläche wird in dem gemeinschaftlich übertragenen
U.S. Patent Nr. 6,013,789 beschrieben. Kurz gesagt können Aminogruppen
auf die Oberfläche
eines Propylenmediums durch Verwenden einer Plasmaentladung in einem Ammoniak
oder organisches Amin enthaltenden Gas, eingeführt werden. Das "Plasma" ist vorzugsweise
ein ionisiertes Gas, das genügend
Ionisierungsenergie von einem elektromagnetischen Feld erhält. Vorzugsweise
wird die Ionisierungsenergie durch eine Radiofrequenz Plasmaentladung,
eine Mikrowellenfrequenz Plasmaentladung oder eine Koronaentladung
angewendet. In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform stammt
das Amin von einem Ammoniakgas und der erhöhte Energiezustand wird mittels
Radiofrequenz Plasmaentladung erreicht. Das aminierte Polypropylen
wird dann zur direkten Adsorption eines vorsynthetisierten Biopolymers
verwendet.
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Um
eine Anzahl unterschiedlicher Testtechniken, einschließlich spezialisierter
Testausstattung, aufzunehmen, können
aminierte Polypropylensubstrate in irgendeiner aus einer Vielfalt
von Gestaltungen und Formen gestaltet werden. Beispiele solcher Gestaltungen
und Formen der aminierten Polypropylensubstrate schließen Schäume, Filamente,
Fäden, Blätter, Filme,
Träger,
Gele, Membranen, Kügelchen oder
Platten ein. Ein aminiertes Polypropylensubstrat kann in der Form
einer planaren Vorrichtung mit diskreten isolierten Bereichen in
Form von Vertiefungen, Durchbrüchen,
Sockeln, hydrophoben oder hydrophilen Stoffen bzw. Stücken oder
ausgestanzten Haft-Reservoirs hergestellt werden. Beispiele eines solchen
Substrats schließen
eine Mikroplatte ein. Da das erfindungsgemäße Substrat besonders nützlich in
der Präparation
von Biopolymermatrices für
die Evaluierung oder Identifikation von biologischer Aktivität ist, liegt
das aminierte Polypropylensubstrat vorzugsweise in der Form einer
Vorrichtung mit mindestens einer ebenen planaren Oberfläche vor.
Beispiele solcher Vorrichtungen mit ebenen Oberflächen schließen Träger, Blätter oder
Filme ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Die
Größe des Substrats
kann variieren und hängt
von der endgültigen
Verwendung der immobilisierten Biopolymere ab. Der Fachmann wird
erkennen, dass Matrices von Biopolymeren, die auf miniaturisierten,
festen Haltern immobilisiert sind, seit vielen Jahren entwickelt
werden. Diese festen Halter können
bezüglich
mm2 planarer Oberflächenbereich beschrieben werden
und können
zahlreiche unterschiedliche immobilisierte Biopolymere aufweisen, wobei
jedes an einem stellenspezifische Ort an dem miniaturisierten festen
Träger
angeheftet ist. Feste Halter in der Form von Messstäben und
Trägern
liegen auch im Rahmen der Erfindung. Wie im Stand der Technik bekannt,
haben Messstäbe
typischerweise eine rechteckige Gestalt, wobei jede Seite einige Zentimeter
misst.
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Da
die vorliegenden Verfahren der Assaygegenstandsbildung direkte Adsorption
von Biopolymeren an Substrate einschließen, wird keine chemische Modifikation
von Biopolymeren benötigt.
Hier bedeutet der Begriff "direkte
Adsorption" ohne
irgendwelche chemische Linker. Anders als im nahe kommenden Stand
der Technik, der chemische Vernetzung von Biopolymeren mit den Substraten
verwendet, gestattet die vorliegende Erfindung Immobilisierung von sowohl
unmodifizierten als auch modifizierten Biopolymeren an Substraten
durch einfaches Lufttrocknen an dem Substrat. Für das Ziel der vorliegenden
Erfindung bedeutet "unmodifiziertes
Biopolymer" natives Biopolymer,
und "modifiziertes
Biopolymer" bedeutet ein Biopolymer
mit eingeführten
funktionellen Gruppen. Zum Beispiel kann ein modifiziertes Biopolymer biotinylierte
oder aminierte DNA sein.
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In
der vorliegenden Erfindung wird ein Biopolymer an einem Substrat
durch Kontaktieren des Biopolymers mit dem Substrat unter einer
Bedingung immobilisiert, welche für eine direkte Adsorption des
Biopolymers an das Substrat ausreichend ist. Eine Bedingung ist
ausreichend, wenn sie gestattet, dass das Biopolymer an der Oberfläche des
Substrats in einer stabilen Weise adsorbiert wird. Ohne durch die
Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass unter den
erfindungsgemäßen Bedingungen
Biopolymere durch ionische und hydrophobe Interaktion an ein Substrat
adsorbiert werden können.
