DE60209273T2

DE60209273T2 - Chip aus biologischen Materialien

Info

Publication number: DE60209273T2
Application number: DE60209273T
Authority: DE
Inventors: Hiroko Asaka-shi Inomata; Masayoshi Asaka-shi Kojima; Yukio Asaka-shi Sudo; Hiroshi Asaka-shi Shinoki; Yoshihide Asaka-shi Iwaki; Osamu Asaka-shi Seshimoto
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 2001-05-09
Filing date: 2002-04-30
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2022-05-01
Also published as: JP2002333446A; EP1256805A2; EP1256805B1; EP1256805A3; US20030040019A1; DE60209273D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen biologischen Chip, wie einen Proteinchip, bei dem biologisches Material, wie DNA oder Protein, an einer Festphasenoberfläche befestigt ist, der für eine Proteomik-Analyse verwendbar ist, ein Verfahren zur Herstellung des Chips und ein Verfahren zur Detektion einer Zielsubstanz unter Verwendung des Chips.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die technologische Entwicklung zum effizienten Analysieren von Genfunktionen einer Vielzahl von Organismen hat rasche Fortschritte gemacht, und ein Detektionswerkzeug, als DNA-Chip bezeichnet, bei dem Nucleotid-Derivate, wie eine große Anzahl von DNA-Fragmenten oder synthetisierten Oligonucleotiden oder dergleichen, an der Oberfläche eines Festphasensubstrates befestigt sind, wurde eingesetzt, um die Basensequenz von DNA oder DNA-Fragmenten zu analysieren. Ein Molekül zur Detektion, wie eine DNA oder ihre Fragmente, oder ein synthetisiertes Oligonucleotid, wie ein Nucleotid-Derivat, das an die Oberfläche eines solchen Festphasensubstrates gebunden ist, wird auch als ein Test-Molekül bezeichnet. Ein repräsentativer DNA-Chip ist ein Mikroarray, bei dem eine große Zahl von Testmolekülen aufgereiht und an einem festen Träger, wie einem Glasobjektträger oder dergleichen, befestigt ist. Bei DNA-Chipverwandten Technologien, die das Herstellen eines DNA-Chips und seine Verwendung betreffen, wird in Erwägung gezogen, dass sie in der Lage sind, auch zum Detektieren eines Biomoleküls außer DNA nützlich zu sein. Daher wird von diesen erwartet, dass sie neue Mittel für das zielgerich tete Suchen bei der Wirkstoffentdeckungsforschung (aiming at drug discovery research), die Entwicklung eines Verfahrens zur Diagnose von Krankheiten oder zum Verhindern der Krankheiten oder dergleichen bereitstellen.
Die DNA-Typ-verwandten Technologien wurden seit der Gegebenheit verwirklicht, dass das Verfahren zum Bestimmen der Basensequenz einer DNA mittels Hybridisierung mit einem Oligonucleotid entwickelt wurde. Obwohl dieses Verfahren die Einschränkung des Verfahrens zum Bestimmen der Basensequenz unter Verwendung von Gelelektrophorese überwinden konnte, wurde es anfänglich nicht in die Praxis umgesetzt.
Nachfolgend wurde es möglich, indem der DNA-Chip, der wie oben gestaltet wurde, und seine Herstellungstechnik entwickelt wurden, die Expression, Mutation, den Polymorphismus oder dergleichen eines Gens effizient in einer kurzen Zeitdauer zu untersuchen. Spezifisch wird eine DNA-Fragment-Probe, die Komplementarität zu einem DNA-Fragment oder einem Oligonucleotid auf dem hergestellten DNA-Chip zeigt (die auch als ein Ziel-DNA-Fragment bezeichnet wird), im Allgemeinen mittels Anwenden der Hybridisierung des DNA-Fragments oder des Oligonucleotids auf dem DNA-Chip mit der markierten DNA-Fragment-Probe detektiert.
Um die DNA-Chip-Herstellungstechnik zur praktischen Anwendung zu bringen, ist eine Technologie zum Aufreihen bzw. Anordnen einer großen Anzahl von DNA-Fragmenten und Oligonucleotiden auf der Oberfläche eines festen Trägers in hoher Dichte und in stabilem Zustand erforderlich.
Was ein Verfahren zu Herstellen eines DNA-Chips betrifft, so sind ein Verfahren zum direkten Synthetisieren von Oligonucleotiden auf der Oberfläche des festen Trägeres (als "on-chip-Verfahren" bezeichnet) und ein Verfahren, in dem ein zuvor hergestelltes DNA-Fragment oder ein Oligonucleotid an die Oberfläche des festen Trägers gebunden wird, bekannt. Was das on-chip-Verfahren betrifft, ist ein Verfahren zum selektiven Synthetisieren eines Oligonucleotids in dem vorher festgelegten genauen Matrixbereich, in dem die Verwendung einer Schutzgruppe, die unter Verwendung von Lichteinstrahlung (Photoirradiation), der Photolithographie-Technologie zum Herstellen von Halbleitervorrichtungen, entfernbar ist, und eine Technologie zum Synthetisieren einer Festphase (als "Maskierungstechnologie" ("masking technology") bezeichnet) kombiniert werden, repräsentativ.
Als ein Verfahren zum Binden und Befestigen eines zuvor hergestellten DNA-Fragments oder eines Oligonucleotids auf die Oberfläche des festen Trägers sind die folgenden Verfahren, die den Arten von DNA-Fragmenten und den Arten von festen Trägern entsprechen, bekannt.
(1) In dem Fall, dass ein DNA-Fragment, das befestigt werden soll, eine cDNA (komplementäre DNA, die mittels Verwenden von mRNA als Matrize synthetisiert wurde) oder PCR-Produkt (DNA-Fragment, das durch Vervielfältigen der cDNA durch ein PCR-Verfahren erhalten wurde) ist, werden im Allgemeinen die cDNAs oder PCR-Produkte unter Verwendung einer Spotter-Vorrichtung, die in einer DNA-Chip-Herstellungsvorrichtung bereitgestellt wurde, auf die Oberfläche des festen Trägers getüpfelt (gedottet), der mit einer polykationischen Verbindung (Polylysin, Polyethylenimin oder dergleichen) Oberflächen-behandelt wurde, und sind elektrostatisch unter Verwenden der Ladung, die in der DNA enthalten ist, an den Träger gebunden. Als ein Verfahren zum Behandeln der Oberfläche des festen Trägers wird auch ein Verfahren, das ein Silankupplungsmittel, welches eine Aminogruppe, eine Aldehydgruppe, eine Epoxygruppe oder dergleichen enthält, einsetzt, angewendet. Bei der Oberflächenbehandlung unter Verwenden des Silankupplungsmittels ist dieses, da die Aminogruppe, die Aldehydgruppe oder dergleichen, mittels einer kovalenten Bin dung auf der Oberfläche des festen Trägers befestigt ist, verglichen mit dem Fall der Oberflächenbehandlung mit einer polykationischen Verbindung stabiler an der Oberfläche des festen Trägers befestigt.
Als ein modifiziertes Verfahren zum Verwenden der Ladung der oben beschriebenen DNA-Fragmente wird ein Verfahren angegeben, worin PCR-Produkte, die mit einer Aminogruppe modifiziert wurden, in SSC (Standard-Salz-Citronensäure-Pufferlösung) (standard salt-citric acid buffer solution) suspendiert sind, auf die Oberfläche des silylierten Glasobjektträgers getüpfelt werden, inkubiert werden und dann mit Natriumborhydrid und dann durch Erhitzen behandelt werden. Jedoch gibt es dahingehend ein Problem, dass es schwierig ist, notwendigerweise die ausreichende Befestigungsstabilität der DNA-Fragmente durch dieses Befestigungsverfahren zu erhalten. Bei DNA-Chip-Technologien ist die Nachweisgrenze wichtig. Daher hat das Binden und Befestigen von DNA-Fragmenten auf die Oberfläche des festen Trägers in einer ausreichenden Menge (d.h., in einer hohen Dichte) und in einem stabilen Zustand einen direkten Einfluss auf die Zunahme der Nachweisgrenze der Hybridisierung von DNA-Fragment-Sonden bzw. -Proben und markierten Nucleinsäure-Fragment-Proben.
(2) In dem Fall, dass ein Oligonucleotid (Testmolekül), das befestigt werden soll, ein synthetisiertes Oligonucleotid ist, ist ein Verfahren bekannt, in dem ein Oligonucleotid, in das eine reaktive Gruppe eingeführt wurde, synthetisiert ist, dann wird das Oligonucleotid auf die Oberfläche des Oberflächen-behandelten festen Trägers getüpfelt, um vorher die reaktive Gruppe zu bilden, wodurch die Oligonucleotide an die Oberfläche des festen Trägers durch kovalente Bindung gebunden und befestigt werden. Z.B. sind ein Verfahren, in dem ein Oligonucleotid mit eingeführter Aminogruppe mit der Oberfläche des Glasobjektträgers, an der eine Aminogruppe in Gegenwart von PDC (p-Phenylendiisothiocyanat) eingeführt ist, zu Reaktion gebracht wird, und ein Verfahren, in dem ein Oligonucleotid mit eingeführter Aldehydgruppe mit dem Glasobjektträger zur Reaktion gebracht wird, bekannt. Diese zwei Verfahren sind von dem Gesichtspunkt her vorteilhafter, dass ein Oligonucleotid, verglichen mit dem oben beschriebenen Verfahren (1) für das elektrostatische Binden mittels Verwenden der Ladung der DNA-Fragmente, stabil gebunden und an die Oberfläche des festen Trägers befestigt ist. Jedoch gibt es dahingehend Probleme, dass bei einem Verfahren der Durchführung der Reaktion in Gegenwart von PDC die Reaktion von PDC und einem Oligonucleotid mit eingeführter Aminogruppe langsam ist, und bei einem Verfahren mit der Verwendung eines Oligonucleotids mit eingeführter Aldehydgruppe die Stabilität der Schiff'schen Base, welche ein Reaktionsprodukt ist, gering ist (d.h., es tritt leichte Hydrolyse auf).
In den letzten Jahren wurde auch eine Technologie vorgeschlagen, die ein Oligonucleotid-Analogon, das als PNA (Peptidnucleinsäure) (peptide nucleic acid) bezeichnet wird, anstelle eines Oligonucleotids oder eines Polynucleotids (auch einschließlich eines synthetisierten Oligonucleotids oder Polynucleotids und eines DNA-Moleküls und DNA-Fragments und eines RNA-Moleküls und RNA-Fragments) als ein Testmolekül eines DNA-Chips einsetzt. Als ein Verfahren zum Befestigen von PNA an das Festphasensubstrat durch kovalente Bindung ist ein Verfahren des Verwendens der Kombination von Avidin und Biotin ebenfalls bekannt (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. H11-332595, Amtsblatt). In dieser Veröffentlichung im Amtsblatt wird auch eine Technologie des Verwendens eines Oberflächen-Plasmon-Resonanz- (surface plasmon resonance) (SPR) Biosensors als das Festphasensubstrat beschrieben. Beim Verwenden des DNA-Chips, bei dem ein Testmolekül auf dem Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Biosensor befestigt ist, kann ein DNA-Fragment, das über Hybridisierung an seine Oberfläche gebunden ist, durch Verwenden des Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Phänomens detektiert werden.
