DE60308176T2

DE60308176T2 - Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendungen

Info

Publication number: DE60308176T2
Application number: DE60308176T
Authority: DE
Inventors: Oleg Melnyk; Xavier Duburcq; Helène GRAS-MASSE; Christophe Olivier; Fengling Zhou; Claude Auriault; Ahmed Bouzidi
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Lille 2 Droit et Sante
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Lille 2 Droit et Sante
Priority date: 2002-05-28
Filing date: 2003-05-15
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2023-05-16
Also published as: FR2840409B1; JP2006501439A; FR2840409A1; EP1507792B1; CA2487483C; CA2487483A1; DE60308176D1; US20070243623A1; WO2003099855A1; EP1507792A1; AU2003260546A8; AU2003260546A1; JP4414880B2; ATE338764T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendungen, insbesondere als diagnostisches Werkzeug (Polypeptid-Chip) für die miniaturisierte Detektion von Molekülen, die strukturell oder funktionell zu den genannten Polypeptiden komplementär sind, insbesondere von Antikörpern.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung entspricht der Ausdruck "Polypeptid-Chip" den englischen Ausdrücken "peptide arrays", "peptide microarrays", "peptide chips", "protein chips" oder auch "protein arrays", die üblicherweise in der Literatur verwendet werden.
Man erkennt derzeit eine große Begeisterung für die Verwendung von Polypeptid-Chips, die die Detektion von Antikörpern oder von spezifischen Teilen dieser, von Antigenen (insbesondere viralen, bakteriellen oder parasitären), von Rezeptoren, von Sequenzen, die für die Bindung an ein Molekül (Enzym, Rezeptor, Antikörper) verantwortlich sind, in verschiedenen flüssigen biologischen Medien, die Untersuchung der Enzymspezifität oder auch die Entwicklung von künstlichen Rezeptoren ermöglichen.
Nun ist es auf diesem besonderen Gebiet ausschlaggebend, Polypeptid-Chips bereitstellen zu können, die eine bestimmte Anzahl von positiven Merkmalen aufweisen.
Diese Chips müssen insbesondere die reproduzierbare Immobilisierung von Sonden ermöglichen, in dem Maße, wie eine reproduzierbare Immobilisierung mit einer selbstreproduzierbaren Detektion verknüpft ist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter Sonde jedes Polypeptid, das auf der Oberfläche eines Trägers abgeschieden ist und das zum Fangen von Targets dient, die in einem biologischen Medium vorliegen, wobei diese Sonden für die zu detektierenden Targets spezifisch sind.
Diese Chips müssen auch die empfindliche Detektion der Targets oder der Rezeptoren, die komplementär sind und die in dem biologischen Medium enthalten sind, ermöglichen. Die Empfindlichkeit der Detektion hängt vom Immobilisierungsgrad, dem Grad des Fangens und dem Verfahren der Detektion eines Signals ab, aber auch und vorwiegend vom Level des Systemeigengeräuschs (nicht spezifisches Signal). Eine Verringerung des Systemeigengeräuschs verbessert das Verhältnis Signal/Hintergrund. In einer Vorrichtung, in der man das Vorliegen von biologischen Species in der Nachbarschaft der Oberfläche detektiert, kommt das Systemeigengeräusch im Wesentlichen von der nicht-spezifischen Adsorption von anderen Molekülen als den biologischen Species von Interesse, die man zu detektieren wünscht, und folglich ist es zweckdienlich, dieses zu begrenzen. Das Ideale ist demnach, eine Vorrichtung zu erhalten, die ein sehr niedriges Systemeigengeräusch und eine erhöhte Detektionsintensität des Signals besitzt.
Unter industriellen Gesichtspunkten ist es darüber hinaus interessant, Vorrichtungen zur Verfügung stellen zu können, die auf einfache Weise hergestellt werden können und die eine ausgezeichnete Lagerungsstabilität vor Verwendung zeigen.
Zurzeit gibt es im Prinzip zwei große Verfahren zur Herstellung von Polypeptid-Chips, die ex situ hergestellte Polypeptide verwenden.
Das erste große Verfahren besteht darin, die Polypeptide in kovalenter Art an eine feste Oberfläche wie eine Glasoberfläche oder an die Oberfläche eines organischen Polymers zu binden. So wurde z.B. in dem Artikel von G. MacBeath et al., Science, 2000, 289, 1760-1763 ein Herstellungsverfahren vorgeschlagen, das darin besteht, die Polypeptide mittels einer Iminbindung zu immobilisieren, wobei diese aus der Reaktion zwischen einer Iminfunktion der Polypeptide und einer Aldehydfunktion eines silanisierten Trägers resultiert. Dieses Verfahren benötigt dann eine Stufe der in situ-Reduktion der Iminfunktion, z.B. durch Natriumborhydrid, um die Bindung Polypeptid-Oberfläche zu stabilisieren. Der Hauptnachteil dieses Ansatzes ist die Notwendigkeit, chemische Stufen durchzuführen, um das Polypeptid an die Oberfläche des Trägers zu binden, die in bestimmten Fällen insbesondere einen Abbau des verwendeten Polypeptids mit sich ziehen können. Darüber hinaus machen solche Reaktionen das Verfahren zur Herstellung der Polypeptid-Chips in nicht vernachlässigbarer Weise kompliziert.
Das zweite große Verfahren besteht darin, die Polypeptide durch Adsorption an einer Oberfläche zu immobilisieren, ohne eine kovalente Bindung zu entwickeln. Dieses Verfahren weist ganz offensichtlich den Vorteil auf, dass es unter industriellem Gesichtspunkt einfacher ist, denn es bringt keine chemische Stufe der Funktionalisierung der Polypepti de ins Spiel. So beschreibt der Artikel von S. Falipou et al., Bioconjugate Chem., 1999, 10, 346-353 ein Verfahren, nach dem SiO₂-Perlen oder Glasscheiben mit 3-Cyanopropyldimethylchlorsilan derart silanisiert werden, dass die Immobilisierung von Antikörpern (glycosylierte Proteine) ermöglicht wird, wobei die nicht kovalente Fixierung in diesem Fall mit Hilfe der Hydroxylfunktionen der glycosylierten Teile erfolgt. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass es auf glycosylierte Proteine beschränkt ist. Es wurde im Übrigen insbesondere in der Internationalen Anmeldung WO 00/63701 vorgeschlagen, Polypeptide an Glasoberflächen, die mit einem kationischen Polymer, wie z.B. Polylysin, bedeckt sind, mit Hilfe elektrostatischer Bindungen zu immobilisieren. Die Eigenschaften der so hergestellten Glasscheiben verändern sich jedoch noch vor Immobilisierung der Polypeptide mit der Zeit. Auch die ausgehend von dieser Trägerart hergestellten Vorrichtungen sind mit der Zeit instabil (Änderung des Signals als Funktion des Alterungsgrads der Vorrichtung). Schließlich führen diese Oberflächen zu einem bedeutenden Level des Systemeigengeräuschs (BB. Haab et al., Genome Biology, 2001, Research 0004.1-13).
Die Erfinder haben sich somit die Aufgabe gestellt, die Gesamtheit der Probleme, die mit den Vorrichtungen des Standes der Technik, die oben beschrieben wurden, auftreten, zu mildern und Vorrichtungen zur Präsentation von Polypeptiden bereitzustellen, die im Lauf der Zeit stabil bleiben (wenigstens 3 Monate Alterung unter beschleunigten Bedingungen, was 12 Monate Alterung bei Umgebungstemperatur entspricht), die einfach herzustellen und zu verwenden sind, die auf jede Art von Polypeptiden anwendbar sind, ohne dass es notwendig ist, dass sie Funktionalisierungsstufen durch laufen, und die die empfindliche und reproduzierbare Detektion eines Signals mit einem sehr schwachen Systemeigengeräusch ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung hat als ersten Gegenstand eine Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens einen festen Träger umfasst, der durch Semicarbazid-Gruppierungen funktionalisiert ist, an denen die Polypeptide adsorbiert sind.
Während die Oberflächen, die Semicarbazid-Gruppierungen tragen, üblicherweise zum Immobilisieren von Biomolekülen wie Nucleinsäuren, die durch Benzaldehyd-Gruppierungen funktionalisiert sind (MA Podyminogin et al., Nucleic Acid Research, 2001, 29, 5090-5098), oder Polypeptiden, die durch α-Oxoaldehydfunktionen modifiziert sind (Internationale Anmeldung WO 01/42495 oder O. Melnyk et al., Bioconjugate Chem., 2002, 13, 713-720), durch Bildung einer kovalenten Bindung des Semicarbazontyps verwendet werden, haben die Erfinder überraschenderweise festgestellt, dass die Verwendung dieser Oberflächen es auch ermöglicht, Polypeptide durch einfache Adsorption in haltbarer und im Lauf der Zeit stabilen Weise zu immobilisieren, ohne dass es notwendig ist, sie vorher zu funktionalisieren.
Somit erlaubt die einfache Adsorption von Polypeptiden an einem derartigen Träger Vorrichtungen zu erhalten, die im Lauf der Zeit stabil bleiben (wenigstens 12 Monate bei Umgebungstemperatur), die einfach herzustellen und zu verwenden sind, und zwar entsprechend einer Methodologie, die auf jede Art von Polypeptiden anwendbar ist (ohne Zusatz von chemischen Reagenzien, mit Ausnahme von Puffern, die klassischer Weise verwendet werden, um Polypeptide zu solubili sieren) und die die empfindliche und reproduzierbare Detektion eines Signals mit sehr schwachem Systemeigengeräusch ermöglichen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der allgemeine Ausdruck "Polypeptide" die Gesamtheit der Peptide, die wenigstens zwei Aminosäuren (der L- oder D-Reihe, α-Aminosäuren, β-Aminosäuren, α-Hydrazinosäuren, proteinogene oder nicht-proteinogene α-Aminosäuren), die Peptidomimetika (Mimetika der Sekundärstrukturen, Mimetika der β-Faltblattstruktur z.B.), die Proteine und die Proteinfragmente.
Die Polypeptide, die an der Oberfläche der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung adsorbiert sind, können Extraktionspolypeptide oder rekombinante Polypeptide ohne Beschränkung bezüglich ihrer Struktur sein (Polypeptide mit oder ohne posttranslationale Modifikation). Es kann sich auch um synthetische Polypeptide handeln, die verschiedene Modifikationen tragen, z.B. eine Polyethylen-Gruppierung oder chemische Gruppierungen, die gegenüber den Semicarbazid-Gruppierungen der Oberfläche inert sind, wie z.B. Semicarbazon- und Hydrazon-Gruppierungen.
Die Abscheidung der Polypeptide auf dem Semicarbazidträger ist von ihrer spontanen Adsorption am Träger begleitet.
Alle festen Träger, die durch eine Semicarbazid-Gruppierung funktionalisiert werden können, sind gemäß der Erfindung einsetzbar. Unter solchen Trägern kann man insbesondere organische und anorganische Materialien nennen, die z.B. aus Glas, Silizium und seinen Derivaten und synthetischen Polymeren ausgewählt sind.
Die Träger, die durch die Semicarbazid-Gruppierungen funktionalisiert sind, können z.B. mit einem "Spotter" mit Nadeln gedruckt werden.
Für die Immobilisierungsstrategie gilt demnach:

– Sie ist auf experimentellen Niveau einfach und hat eine große Reproduzierbarkeit;
– sie ist auf jeden Polypeptidtyp anwendbar, der nicht funktionalisiert ist oder mit einer gegenüber den Semicarbazid-Gruppierungen des Trägers chemisch inerten Gruppe funktionalisiert ist;
– involviert Oberflächen, die durch eine stabile, nicht-hydrolysierbare Funktion funktionalisiert sind;
– erlaubt den Erhalt einer großen Adsorptionsdichte für die Polypeptide an der Oberfläche des Trägers, was ein stark erhöhtes Verhältnis Signal/Systemeigengeräusch sicherstellt (typischerweise stellt das Systemeigengeräusch 0,1 % des detektierten Signals dar).

Die Qualität der Adsorption der Polypeptide an dem Träger bzw. auf dem Träger (Dichte, Homogenität) kann durch sein Vermögen, eine fluoreszierende synthetische Peptidsonde zu fixieren, kontrolliert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der Vorrichtungen zur Präsentation von Polypeptiden, wie sie oben beschrieben wurden, umfassend die folgenden Stufen:

– Funktionalisierung eines festen Trägers durch Semicarbazid-Gruppierungen und
– Abscheidung von Polypeptiden in Form von Probenpunkten und ihrer Adsorption auf dem so funktionalisierten Träger.

Nach einer ersten Variante dieses Verfahrens umfasst die Funktionalisierung des Trägers:

– Einführung einer Aminfunktion durch eine Silanisierungsreaktion des Trägers,
– Transformation der Aminfunktion in eine Isocyanatfunktion,
– Reaktion der Isocyanatfunktion mit einem Hydrazinderivat zur Bildung der Semicarbazid-Gruppierung.