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Für den Zweck
der vorliegenden Erfindung ist es nicht entscheidend, welches besondere
Verfahren verwendet wird, um den Schritt des Kontaktierens des Biopolymers
mit dem Substrat durchzuführen.
In Übereinstimmung
mit den erfindungsgemäßen Ausführungen
kann der Kontaktierungsschritt durch Strahldrucken, Fest- oder Offenkapillarvorrichtungskontaktdrucken,
Mikrofluidkanaldrucken, Siebdrucken und Drucken unter Verwendung
von Vorrichtungen auf Basis von elektrochemischen oder elektromagnetischen
Kräften
durchgeführt
werden. Zum Beispiel können
thermische Tintenstrahldrucktechniken, die kommerziell verfügbare Strahldrucker
verwenden, und piezoelektrische Mikrostrahldrucktechniken, wie in
dem U.S. Patent Nr. 4,877,745 beschrieben, verwendet werden, um
Polynucleotide auf den aminierten Substraten abzubilden. Ein Biomek
High Density Replicating Tool (HDRT) (Beckman Coulter, CA) kann
auch für
ein automatisches Rasterbilden verwendet werden. Alternativ kann
der Kontaktierungsschritt durch Abbilden der Biopolymere auf dem aminierten
Substrat von Hand durchgeführt
werden. Beispiele von Abbilden von Hand schließen Abbilden von Hand mit einer
Pipettierhilfe ein. Es sollte verstanden werden, dass das erfindungsgemäße aminierte
Substrat durch alle Verfahren Biopolymeren exponiert werden kann,
solange die Biopolymere in direkten Kontakt mit dem Substrat gebracht
werden.
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In Übereinstimmung
mit erfindungsgemäßen Ausführungsformen
kann der Schritt des Bereitstellens des Biopolymers Bereitstellen
einer Lösung
des Biopolymers einschließen.
Der Schritt des Kontaktierens des Biopolymers mit aminiertem Substrat
kann einschließen:
- (a) Platzieren eines Aliquots der Biopolymerlösung an
dem Substrat; und
- (b) Lufttrocknen des Substrats, um das Biopolymer direkt an
der Oberfläche
des Substrats zu adsorbieren.
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Die
Lösung
des Biopolymers kann irgendeine Lösung sein, die das Biopolymer
an die Oberfläche
des Substrats abgibt. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel ein wässriger
Puffer mit einem pH von ungefähr
4 bis ungefähr
13. In einer Ausführungsform ist
das Biopolymer ein Polynucleotid, und eine Lösung des Polynucleotids in
50 mM Salzbicarbonat, pH 9, wird auf dem aminierten Substrat abgebildet bzw.
auf das aminierte Substrat gespottet.
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Die
Konzentration von Biopolymeren, die in der wässrigen Lösung enthalten sind, kann in
Abhängigkeit
des Typus eines Moleküls,
der Molekülgröße, der
Molekülstruktur
und anderer Faktoren, welche die Lösungsfähigkeit der Moleküle beeinflussen
können,
variieren. Vorzugsweise reicht die Menge der Biopolymere, die auf
das Substrat angewendet werden, von ungefähr 10–20 bis
ungefähr
10–14 Mol.
Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform
das Biopolymer ein Polynucleotid, und die Menge des Polynucleotids, die
auf das Substrat angewendet wird, beträgt ungefähr 10–18 Mol.
Die Größe des Biopolymerlösungsaliquots
ist nicht entscheidend, solange es eine ausreichende Menge des Biopolymers
bereitstellt. Folglich kann die Größe der Aliquote, die auf das
aminierte Substrat angewendet werden, in Abhängigkeit von der Konzentration
des Biopolymers in der Lösung und
den Assayanforderungen variieren. Zum Beispiel kann das Aliquot
von ungefähr
0,1 nl bis ungefähr 500
nl betragen. In einer Ausführungsform
ist das Biopolymer ein Polynucleotid, und Aliquote von ungefähr 10 nl
der 1 nM Polynucleotidlösungen
werden an dem aminierten Substrat platziert.
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In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung wird der Lufttrocknungsschritt für eine Zeitspanne,
die ausreichend ist, eine Adsorption der Biopolymerlösung zu
gestatten, durchgeführt.
Die Länge der
Lufttrocknungszeit hängt
von dem Volumen der Aliquote, die auf das Substrat angewendet werden, der
Raumtemperatur und der Feuchtigkeit ab. Für Mikro- und Nanoliteraliquote
kann der Lufttrocknungsschritt von ungefähr 5 bis ungefähr 60 Minuten dauern.
Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform 10 nl Aliquote an
der Oberfläche
das aminierten Substrats platziert und bei 22°C für eine Stunde oder für ungefähr fünfzehn Minuten
bei 35°C
getrocknet.
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Wie
oben erwähnt,
benötigen
viele Anwendungen zum Verwenden immobilisierter Biopolymere Biopolymere,
die an stellenspezifischen Orten an eine Substratoberfläche immobilisiert
sind. In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Biopolymeren
an der Oberfläche des
aminierten Polypropylensubstrats in einer Matrix platziert und adsorbiert
werden. Um geordnete Matrices von Biopolymeren zu präparieren,
wobei jedes Biopolymer an stellenspezifischen Orten lokalisiert ist,
einschließlich
Raster und 1 × n
Matrices von immobilisierten Biopolymeren, wird eine vorausgewählte Stelle
an der Oberfläche
des Substrats einer Lösung
des gewünschten
Biopolymers exponiert. In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung kann dies von Hand durch Anwenden
eines Aliquots einer Biopolymerlösung
auf einen vorausgewählten Ort
an dem Substrat durchgeführt
werden. Alternativ können
thermische Tintenstrahldrucktechniken, die kommerziell verfügbare Strahldrucker
verwenden, und piezoelektrische Mikrostrahldrucktechniken, wie beschrieben
in dem U.S. Pat. Nr. 4,877,745, verwendet werden, um ausgewählte Substratoberflächenstellen
mit ausgewählten
Biopolymeren zu spotten.
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Eine
große
Vielfalt von Matrixformaten kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung angewendet werden. Ein besonders nützliches Format ist eine lineare
Matrix aus Nucleinsäuresonden, worauf
im Stand der Technik allgemein als Tauchstäbchen Bezug genommen wird.
Ein anderes geeignetes Format umfasst ein zweidimensionales Muster von
diskreten Zellen. Natürlich
könnte
vom Fachmann leicht erkannt werden, dass andere Matrixformate zur
erfindungsgemäßen Verwendung
gleich gut geeignet sein würden.
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Die
erfindungsgemäße Matrix
kann ein Teil einer Vielfalt von Vorrichtungen, wie Mikrotiterplatten, Teströhrchen,
anorganische Blätter
oder Tauchstäbchen
sein. Wenn zum Beispiel das Substrat ein Faden ist, können ein
oder mehrere solcher Fäden
an einer Kunststoff Tauchstäbchentypusvorrichtung
befestigt sein. Wenn das Substrat in Form einer Membran vorliegt,
kann es an Glasträgern
befestigt sein. Die besondere Vorrichtung ist an sich unwichtig,
solange das Substrat sicher an der Vorrichtung befestigt ist ohne
das funktionelle Verhalten des Substrats oder jeglichem adsorbierten
Biopolymer zu beeinflussen. Die Vorrichtung sollte auch gegenüber jeglichen Materialien,
in welche die Vorrichtung eingeführt wird,
stabil sein (z.B. klinische Proben).
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Das
Verfahren zur Herstellung eines Assaygegenstands kann ferner einen
Schritt des Exponierens des Assaygegenstands einem Reagenz, wie Ammoniumhydroxid,
Ethanol oder Protein einschließen.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird Ethanol für Nucleinsäurematrices verwendet,
und Casein wird für
Proteinmatrices verwendet.
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Die
direkte Adsorption von Biopolmeren an aminierte Polypropylensubstrate
ist zur Verwendung in der Herstellung von Gensensoren und anderen Matrix
basierten Systemen, wie differenziellen Genexpressionsmikromatrices,
gut geeignet. Ein aminiertes Polypropylensubstrat mit den erfindungsgemäßen adsorbierten
Biopolymeren kann auch als eine Vorrichtung zum Durchführen eines
Ligandenbindungsassays oder zum Durchführen eines Hybridisierungsassays
durch entweder reverse Hybridisierung (Sonden angeheftet) oder Southern
Blot (Target angeheftet) verwendet werden. Eine solche Vorrichtung
kann auch in einem Immunassay verwendet werden.
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Dementsprechend
stellt ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren
zum Detektieren eines Targetbiopolymers, welches in einer Probe
enthalten ist, bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte:
- (a) Bereitstellen eines aminierten Substrats;
- (b) Bereitstellen eines Sondenbiopolymers, welches einen Komplex
mit dem Targetbiopolymer bilden kann;
- (c) Kontaktieren von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer
mit einer Oberfläche
des aminierten Substrats unter einer Bedingung, welche für eine direkte
Adsorption von entweder dem Sonden- oder dem Targetbiopolymer an
der Substratoberfläche
geeignet ist, um einen Sondenassaygegenstand oder einen Targetassaygegenstand
zu bilden;
- (d) Kontaktieren des Sondenassaygegenstands mit dem Targetbiopolymer
oder Kontaktieren des Targetassaygegenstands mit dem Sondenbiopolymer
unter einer Bedingung, welche die Bildung eines Komplexes, umfassend
die Sonden und die Targetbiopolymere, gestattet; und
- (e) Detektieren und Bestimmen der Anwesenheit des Komplexes
als eine Messung der Anwesenheit oder der Menge des Targetbiopolymers,
welches in der Probe enthalten ist.