Darüber hinaus ist auch die Verwendung einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (charge coupled device) (CCD) als ein Substrat des DNA-Chips bekannt (Nucleic Acid Research, 1994, Bd. 22, Nr. 11, S. 2124–2125).
In der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. H04-228076, Amtsblatt (entsprechend dem US-Patent Nr. 5 387 505), ist eine Technologie zum Isolieren einer Ziel-DNA beschrieben. Bei dieser Technologie ist die Ziel-DNA mit Biotinmolekül an ein Substrat gebunden, an dessen Oberfläche Avidinmoleküle befestigt sind.
Die japanische Patentveröffentlichung Nr. H07-43380, Amtsblatt (entsprechend dem US-Patent Nr. 5 094 962), beschreibt ein Detektionswerkzeug, das für einen Ligand-Rezeptor-Assay (ligand-receptor assay) verwendet wurde, d.h., ein Analysewerkzeug, bei dem ein Rezeptormolekül an die Oberfläche eines mikroporösen Polymerpartikels mit einer reaktiv aktiven Gruppe auf seiner Oberfläche gebunden ist.
Da die Genom-Analyse nahezu vervollständigt wurde, machte andererseits in den letzten Jahren die "Proteom-/Proteomik"-Forschung, die wesentliche Informationen bereitstellt, um schließlich die Bedeutungen der Geninformation zu verstehen und die Lebensaktivitäten der Zellen zu simulieren, Fortschritte. Der Begriff "Proteom" bedeutet alle die Sätze von Proteinen, die translatiert und in einer speziellen Zelle, einem Apparat und einem Organ produziert werden, und das Forschungsgebiet der Informationsanalyse auf hoher Ebene bezüglich der chemischen Struktur, Gesamtmenge, Expressionsdauer, Modifikation nach der Translation, der Entstehung von Aggregation und dergleichen, wird als "Proteomik" bezeichnet.
Die Proteomforschung schließt das Erstellen eines Profils (profiling) von Proteinen, eine Identifikation und eine genaue Analyse von Proteinen, eine Interaktionsnetzwerk-Analyse (interaction network analysis) und den Aufbau einer Proteom-Datenbank ein und ist ein Gebiet, in dem diese Technolologien für die Life Science-Forschungen angewendet werden.
Unter diesen wurden als das Interaktionsnetzwerk-Analyse-Verfahren ein Hefe-zwei-Hybrid-Verfahren und ein Phagen-Display-Verfahren durchgeführt, und als ein Verfahren der Verwendung des Bindens über Affinität (affinity capture) wurden ein Immunpräzipitationsverfahren, ein BIA-MA-Verfahren (BIA-MA method), ein Säulenwechsel-Massenspektrometrie-Verfahren (column switching-mass spectrometry method) und dergleichen durchgeführt ("Proteome analysis method", S. 163–211, verlegt von Yodosha, Co., Ltd., 2000). Jedoch erreichen diese oben aufgelisteten Interaktionsnetzwerk-Analysen keine Analyse mit hohem Durchsatz.
Der Bericht über einen Protein-Mikroarray für eine Analyse der Wechselwirkungen von Proteinen mit hohem Durchsatz wurde von Schreiber et al. gemacht (Science 289: 1760–1763, 2000). Dies ist ein Verfahren, in dem eine wässrige Proteinlösung auf den Glasobjektträger mit einer Aldehydgruppe getüpfelt wird, mit BSA-Lösung geblockt wird, dann mit der Proteinlösung zur Reaktion gebracht wird, um die Detektion mittels eines Fluoreszenzlesegeräts durchzuführen. In diesem Fall gibt es dahingehend ein Problem, dass die Stabilität der Schiff'schen Base, welche ein Reaktionsprodukt zwischen einer Aldehydgruppe und einer Aminogruppe ist, gering ist (gewöhnlich tritt leicht Hydrolyse auf).
Als ein Verfahren zum Befestigen eines Proteins an der festen Phase ist zusätzlich zu diesen in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. H07-53108, Amtsblatt, ein Verfahren beschrieben, in dem ein hydrophobes Polypeptid am Ende des Proteins eingeführt wird.
In dem japanischen Patent Nr. 2 922 040 ist ein Verfahren zum Befestigen eines Antikörperproteins mit einem Protein A-Molekülfilm beschrieben.
Außerdem offenbart die europäische Patentanmeldung 0 323 692 ein Reagens, zusammengesetzt aus:

(a) einem polymeren Teilchen, das durch reaktive überhängende Gruppen gebunden ist an
(b) eine immunologische Spezies, die dazu befähigt ist, an einer immunologischen Reaktion mit einem entsprechenden Rezeptor teilzunehmen, wobei das Reagens dadurch gekennzeichnet ist, dass das Polymer von mindestens einem ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomer, das entweder überhängende aktivierte 2-substituierte Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen hat, abgeleitet ist, und wobei das Innere des Teilchens im Wesentlichen frei von detektierbarem Tracer-Material ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, einen Chip aus biologischem Material bereitzustellen, in dem zumindest ein Mitglied spezifischer Bindungspartner gebunden ist und an einem reaktiven festen Träger befestigt ist, der rasches und stabiles Binden und Befestigen erreichen kann. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die Detektion einer Zielsubstanz, die ein anderes Mitglied der spezifischen Bindungspartner ist, unter Verwen dung des zuvor genannten Chips aus biologischem Material bereitzustellen. Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die Herstellung des zuvor genannten Chips aus biologischem Material bereitzustellen.
Um die obigen Aufgaben zu erfüllen, stellten die Erfinder ernsthaft Untersuchungen an und stellten einen Chip aus biologischem Material her, in dem mindestens ein Mitglied spezifischer Bindungspartner durch eine kovalente Bindung über eine Sulfonylgruppe an einen festen Träger gebunden war. Als ein Ergebnis stellten sie fest, dass das Mitglied der spezifischen Bindungspartner unverzüglich und stabil an den festen Träger gebunden werden konnte und dass ein Zielmaterial effizient detektiert werden konnte. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Ergebnisse vervollständigt.
Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Chip aus biologischem Material bereitgestellt, wobei eine Gruppe, dargestellt durch die folgende Formel (I), die einen Rest eines Mitglieds spezifischer Bindungspartner enthält, an einen festen Träger gebunden ist, wobei die Formel -L-SO₂-X-A (I)ist, und in der Formel (I) L eine Verknüpfungsgruppe darstellt, die -SO₂-X-A und den festen Träger verbindet; X -CR¹(R²)-CR³(R¹)- darstellt; jedes von R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, darstellt; und A einen Rest des Mitglieds der spezifischen Bindungspartner darstellt, wobei die spezifischen Bindungspartner eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Liganden, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Antigens, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Haptens, eine Kombination von Avidinen und Biotinen oder eine Kombination eines Rezeptors und eines Liganden sind, und der feste Träger Glas, eine Elektrodenoberfläche oder eine Sensorchipoberfläche ist.
Gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Detektion einer Zielsubstanz in einer Probe bereitgestellt, umfassend die Schritte:

(a) In-Kontakt-Bringen eines Chips aus biologischem Material, wobei eine Gruppe, dargestellt durch die folgende Formel (I), die einen Rest eines Mitglieds der spezifischen Bindungspartner enthält, an einen festen Träger gebunden ist, mit einer Probe, die eine Zielsubstanz enthält, die ein anderes Mitglied der spezifischen Bindungspartner ist; und
(b) Analysieren der Wechselwirkung zwischen den Mitgliedern der spezifischen Bindungspartner, wobei die Formel -L-SO₂-X-A (I)ist, und in der Formel (I) L eine Verknüpfungsgruppe darstellt, die -SO₂-X-A und den festen Träger verbindet; X -CR¹(R²)-CR³(R⁴)- darstellt; jedes von R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, darstellt; und A einen Rest eines Mitglieds der spezifischen Bindungspartner darstellt, wobei die spezifischen Bindungspartner eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Liganden, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Antigens, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Haptens, eine Kombination von Avidinen und Biotinen oder eine Kombination eines Rezeptors und eines Liganden sind, und der feste Träger Glas, eine Elektrodenoberfläche oder eine Sensorchipoberfläche ist.

Gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Herstellung eines Chips aus biologischem Material nach Anspruch 1 bereitgestellt, umfassend einen Schritt des In-Kontakt-Bringens von mindestens einem Mitglied der spezifischen Bindungspartner, das eine reaktive Gruppe enthält, die eine kovalente Bindung durch Reagieren mit einer Vinylsulfongruppe oder deren reaktiver Vorläufergruppe, dargestellt durch die folgende Formel (II), bildet, mit einem festen Träger, der eine Vinylsulfonylgruppe oder deren reaktive Vorläufergruppe, dargestellt durch die folgende Formel (II), auf seiner Oberfläche hat, wobei die Formel -L-SO₂-X' (II)ist, und in der Formel (II) L eine Verknüpfungsgruppe darstellt, die -SO₂-X' und den festen Träger verbindet; X' -CR¹=CR²(R³) oder -CH(R¹)-CR²(R³) (Y) darstellt; jedes von R¹, R² und R³ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, darstellt; Y eine Gruppe darstellt, die durch ein nukleophiles Reagens substituiert ist, oder eine Gruppe, die als [HA] durch eine Base eliminiert wird, wobei die spezifischen Bindungspartner eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Liganden, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Antigens, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Haptens, eine Kombination von Avidinen und Biotinen oder eine Kombination eines Rezeptors und eines Liganden sind, und der feste Träger Glas, eine Elektrodenoberfläche oder eine Sensorchipoberfläche ist.
In Verbindung mit dem Chip aus biologischem Material sind das Verfahren für die Detektion einer Zielsubstanz in einer Probe und das Verfahren für die Herstellung des zuvor genannten Chips aus biologischem Material wie oben erwähnt, die bevorzugten Ausführungsformen sind unten erwähnt.
Die spezifischen Bindungspartner sind zusammengesetzt aus den einzelnen Mitgliedern, die eine spezifische biologische Bindung bilden können.
Die spezifischen Bindungspartner sind eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Liganden, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Antigens, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Haptens, eine Kombination von Avidinen und Biotinen oder eine Kombination eines Rezeptors und eines Liganden.
Die Avidine sind Avidin, Streptavidin oder ihre veränderten Körper, die einen stabilen Komplex mit Biotin bilden können.