Nach einer zweiten Variante dieses Verfahrens wird die Funktionalisierung des Trägers in einer einzigen Stufe durch Reaktion des Trägers mit einem Silan, das eine Semicarbazid-Gruppierung trägt, durchgeführt.
Die Stufe der Abscheidung der Polypeptide umfasst vorzugsweise:

– Herstellung von Polypeptidlösungen in einem Puffer mit einer Konzentration zwischen 10 mg/ml und 0,01 mg/ml;
– ihre Verteilung in einem zu ihrer Entnahme geeigneten Behälter vom Typ Vertiefungen einer Mikrotiterplatte;
– ihre Entnahme mit Hilfe einer manuellen Entnahmeapparatur oder einer automatischen Entnahmeapparatur, beispielsweise vom Spotter-Typ;
– ihre Abscheidung auf dem Semicarbazidträger und gegebenenfalls
– Sättigung des Trägers.

Am Ende ihrer Herstellung können die erfindungsgemäßen Vorrichtungen direkt verwendet werden oder auch bei Umgebungstemperatur, geschützt vor Licht und Staub, gelagert werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Vorrichtungen zur Präsentation von Polypeptiden als "Polypeptid-Chips", als Diagnosewerkzeug, das miniaturisiert und hoch parallel ist oder für die Detektion eines Risikos bei einer Transfusion oder einer Organspende.
Die Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch als "Polypeptid-Chips" für die Serumtypisierung oder das Screening von Epitopen verwendet werden.
Diese Verwendungen involvieren die Detektion von Reaktionen des Antigen-Antikörper-Typs durch Verwendung von markierten Reagenzien, fluoreszierenden Reagenzien, radioaktiven Reagenzien oder chemisch markierten Reagenzien.
Die Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch als Polypeptid-Chips für die quantitative Bestimmung von Proteinen in komplexen biologischen Medien verwendet werden.
Schließlich können die erfindungsgemäßen Vorrichtungen auch für die Analyse der Beziehungen zwischen biologischen Peptidmolekülen des Ligand-Rezeptor-Typs verwendet werden.
Außer den Vorrichtungen, die vorstehend beschrieben wurden, umfasst die Erfindung auch andere Vorrichtungen, die aus der Beschreibung, die folgt, hervorgehen, wobei sich die Beschreibung auf ein Herstellungsbeispiel für Glasplättchen, die durch Semicarbazid-Gruppierungen funktionalisiert sind, auf ein Beispiel, das das Adsorptionsprotokoll der Polypeptide auf den Semicarbazid-Glasplättchen detailliert erläutert, und die Verwendung der entsprechenden so erhaltenen Vorrichtungen, die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen für die Serumdiagnose von Hepatitis B, Hepatitis C und AIDS, Untersuchungen für die Stabilität dieser Vorrichtungen, eine Untersuchung einer Multiserumdetektion und einer Detektion des Oberflächenantigens von Hepatitis B bezieht, sie bezieht sich auch auf die beigefügten 1 bis 5, von denen:
Die 1 und 2 das Fluoreszenzsignal darstellen, das in Funktion der Konzentration von Antigenen nach 0, 1 oder 3 Monaten Alterung der Semicarbazidplättchen, auf denen Antigene des AIDS-Virus adsorbiert waren, gemessen wurde;
die 3 und 4 das Fluoreszenzsignal, gemessen für die aminierten Plättchen, auf denen Antigene des AIDS-Virus fixiert worden waren, als Funktion der Konzentration und dies nach 0 und 1 Monat beschleunigter Alterung, darstellen;
die 5 die Fluoreszenz, gemessen als Funktion der Menge eines rekombinanten HBs-Antigens in einem Serumdetektionstest auf das Oberflächenantigen von Hepatitis B, darstellt.
BEISPIEL 1: FUNKTIONALISIERUNG VON GLASPLÄTTCHEN DURCH SEMICARBAZID-GRUPPIERUNGEN
Diese Funktionalisierung wurde nach zwei Varianten durchgeführt.
1) Erste Variante
a) Stufe A: Waschen, Oberflächenbehandlung ("décapage") und Silanisierung
Im Handel erhältliche Objektträger (Esco), die vorgereinigt waren, an den Rändern geschliffen und im Randbereich mattiert waren, werden während einer Nacht in eine Lösung eingetaucht, die aus einem Gemisch aus mit Sauerstoff versetztem Wasser und Schwefelsäure (50/50, V/V) bestand. Vorangehende Spülungen von 3 Minuten werden mit entionisiertem Wasser (dreimal), dann mit Methanol (einmal) durchgeführt, bevor die Plättchen in ein Bad mit 3 % Aminopropyltrimethoxysilan und 95 %igem Methanol für 30 Minuten bei Ultraschallbehandlung eingetaucht werden. Die Plättchen werden dann sukzessive durch Bäder für 3 Minuten in Methanol (einmal), mit entionisiertem Wasser (zweimal) und schließlich mit Methanol (einmal) gespült. Die Plättchen werden dann für einige Minuten abtropfen gelassen, während 15 Minuten in einem Trockenofen bei 110°C getrocknet, dann in einem Vakuumexsikkator gelagert.
b) Stufe B: Bildung eines Isocyanats
Die vorher silanisierten Plättchen werden während 2 Stunden in einer 1,2-Dichlorethan-Lösung, die Triphosgen (100 mmol/l) und Diisopropylethylamin (DIEA) (800 mmol/l) enthält, getaucht.
c) Stufe C: Funktionalisierung durch Semicarbazid-Gruppierungen
Die in Stufe b) oben erhaltenen Plättchen werden dann schnell abtropfen gelassen, bevor sie direkt in eine Lösung eingetaucht werden, die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-NH-NH₂ (Fmoc-NH-NH₂), das vorher gemäß Zhang et al., Anal. Biochem., 1991, 195, 160-170 hergestellt worden war, mit 22 mmol/l in Dimethylformamid (DMF) enthält und während 2 Stunden mit Ultraschall behandelt. Die Plättchen werden dann sukzessive mit zwei Bädern, jeweils 3 Minuten in DMF gespült.
d) Stufe D: Entschützung
Die vorher in Stufe c) oben erhaltenen Plättchen werden in einer DMF-Lösung, die Piperidin (0,2 Vol.-%) und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]-undec-7-en (DBU) (2 Vol.-%) enthält, für 30 Minuten eingetaucht. Die Plättchen werden dann sukzessive durch Bäder für 3 Minuten in DMF (einmal), entionisiertem Wasser (zweimal) und schließlich Methanol (einmal) gespült, bevor sie getrocknet und in einem Vakuumexsikkator gelagert werden.
2) Zweite Variante
Die Stufen der Silanisierung und der Funktionalisierung durch Semicarbazid-Gruppierungen sind durch vorherige Herstellung des Reagenses in einer einzigen Reaktion kombiniert.
a) Stufe A: Herstellung des Silanisierungsreagenses, das die geschützte Semicarbazid-Gruppierung enthält (Fmoc-NH-NH-CO-NH-(CH₂)₃-Si-(OEt)₃)
515 mg Fmoc-NH-NH₂ (2,03 mmol) werden in 15 ml absolutem Ethanol suspendiert. Das Gemisch wird zum Rückfluss erhitzt (75-80°C). 570 ml Isocyanopropyltriethoxysilan (2,28 mmol, 1,2 Äq.) werden dann auf einmal zugesetzt. Nach Verschwinden der Suspension (15-20 Minuten) wird der Ethanol abgedampft. Der erhaltene weiße Feststoff wird in einem Minimum an trockenem Dichlormethan gelöst, dann mit trockenem Pentan präzipitiert. Nach Filtration unter Argon gewinnt man 841 mg (83 %) eines reinen Feststoffs.