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Für den Zweck
der vorliegenden Erfindung erkennt und bindet das Sondenbiopolymer
an das Targetbiopolymer, wobei ein Sonden-Targetkomplex gebildet
wird. Sowohl die Sonde als auch das Targetbiopolymer können aus
einer Gruppe, bestehend aus Nucleinsäuren, Polypeptiden, Proteinen
und deren Analoga, ausgewählt
werden. Wenn zum Beispiel das Target ein Polynucleotid ist, kann
die Sonde ein Polynucleotid, das komplementär zu dem Target-Polynucleotid
ist, umfassen (siehe 1). Wenn das Target ein Rezeptor
oder ein Ligand ist, kann die Sonde einen Liganden oder einen Rezeptor
umfassen, der entsprechend den Targetrezeptor oder -liganden erkennt
und an ihn bindet. Wenn das Target ein Antigen ist, kann die Sonde
einen Antikörper
umfassen, der das Antigen erkennt oder vice versa (siehe 2).
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Entweder
das Target oder die Sonde kann direkt an das Substrat adsorbiert
werden. Zum Beispiel werden in den Southern Blot oder Northern Blot
Anwendungen Targets an das Substrat adsorbiert. Dann wird das Substrat
mit den adsorbierten Targets mit den Sonden, die vorzugsweise markiert
sind, in Kontakt gebracht, um die Targetbiopolymere zu detektieren.
Im Gegensatz dazu werden in Ligandenbindungsassays oder Affinitätsreinigungsassays
zuerst die Sonden an das Substrat gebunden. Dann wird ein Target,
das in einer Probenlösung
enthalten ist, mit den Sonden, die an das Substrat adsorbiert sind,
in Kontakt gebracht.
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Für den Zweck
der vorliegenden Erfindung ist eine Adsorptionsbedingung ausreichend,
wenn die Sonde oder das Target an das Substrat adsorbieren kann.
Eine solche Bedingung kann in Abhängigkeit des Typus des Biopolymers
und dessen Größe variieren.
Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform, die im Detail in
dem folgenden Beispiel 1 beschrieben wird, 10 nl Aliquote von cDNA
Lösungen auf
ein aminiertes Polypropylensubstrat angewendet. Nach der Anwendung
der cDNA wird das Substrat bei 35°C
für 15
Minuten getrocknet. Dann wird das Substrat entweder in Ethanol für eine Stunde
oder in Ammoniumhydroxid für
15 Minuten getränkt,
um locker gebundene Nucleinsäure
zu entfernen. Schließlich
werden die Träger
kurz mit Wasser gespült
und luftgetrocknet. Der Fachmann kann leicht die geeigneten Bedingungen
zum Adsorbieren anderer Sonden oder Targets angesichts der erfindungsgemäßen Lehre
bestimmen. Wie oben diskutiert kann eine Vielfalt von Substraten
verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform jedoch werden aminierte Polypropylensubstrate
verwendet.
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Das
Kontaktieren der Sonden mit den Targets (oder Hybridisierung) wird
unter Bedingungen, welche das Bilden von stabilen Komplexen zwischen Sonden
und Targets gestatten, durchgeführt.
Wenn zum Beispiel Target-Polynucleotide mit Sonden-Polynucleotiden,
die an ein aminiertes Polypropylensubstrat adsorbiert sind, in Kontakt
gebracht werden, verbinden sich komplementäre Regionen an den Target- und
den Sonden-Polynucleotiden wieder, wobei ein Sonden-Targetkomplex gebildet
wird. Die Auswahl solcher Bedingungen liegt innerhalb des Könnens des
Fachmanns und schließt
solche ein, bei denen ein niedriger, im Wesentlichen Null, Prozentsatz
von nicht passenden Hybriden gebildet wird. Die genauen Bedingungen
hängen
jedoch von der erwünschten
Selektivität
und Sensitivität
des Assays ab. Solche Bedingungen schließen die Hybridisierungstemperatur,
die ionische Stärke
und Viskosität
des Puffers und die entsprechenden Konzentrationen der Target- bzw.
der Sondenbiomoleküle
ein. Die Hybridisierungsbedingungen können anfänglich ausgewählt werden,
dass sie jenen entsprechen, von denen bekannt ist, dass sie sich
in Standardverfahren zur Hybridisierung an Filter eignen, und dann
zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen aminierten Polypropylensubstraten
optimiert werden. Die Bedingungen, die zur Hybridisierung von einem
Typus eines Targetmaterials geeignet sind, würden zur Verwendung mit anderen
Targetmaterialien entsprechend angeglichen werden.
