DE69824099T2 - Analytisches verfahren, testsatz und vorrichtung - Google Patents

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Yuichi Yuuki-shi OKU
Yoshitatsu Yuuki-shi TANAKA
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Assay-Verfahren zum Untersuchen eines Analyten als biologisches Untersuchungsobjekt oder für die Bestimmung dessen Gegenwart oder Fehlen, der für einfache klinische Diagnosen verwendbar ist, sowie ein Kit und eine für das Verfahren verwendbare Assay-Vorrichtung; noch spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Assay-Verfahren zur Untersuchung einer großen Anzahl an Kombinationen von zwei oder mehreren Analyt-Spezies, enthalten in einer Flüssigkeitsprobe oder deren Gegenwart oder Fehlen, sowie ein Kit und eine Assay-Vorrichtung hierfür.
  • Hintergrund des Standes der Technik
  • Zum Bestimmen der einen Patienten beeinflussenden Krankheit in einem Labor-Test sollten mehrere Typen an Labor-Testergebnissen kollektiv untersucht werden. Im allgemeinen sollten Patienten mehreren Typen derartiger Tests für geeignete Diagnosen und eine therapeutische Behandlung unterzogen werden. Jedoch kann ein Laboratoriumsreagenz in den meisten Fällen im Stand der Technik nur ein Element untersuchen oder bestimmen, so dass das vom Patient genommene Probenvolumen sich im Verhältnis zur Anzahl der Tests erhöht, was als eine physische Belastung für den Patienten wirkt.
  • Alternativ ist es erforderlich, unter Verwendung automatischer Assay-Vorrichtungen herkömmliche immunologische Tests durchzuführen, so dass die von einem Patienten genommene Probe an ein Institut, das mit derartigen automatischen Assay-Vorrichtungen ausgestattet ist, geliefert wird, wo die Tests durchgeführt werden, und die Testergebnisse werden dann dem Arzt berichtet. In einer derartigen Art und Weise kann der Arzt, basierend auf den Ergebnissen und den klinischen Bedingungen des Patienten, seine Diagnose stellen. Somit ist so eine Vorrichtung ein Grund für einen Zeitverlust bei der Behandlung, weil der Arzt keine unmittelbare Entscheidung treffen kann.
  • Um ein derartiges Problem zu überwinden, wurde ein Verfahren, umfassend eine Kombination von Immunreaktion und Chromatographie (hierin abgekürzt als "Immunchromatographie") in den letzten Jahren entwickelt. Das Standardprinzip der herkömmlichen Immunchromatographie wird nun nachfolgend beschrieben.
  • In der für die herkömmliche Immunchromatographie eingesetzten Assay-Vorrichtung sind die nachfolgenden Zonen angeordnet: eine Beladungszone zum Beladen einer einen Analyten enthaltenden Flüssigkeitsprobe, die an einem Ende eines Entwicklungselements in Form einer porösen Lage, wie einem Nitrocellulosefilm, angeordnet ist, eine Wasserabsorptionszone zur Aufnahme der durch das Kapillarphänomen im Entwicklungselement transferierten Flüssigkeit, angeordnet am anderen Ende, eine Einschlusszone, enthaltend eine mit Marker markierte Immunsubstanz, angeordnet auf einer Seite nahe der Beladungszone zwischen der Wasserabsorptionszone und der Beladungszone, und eine Detektionszone, wo eine Immunsubstanz immobilisiert ist, um einen aus dem Analyt und der markierten Substanz zu sammengesetzten Komplex zu binden, wobei die Zone auf einer Seite getrennt von der Beladungszone angeordnet ist.
  • Durch das Assay-Verfahren unter Verwendung einer derartigen Assay-Vorrichtung wird eine Flüssigkeitsprobe, enthaltend einen zu untersuchenden Analyten, zunächst der Beladungszone zugeführt, und die Flüssigkeitsprobe wird dann durch ein Kapillarphänomen zur Einschlusszone, enthaltend eine mit Marker markierte Immunsubstanz, transferiert. In der Einschlusszone sind die markermarkierte Immunsubstanz und der Analyt durch immunologische Affinität miteinander verbunden, um einen markermarkierten Immunkomplex zu bilden. Der markenmarkierte Immunkomplex wird entwickelt und durch ein Kapillarphänomen und/oder Diffusion im Entwicklungselement zur Detektionszone transferiert, wo eine in der Detektionszone inmobilisierte Immunsubstanz den Komplex einfängt. Der Marken im markermarkierten Immunkomplex, der in der Detektionszone abgefangen wird, wird untersucht oder bestimmt, wodurch die Menge oder die Gegenwart des in der Flüssigkeitsprobe enthaltenen Analyten untersucht werden kann.