b) Stufe B: Vorbereitung der Plättchen
Im Handel erhältliche Objektträger (Esco), die vorgereinigt sind, an den Rändern poliert und im Randbereich mattiert sind, werden in eine Lösung getaucht, die aus einem Gemisch aus mit Sauerstoff angereichertem Wasser und Schwefelsäure (50/50, V/V) besteht, und zwar während einer Nacht. Die Plättchen werden dann unter Bewegung in folgenden aufeinanderfolgenden Bädern gespült: entionisiertes Wasser (dreimal 3 Minuten), absolutes Ethanol (einmal 3 Minuten), dann werden sie mit einer Radialschieberpumpe getrocknet.
Die Plättchen werden dann für 2 Stunden in eine Lösung mit 1 mg/ml Silanisierungsreagens, das oben in Stufe a) hergestellt worden war, in einem Gemisch aus 10 % Tetrahydrofuran (THF) in Toluol bei 47°C unter Ultraschallbehandlung getaucht. Die Plättchen werden dann unter Bewegung in Toluol (zweimal 3 Minuten) gespült, bevor sie abtropfen gelassen werden, dann werden sie 15 Minuten in einem Trockenofen bei 120°C getrocknet und in einem Vakuumexsikkator gelagert.
c) Stufe C: Entschützung
Die Plättchen, die vorstehend oben in Stufe b) erhalten wurden, werden für 3 Minuten in eine DMF-Lösung getaucht, bevor sie unter Rühren in ein Bad, das Piperidin (0,2 Vol.-%) und Diazabicycloundecen (2 Vol.-%) in DMF enthält, für 30 Minuten gelegt werden. Die Plättchen werden dann sukzessive für je 3 Minuten durch Bäder in DMF (einmal), in entionisiertem Wasser (zweimal) und schließlich in Methanol (einmal) gespült, bevor sie getrocknet und in einem Vakuumexsikkator gelagert werden.
Die so hergestellten Plättchen sind bereit zum Adsorbieren der Polypeptiden eingesetzt zu werden.
BEISPIEL 2: PROTOKOLL DER VERWENDUNG DER SEMICARBAZIDPLÄTTCHEN
1) Adsorption der Polypeptide auf den Plättchen
Lösungen synthetischer Peptide oder rekombinanter Proteine (Antigene) werden in einem Phosphatpuffer (pH 7,4) oder in einem Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,2) verdünnt, entsprechend dem verwendeten Protein auf zwischen 0,1 und 10 mg/ml, dann in den Vertiefungen einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen verteilt. Ein Mindestvolumen von 20 μl Probe pro Vertiefung ist notwendig, um die Stufe der Imprägnierung bzw. Bedruckung (impression) der Plättchen zu realisieren.
Die Platte wird dann auf einem automatischen Spotter mit 4 Nadeln angeordnet (z.B. der Typ MWG 417 Arrayer der Firma Affymetrix). Als Spotter bezeichnet man die Apparatur, die es ermöglicht Abscheidungen von Antigenlösungen durchzuführen.
Die Plättchen werden dann mit den Polypeptidlösungen nach einem vorher entwickelten Schema imprägniert bzw. bedruckt. Die Nadeln werden dann entsprechend den Empfehlungen des Herstellers reichlich gewaschen.
2) Lagerung der Plättchen
Die so imprägnierten bzw. bedruckten Plättchen werden bei Umgebungstemperatur in einem verschlossenen Schrank geschützt vor Licht und Staub aufbewahrt. Die Stabilität der Plättchen wurde untersucht (siehe Beispiel 6, nachfolgend). Die Resultate zeigen, dass die Eigenschaften der so be druckten Plättchen während einer Lagerung von 3 Monaten bei 37°C in feuchter Atmosphäre (Bedingungen einer beschleunigten Alterung) nicht verändert werden.
3) Entwicklung der Plättchen
Die bedruckten bzw. imprägnierten Platten werden zunächst einer Stufe der Ultraschallbehandlung während einer Stunde in einer Sättigungslösung unterworfen: Phosphatpuffer, versetzt mit 1,8 % NaCl, pH 7,4 (PBS-Lösung) + 0,1 % Tween^® 20 + 5 % entrahmte Milch.
Die Plättchen werden dann nacheinander drei Waschgängen mit einer PBS-Lösung in Gegenwart von 0,05 % Tween^® 20 unterworfen.
Die Plättchen werden dann während 45 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 100 μl Patientenserum, die auf 1/50 in einem Verdünnungspuffer (PBS-Lösung + 0,1 % Tween^® 20 + 5 % entrahmte Milch) verdünnt worden waren, unter einer Lamelle eines Deckglases (24 × 60 mm) inkubiert. Die Inkubation erfolgt in feuchter Atmosphäre.
Nach dieser Inkubation werden dann drei aufeinanderfolgende Waschgänge der Plättchen mit einer PBS-Lösung, die mit 0,05 % Tween^® 20 versetzt ist, durchgeführt.
Die Stufe der Detektion der Patienten-Antikörper an den auf den Plättchen adsorbierten Polypeptiden erfolgt durch Fixierung, und zwar der humanen fluoreszierenden Anti-Ig-Antikörper: 100 μl einer Lösung von humanen Anti-IgG-A-M-Antikörpern, die mit Rhodamin (TRITC) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, USA) markiert sind, 1/100 verdünnt in Verdünnungspuffer (PBS-Lösung + 0,1 % Tween^® 20 + 5 % entrahmte Milch). Man bedeckt dann jedes Plättchen mit einer Glaslamelle (24 × 60 mm), und man lässt 45 Minuten bei 37°C unter feuchter Atmosphäre inkubieren.
Nach dieser Inkubation wird dann eine Reihe von drei aufeinanderfolgenden Waschgängen an den Plättchen mit einer PBS-Lösung, versetzt mit 0,05 % Tween^® 20, durchgeführt. Auf diese Waschgänge folgt ein Spülen der Plättchen mit destilliertem Wasser und eine Trocknung der Plättchen mit Ethanol.
Das Lesen der Plättchen wird dann durch Messen der emittierten Fluoreszenz mit einem Plättchenscanner (Affymetrix 418 Array Scanner) bei zwei verschiedenen Stärken (P35/PMT 50 oder P55/PMT 70) durchgeführt. Die quantitative Bestimmung der emittierten Fluoreszenz wird dann mit Hilfe der Software Scanalyse^® (Standford-University Software) durchgeführt. Wenn nichts Anderes angegeben ist, wurden die Resultate, die in der folgenden Tabelle angegeben sind, mit der Stärke P35/PMT 50 erhalten.
Alle Beispiele, die folgen, wurden nach diesem Protokoll durchgeführt.
BEISPIEL 3: VERWENDUNG VON POLYPEPTID-CHIPS GEMÄSS DER ERFINDUNG FÜR DIE SERUMDIAGNOSTIK VON HEPTATIS B
1) Material und Verfahren
Alle Abscheidungen wurden zweifach auf den Plättchen, wie sie oben in Beispiel 1 hergestellt wurden, mit Hilfe eines Spotters MWG 417 Arrayer (Affymetrix) durchgeführt. Der Abstand zwischen den Abscheidungen ist 375 μm, die Kontrolle der Wirksamkeit der Waschung der Nadeln erfolgt durch Ab scheidung von Wasser, das keine Antigenspur als Fluoreszenz zeigt.
In diesem Beispiel werden die Glasplättchen mit verschiedenen Antigenen des Hepatitis B-Virus bedruckt. Die Ausdrücke Oberfläche (HBs), Kern (HBc) oder (Hbe) entsprechen verschiedenen Regionen dieses Virus. Es wurden 20 Abscheidungen pro Antigen oder pro Konzentration durchgeführt.