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Zum
Beispiel werden in bestimmten Ausführungsformen die Target-Polynucleotide
an die Sonden-Polynucleotide bei Temperaturen im Bereich von ungefähr 20°C bis ungefähr 70°C für einen
Zeitraum von ungefähr
1 Stunde bis ungefähr
24 Stunden in einem geeigneten Hybridisierungspuffer hybridisiert. Geeignete
Hybridisierungspuffer zur Verwendung bei der Durchführung der
vorliegenden Erfindung enthalten allgemein eine hohe Konzentration
an Salz. Ein typischer Hybridisierungspuffer enthält im Bereich von
ungefähr
2× bis
ungefähr
6 × SSC
und ungefähr 0,01%
bis ungefähr
0,5% SDS bei pH 7–8.
Wenn der Sonden/Targetkomplex gebildet ist, wird das Substrat unter
Bedingungen gewaschen, die geeignet sind, alle nicht spezifisch
gebundene Target- oder Sondenpolymere im Wesentlichen zu entfernen.
Vorzugsweise wird das Waschen bei einer Temperatur im Bereich von
ungefähr
20°C–70°C mit einem
Puffer, der ungefähr
0,1–6 × SSC und
0,01–0,1%
SDS enthält, durchgeführt. Die
am meisten bevorzugten Waschbedingungen für Polynucleotide schließen derzeit eine
Temperatur, welche dieselbe wie die Hybridisierungstemperatur ist,
und einen Puffer, der 2 × SSC und
0,01% SDS enthält,
ein. Wie vorher angemerkt, würde
es für
den Fachmann eine Routineangelegenheit sein, die Kontaktierungs-(Hybridisierungs-)bedingungen
für irgendeine
gegebene Kombination von Target- und Sondenbiopolymeren zu optimieren.
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In Übereinstimmung
mit den erfindungsgemäßen Ausführungsformen
können
entweder die erfindungsgemäßen Targets
oder Sonden mit einem Reporter markiert werden. Detektionsfähigkeit
kann durch solche Merkmale, wie Farbwechsel, Lumineszenz, Fluoreszenz
oder Radioaktivität
bereitgestellt werden. Beispiele von Reportern schließen Farbstoffe,
chemilumineszierende Verbindungen, Enzyme, fluoreszierende Verbindungen,
Metallkomplexe, magnetische Teilchen, Biotin, Haptene, Radiofrequenztransmitter
und Radiolumineszenzverbindungen ein. Der Fachmann kann leicht den
Typus eines zu verwenden Reporters bestimmen, sobald der Typus der Target-
oder Sondenbiopolymere bestimmt ist.
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Das
Markierungsverfahren kann vor der Analyse (direktes Markieren) oder
nach der Hybridisierung (indirektes Markieren) stattfinden. Ein
Beispiel von indirektem Markieren würde die Biotinylierung eines
Target-Polynucleotids, dessen Hybridisieren mit einer Sonde und
Reagieren des Target-Sondenkomplexes mit einem Streptavidin-Alkaliphosphatasekonjugat
bzw. Streptavidin-alkalische Phosphatasekonjugat sein. Die Biotinanteile,
die nach der Hybridisierung mit Sonden-Polynucleotiden zurückgehalten werden, binden an
ein Streptavidin-alkalische Phosphatasekonjugat, das dann auf ein
chromogenes Substrat, wie Enzymmarkiertes fluoreszierendes (engl.:
Enzyme Labeled Fluorescent (ELF)) Reagenz, wirkt.
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Für den Zweck
der vorliegenden Erfindung können
dieselben oder unterschiedliche Biopolymere an das Substrat angeheftet
werden. Wenn die Biopolymere unterschiedlich sind, werden sie vorzugsweise
an isolierten Bereichen des Substrats lokalisiert, um Matrices zu
bilden. Zum Beispiel kann ein Substrat eine Mikroplatte sein. Unterschiedliche
Biopolymere können
innerhalb unterschiedlicher Vertiefungen der Mikroplatte adsorbiert
werden, um Matrices zu bilden. In Übereinstimmung mit einer anderen
erfindungsgemäßen Ausführungsform
kann das Substrat ein Träger
sein, und unterschiedliche Biopolymere werden an unterschiedlichen
Bereichen des Trägers adsorbiert,
um ein Matrix zu bilden.