Die Biotine sind Biotin, Biocytin, Desthiobiotin, Oxybiotin oder ihre Derivate, die einen stabilen Komplex mit Avidin bilden können.
Verweisende Beispiele der spezfischen Bindungspartner sind eine Kombination einer Nucleinsäure und einer Nucleinsäure oder eine Kombination einer Nucleinsäure und einer Nucleinsäure-bindenden Substanz.
Die Nucleinsäure ist ein Nucleotid-Derivat, eine Peptidnucleinsäure (peptide nucleonic acid) oder ein LNA.
Die Nucleinsäure-bindende Substanz ist eine Doppelstrang-DNA-Erkennungssubstanz.
Die Doppelstrang-DNA-Erkennungssubstanz ist ein Doppelstrang-DNA-Erkennungsantikörper.
Die Doppelstrang-DNA-Erkennungssubstanz ist ein DNA-Transkriptionsfaktor.
Die Doppelstrang-DNA-Erkennungssubstanz ist ein Protein mit einem Zinkfinger-Motiv oder einem Ring-Finger-Motiv.
Die Doppelstrang-DNA-Erkennungssubstanz ist eine Peptidnucleinsäure (peptide nucleic acid).
In der Formel (I) stellt "A" einen Rest eines Proteins dar.
Der feste Träger ist Glas, eine Elektrodenoberfläche oder eine Sensorchipoberfläche; und eine Blockierungsbehandlung einer freien reaktiven Gruppe auf der Oberfläche des festen Trägers wird mit einer wässrigen Lösung einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Proteins nach dem In-Kontakt-Bringen von mindestens einem Mitglied der spezifischen Bindungspartner mit dem festen Träger durchgeführt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist eine schematische Darstellung, die die Struktur eines Proteinchips zeigt, der eine typische Ausführung der vorliegenden Erfindung ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Chip aus biologischem Material, wobei eine Gruppe, dargestellt durch die folgende Formel (I), die einen Rest eines Mitglieds spezifischer Bindungspartner enthält, an einen festen Träger gebunden ist. -L-SO₂-X-A (I)wobei in der Formel (I) L eine Verknüpfungsgruppe darstellt, die -SO₂-X-A und den festen Träger verbindet; X -CR¹(R²)-CR³(R⁴)- darstellt; jedes von R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, darstellt; A einen Rest des Mitglieds der spezifischen Bindungspartner darstellt.
Die spezifischen Bindungspartner in der vorliegenden Erfindung bedeuten Bindungspartner, die eine spezifische biologische Bindung bilden. Beispiele davon schließen Kombinationen, wie ein Antikörper oder ein Antikörper-Fragment/ein Ligand, ein Antikörper oder ein Antikörper-Fragment/ein Antigen, ein Antikörper oder ein Antikörper-Fragment/Substanz mit einer antigenen Determinante, wie ein Hapten, einen Rezeptor/einen Liganden und Avidine/Biotine, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Wenn der feste Träger mit einer daran befestigten DNA, der hergestellt ist, als DNA-Chip verwendet wird, sind die spezifischen Bindungspartner jene, die eine bestimmte Bindungsstärke haben und in exakter Weise und wiederholt in dem nachfolgenden Hybridisierungsverfahren verwendet werden können.
Verweisende Beispiele von Biotinen schließen Biotin, Biocytin, Desthiobiotin, Oxybiotin oder ihre Derivate ein, die einen stabilen Komplex mit Avidin bilden können. Die Phrase "kann einen stabilen Komplex bilden" bedeutet, dass ein Komplex mit einer Dissoziationskonstante, nahe bei der Dissoziationskonstante des Biotin-Avidin-Komplexes (10^–15M), gebildet werden kann. Beispiele von Avidinen schließen Avidin, Streptavidin oder ihre veränderten Körper ein, die einen stabilen Komplex mit Biotin bilden können. Die Phrase "ein stabiler Komplex" bedeutet ebenfalls den gleichen Gegenstand, wie oben im Hinblick auf die Biotine definiert. Der veränderte Körper bedeutet weiterhin einen modifizierten Körper oder seine Fragmente von natürlich auftretendem Avidin oder Streptavidin oder von Rekombinanten davon.
Verweisende Beispiele der Nucleinsäure schließen Nucleotid-Derivate oder ihre Analoga ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Repräsentative Beispiele schließen ein Oligonucleotid, ein Polynucleotid und eine Peptidnucleinsäure ein. Das Nucleotid-Derivat oder sein Analogon kann ein natürlich auftretendes sein (DNA, DNA-Fragment, RNA oder RNA-Fragment und dergleichen), oder es kann eine synthetische Verbindung sein. Darüber hinaus schließen Nucleotid-Derivate oder ihre Analoga eine Vielzahl von analogen Verbindungen ein, wie diejenige, die LNA genannt wird, mit einer (quer-) vernetzenden Gruppe an ihrem Zuckereinheit-Anteil (J. Am. Chem. Soc. 1998, 120:13252–13253).
Die Nucleinsäure-bindenden Substanzen schließen eine Doppelstrang-DNA-Erkennungssubstanz ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Doppelstrang-DNA-Erkennungssubstanzen schließen eine Substanz ein, die eine Doppelstrang-DNA erkennt und spezifisch daran bindet. Beispiele der Doppelstrang-DNA-Erkennungssubstanz schließen einen DNA-Transkriptionsfaktor, ein Fehlpaarungs-Reparaturprotein (mismatch repairing protein), einen Doppelstrang-DNA-Erken nungsantikörper oder eine Peptidnucleinsäure ein. Darüber hinaus schließen die Doppelstrang-DNA-Erkennungssubstanzen Substanzen mit Zinkfinger-Motiv oder Ring-Finger-Motiv ein.
Der DNA-Transkriptionsfaktor ist eine Substanz, die an die Promotorregion auf dem Gen bindet und die Transkription von DNA zu mRNA kontrolliert (Takaaki, Tamura: Transcription Factor, verlegt durch Yodosha, Co., Ltd., 1995). Demgemäß ist es bekannt, dass der Transkriptionsfaktor spezifisch an Doppelstrang-DNA der spezifischen Sequenz bindet.
Unter einer großen Anzahl von Transkriptionsfaktoren zeigt das Zinkfinger-Protein, d.h., eine Transkriptionsfaktorgruppe mit Zinkfinger- und Ring-Finger-Motiven, eine sehr hohe Erscheinungsrate bei Eukaryoten, und 1% des Genoms scheint für sie zu codieren.
Plabo et al. analysierten die Tertiärstruktur des Zinkfinger-Motivs und klärten den Mechanismus einer Bindung an DNA auf (Science 252:809 (1991)). Weiterhin waren Choo et al. erfolgreich darin, durch ein rekombinantes Genverfahren eine Zinkfinger-Proteingruppe herzustellen, die an die spezifische Sequenz bindet, die aber nicht in der Natur vorkommt (Nature 372: 642 (1994), PNAS 91:11163 (1994)). Weiterhin war die Gruppe des Scripps Research Institute erfolgreich darin, eine neue Zinkfinger-Proteingruppe mittels Phagen-Display herzustellen (PNAS 95: 2812 (1998); 96: 2758 (1999)). Wie oben beschrieben, hat die DNA-Transkriptionsfaktorgruppe, repräsentiert durch das Zinkfinger-Protein, ursprünglich die Eigenschaft, an eine Doppelstrang-DNA zu binden, und gemäß der Forschungen in den letzten Jahren wurde es ermöglicht, eine Rekombinante herzustellen, die eine gegebenen DNA-Sequenz erkennt. Es ist möglich, eine Doppelstrang-DNA effzient auf einem Träger festzuhalten, indem solche Proteine befestigt werden.
Neben diesen schließen die Nucleinsäure-bindenden Substanzen ein Helix-Schleife-Helix-Protein und eine Substanz mit einer ETS-Domäne ein.
In dem Fall, dass das Mitglied der spezifischen Bindungspartner, das an den festen Träger gebunden werden soll, zu den Proteinen gehört, kann eine Gruppe, wie eine Aminogruppe, eine Iminogruppe, eine Hydrazingruppe, eine Carbomoylgruppe (carbomoyl group), eine Hydrazinocarbonylgruppe, eine Mercaptogruppe oder eine Carboxyimidogruppe, in die Proteine eingeführt werden. Beim Verwenden einer Aminogruppe oder einer Mercaptogruppe, die in dem Protein vorhanden ist, oder der oben erwähnten eingeführten Gruppe, kann eine kovalente Bindung mit der reaktiven Gruppe über eine Sulfonylgruppe gebildet werden.
Der feste Träger, an dem das zuvor genannte Mitglied der spezifischen Bindungspartner (z.B. Antikörper, Avidine oder Nucleinsäure-bindende Substanz) befestigt wurde, kann ein anderes Mitglied (z.B. Ligand, Biotine oder Nucleinsäure) der Bindungspartner, das befähigt ist, spezifisch mit den befestigten Mitgliedern zu reagieren, indem der feste Träger mit dem anderen Mitglied der spezifischen Bindungspartner bei Vorhandensein eines wässrigen Mediums in Kontakt gebracht wird, fixieren. Es ist wünschenswert, dass eine detektierbare Markierung (z.B. Fluoreszenzmarkierung, Enzymmarkierung oder dergleichen) an das andere Mitglied der spezifischen Bindungspartner, das fixiert werden soll (z.B. Ligand, Biotine oder Nucleinsäure), in einer solchen Weise gebunden ist, dass die Fixierung von außerhalb detektiert werden kann.
Vergleichende Beispiele eines Nucleotid-Derivats oder seines Analogons, in dem Fall, dass die Substanz, die an dem festen Träger fixiert werden soll, eine Nucleinsäure ist, schließen ein Oligonucleotid, ein Polynucleotid, eine Peptidnucleinsäure oder eine LNA ein. Diese Nucleotid-Deri vate oder ihre Analoga schließen Verbindungen ein, die eine reaktive Gruppe bei oder nahe bei einem der Endanteile eines Moleküls haben, die mit einer Vinylsulfonylgruppe oder deren reaktiver Vorläufergruppe reagieren kann, um eine kovalente Bindung zu bilden, und werden verwendet.
Beispiele solcher reaktiven Gruppen schließen eine Aminogruppe, eine Iminogruppe, eine Hydrazinogruppe, eine Carbamoylgruppe, eine Hydrazinocarbonylgruppe, eine Carboxyimidogruppe, eine Mercaptogruppe und dergleichen ein.