– HBs-Antigen, es wurden 2 Chargen verwendet: • HBs-Charge a: Antigen, im Handel von der Firma Advanced Immuno Chemical unter der Bezeichnung A1-HS7, mit 3 mg/ml. • HBs-Charge b: 5 mg/ml.
– Hbe-Antigen: 10 mg/ml.
– HBc-Antigen: 10 mg/ml.
– Positiver Vergleich: Protein A

Patientenseren, deren Serologie bekannt ist (d.h. mit einem Referenz-ELISA-Test verifiziert wurde) wurden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Chips analysiert.
Die Verteilung der Seren war die folgende:

– Serodiagnostik HBs-Ag mit der Charge a: 40 positiv bewertete Seren und 40 negativ bewertete Seren;
– Serodiagnostik HBs-Ag mit der Charge b: 60 positive bewertete Seren und 40 negativ bewertete Seren;
– Serodiagnostik Hbe: 16 positive bewertete Seren und 16 negativ bewertete Seren;
– Serodiagnostik Hbc: 60 positiv bewertete Seren und 40 negativ bewertete Seren.

2) Resultate
Die für die positiven Seren erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle I angegeben. In dieser Tabelle entsprechen die angegebenen Werte dem Wert der Fluoreszenz minus dem durchschnittlichen Systemeigengeräusch des Plättchens.
TABELLE I
TABELLE 1 (Fortsetzung)

*: nt bedeutet nicht getestet

Der Schwellenwert ("valeur seuil" = VS) wird als Mittelwert des Signals von 20 negativen Seren minus dem Systemeigengeräusch errechnet, wobei diesem die dreifache Abweichung zuaddiert wurde, die für diese Werte negative Seren errechnet wurden. Alle negativ bewerteten Seren ergaben einen Fluoreszenzwert unter dem Schwellenwert und wurden demnach als negativ bestimmt, wobei die Plättchen gemäß der Erfindung verwendet wurden.
Die Gesamtheit dieser Resultate zeigt, dass die Verwendung von Polypeptid-Chips gemäß der Erfindung eine Serodiagnostik erlaubt, die 100 % empfindlich und spezifisch für alle Hepatitis B-Antigene, die mit verschiedenen Seren getestet wurden, ist. In der Tat wurden alle positiv angegebenen Seren detektiert, während keines der negativ angegebenen Seren durch dieses Verfahren als falsch positiv gefunden wurde.
BEISPIEL 4: VERWENDUNG VON POLYPEPTID-CHIPS GEMÄSS DER ERFINDUNG FÜR DIE SERODIAGNOSTIK VON HEPATITIS C
1) Material und Verfahren
Nach dem oben in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren wurden die Glasplättchen mit verschiedenen Antigenen des Hepatitis C-Virus in verschiedenen Konzentrationen bedruckt. Die Ausdrücke NS3, NS4 oder Kern entsprechen den verschiedenen Regionen des Hepatitis C-Virus. In diesem Beispiel wurde das Protein A als positiver Vergleich verwendet.

– HCV-Charge 1 entspricht dem ganzen Antigen: Abscheidungen mit 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml und 0,05 mg/ml;
– HCV-Charge 2 entspricht dem ganzen Antigen: Abscheidungen mit 2 mg/ml, 1 mg/ml und 0,5 mg/ml;
– HCV-Ag, Kern: Abscheidungen mit 1 mg/ml, 0,5 mg/ml und 0,1 mg/ml;
– HCV-Ag NS3, Charge 3: Abscheidungen mit 1 mg/ml, 0,5 mg/ml und 0,1 mg/ml;
– HCV-Ag NS4, Charge 5: Abscheidungen mit 0,4 mg/ml und 0,1 mg/ml;

In diesem Beispiel wurden 100 Seren, die durch einen klassischen Test EIA Abbot 3.0 (Verfahren des ELISA-Typs) positiv beurteilt worden waren, und 30 Seren, die nach demselben Verfahren als negativ beurteilt worden waren, getestet.
2) Resultate
Die Resultate haben es ermöglicht, die Konzentrationen zu bestimmen, die zur Verwendung für jedes Antigen optimal sind:

– HCV, Charge 2: 2 mg/ml
– HCV-Ag NS3, Charge 3: 0,5 mg/ml
– HCV-Ag NS4, Charge 5: 0,4 mg/ml
– HCV-Ag, Kern: 1 mg/ml

Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle II unten angegeben. In dieser Tabelle entsprechen die angegebenen Werte dem Wert der Fluoreszenz minus dem mittleren Systemeigengeräusch des Plättchens.
TABELLE II

Anmerkung: In dieser Tabelle bedeutet das Fragezeichen, dass der Abbott-Test nicht durchgeführt wurde.