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Das
durch eine Matrix hergestellte Signal kann durch das bloße Auge
oder mittels einer speziell gestalteten Ausstattung, wie eines Konfokalmatrixlesers,
detektiert werden. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform
ein fluoreszierendes Signal mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtungs-(engl.:
charged coupled device (CCD)) Kamera aufgezeichnet. Es würde durch
den Fachmann erkannt werden, dass die Auswahl eines besonderen Verfahrens,
das verwendet wird, um das Signal zu detektieren und quantifizieren,
nicht entscheidend für
diese Erfindung ist. Im Wesentlichen kann irgendein Detektionsverfahren verwendet
werden, solange es konsistente und genaue Ergebnisse bereitstellt.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen Assaygegenstand
zum Detektieren von Targetbiopolymeren bereit. Der erfindungsgemäße Assaygegenstand
umfasst ein Substrat und ein Biopolymer, das direkt an der Oberfläche des
Substrats adsorbiert ist.
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Das
Substrat kann aus einer Vielfalt von Materialien hergestellt werden.
In einer Ausführungsform
wird das Substrat aus Polypropylen oder Polyethylen hergestellt.
Polypropylen und Polyethylen sind organische Materialien, die oberflächenaktiviert
sein können,
aber andererseits unter strengen chemischen Bedingungen chemisch
inert sind. Polypropylen kann in sehr korrosiven Umgebungen verwendet werden.
Zum Beispiel hat Polypropylen eine hohe chemische Beständigkeit
gegenüber
einer Vielfalt von Mineralsäuren
(z.B. Salzsäure),
organischen Säuren
(z.B. Ameisensäure,
Essigsäure),
Basen (z.B. Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid), Salzen (z.B. Natriumchlorid),
Oxidationsmitteln (z.B. Peressigsäure, Iodlösungen) und organischen Lösungsmitteln
(z.B. Aceton, Ethylalkohol, Acetonitril oder Dichlormethan). Zusätzlich sind
Polypropylen und Polyethylen hydrophob und stellen einen geringen
Fluoreszenzhintergrund bereit. Aminogruppen können durch Verwenden einer
Plasmaentladung in einem Ammoniak oder einem organisches Amin enthaltenden
Gases, wie oben beschrieben, auf die Polypropylen- und Polyethylenoberfläche eingeführt werden.
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Der
erfindungsgemäße Assaygegenstand kann
in einer Vielfalt von Gestalten, die Schäume, Filamente, Fäden, Blätter, Filme,
Träger,
Gele, Membranen, Kügelchen
oder Platten einschließen,
gestaltet oder anderweitig geformt werden.
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Das
Biopolymer kann aus einer Gruppe, bestehend aus Nucleinsäuren, Polypeptiden,
Proteinen und Analoga davon, ausgewählt werden. Ein Sondenbiopolymer
kann ein Polynucleotid, wie eine amplifizierte DNA, cDNA, RNA oder
Protein, sein. Ein Targetbiopolymer kann amplifizierte DNA, cDNA,
Oligonucleotide, PNA, RNA oder Protein sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Substrat aus einem aminierten Polypropylensubstrat in einer
Form eines Trägers
hergestellt, und das adsorbierte Biopolymer ist ein Polynucleotid.
Polynucleotide von unterschiedlichen Längen können direkt an das aminierte
Polypropylensubstrat adsorbiert werden. In Übereinstimmung mit erfindungsgemäßen Ausführungsformen
kann die Länge
der adsorbierten Polynucleotide von ungefähr 20 bp bis ungefähr 10 kb
betragen. Um eine höhere
Effizienz der Adsorption zu erreichen, beträgt die Länge der adsorbierten Polynucleotide
vorzugsweise zwischen ungefähr
100 bp und ungefähr
10 kb.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Testkit zur
Detektion eines Targetbiopolymers, das in einer Probe enthalten
ist, bereit. Das Kit umfasst ein aminiertes Polypropylensubstrat
und ein Sondenbiopolymer, das direkt an der Oberfläche des
Substrats adsorbiert ist. Wenn das Sondenpolymer mit dem Targetbiopolymer
in Kontakt gebracht wird, bilden sie einen Komplex, der durch Verwenden von
Reportern und Signaldetektionsvorrichtungen detektiert werden kann.
Das Kit kann auch einen Reporter zum Erzeugen eines Signals, das
eine Bildung des Komplexes anzeigt, einschließen. Vorzugsweise sind eine
Vielzahl derselben oder unterschiedlicher Biopolymere an das Substrat
angeheftet, wobei eine Matrix gebildet wird.
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In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung und wie es oben beschrieben ist,
können
dieselben oder unterschiedliche Biopolymere an die aminierten Polypropylensubstrate
geheftet werden, um eine Matrix zu bilden.