  • Verglichen mit Enzym-Immunoassays als einem Assay-Verfahren mit immunchemisch aktiven Substanzen ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass während einer Zwischenstufe des Testens kein Spülen erforderlich ist, und der Assay kann mit bloßem Auge durchgeführt werden und erfordert im wesentlichen nie irgendeine Vorrichtung, um den Marken zu bestimmen, und dadurch, dass das in der Assay-Vorrichtung enthaltene Reagenz im trockenen Zustand gehalten wird, können diese so bei Raumtemperatur für lange Dauer gelagert werden. Nach der herkömmlichen Immunchromatographie kann der Arzt unmittelbar eine von ihm genommene Probe untersuchen, und dann kann der Arzt den klinischen Bedingungen eines Patienten Rechnung tragen sowie den immunologischen Testergebnissen des Patienten, um dem Patienten in einer kurzen Zeit die Diagnose zu stellen. Demgemäß ist der Zeitverlust bei der Behandlung in vorteilhafter Weise geringer.
  • Eine Anzahl von Patenten, betreffend die Immunchromatographie, wurde offengelegt. Beispielsweise ist die Immunchromatographie, beschrieben in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. Hei 7-13640, im wesentlichen dieselbe wie die oben beschriebene Immunchromatographie des Standes der Technik, dadurch gekennzeichnet, dass ein an einen unlöslichen Teilchenmarker gebundener Ligand eingesetzt wird, und der unlösliche Teilchenmarker ein gefärbtes Liposom, ein gefärbtes Polymerkügelchen oder Metall oder ein Polymer-Farbstoffteilchen ist. Jedoch umfasst die Veröffentlichung keinerlei Beschreibung über den gleichzeitigen Assay oder die Bestimmung von einem oder mehr Spezies biologischer Substanzen, wie Antigen oder Antikörper.
  • Die EP 0 698 792 A1 offenbart ein Assay-Reagenz und ein Kit, wobei das nicht-spezifische Abfangen einer markierten Substanz durch eine Festphase unterdrückt, und mehr als ein Analyt durch das Reagenz bestimmt werden kann.
  • Die US 5 141 850 offenbart ein Immuno-Assay-Verfahren für die Bestimmung und den Nachweis eines immunologisch reaktiven Analyts in einer wässerigen Probe.
  • Das japanische Patent Nr. 2504923 beschreibt Immunchromatographie, im wesentlichen dieselbe wie die Immunchromatographie des Standes der Technik, und schlägt eine Analyse durch ein Sandwich-Verfahren vor, worin ein Komplex, der in einer Detektionszone gefangen wird, einen markermarkierten Rezeptor-Analyt-Rezeptor darstellt, genauso wie die simultane Detektion eines ersten und eines zweiten Analyten mit verschiedenen biologischen Affinitäten zueinander. Jedoch weist die Veröffentlichung nicht darauf hin, dass der markermarkierte Immunkomplex durch die komplementäre Bindung zwischen den Nucleinsäure-Basen in einer Detektionszone gefangen wird oder die Anwendbarkeit des Verfahrens auf zwei oder mehrere der Analyten oder die Assay-Empfindlichkeit hiervon.
  • Alternativ können Immuno-Assay-Verfahren höhere Empfindlichkeiten erzielen, wenn eine große Menge an immunochemisch aktiven Substanzen immobilisiert werden kann, und in diesem Fall können die Verfahren dieselben Gehalte an immunchemisch aktiven Substanzen in einer kürzeren Zeit nachweisen. Daher war eine höher empfindliche Assay-Technik auf dem Gebiet der Immunchromatographie erwünscht.