Der feste Träger, an dem die zuvor genannten Nucleotid-Derivate oder ihre Analoga befestigt sind, kann ein Oligonucleotid oder ein Polynucleotid (DNA oder ihre Fragmente oder RNA oder ihre Fragmente) die Komplementarität zu einem der befestigten Nucleotid-Derivate oder deren Analoga zeigt, fixieren, indem der feste Träger mit dem komplementären Oligonucleotid oder Polynucleotid in Kontakt gebracht wird, um eine Hybridisierung durchzuführen. Es ist wünschenswert, dass eine detektierbare Markierung (z.B. Fluoreszenzmarkierung) an das komplementäre Oligonucleotid oder Polynucleotid, das fixiert werden soll, in einer solchen Weise gebunden ist, dass die Fixierung von außerhalb detektiert werden kann.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete feste Träger kann in einer beliebigen Form sein, einschließlich z.B. einer Platte, einer Mikrotiterplatte, Kügelchen, eines Stabes oder dergleichen, solange sie keine nachteilige Wirkung auf die Bindungsbildung zwischen den entsprechenden Mitgliedern der spezifischen Bindungspartner hat. Es ist bevorzugt, ein Substrat zu verwenden, wobei die Oberfläche die Eigenschaften einer insbesondere hydrophoben oder schwach hydrophilen Beschaffenheit und Glätte hat. Weiterhin kann ein Substrat, das eine Oberfläche von geringer Glätte mit einer konvexen und einer konkaven (Seite) hat, verwendet werden. Die Substanz für den festen Träger schließt Glas, Zement, Keramiken oder neue Keramiken, wie Tonwaren, Polymere, wie Polyethylenterephthalat, Celluloseacetat, Polycarbonat aus Bisphenol A, Polystyrol oder Polymethylmethacrylat, Silicium, eine Vielzahl von porösen Substanzen, wie Aktivkohle, poröses Glas, poröse Keramiken, poröses Silicium, poröse Aktivkohle, Webware, Maschenware, Vlies, Filterpapier, Kurzfaser oder Membranfilter, ein. Es ist bevorzugt, dass die Größe eines feinen Lochs einer porösen Substanz in dem Bereich von 2 bis 1000 nm, und besonders bevorzugt in dem Bereich von 2 bis 500 nm, ist. Es ist besonders bevorzugt, dass die Substanzbeschaffenheit des festen Trägers Glas oder Silicium ist. Dies ist so aufgrund der Einfachheit der Oberflächenbehandlung und der Einfachheit der Analyse mittels eines elektrochemischen Verfahrens. Es ist bevorzugt, dass die Dicke des festen Trägers in dem Bereich von 100 bis 2000 μm ist. Der feste Träger kann für die Zweckmäßigkeit der Handhabung in Form eines magnetischen Materials oder einer Elektrode ausgearbeitet sein.
Der feste Träger kann ein Elektrodensubstrat sein, das als ein Substrat eines DNA-Chips verwendet wird, der für ein elektrochemisches Analyseverfahren verwendet wird. Weiterhin kann auch eine Vielzahl von funktionalen Substraten, wie ein Substrat, das für den oben beschriebenen Oberflächen-Plasmon-Resonanz-(SPR)-Biosensor oder eine ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) verwendet wird, verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung ist ein Mitglied eines spezifischen Bindungspartners (in der folgenden Formel (I) ein Rest, dargestellt durch A) des Chips aus biologischem Material an den festen Träger durch eine kovalente Bindung über eine Sulfonylgruppe gebunden, wie es in der folgenden Formel (I) gezeigt ist. -L-SO₂-X-A (I) wobei in der Formel (I) L eine Verknüpfungsgruppe darstellt, die -SO₂-X-A und den festen Träger verbindet; X -CR¹(R²)-CR³(R⁴)- darstellt; jedes von R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, darstellt; und A einen Rest des Mitglieds der spezifischen Bindungspartner darstellt.
In der Formel (I) stellt L eine bivalente oder Mehrfach-Verknüpfungsgruppe für das Verbinden von -SO₂-X-A und dem festen Träger dar. Beispiele eines -L- schließen eine beliebige Verknüpfungsgruppe, ausgewählt aus aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Verbindungen, Kohlenwasserstoffketten, die durch ein Heteroatom unterbrochen sein können, oder Kombinationen aus diesen, ein. Darüber hinaus kann L eine Einfachbindung sein.
In der Formel (I) schließen Beispiele einer Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine n-Propylgruppe, eine n-Butylgruppe und eine n-Hexylgruppe ein, und die Methylgruppe ist bevorzugt. Beispiele einer Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen schließen eine Phenylgruppe und eine Naphthylgruppe ein. Es ist bevorzugt, dass jedes von R¹, R² und R³ ein Wasserstoffatom darstellt.
Beispiele einer Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, schließen die Kombination der Beispiele einer Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und der Beispiele einer Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen ein.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Detektion einer Zielsubstanz in einer Probe, umfassend die Schritte:

(a) In-Kontakt-Bringen eines Chips aus biologischem Material, wobei eine Gruppe, dargestellt durch die zuvor genannte Formel (I), die einen Rest eines Mitglieds der spezifischen Bindungspartner enthält, an einen festen Träger gebunden ist, mit einer Probe, die eine Zielsubstanz enthält, die ein anderes Mitglied der spezifischen Bindungspartner ist; und
(b) Analysieren der Wechselwirkung zwischen den Mitgliedern der spezifischen Bindungspartner.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Typ der "Probe, die eine Zielsubstanz enthält", ist nicht im Besonderen beschränkt und schließt z.B. ein Blut, wie peripheres Venenblut, weiße Blutzellen, Serum, Urin, Stuhl, Sperma, Speichel, eine kultivierte Zelle, eine Gewebezelle, wie eine Vielzahl von Zellen von Organen, und eine beliebige andere Probe, die Nucleinsäure enthält, ein. Was die Probe betrifft, so kann die Probe, wie die Gewebezelle, wie oben beschrieben, so verwendet werden, wie sie ist. Jedoch wird vorzugsweise Nucleinsäure, ein Ligand oder dergleichen, die/der durch Zerstören der Zelle in der Probe freigesetzt wurde, als eine Probe verwendet. Die Zerstörung der Zelle in der Probe kann gemäß der konventionellen Weise durchgeführt werden. Z.B. kann sie durch Anbringen einer physikalischen Handlung, wie Schütteln, Ultraschallbehandlung von außerhalb, durchgeführt werden. Die Nucleinsäure kann auch unter Verwendung einer Nucleinsäure-Extraktionslösung (z.B. eine Lösung, die ein Tensid, wie SDS, Triton-X, Tween-20 oder dergleichen, oder Saponin, EDTA, eine Protease oder dergleichen, oder dergleichen enthält) aus der Zelle freigesetzt werden. In dem Fall, dass die Nucleinsäure unter Verwendung einer Nucleinsäure-Extraktions lösung herausgelöst wird, kann die Reaktion durch Inkubation bei einer Temperatur von 37°C oder höher gefördert werden.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des Chips gemäß der vorliegenden Erfindung, das den Schritt des In-Kontakt-Bringens des festen Trägers, der eine Vinylsulfonylgruppe oder deren reaktive Vorläufergruppe enthält, dargestellt durch die folgende Formel (II), auf der Oberfläche enthält, mit mindestens einem Mitglied der spezifischen Bindungspartner, der eine reaktive Gruppe hat, die eine kovalente Bindung durch Reagieren mit der Vinylsulfonylgruppe oder deren reaktiver Vorläufergruppe bildet. -L-SO₂-X' (II)wobei in der Formel (II) L eine Verknüpfungsgruppe zum Verbinden von -SO₂-X' und dem festen Träger darstellt; X' -CR¹=CR²(R³) oder -CH(R¹)-CR²(R³)(Y) darstellt; jedes von R¹, R² und R³ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, darstellt; und Y eine Gruppe, die durch ein nucleophiles Reagens substituiert ist, oder eine Gruppe, die mittels Base als "HY" eliminiert wird, darstellt.
In der Formel (II) schließen Beispiele einer Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine n-Propylgruppe, eine n-Butylgruppe und eine n-Hexylgruppe ein, und die Methylgruppe ist besonders bevorzugt. Beispiele einer Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen schließen eine Phenylgruppe und eine Naphthylgruppe ein. Es ist bevorzugt, dass jedes von R¹, R² und R³ ein Wasserstoffatom darstellt.
Beispiele einer Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, schließen die Kombination der Beispiele einer Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und der Beispiele einer Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen ein.
In der Formel (II) stellt Y eine Gruppe, die durch ein nucleophiles Reagens, wie -OH, -OR⁰, -SH, NH₃, NH₂R⁰ (R⁰ stellt eine Gruppe, wie eine Alkylgruppe oder dergleichen, mit Ausnahme des Wasserstoffatoms, dar), substituiert ist, oder eine Gruppe, die mittels Base als "HY" eliminiert wird, dar. Beispiele davon schließen ein Halogenatom, -OSO₂R¹¹, -OCOR¹², -OSO₃M oder eine quaternäre Pyridiniumgruppe ein (R¹¹ stellt eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, dar; R¹² stellt eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine halogenierte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen dar; M stellt ein Wasserstoffatom, ein Alkalimetallatom oder eine Ammoniumgruppe dar).
Eine Alkylgruppe von R¹¹, eine Arylgruppe von R¹¹ und eine Aralkylgruppe von R¹¹ können einen Substituenten haben. Beispiele eines solchen Substituenten schließen ein Atom oder eine Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Hydroxylgruppe, einer Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einer Alkenylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einer Carbamoylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, einer Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einer Aralkylgruppe mit 7 bis 16 Kohlenstoffatomen, einer Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, einer Sulfamoylgruppe (oder ihr Natriumsalz, Kaliumsalz oder dergleichen), einer Sulfogruppe (oder ihr Natriumsalz, Ka liumsalz oder dergleichen), einer Carbonsäuregruppe (oder ihr Natriumsalz, Kaliumsalz oder dergleichen), einem Halogenatom, einer Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einer Arylengruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, einer Sulfonylgruppe, und ihre Kombinationen ein.
In der Formel (II) stellt L eine bivalente oder Mehrfach-Verknüpfungsgruppe zum Verbinden der SO₂-X'-Gruppe und des festen Trägers dar. Beispiele einer -L- schließen eine beliebige Verknüpfungsgruppe, ausgewählt aus einer aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Verbindung, und einer Kohlenwasserstoff kette, die durch ein Heteroatom unterbrochen sein kann, und eine Verknüpfungsgruppe, die aus deren Kombinationen ausgewählt ist, ein. Weiterhin kann L eine Einfachbindung sein.
Bevorzugte Beispiele der oben beschriebenen "-X'"-Gruppe sind nachfolgend gezeigt:
In den oben beschriebenen konkreten Beispielen ist es bevorzugt, dass "-X'" (X1), (X2), (X3), (X4), (X7), (X8), (X13) oder (X14) darstellt, und es ist stärker bevorzugt, dass "-X'" (X1) oder (X2) darstellt. Und es ist besonders bevorzugt, dass "-X'" eine Vinylgruppe darstellt, die durch (X1) dargestellt ist.