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Die
Erfindung kann besser verstanden werden unter Bezugnahme auf das
beigefügte
Beispiel, das nur Darstellungszwecken dient und nicht in irgendeiner
Hinsicht als den Schutzbereich der Erfindung, der in den hier angehängten Patentansprüchen definiert
ist, beschränkend
ausgelegt werden soll. Während
die beschriebenen Verfahren in dem folgenden Beispiel für jene,
die verwendet werden könnten,
typisch sind, können
andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, alternativ verwendet werden.
In der Tat kann sich der Fachmann leicht weitere Ausführungsformen,
die auf der Lehre hier beruhen, ohne übermäßiges Experimentieren vorstellen
und herstellen.
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Beispiel 1:
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Präparation
von cDNA Matrices
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Polypropylenträger wurden
durch eine Radiofrequenzentladung in Ammoniakgas oberflächenaminiert,
wie in Coassin et al. (U.S. Pat. Nr. 5,554,501, übertragen auf den Übertragungsempfänger der
vorliegenden Erfindung) beschrieben. Unmodifizierte cDNA von Aktin, β-Mikroglobulin,
G3PDH, p53 und TNF-α Gene
wurden jeweils in einer Endkonzentration von 1 nM in 50 mM Salzbicarbonat
Puffer, pH 9, präpariert.
Ein Biomek 2000TM Robotersystem (Beckman
Coulter, Inc., CA), ausgestattet mit einem 384-pin HDRT System (Beckman
Coulter, Inc., CA), wurde verwendet, um 10 nl Aliquote von cDNA
Lösungen
auf die aminierten Polypropylenträger anzuwenden. Eine Reihe
von 5-(Biotinamid)pentylamin (BAPA) Markierungen (Pierce Chemical,
IL) wurde auch an beiden Enden jedes Trägers gedruckt, wodurch die
cDNA flankiert wurde. BAPA, welches Streptavidin-Enzymkonjugate unabhängig von einer Hybridisierung
bindet, dient als eine interne Kontrolle für die Assayrobustheit. Nach
der Anwendung der cDNA und BAPA Markierungen, wurden die Träger bei
35°C für 15 Minuten
getrocknet. Dann wur den die Träger
entweder in Ethanol für
eine Stunde oder in Ammoniumhydroxid für 15 Minuten getränkt, um
locker gebundene Nucleinsäure
zu entfernen. Dann wurden die Träger
kurz mit Wasser gespült
und luftgetrocknet. In einem Fall wurde ein Ethanol gequenschter
Träger
ferner in 1 M NaOH für
15 Minuten gespült.
Die Träger
wurden bei –20°C über Nacht aufbewahrt.
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Hybridisierung
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Zur
Hybridisierung wurde jeder Träger
auf Raumtemperatur gebracht und für 15 Minuten in 0,15 M NaCl
und 0,5 M NaOH Lösung
denaturiert. Eine Mischung Biotin markierter cDNA Targets von Aktin, β-Mikroglobulin,
G3PDH und p53 wurde in einer Endkonzentration von 0,5 nM angewendet,
dem folgen Denaturierung und die Zugabe von Hybridisierungspuffer
(2,4 × SSC,
0,016% SDS, 0,28 M TRIS, 0,028 NaCl, pH 7,5). Das TNF-α Target wurde
nicht zugegeben, so dass unspezifische Hybridisierung an die TNF-α Sonde gemessen
werden konnte. Die Hybridisierung wurde für 1 Stunde bei 60°C fortgesetzt,
gefolgt durch eine Stringenzspülung
in 2 × SSC,
0,01% SDS bei derselben Temperatur. Die Träger wurden mit Streptavidin-alkalische
Phosphatasekonjugat und ELF-Reagenz (fluoreszierendes Substrat für alkalische
Phosphatase) für
30 min. inkubiert. Nach der Inkubation wurde das fluoreszierende
Signalbild durch Verwenden einer CCD-Kamera aufgezeichnet.
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Ergebnisse
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Ein
Matrix aus cDNA und BAPA Markierungen wurde erfolgreich an den aminierten
Polypropylenträger
adsorbiert, wie durch Hybridisierung einer Mischung der entsprechenden
cDNAs bestimmt wurde (1). 1 zeigt
Biomek HDRT Drucken von cDNA und BAPA Markierungen auf aminierte
Polypropylenträger.
Das TNF-α Signal
war abwesend (Negativkontrolle), während das verbleibende cDNA Hybridisierungssignal
ungefähr
bei derselben Intensität
blieb wie die Signale der BAPA Markierungen (Positivkontrolle).
Das Signal der Ammoniumhydroxid gequenschten Träger wurde in der Intensität über das
der Ethanol gequenschten Träger
signifikant reduziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen
Ethanol- vs. Ethanol-NaOH vorbehandelten Trägern. Dieses Beispiel stellt
dar, dass Plasma aminierte Polypropylenträger zu direkter und stabiler
Adsorption von cDNA ohne chemische Vernetzung fähig sind.