Alle Seren, die als positiv beurteilt worden waren, wurden bei Verwendung der Plättchen gemäß der Erfindung wieder als positiv bestimmt.
In der gleichen Weise wurden alle Seren, die als negativ beurteilt worden waren, unter Verwendung der Plättchen gemäß der Erfindung wieder als negativ bestimmt.
Die Resultate zeigen, dass das Fluoreszenzsignal, das mit schwacher Stärke erhalten worden war (P35, PMT50), verstärkt wird und dass kein zweites Lesen mit einer höheren Stärke des Scanners (L55, PMT 70) erforderlich ist.
Für HCV Charge 1 und Charge 2, für die ein schwacher Fluoreszenzwert für die Negativen beobachtet wurde, wird der Schwellenwert als Mittelwert von 20 negativen Seren minus dem Systemeigengeräusch plus der dreifachen Standardabweichung bei diesen negativen Serumwerten errechnet. Für die anderen getesteten Antigene wurde für die negativen Seren keine Fluoreszenz über dem Systemeigengeräusch beobachtet; der Schwellenwert entspricht demnach dem Wert der Negativen minus dem Systemeigengeräusch, nämlich Null.
Sobald man für HCV Kern, NS4 und NS3 ein Fluoreszenzrauschen beobachtet, ist das Serum positiv. Dies stellt einen sehr großen Vorteil im Vergleich zu einer Serodiagnostik dar, die in klassischer Art durch das ELISA-Verfahren durchgeführt wird, für das immer ein nicht-spezifisches Signal bei den negativen Seren beobachtet wird, was es notwendig macht, einen Schwellenwert zu definieren, der eine Funktion dieses nicht-spezifischen Signals ist.
Darüber hinaus geht aus diesen Resultaten hervor, dass die Charge 2 besonders interessant ist: sie erhöht die Empfindlichkeit der Serodetektion, indem sie die eindeutige Detektion von Seren erlaubt, die nach Abbott-ELISA schwach sind (unter 10), für die RIBA (Recombinant Immunoblot Assay: rekombinanter Immunotransfer-Test, der an einer Nitrocellulosemembran durchgeführt wird und mit dem man bestimmen kann, gegen welches Antigen des Hepatitis C-Virus die Antikörper gerichtet sind, die als Folge einer Virusinfektion produziert werden) positiv oder grenzwertig (0,5+) ist. Die Verwendung des Antigens der Charge 2, das auf einem Semicarbazidträger adsorbiert ist, erlaubt es demnach, die Empfindlichkeit der Detektion im Vergleich zu ELISA zu verbessern, was insbesondere bezüglich der Vorzeitigkeit der Detektion interessant ist. Darüber hinaus sind Polypeptid-Biochips gemäß der Erfindung spezifischer als der Referenztest Abbott-ELISA. In der Tat wurden Seren, die nach Abbott falsch positiv waren (Seren 2, 9, 17, 18, 25, 26, 29 und 32, Seren, die durch RIBA als negative bestimmt worden waren) korrekt diagnostiziert (negativ), indem die Polypeptid-Biochips gemäß der Erfindung verwendet wurden.
Die Semicarbazid-Glasplättchen, auf denen die Antigene NS3, NS4 und Kern adsorbiert sind, bilden demnach empfindliche und spezifische Diagnosewerkzeuge, die es ermöglichen, die verschiedenen Antigene der Hepatitis C zu differenzieren, während es mit der ELISA-Technik, die Kombinationen verschiedener Antigene verwendet, nicht möglich ist, eine derartige Differenzierung zu erhalten.
BEISPIEL 5: VERWENDUNG VON POLYPEPTID-CHIPS GEMÄSS DER ERFINDUNG FÜR DIE SERODIAGNOSE VON AIDS
1) Material und Verfahren
In diesem Beispiel wurden 30 Abscheidungen von Antigenen auf jedem Plättchen durchgeführt.
Es wurden zwei verschiedene Antigene des Virus von AIDS (HIV) getestet, dabei handelt es sich um die Antigene Gp41 und Gp120, die Glycoproteine der Hülle des Virus sind. Diese HIV-Antigene werden von Lily Bio-products, Hanan, China, produziert.
Das Protein A wurde als positiver Vergleich verwendet.
Die getesteten Konzentrationen sind die folgenden:

– Gp41: 2; 1; 0,5; 0,1 und 0,05 mg/ml.
– Gp120: 0,5; 0,25; 0,1 und 0,05 mg/ml.

90 Seren, die als positiv beurteilt worden waren, und 20 Seren, die als negativ beurteilt worden waren, wurden getestet (ELISA-Technik: Tests Ac HIV Genscreen Plus^® der Firma BIORAD und HIV-Test Integral der Firma BEHRING).
2) Resultate
Die erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle III angegeben. In dieser Tabelle entsprechen die angegebenen Werte dem Wert der Fluoreszenz minus dem mittleren Systemeigengeräusch des Plättchens.
TABELLE III
TABELLE III (Fortsetzung)
TABELLE III (Fortsetzung)

Anmerkung: 20 negative Seren wurden getestet; sie geben keinen Fluoreszenzwert, der über dem Systemeigengeräusch liegt (Schwellenwert = 0).

Diese Resultate zeigen, dass die Verwendung des Tests gemäß der Erfindung eine sensible und zu 100 % spezifische Diagnostik der positiven und negativen Seren bei allen getesteten Konzentrationen erlaubt.
Was das Antigen Gp41 betrifft, so ist die optimale Konzentration 1 mg/ml, und für das Antigen Gp120 ist die optimale Konzentration 0,5 mg/ml, jedoch kann für dieses letzte die Sättigungsebene des Signals nicht erreicht werden, was annehmen lässt, dass auch höhere Konzentrationen zu ausgezeichneten Resultaten führen könnten.
BEISPIEL 6: UNTERSUCHUNG DER STABILITÄT DER IN DEN BEISPIELEN 4 UND 5 HERGESTELLTEN VORRICHTUNGEN IM LAUF DER ZEIT
Um die Stabilität der Vorrichtungen gemäß der Erfindung im Lauf der Zeit zu testen, wurden Semicarbazid-Glasplättchen, die durch Adsorption von Antigenen des Virus von AIDS imprägniert waren, wie sie in Beispiel 5 oben hergestellt worden waren, für eine Dauer von 1 oder 3 Monaten in eine feuchte Atmosphäre mit 37°C gelegt. Diese Bedingungen erlauben es, eine Untersuchung der beschleunigten Alterung zu realisieren.
Diese Untersuchung wurde an Plättchen durchgeführt, die mit verschiedenen Antigenen mit mehreren Konzentrationen präpariert worden waren:

– HIV-Gp41: 2; 1; 0,5; 0,1 und 0,05 mg/ml;
– HIV-Gp120: 0,5; 0,25; 0,1 und 0,05 mg/ml;

Die erhaltenen Resultate sind in den beigefügten 1 und 2 gezeigt, bei denen das Fluoreszenzsignal als Funktion der Konzentration an Antigene aufgetragen ist, und zwar nach 0 (schraffierte Balken), 1 Monat (Balken mit Schachbrettmuster) und nach 3 Monaten beschleunigte Alterung (nicht gemusterte Balken). Diese Resultate beweisen eine ausgezeichnete Stabilität der Plättchen nach 3 Monaten beschleunigter Alterung ganz gleich wie die getesteten Konzentrationen waren.
VERGLEICHSBEISPIEL 7: UNTERSUCHUNG DER STABILITÄT DER AMINIERTEN PLÄTTCHEN DES STANDES DER TECHNIK
Mikroskopierplättchen, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan silanisiert waren, wie die, die z.B. in dem Artikel von N. Zammatteo et al., Anal. Biochem., 2000, 280, 143-150 beschrieben sind, sowie Plättchen, die durch Semicarbazidgruppierungen funktionalisiert worden waren, wie die, die in Beispiel 1 oben beschrieben sind, wurden mit zwei Antigenen des Virus von AIDS (Gp120 und Gp41, wie in Beispiel 5 oben beschrieben) und mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,5; 0,25; 0,1; 0,05 und 0,01 mg/ml) bedruckt.
Die so hergestellten Plättchen wurden mit 20 positiv beurteilten Seren inkubiert. Die so präparierten Plättchen wurden einer Untersuchung über die Stabilität im Lauf der Zeit nach dem in Beispiel 6 oben beschriebenen Protokoll unterworfen.
Die erhaltenen Resultate sind in den beigefügten 3 und 4 dargestellt, bei denen die Fluoreszenzwerte als Funktion de getesteten Konzentrationen ausgedrückt sind.
Die Stabilitätsuntersuchung wurde nach 30 Tagen beendet (t = 0: helle Balken und t = 30 Tage: graue Balken).
Diese Resultate zeigen, dass die aminierten Plättchen des Standes der Technik nach 1-monatiger Aufbewahrung nicht stabil sind; man beobachtet in der Tat sehr deutliche Veränderungen entweder eine Abnahme der gemessenen Fluoreszenz oder ihre Erhöhung.
Dagegen sind die erfindungsgemäßen Plättchen, die Semicarbazid-Gruppierungen umfassen, nach 3-monatiger Lagerung unter beschleunigten Alterungsbedingungen stabil, wie es bereits in Beispiel 6 bewiesen wurde.
BEISPIEL 8: VERWENDUNG DER SEMICARBAZID-PLÄTTCHEN FÜR EINE STUDIE EINER MULTISERODETEKTION
In diesem Beispiel wurden Semicarbazid-Glasplättchen, wie sie in Beispiel 1 oben hergestellt wurden, mit Antigenen, die aus verschiedenen Pathologien stammten (HIV, Hepatitis B: HBV und Hepatitis C: HCV), bedruckt.
90 Seren, die für die Gesamtheit dieser Pathologien durch klassische Tests des ELISA-Typs stehen, wurden auf Plättchen gemäß der Erfindung (Biochips) getestet.
Für den HIV-Test sind die verwendeten Referenzverfahren der Test Ac HIV Genscreen Plus^® der Firma BIORAD und der Test Ac HIV Integral der Firma BEHRING. Die Positivität dieser Tests wird durch einen Western Blot-Test bestätigt.
Für die Tests auf Hepatitis B sind die verwendeten Referenzverfahren der HBs-Test der Firma BIORAD und der HBc-Test der Firma BIORAD.
Für die Tests auf Hepatitis C sind die verwendeten Referenzverfahren der HCV-Test der Firma BIORAD und der Test HCV EIA 3.0 der Firma ABBOTT. Die Positivität wird durch einen Test RIBA DECISCAN HCV PLUS^® bestätigt.
Für den Test auf Hepatitis C auf den erfindungsgemäßen Biochip wurden die Plättchen mit den rekombinanten Antigenen von NS3 (0,5 mg/ml) und des ganzen Gens (Charge 1: 0,5 mg/ml) bedruckt.
Für den Test auf Hepatitis B auf den erfindungsgemäßen Biochip wurden die Plättchen mit den Antigenen HBc (Kern) mit 10 mg/ml und HBs-Charge b mit 5 mg/ml, wie sie oben in Beispiel 3 beschrieben wurden, bedruckt.
Für den Test der Seropositivität für das Virus von AIDS an den erfindungsgemäßen Biochips wurden die Plättchen mit den Antigenen Gp120 (0,5 mg/ml) und Gp41 (2 mg/ml), wie bereits oben in Beispiel 5 beschrieben, bedruckt.
Vor ihrer Verwendung wurden die Seren 1:50 verdünnt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Die Plättchen wurden zunächst während 45 Minuten mit Seren, dann während 45 Minuten mit komplementärem fluoreszierendem Antikörper inkubiert.
Die erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle IV angegeben:
TABELLE IV