Da eine kovalente Bindung über eine Sulfonylgruppe, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine hohe Resistenz gegenüber Hydrolyse hat, kann sie leicht in einem stabilen Zustand gelagert werden und kann rasch mit einer reaktiven Gruppe von Nucleotid-Derivaten oder deren Analoga reagieren, die bereits zuvor eine Aminogruppe enthalten oder bei welchen eine reaktive Gruppe, wie eine Aminogruppe, eingeführt wurde, um eine stabile kovalente Bindung zu bilden.
An einem Ende eines Nucleotid-Derivats oder seines Analogons, wie ein Oligonucleotid und ein DNA-Fragment, wird eine reaktive Gruppe, die eine kovalente Bindung durch Reagieren mit der zuvor genannten Vinylsulfonylgruppe oder deren reaktiver Vorläufergruppe bildet, eingeführt. Bevorzugte Beispiele einer solchen reaktiven Gruppe schließen eine Aminogruppe, eine Iminogruppe, eine Hydrazinogruppe, eine Carbomoylgruppe, eine Hydrazinocarbonylgruppe, eine Carboxyimidogruppe oder eine Mercaptogruppe ein, und die Aminogruppe ist besonders bevorzugt. Die reaktive Gruppe ist gewöhnlich über ein Vernetzungsmittel an ein Oligonucleotid und ein DNA-Fragment gebunden. Als Vernetzungsmittel wird z.B. eine Alkylengruppe oder eine n-Alkylaminoalkylengruppe verwendet, und eine Hexylengruppe oder eine n-Methylaminohexylengruppe ist bevorzugt, und eine Hexylengruppe ist besonders bevorzugt. Es sollte angemerkt werden, dass, da eine Peptidnucleinsäure (PNA) eine Aminogruppe hat, es gewöhnlich nicht erforderlich ist, eine weitere reaktive Gruppe einzuführen.
Da das Protein eine Aminogruppe oder eine Mercaptogruppe hat, ist es dementsprechend gewöhnlich nicht notwendig, eine andere reaktive Gruppe einzuführen. Da jedoch die Tertiärstruktur des Proteins wesentlich mit seiner Funktion zusammenhängt, ist es in dem Fall, dass die Aktivität des Proteins verringert wird, bevorzugt, eine reaktive Gruppe an einer spezifischen Position einzuführen, die keinen Einfluss auf die Aktivität hat.
Der Kontakt eines Nucleotid-Derivats oder seines Analogons mit einer reaktiven Gruppe mit einem reaktiven festen Träger wird gewöhnlich vorgenommen, indem die wässrige Lösung des Nucleotid-Derivates oder seines Analogons auf die Oberfläche des reaktiven festen Trägers getüpfelt wird. Konkret ist es zu bevorzugen, dass eine wässrige Flüssigkeit hergestellt wird, indem das Nucleotid-Derivat oder sein Analogon mit einer reaktiven Gruppe in einem wässrigen Medium aufgelöst oder dispergiert wird, und dann wird die wässrige Flüssigkeit in eine 96 Well- oder 384 Well-Kunststoffplatte gefüllt, und die eingefüllte wässrige Flüssigkeit wird unter Verwendung einer Spotter-Vorrichtung oder dergleichen auf die Oberfläche des festen Trägers getropft.
In dem Fall, dass das Protein aufgetüpfelt wird, kann eine Spotter-Vorrichtung zum Auftüpfeln einer wässrigen Flüssigkeit verwendet werden. Es besteht jedoch eine Möglichkeit, dass die Aktivität des Proteins in Abhängigkeit von der Eigenschaft eines Nadelkopfes verringert wird. In diesem Fall kann es stärker bevorzugt sein, eine Tintenstrahl-Vorrichtung oder dergleichen zu verwenden.
Um das Eintrocknen des Nucleotid-Derivats oder seines Analogons nach dem Auftüpfeln zu verhindern, kann eine Substanz mit einem hohen Siedepunkt in die wässrige Flüssigkeit, in der das Nucleotid-Derivat oder sein Analogon gelöst oder dispergiert ist, hinzugefügt werden. Die Sub stanz mit einem hohen Siedepunkt ist vorzugsweise eine Substanz, die in der wässrigen Lösung, in der das Nucleotid-Derivat oder sein Analogon, das aufgetüpfelt werden soll, gelöst oder dispergiert ist, gelöst werden kann, die die Hybridisierung mit einer Probe, wie einer Nucleinsäure-Fragment-Probe (Ziel-Nucleinsäure-Fragment), die ein Gegenstand der Detektion ist, nicht behindert und keine sehr hohe Viskosität hat. Solche Substanzen schließen Glycerin, Ethylenglykol, Dimethylsulfoxid und ein hydrophiles Polymer mit einem geringen Molekulargewicht ein. Beispiele der hydrophilen Polymere schließen Polyacrylamid, Polyethylenglykol und Natriumpolyacrylat ein. Das bevorzugte Molekulargewicht dieses Polymers ist in dem Bereich von 10³ bis 10⁶. Es ist stärker bevorzugt, als Substanz mit einem hohen Siedepunkt Glycerin oder Ethylenglykol zu verwenden, und besonders bevorzugt ist es, Glycerin zu verwenden. Eine bevorzugte Konzentration der Substanz mit hohem Siedepunkt ist in dem Bereich von 0,1 bis 2 Vol.-%, und besonders bevorzugt 0,5 bis 1 Vol.-%, in der wässrigen Flüssigkeit des Nucleotid-Derivats oder seines Analogons.
Um das Trocknen und Denaturieren des Proteins nach dem Auftüpfeln zu verhindern, kann die Substanz mit einem hohen Siedepunkt in die wässrige Flüssigkeit hinzugefügt werden, wie es bei dem Nucleotid-Derivat oder seinem Analogon der Fall ist. Es gibt keine Regulierung bei der Konzentration der Substanz mit einem hohen Siedepunkt in einer wässrigen Flüssigkeit des Nucleotid-Derivats oder seines Analogons. Die Konzentration kann in Abhängigkeit einer Aktivität eines Proteins nach dem Auftüpfeln angepasst werden.
Darüber hinaus ist es um des gleichen Zweckes willen auch bevorzugt, den festen Träger nach dem Auftüpfeln der Nucleotid-Derivate oder ihrer Analoga, der Proteine oder dergleichen, unter solchen Verhältnissen zu platzieren, wo die Feuchtigkeit bzw. Luftfeuchtigkeit 90% oder mehr ist und die Temperatur in dem Bereich von 25 bis 50°C (in dem Fall des Proteins bis zu 37°C) ist.
Eine bevorzugte festgelegte Menge (numerische Menge) des Proteins, Nucleotid-Derivats oder seines Analogons auf der Oberfläche des festen Trägers ist in dem Bereich von 1 bis 10⁵ Sorten/cm² (kind/cm²). Durch Auftüpfeln wird die wässrige Flüssigkeit des Proteins, des Nucleotid-Derivats oder seines Analogons in einer Punktform an der Oberfläche des festen Trägers befestigt. Die Form des Punkts ist nahezu kreisförmig. Der Abstand zwischen den entsprechenden Punkten, die Größe des Punkts und das Volumen der wässrigen Flüssigkeit, wenn sie aufgetüpfelt ist, variiert in Abhängigkeit von ihrer beabsichtigten Verwendung.
In 1 ist schematisch eine Anordnung auf einem Proteinchip gezeigt, die eine repräsentative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist.
Wenn das Protein A mit der reaktiven Gruppe (Z) auf die Oberfläche des festen Trägers (P1), der in 1 gezeigt ist, aufgetüpfelt wird, tritt die Reaktion zwischen X und dem Protein ein. Es ist jedoch ein nicht-reagiertes X, an das das Protein nicht gebunden ist, auf der Oberfläche des festen Trägers (P1) vorhanden. In diesem Fall besteht eine Möglichkeit, dass solches X in einer nicht-spezifischen Weise mit einer markierten Ligandenprobe und dergleichen in einer Reaktion, die später durchgeführt werden soll, reagiert, was in dem Problem resultiert, dass die nichtspezifische Bindung gemessen werden kann. Daher ist es bevorzugt, dass das X zuvor einer Blockierungsbehandlung unterzogen wurde. Es ist bevorzugt, dass die Blockierungsbehandlung durchgeführt wird, indem eine Verbindung mit einer Aminogruppe oder einer Mercaptogruppe in Kontakt mit der Oberfläche des festen Trägers (P2) gebracht wird. Um die nicht-spezifische Bindung eines Liganden, der zur Reaktion gebracht werden soll, zu verhindern, ist es bevor zugt, die Blockierungsbehandlung unter Verwendung eines Protein-Blockierungsmittels, speziell BSA, Casein, Gelatine oder dergleichen, durchzuführen. Als Ergebnis der Blockierung ist BSA oder dergleichen auf der Oberfläche des festen Trägers (P2) vorhanden, auf die nichts aufgetüpfelt wurde, wodurch das Binden des Liganden verhindert wird. Darüber hinaus kann die Blockierungsbehandlung in dem Fall, dass die Nucleinsäure zur Reaktion gebracht werden soll, durch In-Kontakt-Bringen mit einer anionischen Verbindung mit einer Aminogruppe oder einer Mercaptogruppe, außer dem oben beschriebenen Protein-Blockierungsmittel, durchgeführt werden. In dem Fall, dass die Substanz, mit der das Protein zur Reaktion gebracht wird, eine Nucleinsäure ist, kann sie, da die Nucleinsäure eine negative Ladung hat, die Nucleinsäure daran hindern, mit nichtumgesetztem X zu reagieren, indem sie auch auf der Oberfläche des festen Trägers (P2) eine negative Ladung erzeugt. Was eine solche anionische Verbindung betrifft, so kann eine beliebige Verbindung verwendet werden, wenn sie mit X reagiert und eine negative Ladung hat (COO^–, SO₃ ^–, OSO₃ ^–, PO₃ ^– oder PO₂ ^–). Unter diesen ist eine Aminosäure bevorzugt, und Glycin oder Cystein ist besonders bevorzugt. Weiterhin wird auch Taurin vorzugsweise verwendet.
Ein Proteinchip, der ein repräsentativer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, wird für die Analyse von Proteinwechselwirkungen, die Analyse der Proteinexpression und die Wirkstoffentwicklungssuche verwendet. Weiterhin kann er in dem Fall, dass das Protein ein Nucleinsäure-bindendes Protein ist, für die Mutationsanalyse und die Nucleotid-Polymorphismus-Analyse in Abhängigkeit von seiner Erkennungs-Nucleinsäuresequenz verwendet werden.