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Somit
sind die erfindungsgemäßen aminierten
Polypropylenträger
mit direkt adsorbierten Biopolymeren und das Verfahren zu ihrer
Verwendung in der Detektion von Targetbiopolymeren gut angepasst,
um all die Zwecke und die Ziele, die oben dargelegt wurden, zusammen
mit anderen Vorteilen, die dem System eigen sind, zu erreichen.
Die vorliegende Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ohne
von ihren wesentlichen Merkmalen abzuweichen, durchgeführt werden.
Die beschriebene Ausführungsform
ist in allen Beziehungen nur als darstellend und nicht als beschränkend zu
erachten. Der Schutzbereich der Erfindung wird deshalb durch die angehängten Patentansprüche statt
durch die vorangegangene Beschreibung angegeben. Alle Änderungen,
die in die Bedeutung und den Bereich der Äquivalenz der Patentansprüche fallen,
werden in ihren Schutzbereich eingeschlossen.
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Beispiel 2:
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Präparation
einer Proteinmatrix
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Anheftung
von humanem IgG: Ein Polypropylenfilm wurde durch eine Radiofrequenzentladung oberflächenaminiert,
wie in Beispiel 1 beschrieben. Verdünntes humanes IgG (Pierce Chemicals,
Kat. # 31877, 28 mg/ml) wird zu 1 mg/ml in Natriumbicarbonat (50
mM, pH 9) und 4% Natriumsulfat gelagert. Einundzwanzig 0,5 μl Spots wurden
auf einen 2 cm breiten und 8 cm langen Polypropylenstreifen pipettiert.
Die Adsorption wurde für
60 min. bei 25°C
fortzugesetzt. Der Film wurde mit Caseinlösung (1 mg/ml in 50 mM Natriumcarbonat,
0,15 M NaCl pH 9) für
60 min. bei 25°C
gespült
und dann zweimal in deionisiertem Wasser und kurz mit 1 × TBS, 0,02%
Tween-20, pH 7,4 gespült.
Der Streifen wurde dann für
den Bindungsassay verwendet.
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Konjugation
mit Ziege Anti-human IgG alkalische Phosphatase: Die 200 μl der verdünnten Ziege Anti-human
IgG alkalische Phosphatase (Pierce Chemicals, Kat. # 31310) Lösung 1:1000
in Blockierungspuffer (1 × TBS,
1 mg/ml Casein, 0,02% Tween-20 pH 7,4) wurden in eine Petri Schale
pipettiert, und der oben gespottete Polypropylenstreifen wurde,
mit der gespotteten Seite des Polypropylenstreifens nach unten auf
die Oberfläche
der Lösung, auf
ihr platziert und wurde für
60 min. bei 25°C
inkubiert. Der Polypropylenstreifen wurde dann 4 Mal in 20 ml 1 × TBS, 0,02%
Tween-20, pH 7,4 gespült.
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ELF-Detektion:
Um ein Fluoreszenzsignal zu detektieren, wurde das Enzymsubstrat,
ELF, durch Mischen von Bestandteilen A und B (1:25) (Molecular Probes,
Eugene, OR) präpariert,
und 200 μl
Lösung wurde
für jeden
Streifen, wie oben beschrieben, verwendet. Nach 30 min. Inkubation
bei 22°C
wurde der Streifen einmal in deionisiertes Wasser getaucht. Die Signale
wurden durch Verwenden von 365 nm UV Licht und einer CCD Kamera
mit einem 520 nm Filter, wie in 2 gezeigt,
detektiert.
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Ergebnisse
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Eine
Matrix von IgG wurde erfolgreich an den aminierten Polypropylenfilm
adsorbiert, wie in 2 gezeigt.
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Somit
sind die erfindungsgemäßen aminierten
Polypropylenträger
mit direkt adsorbierten Biopolymeren und das Verfahren ihrer Verwendung
in der Detektion von Targetbiopolymeren gut angepasst, um all die
Zwecke und Ziele, die oben dargelegt wurden, zusammen mit anderen
Vorteilen, die dem System eigen sind, zu erreichen. Die vorliegende
Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ohne von ihren wesentlichen
Merkmalen abzuweichen, ausgeführt
werden. Die beschriebene Ausführungsform
ist in allen Beziehungen nur als darstellend und nicht als beschränkend zu
erachten. Der Schutzbereich der Erfindung wird deshalb durch die
angehängten
Patentansprüche
statt durch die vorangegangene Be schreibung angegeben. Alle Änderungen,
die in die Bedeutung und den Bereich der Äquivalenz der Patentansprüche fallen,
werden in ihren Schutzbereich eingeschlossen.