Anmerkung: + Serum positiv, – Serum negativ

Diese Resultate zeigen eine perfekte Korrelation für 85 von 90 getesteten Seren; für die 5 Seren, die den Eingängen 4 und 5 entsprechen, wurde jedoch eine Differenz zwischen den zwei Verfahren gefunden, diese Seren wurden durch das ELISA-Referenzverfahren als HCV-positiv und nach dem Biochip-Verfahren gemäß der Erfindung (Eingänge Nr. 4 und Nr. 5) als negativ gefunden.
Um diese Differenz zu bestätigen, wurde der RIBA-Test, der dazu dient, die Positivität eines Serums gegenüber Hepatitis C zu bestätigen – durchgeführt und er erwies sich als negativ. Diese Seren sind demnach HCV-negativ, denn sie besitzen keine Antikörper, die gegen das Virus gerichtet sind, sie sind demnach nicht in Kontakt mit diesem Virus gewesen.
Dies bestätigt das Biochip-Resultat, das diese Seren als negativ bezeichnet hat, diese Seren sind demnach nach dem ELISA-Referenzverfahren falsch positiv.
BEISPIEL 9: VERWENDUNG VON SEMICARBAZID-PLÄTTCHEN FÜR DIE BESTIMMUNG DES HBs-PROTEINS IN EINEM KOMPLEXEN BIOLOGISCHEN MEDIUM
Ziel dieses Beispiels ist es, zu beweisen, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen es erlaubt, einen monoklonalen Antikörper auf einem Glasplättchen zu fixieren, das Semicarbazid-Gruppierungen umfasst (Antigen, das gegen das Oberflächenantigen des Virus der Hepatitis B gerichtet ist), das anschließend mit einem Serum in Kontakt gebracht wird, das dieses Oberflächenantigen besitzt; die Entwicklung erfolgt unter Verwendung eines anderen monoklonalen Antikörpers, der durch Rhodamin markiert ist und gegen das Oberflächenantigen des Virus der Hepatitis B gerichtet ist.
Diese Technik, die als "Sandwich"-Technik bezeichnet wird, ermöglicht es, im Serum zirkulierende Antigene zu detektieren. Diese Technik hat zahlreiche potenzielle Anwendungen, sowohl in der Serodiagnostik als auch in der Durchmusterung biologischer Moleküle (Suche nach aktiven Substanzen, toxischen Substanzen), indem eine Gruppe monoklonaler Antikörper, die bekannt sind und gegen diese biologischen Moleküle gerichtet sind, fixiert werden.
1) Material und Verfahren
Glasplättchen, die vorab durch Semicarbazid-Gruppierungen gemäß Beispiel 1 oben funktionalisiert worden waren, werden mit Hilfe eines automatischen Spotters mit einer Lösung, die 3 mg/ml eines monoklonalen Antikörpers (muriner Antikörperklon NE3 der Firma Advanced Immuno Chemical) in einem Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,2) enthält, bedruckt.
Jede Abscheidung wird dreimal durchgeführt, was insgesamt 27 Abscheidungen der Lösung des monoklonalen Antikörpers auf jedem Plättchen ergibt.
Man gibt zu 200 μl negativer Seren, die 1:50 verdünnt wurden, bekannte Mengen eines rekombinanten HBs-Antigens (Société Advanced Immuno Chemical mit 0,5 mg/ml). Diese Seren (100 μl) werden dann mit den Glasplättchen in Kontakt gebracht, auf die die monoklonalen Antikörper vorher fixiert worden waren. Die Abscheidungen werden durch ein Deckglas bedeckt. Die Plättchen werden dann für 2 Stunden bei 37°C in feuchter Atmosphäre inkubiert.
Nach Waschgängen wird die Entwicklungsstufe mit 100 μl einer Lösung eines murinen monoklonalen Antikörpers gegen das Oberflächenantigen der Hepatitis B (Klon NF5, im Handel von der Firma Advanced Immuno Chemical, in einer Konzentration von 1,5 mg/ml), der vorher mit Rhodamin markiert worden war und 1:100 in Verdünnungslösung (PBS-Tween 0,1 % – halbentrahmte Milch 5 %) verdünnt worden war, durchgeführt war.
Die Inkubation erfolgt 60 Minuten lang zwischen Plättchen und Lamelle, und zwar bei 37°C unter feuchter Atmosphäre.
Nach Waschgängen werden die Plättchen mit dem Scanner der Firma Affymetrix (Affymetrix 418 Array) mit der Stärke P70, PMT90, gelesen. Die quantitative Bestimmung der Fluoreszenz wird mit Hilfe der Software Scanalyse^® (Standford-University Software) durchgeführt.
2) Resultate
Die erhaltenen Resultate sind in der beigefügten 5 dargestellt, in der die Fluoreszenz als Funktion der Menge an rekombinantem HBs-Antigen, die zugesetzt wurde, ausgedrückt in mg/μl, ausgedrückt.
Diese Resultate zeigen, dass die Verwendung der Vorrichtungen gemäß der Erfindung es ermöglicht, zirkulierende Antigen zu detektieren. Sie zeigen auch, dass die Adsorption des Antikörpers auf dem Glasplättchen es ermöglicht, die Zugänglichkeit der Fixierungsstelle des Antigens (Fab-Segment des Antikörpers) für die Erkennung Antigen-Antikörper zu konservieren.

Claims

Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens einen festen Träger, der durch Semicarbazidgruppierungen funktionalisiert ist, umfasst, an denen die Polypeptide adsorbiert sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polypeptide unter den Peptiden, die wenigstens zwei Aminosäuren umfassen, den Peptidomimetika, den Proteinen und den Proteinfragmenten ausgewählt sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger ein organisches oder anorganisches Material ist, das aus Glas, Silicium und seinen Derivaten und synthetischen Polymeren ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen umfasst: – Funktionalisierung eines festen Trägers durch Semicarbazidgruppierungen und – Abscheidung von Polypeptiden in Form von Probenpunkten und ihre Adsorption auf dem so funktionalisierten Träger.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionalisierung des Trägers umfasst: – Einführung einer Aminfunktion durch eine Silanisierungsreaktion des Trägers, – Transformation der Aminfunktion in eine Isocyanatfunktion, – Reaktion der Isocyanatfunktion mit einem Hydrazinderivat zur Bildung der Semicarbazidgruppierung.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionalisierung des Trägers in einer einzigen Stufe durch Reaktion des Trägers mit einem Silan, das eine Semicarbazidgruppierung trägt, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Abscheidung der Polypeptide umfasst: – Herstellung von Polypeptidlösungen in einem Puffer mit einer Konzentration zwischen 10 mg/ml und 0,01 mg/ml; – ihre Verteilung in einem zu ihrer Entnahme geeigneten Behälter vom Typ Vertiefungen einer Mikrotiterplatte; – ihre Entnahme mit Hilfe einer manuellen Entnahmeapparatur oder einer automatischen Entnahmeapparatur, bspw. vom Spotter-Typ; – ihre Abscheidung auf dem Semicarbazidträger und ggf. – Sättigung des Trägers.
Verwendung einer Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Polypeptid- Chips als Diagnosewerkzeug, das miniaturisiert und hoch parallel ist.
Verwendung einer Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Polypeptid-Chips für die Detektion eines Risikos bei einer Transfusion oder einer Organspende.
Verwendung einer Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Polypeptid-Chips für die Serumtypisierung oder das Screening von Epitopen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie Detektion von Antworten des Antigen-Antikörpertyps durch Verwendung von markierten Reagenzien, fluoreszierenden Reagenzien, radioaktiven Reagenzien oder chemisch markierten Reagenzien einsetzt.
Verwendung einer Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Polypeptid-Chips für die quantitative Bestimmung von Proteinen in komplexen biologischen Medien.
Verwendung einer Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Polypeptid-Chips zur Analyse von Ligand-Rezeptor-Beziehungen zwischen biologischen Peptidmolekülen.