Das Detektionsprinzip basiert auf der Reaktion mit dem markierten Liganden oder der markierten Nucleinsäure. Was die Markierungsverfahren betrifft, obwohl eine RI-Methode und eine Nicht-RI-Methode (Fluoreszenz-Methode, Biotin- Methode, Chemolumineszenz-Methode oder dergleichen) bekannt sind, so ist dies nicht im Besonderen beschränkt. Z.B. kann in dem Fall der Fluoreszenz-Methode eine beliebige Substanz als Fluoreszenzsubstanz zur Fluoreszenzmarkierung verwendet werden, wenn sie an den basischen Teil einer Nucleinsäure oder eines Protein-Aminosäurerestes binden kann. Z.B. können ein Cyanin-Farbstoff (z.B. Cy3, Cy5 oder dergleichen der Cy-Dye^TM-Reihe, die kommerziell erhältlich ist), Rhodamin 6G-Reagens, N-Acetoxy-N2-acetylaminofluoren (AAF) oder AAIF (Iod-Derivat von AAF) verwendet werden.
Es ist bevorzugt, dass die Ziel-Nucleinsäure in der Probe direkt detektiert wird, ohne dass sie durch ein PCR-Verfahren oder dergleichen vervielfältigt wird. Sie kann jedoch auch detektiert werden, nachdem sie zuvor vervielfältigt wurde. Die Ziel-Nucleinsäure oder ihr vervielfältigter Körper kann leicht durch vorheriges Markieren derselben/desselben detektiert werden. Um die Nucleinsäure zu markieren, wird häufig ein Verfahren unter Verwendung eines Enzyms (Reverse Transkriptase, DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Terminale Desoxynucleotidyl-Transferase (terminal deoxy transferase) oder dergleichen) verwendet. Weiterhin kann die Markierungssubstanz direkt durch eine chemische Reaktion gebunden werden. Ein solches Markierungsverfahren wurde in einigen Büchern als die bekannte Technologie beschrieben (Shintaro Nomura: De-isotope Experiment Protocol 1, veröffentlicht von Shujun Sha, Co., Ltd., 1994; Shintaro Nomura: De-isotope Experiment Protocol 2, veröffentlicht von Shujun Sha, Co., Ltd., 1998; Masaaki Muramatsu: DNA Microarray and Advanced PCR Method Labeling Material, veröffentlicht von Shujun Sha, Co., Ltd., 2000). Es ist bevorzugt, dass das Markierungsmaterial ein Material ist, das befähigt ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen. In dem Fall, dass das Markierungsmaterial ein Material mit einer Fähigkeit zum Verstärken des Signals, wie ein Enzym und ein Katalysator, ist, ist die Nachweisempfindlichkeit der DNA in hohem Maße verstärkt.
Da jedoch die oben beschriebene Durchführung der Markierung allgemein mühselig ist, kann ein Verfahren zum Messen der Nucleinsäure in der Probe ohne vorherige Markierung der Nucleinsäure als ein bevorzugtes Verfahren der Detektion verwendet werden. Für diesen Zweck kann z.B. ein DNA-interkalierendes Mittel, das eine Doppelstrang-DNA erkennt, d.h. das, was ein DNA-Interkalator genannt wird, verwendet werden. Durch die Verwendung eines DNA-Interkalators wird nicht nur die Durchführung der Detektion vereinfacht, sondern auch die Empfindlichkeit der Detektion wird verstärkt. Z.B. in dem Fall, dass eine DNA von 1000 bp detektiert werden soll, können, obwohl ein Markierungsverfahren bestenfalls mehrere Markierungsmaterialien einführen kann, 100 oder mehr Markierungsmaterialien in dem Fall eingeführt werden, dass der Interkalator verwendet wird.
Der DNA-Interkalator kann ein Material sein, das selbst ein detektierbares Signal bilden kann, oder das Signalgebende Material kann an die Seitenkette des Interkalators gebunden sein oder über ein spezifisches Bindungspaar, wie Biotin-Avidin, Antigen-Antikörper oder Hapten-Antikörper, an den Interkalator gebunden sein. Es ist bevorzugt, dass das in der vorliegenden Erfindung verwendete detektierbare Signal das Signal ist, das durch eine Fluoreszenzdetektion, eine Lumineszenzdetektion, eine Chemolumineszenzdetektion, eine Biolumineszenzdetektion, eine Elektrochemolumineszenzdetektion, eine Strahlungsdetektion, eine elektrochemische Detektion oder eine kolorimetrische Detektion detektierbar ist, aber es ist nicht auf diese beschränkt.
In dem Fall, dass ein Ligand ein Ziel ist, kann eine Substanz verwendet werden, die durch Reagierenlassen eines Succinimid-Körpers eines Cyanin-Farbstoffs (z.B. Cy3, Cy5 oder dergleichen der Cy-Dye^TM-Reihe, die kommerziell erhältlich ist), eines Rhodamin 6G-Reagenses, von N-Acetoxy-N₂-acetylaminofluoren (AAF) oder AAIF (Iod-Derivat von AAF) mit einer innen vorhandenen Aminogruppe erhalten wird.
Es ist bevorzugt, dass die Hybridisierung durchgeführt wird, indem eine wässrige Lösung, die zuvor in eine 96 Well- oder 384 Well-Kunststoffplatte pipettiert wird, in der die markierten Nucleinsäure-Fragment-Proben gelöst oder dispergiert sind, auf den festen Träger der vorliegenden Erfindung, an dem die Nucleotid-Derivate oder ihre Analoga befestigt sind, aufgetüpfelt wird. Die bevorzugte Menge der Lösung zum Auftüpfeln ist in dem Bereich von 1 bis 100 l. Die Hybridisierung wird vorzugsweise in dem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 70°C und für die Dauer von 1 bis 20 Stunden durchgeführt. Nach der Beendigung der Hybridisierung ist es bevorzugt, dass Waschen unter Verwendung einer gemischten Lösung eines Tensids und einer Pufferlösung durchgeführt wird, um nicht-umgesetzte Nucleinsäure-Fragment-Proben zu entfernen. Es ist bevorzugt, Natriumdodecylsulfat (SDS) als ein Tensid zu verwenden. Als eine Pufferlösung können Citratpufferlösung, Phosphatpufferlösung, Boratpufferlösung, Tris-Pufferlösung, Good-Pufferlösung oder dergleichen verwendet werden. Es ist besonders bevorzugt, Citratpufferlösung zu verwenden.
Die Hybridisierung unter Verwendung des festen Trägers, an dem die Nucleotid-Derivate oder ihre Analoga befestigt sind, ist dadurch charakterisiert, dass die Verwendungsmenge der markierten Nucleinsäure-Fragment-Proben bis zu einer sehr kleinen bzw. genauen (minute) Menge verringert werden kann. Es ist daher erforderlich, die optimalen Bedingungen der Hybridisierung in Abhängigkeit von der Kettenlänge der Nucleotid-Derivate oder ihrer Analoga, die an dem festen Träger befestigt sind, und der Typen der mar kierten Nucleinsäure-Fragment-Proben festzulegen bzw. einzustellen. Für die Analyse der Genexpression ist es bevorzugt, dass eine Hybridisierung für eine lange Zeitdauer durchgeführt wird, um in der Lage zu sein, sogar schwächer exprimierende Gene ausreichend zu detektieren. Für die Detektion eines Einzel-Nucleotid-Polymorphismus ist es bevorzugt, dass eine Hybridisierung für eine kurze Dauer durchgeführt wird. Darüber hinaus ist sie auch dadurch gekennzeichnet, dass ein Vergleich oder eine quantitative Bestimmung der Expressionsmengen unter Verwendung eines einzelnen festen Trägers, an dem die DNA-Fragmente befestigt sind, ermöglicht werden, indem zuvor zwei Typen der Nucleinsäure-Fragment-Proben hergestellt werden, die mit voneinander verschiedenen fluoreszierenden Substanzen markiert sind, und indem sie in einer Hybridisierung zur gleichen Zeit verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird unten durch die folgenden Beispiele konkreter beschrieben werden. Jedoch werden diese Beispiele nur angeboten, um bei einem leichteren Verstehen der vorliegenden Erfindung zu helfen, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie den Rahmen der vorliegenden Erfindung einschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Detektion einer komplementären Ziel-Oligonucleotid-Probe (Bezugsbeispiel)
(1) Herstellung eines festen Trägers, bei dem eine Vinylsulfonylgruppe eingeführt wurde Nach dem Eintauchen eines Glasobjektträgers (25 mm × 75 mm) in eine Ethanollösung von Aminopropylethoxysilan (2 Gew.-%) (Shin-Etsu Chemical) bei 110°C für 10 Minuten, wurde der Glasobjektträger aus der Lösung herausgenommen. Dann wurde der Glasobjektträger mit Ethanol gewaschen und bei 110°C für 10 Minuten getrocknet, um einen Silanverbindung-beschichteten Glasobjektträger (A) herzustellen. Als Nächstes wurde der Silanverbindung-beschichtete Glasobjektträger in einer Phosphatpufferlösung (pH 8,5) von 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamid)ethan (5 Gew.-%) für 1 Stunde eingetaucht und wurde aus der Lösung herausgenommen. Dann wurde der Glasobjektträger mit Acetonitril gewaschen und für 1 Stunde unter einer Bedingung mit verringertem Druck getrocknet, um einen festen Träger (B) zu erhalten, bei dem die Vinylsulfonylgruppe an seiner Oberfläche eingeführt wurde.
(2) Herstellung eines festen Trägers mit befestigtem Oligonucleotid
Eine wässrige Flüssigkeit (1 × 10^–6M, 1 μl) einer Dispersion eines 40mer-Oligonucleotid-Fragments:
(3'-TCCTCCATGTCCGGGGAGGATCTGACACTTCAAGGTCTAG-5') (Sequenz Nr. 1), dessen 3'-Ende mit einer Aminogruppe in 0,1M Carbonatpufferlösung (pH 9,3) modifiziert wurde, wurde auf den festen Träger (B), der oben unter (1) von Beispiel 1 erhalten wurde, aufgetüpfelt. Sofort nach dem Auftüpfeln wurde der feste Träger für eine Stunde bei der Temperatur von 25°C und der Feuchtigkeit bzw. Luftfeuchtigkeit von 90% belassen. Dann wurde der feste Träger zweimal mit der gemischten Lösung aus 0,1 Gew.-% SDS (Natriumdodecylsulfat) und 2 × SSC (2 × SSC: Lösung durch Verdünnen der Stammlösung von SSC um das 2fache erhalten; SSC: Standard-Salz-Citratpufferlösung) gewaschen und einmal mit wässriger 0,2 × SSC-Lösung gewaschen. Dann wurde der Glasobjektträger nach dem obigen Waschen in wässrige 0,1M Glycinlösung (pH 10) für 1 Stunde und 30 Minuten eingetaucht, mit destilliertem Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet, um einen festen Träger (C) zu erhalten, an dem die Oligonucleotide befestigt waren.
(3) Detektion einer komplementären Ziel-Oligonucleotid-Probe
Eine wässrige Dispersionsflüssigkeit der 22mer-Ziel-Oligonucleotid-Probe (3'-CTAGTCTGTGAAGTTCCAGATC-5') (Sequenz Nr. 2), deren 5'-Ende mit Cy5 (Fluoreszenzmarkierung) verbunden war, in der Hybridisierungslösung (gemischte Lösung von 4 × SSC und 10 Gew.-% SDS, 20 μl) wurde auf den festen Träger (C), der in dem oben beschriebenen (1) erhalten wurde, aufgetüpfelt. Dann, nachdem die Oberfläche mit einem Deckglas für die Mikroskopie geschützt wurde, wurde der feste Träger bei 60°C für 20 Stunden in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. Nach der Inkubation wurde der feste Träger abwechselnd mit einer gemischten Lösung von 0,1 Gew.-% SDS und 2 × SSC, einer gemischten ^Lösung von 0,1 Gew.-% SDS und 2 × SSC und einer wässrigen 0,2 × SSC-Lösung gewaschen, bei 700 UpM für 10 Minuten zentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Die Fluoreszenzintensität der Oberfläche des Glasobjektträgers, die mit einer Fluoreszenzlesevorrichtung gemessen wurde, war 1219, und sie war in hohem Maße vergrößert, verglichen mit der Hintergrund-Fluoreszenzintensität. Somit wird verstanden, dass unter Verwendung des festen Trägers mit einem befestigten Oligonucleotid, der gemäß dem Befestigungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, eine Ziel-Oligonucleotid-Probe, wie eine Ziel-DNA-Fragment-Probe, mit der Komplementarität zu dem Oligonucleotid, das auf dem festen Träger mit einem befestigten Oligonucleotid befestigt ist, effizient detektiert werden kann.
Beispiel 2: Detektion von komplementärer cDNA unter Verwendung eines cDNA-Chips (Bezugsbeispiel)
(1) Herstellung von Amino-terminaler DNA
Eine Amino-terminale DNA (GP-NH2) zum Auftüpfeln wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung eines 20mer-Primers (5'-TGGCCGCCTTCAACGCTCAG-3') (Sequenz Nr. 3) und eines 24mer-Primers (5'-GAAGGTGTGGCGCAGGTCGTAGTG-3') (Sequenz Nr. 4), von denen ihre 5'-Enden mit einer Aminogruppe gebunden waren, und unter Verwendung von PCR-Script^TM SK (+)-α-2-HS-Glykoprotein als eine Matrize hergestellt. Was die PCR-Bedingungen betrifft, so wurde die Reaktion in 30 Zyklen von 94°C/20 Sekunden, 60°C/30 Sekunden und 72°C/30 Sekunden unter Verwendung von Pyrobest DNA-Polymerase durchgeführt. Ein PE Thermal Circular 9700 wurde verwendet. Unter den gleichen PCR-Bedingungen wurde eine Amino-terminale DNA (Act-NH2) zum Auftüpfeln unter Verwendung eines 23mer-Primers (5'-ATGGATGATGATATCGCCGCGCT-3') (Sequenz Nr. 5) und eines 24mer-Primers (5'-GGTGAGGATCTTCATGAGGTAGTC-3') (Sequenz Nr. 6), von d_enen ihre 5'-Enden mit einer Aminogruppe gebunden waren, und unter Verwendung von pBlueScript II SK(+)-ß-Actin als eine Matrize hergestellt.
(2) Herstellung eines festen Trägers mit befestigter DNA
Eine wässrige Flüssigkeit (1 × 10^–6M, 1 μl) einer Dispersion von GP-NH2 oder Act-NH2 in 0,1M Carbonatpufferlösung (pH 9,3) wurde mittels einer Spotter-Vorrichtung auf den ^festen Träger mit einer Vinylsulfonylgruppe auf seiner Oberfläche, der in Beispiel 1 (1) erhalten wurde, aufgetüpfelt. Sofort nach dem Auftüpfeln wurde der feste Träger bei 25°C über Nacht in der Kammer mit gesättigter Salzlösung belassen. Dann wurde der feste Träger für 1 Stunde in eine wässrige 0,5M Glycinlösung (pH 8,5) eingetaucht und in kochendem Wasser für 30 Minuten belassen, um die Doppelstränge in Einzelstränge zu denaturieren. Dann wurde das Denaturieren durch Eintauchen des festen Trägers in eisgekühltes Ethanol beendet, und der feste Träger wurde bei Raumtemperatur getrocknet, um einen festen Träger (D) zu erhalten, an dem die cDNAs befestigt waren.
(3) Herstellung eines Fluoreszenzfarbstoff-markierten cDNA-Ziels unter Verwendung einer reverse Transkription-Reaktion.
Ein Fluoreszenzfarbstoff-markiertes cDNA-Ziel wurde aus einem 22mer-Primer (5'-ACTGTGCGTGTTTTCCGGGGGT-3') (Sequenz Nr. 7) durch eine reverse Transkription-Reaktion unter Verwendung von GP-cRNA hergestellt, die durch in vitro-Transkription als eine Matrize hergestellt wurde. cRNA (2 μg), Primer (20 pmol), dATP, dGTP und dCTP in einer Endkonzentration von 500 μM, dTTP in einer Endkonzentration von 200 μM und Cy5-dUTP (Amersham Pharmacia Biotech) in einer Endkonzentration von 100 μM wurden gemischt. Dann wurde das Gemisch durch Hinzufügen von DEPC-dH₂O (Life Technologies) auf 13 μl eingestellt. Nach einer Inkubation für 5 Minuten bei 65°C wurde das Gemisch rasch auf Eis abgekühlt. 4 μl des 5 × SuperScriptII-Puffers (Life Technologies), 1 μl von RnaseOUT (Life Technologies) und 2 μl von 0,1M DTT wurden dazu zugegeben. Nach einer Inkubation für 2–3 Minuten bei 42°C wurde 1 μl der SuperScriptII-reversen Transkriptase (Life Technologies) hinzugefügt, und die Mischung wurde dann bei 42°C für 30 Minuten inkubiert. Weiterhin wurde 1 μl der SuperScriptII-reverse Transkriptase (Life Technologies) hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei 42°C für 30 Minuten inkubiert. EDTA in einer Endkonzentration von 50 mM und NaOH in einer Endkonzentration von 0,2M wurden hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei 65°C für 15 Minuten inkubiert. Nach der Neutralisation mit 1M Tris-HCl (pH 7,5) wurde das Gemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Das Gel wurde mittels eines Fluoreszenz-Scanners (FLA2000, Fuji Photo Film Co., LTD) gescannt, um das Cy5-markierte Ziel (GP-Cy5) zu identifizieren.
(4) Hybridisierung der komplementären Ziel-cDNA
Die Dispersion von 1 × 10^–8M Ziel-cDNA (GP-Cy5) in einer Hybridisierungslösung (gemischte Lösung von 4 × SSC und 10 Gew.-% SDS, 20 μl) wurde auf den festen Träger (D), der oben unter (2) erhalten wurde, aufgetüpfelt. Nachdem die Oberfläche mit einem Deckglas für die Mikroskopie geschützt wurde, wurde der feste Träger bei 60°C für 20 Stunden in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. Dann wurde der feste Träger mit einer gemischten Lösung aus 0,1 Gew.-% SDS und 2 × SSC, einer gemischten Lösung aus 0,1 Gew.-% SDS und 0,2 × SSC und einer wässrigen 0,2 × SSC-Lösung gewaschen, bei 700 UpM für 5 Minuten zentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Dann wurde die Fluoreszenzintensität der Oberfläche auf dem Glasobjektträger mittels einer Fluoreszenzlesevorrichtung gemessen. An dem GP-NH2-Spot war sie 337.000, was, verglichen mit der Hintergrund-Fluoreszenzintensität, in hohem Maße erhöht war. Weiterhin war die Fluoreszenzintensität an dem Act-NH2-Spot, der eine Negativkontrolle war, 39.000, was darauf hindeutet, dass das Signal an dem GP-NH2-Spot signifikant erhöht war. Daher wird verstanden, dass unter Verwendung des festen Trägers mit befestigter DNA, der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, an dem DNA über eine Sulfonylgruppe befestigt ist, eine Ziel-cDNA-Probe, wie eine Ziel-cDNA-Fragmentprobe, mit der Komplementarität zu der DNA, die auf dem festen Träger mit befestigter DNA befestigt ist, effizient detektiert werden kann.
Beispiel 3: Detektion eines Liganden durch einen Objektträger mit befestigtem Antikörper
(1) Befestigung des Antikörpers
Ziege-anti-Human IgG (Jackson ImmunoResearch) wurde mit PBS (100, 20, 4, 0,8, 0,16 ng/μl) verdünnt, und 1 μl dieses verdünnten IgG wurde auf den festen Träger (B), der in dem obigen Beispiel 1 (1) hergestellt wurde, aufgetüpfelt. Sofort nach dem Auftüpfeln wurde der feste Träger für 3 Stunden bei 25°C in einer gewöhnlichen gesättigten Salzkammer belassen, dann einer Blockierungsbehandlung unterzogen, indem er in 0,1% BSA/0,05 Tween 20-PBS (PBS-T) für 1 Stunde eingetaucht wurde, um einen Antikörper-Objektträger (E) zu erhalten.
(2) Reaktion mit dem Liganden und Detektion
HybriWell (Grace Bio-Labs) wurde mit dem Antikörper-Objektträger (E), der oben unter (1) hergestellt wurde, in engen Kontakt gebracht. Human IgG-Cy5 (Jackson ImmunoResearch) wurde mit 1% BSA/PBS-T auf 2 μg/ml verdünnt. Nachdem 100 μl der verdünnten Lösung in die HybriWell (-Kammern) zugefügt worden waren, wurde er (der Antikörper-Objektträger) bei 25°C für 1 Stunde in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. Nachfolgend wurde er dreimal mit PBS-T gewaschen, mit PBS gespült und durch eine Zentrifugenbehandlung bei 700 UpM für 5 Minuten getrocknet. Als die Fluoreszenzintensität der Glasobjektträgeroberfläche mittels einer Fluoreszenzlesevorrichtung gemessen wurde, war sie 35,5 an der Position, an der der Antikörper mit 100 ng/μl platziert war, was eine große Erhöhung von einer Hintergrund-Fluoreszenzintensität anzeigt. Daher wird verstanden, dass durch Einsetzen des festen Trägers mit befestigtem Antikörper der vorliegenden Erfindung, wobei der Antikörper über eine Sulfonylgruppe gebunden ist, ein Ligand mit Reaktivität mit dem Antikörper, der auf dem festen Träger mit befestigtem Antikörper befestigt ist, effizient detektiert werden kann.
Beispiel 4: Herstellung eines festen Trägers mit einem befestigten Oligonucleotid und Messung der Menge des befestigten Oligonucleotids (Bezugsbeispiel)
(1) Herstellung einer Goldelektrode, an deren Oberfläche eine Vinylsulfonylgruppe befestigt ist
Auf die Oberfläche einer Goldelektrode (Oberflächenfläche: 2,25 mm²), die mit Aceton gewaschen wurde, wurden 2 μl einer wässrigen 11-Amino-1-undecathiol-Lösung (1 mM) getropft. Dann wurde die Goldelektrode für 10 Stunden stehen gelassen, während die Lösung nicht eingetrocknet wurde, und die Oberfläche der Elektrode wurde abwechselnd mit destilliertem Wasser und Ethanol gewaschen. Dann wurden 2 μl Phosphatpufferlösung (pH 8,5), die 3% 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamid)ethan enthielt, auf die Oberfläche der Goldelektrode getropft, und die Goldelektrode wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur belassen, und die Oberfläche wurde abwechselnd mit destilliertem Wasser und Ethanol gewaschen. Dann wurde die Oberfläche für 1 Stunde unter einem verminderten Druck getrocknet, um eine Goldelektrode zu erhalten, an deren Oberfläche eine Vinylsulfonylgruppe über eine Verknüpfungsgruppe gebunden war.
(2) Befestigen eines Oligonucleotids (Herstellung eines elektrochemischen Analyseelements)
2 μl einer wässrigen Lösung (100 pM/1 μl) eines Oligonucleotids eines Thymin-20-mers (T20), an dessen 5'-Ende eine Aminohexylgruppe eingeführt war, wurden auf die Goldelektrode mit einer Vinylsulfonylgruppe auf der Oberfläche, die oben unter (1) erhalten wurde, getropft. Dann wurde die Goldelektrode für 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen, gewaschen, um das überschüssige Oligonucleotid (T20) zu entfernen, und dann getrocknet, um ein elektrochemisches Analyseelement herzustellen.
(3) Herstellung eines Ferrocen-markierten Oligonucleotids
Ein Aminohexylgruppen-gebundenes Oligonucleotid wurde erhalten, indem ein Aminohexylgruppen-Linker an das 5'-Ende eines 20mers aus Adenin (A20) gebunden wurde.
Unter Verwendung des oben erhaltenen Aminohexylgruppengebundenen Oligonucleotids wurde ein Oligonucleotid eines 20mers aus Adenin, dessen 5'-Ende mit Ferrocen (F1-A20) markiert war, gemäß einem Verfahren, das in Analytical Biochemistry, Takenaka et al., 217: 436–443 (1994), beschrieben wurde, hergestellt.
(4) Detektion einer komplementären Ziel-Oligonucleotid-Probe
2 μl 10 mM Tris-Pufferlösung (pH 7,5), die das oben erwähnte Oligonucleotid eines 20mers aus Adenin, dessen 5'-Ende mit Ferrocen markiert war (F1-A20), wurden auf die Oberfläche des elektrochemischen Analyseelements, das oben unter (2) hergestellt wurde, getropft. Dann wurde das elektrochemische Analyseelement bei 25°C für 30 Minuten inkubiert. Nach der Beendigung der Inkubation wurde die Oberfläche des Analyseelements mit reinem Wasser gewaschen, und die nicht-umgesetzte Verbindung F1-A20 wurde entfernt.
Als die differentielle Puls-Voltametrie (DVP) in einem angewendeten Spannungsbereich von 100 bis 700 mV unter Verwendung einer 0,1M Kaliumchlorid-0,1M Essigsäurepufferlösung (pH 5,6) als eine Messlösung (38°C) durchgeführt wurde, wurde der Antwortstrom, der von der Verbindung F1-A20 stammte, bei 460 mV der angelegten Spannung erhalten.
Es wurde durch die oben genannten Vorgehensweisen und Ergebnisse bestätigt, dass ein Oligonucleotid stabil gebunden und an der Oberfläche der Goldelektrode befestigt wurde, und dass unter Verwendung dieser Elektrode eine komplementäre Ziel-Nucleotid-Probe, die mit einer elektrochemischen Markierungssubstanz markiert ist, detektiert werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde es möglich, einen Chip aus biologischem Material bereitzustellen, der durch Binden und Befestigen von mindestens einem Mitglied spezifischer Bindungspartner an einen reaktiven festen Träger, der eine rasche und stabile Bindung und Befestigung erzielen kann, hergestellt wurde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Chip aus biologischem Material, wobei eine Gruppe, dargestellt durch die folgende Formel (I), die einen Rest eines Mitglieds spezifischer Bindungspartner enthält, an einen festen Träger gebunden ist, wobei die Formel -L-SO₂-X-A (I)ist, und in der Formel (I), L eine Verknüpfungsgruppe darstellt, die -SO₂-X-A und den festen Träger verbindet; X -CR¹(R²)-CR³(R⁴)- darstellt; jedes von R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig von einander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, darstellt; und A einen Rest des Mitglieds der spezifischen Bindungspartner darstellt, wobei die spezifischen Bindungspartner eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Liganden, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Antigens, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Haptens, eine Kombination von Avidinen und Biotinen oder eine Kombination eines Rezeptors und eines Liganden sind, und der feste Träger Glas, eine Elektrodenoberfläche oder eine Sensorchipoberfläche ist.
Chip aus biologischem Material nach Anspruch 1, wobei die Avidine Avidin, Streptavidin oder ihre veränderten Körper sind, die einen stabilen Komplex mit Biotin bilden können.
Chip aus biologischem Material nach Anspruch 1, wobei die Biotine Biotin, Biocytin, Desthiobiotin, Oxybiotin oder deren Derivate sind, die einen stabilen Komplex mit Avidin bilden können.
Chip aus biologischem Material nach Anspruch 1, wobei A einen Rest eines Proteins in der Formel (I) darstellt.
Verfahren zur Detektion einer Zielsubstanz in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) In-Kontakt-Bringen eines Chips aus biologischem Material, wobei eine Gruppe, dargestellt durch die folgende Formel (I), die einen Rest eines Mitglieds der spezifischen Bindungspartner enthält, an einen festen Träger gebunden ist, mit einer Probe, die eine Zielsubstanz enthält, die ein anderes Mitglied der spezifischen Bindungspartner ist; und (b) Analysieren der Wechselwirkung zwischen den Mitgliedern der spezifischen Bindungspartner, wobei die Formel -L-SO₂-X-A (I)ist, und in der Formel (I), L eine Verknüpfungsgruppe darstellt, die -SO₂-X-A und den festen Träger verbindet; X -CR¹(R²)-CR³(R⁴)- darstellt; jedes von R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig von einander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, darstellt; und A einen Rest eines Mitglieds der spezifischen Bindungspartner darstellt, wobei die spezifischen Bindungspartner eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Liganden, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Antigens, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Haptens, eine Kombination von Avidinen und Biotinen oder eine Kombination eines Rezeptors und eines Liganden sind, und der feste Träger Glas, eine Elektrodenoberfläche oder eine Sensorchipoberfläche ist.
Verfahren zur Detektion einer Zielsubstanz nach Anspruch 5, wobei die Avidine Avidin, Streptavidin oder ihre veränderten Körper sind, die einen stabilen Komplex mit Biotin bilden können.
Verfahren zur Detektion einer Zielsubstanz nach Anspruch 5, wobei die Biotine Biotin, Biocytin, Desthiobiotin, Oxybiotin oder deren Derivate sind, die einen stabilen Komplex mit Avidin bilden können.
Verfahren zur Detektion einer Zielsubstanz nach Anspruch 5, wobei A einen Rest eines Proteins in der Formel (I) darstellt.
Verfahren zur Detektion einer Zielsubstanz nach Anspruch 5, wobei eine freie reaktive Gruppe, die auf einer Oberfläche eines festen Trägers vorhanden ist, an den eine Gruppe, dargestellt durch die Formel (I), die einen Rest eines Mitglieds der spezifischen Bindungspartner enthält, gebunden ist, einer Blockierungsbehandlung mit einer wässrigen Lösung einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Proteins unterzogen wird.
Verfahren zur Herstellung eines Chips aus biologischem Material nach Anspruch 1, umfassend einen Schritt des In-Kontakt-Bringens von mindestens einem Mitglied der spezifischen Bindungspartner, das eine reaktive Gruppe enthält, die eine kovalente Bindung durch Reagieren mit einer Vinylsulfongruppe oder deren reaktiver Vorläufergruppe, dargestellt durch die folgende Formel (II), bildet, mit einem festen Träger, der eine Vinylsulfonylgruppe oder deren reaktive Vorläufergruppe, dargestellt durch die folgende Formel (II), auf seiner Oberfläche hat, wobei die Formel -L-SO₂-X' (II)ist, und in der Formel (II), L eine Verknüpfungsgruppe darstellt, die -SO₂-X' und den festen Träger verbindet; X' -CR¹=CR²(R³) oder -CH(R¹)-CR²(R³) (Y) darstellt; jedes von R¹, R² und R³ unabhängig von einander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit insgesamt 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, die eine Alkylkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen enthält, darstellt; Y eine Gruppe darstellt, die durch ein nukleophiles Reagens substituiert ist, oder eine Gruppe, die als [HA] durch eine Base eliminiert wird, wobei die spezifischen Bindungspartner eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Liganden, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Antigens, eine Kombination eines Antikörpers oder seines Fragments und eines Haptens, eine Kombination von Avidinen und Biotinen oder eine Kombination eines Rezeptors und eines Liganden sind, und der feste Träger Glas, eine Elektrodenoberfläche oder eine Sensorchipoberfläche ist.
Verfahren zur Herstellung eines Chips aus biologischem Material nach Anspruch 10, wobei die Avidine Avidin, Streptavidin oder ihre veränderten Körper sind, die einen stabilen Komplex mit Biotin bilden können.
Verfahren zur Herstellung eines Chips aus biologischem Material nach Anspruch 10, wobei die Biotine Biotin, Biocytin, Desthiobiotin, Oxybiotin oder deren Derivate sind, die einen stabilen Komplex mit Avidin bilden können.
Verfahren zur Herstellung eines Chips aus biologischem Material nach Anspruch 10, wobei das Mitglied der spezifischen Bindungspartner, das mit dem festen Träger in Kontakt gebracht werden soll, ein Protein ist.
Verfahren zur Herstellung eines Chips aus biologischem Material nach Anspruch 10, umfassend einen Schritt des Durchführens einer Blockierungsbehandlung einer freien reaktiven Gruppe auf einer Oberfläche des festen Trägers mit einer wässrigen Lösung einer Aminosäure, eines Peptids oder eines Proteins nach dem In-Kontakt-Bringen von mindestens einem Mitglied der spezifischen Bindungspartner mit dem festen Träger.