  • Es war daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein für die klinische Diagnose verwendbares Assay-Verfahren bereitzustellen, das gleichzeitig ein oder mehr Spezies von biologischen Substanzen untersuchen oder die Gegenwart oder das Fehlen hiervon bei höherer Empfindlichkeit, mittels einer einzelnen Assay-Vorrichtung in einer einfachen Art und Weise nachweisen kann, sowie ein Kit und eine Assay-Vorrichtung für den Test.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Ein erster Aspekt des Assay-Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist ein Assay-Verfahren mittels eines Kits, worin ein Reagenz und eine Assay-Vorrichtung getrennt vorgesehen sind. Das Assay-Verfahren ist ein Assay-Verfahren zum Untersuchen der Mengen von zwei oder mehr Spezies von Analyten, die in einer Flüssigkeitsprobe vorliegen, oder Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens hiervon, umfassend:
    • (1) In Kontakt bringen einer Flüssigkeitsprobe, enthaltend ein oder mehr Spezies von Analyten mit einem Reagenz, enthaltend zwei oder mehr Spezies von markermarkierten Liganden, jeder erzeugt durch Binden eines Markers an einen ersten Liganden, und zwei oder mehr Spezies von Bindungselement-markierten Liganden, jeder erzeugt durch Binden eines Bindungselements, bestehend aus Nucleinsäuren mit einer vorbestimmten Basensequenz, abhängig von den Analyt-Spezies, an einen zweiten Liganden, um spezifische Komplexe zu erzeugen, jeweils zusammengesetzt aus einer spezifischen Analyt-Spezies, einer spezifischen markermarkierten Ligand-Spezies, spezifisch bindend an die spezifische Analyt-Spezies und spezifische Bindungselement-markierte Ligand-Spezies, spezifisch bindend an die spezifische Analyt-Spezies;
    • (2) Entwickeln der Spezies von erzeugten Komplexen durch ein Kapillarphänomen in einem Entwicklungselement in Lagenform;
    • (3) Abfangen eines Komplexes, abhängig von der Analyt-Spezies durch die komplementäre Bindung zwischen dem Bindungselement und einem Anti-Bindungselement in der Detektionszone, erzeugt durch unabhängiges Immobilisieren von Anti-Bindungselementen, bestehend aus Nucleinsäuren, jeweils mit einer komplementären Sequenz zur Basensequenz einer Bindungselement-Spezies in den Komplexen, wodurch ein unabhängiges Band gebildet wird; und
    • (4) Untersuchen oder Nachweisen des im Band in der Detektionszone gebildeten Markers.
  • Eine weitere Ausführungsform des Assay-Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren mit einer einstückigen Assay-Vorrichtung, enthaltend ein Reagenz. Das Assay-Verfahren ist ein As say-Verfahren zum Untersuchen der Mengen von zwei oder mehr Spezies von Analyten, die in einer Flüssigkeitsprobe vorliegen, oder Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens hiervon, umfassend:
    • (1) Zugeben einer Flüssigkeitsprobe auf ein Entwicklungselement in Lagenform, hierdurch Entwickeln der Flüssigkeitsprobe durch ein Kapillarphänomen im Entwicklungselement;
    • (2) Transferieren der Flüssigkeitsprobe, um die Probe mit einer Einschlusszone in Kontakt zu bringen, worin Reagenzkomponenten versiegelt sind, einschließlich zwei oder mehr Spezies von markermarkierten Liganden, jeder erzeugt durch Binden eines Markers an einen ersten Liganden, der insbesondere für eine spezifische Analyt-Spezies reaktiv ist, und zwei oder mehr Spezies von Bindungselement-markierten Liganden, jeder erzeugt durch Binden eines Bindungselements, bestehend aus Nucleinsäuren mit einer vorbestimmten Basensequenz, abhängig von der Analyt-Spezies, an einen zweiten Liganden, der für die spezifische Analyt-Spezies spezifisch reaktiv ist;
    • (3) Entwickeln von Komplexen, jeder zusammengesetzt aus einer spezifischen Analyt-Spezies, einer spezifischen markermarkierten Ligand-Spezies, spezifisch bindend an die spezifische Analyt-Spezies, und eine spezifische Bindungselement-markierte Ligand-Spezies, spezifisch bindend an die spezifische Analyt-Spezies, oder Entwickeln eines Reaktionsprodukts auf dem Bildungsweg, durch ein Kapillarphänomen im Entwicklungselement;
    • (4) Abfangen eines Komplexes, abhängig von der Analyt-Spezies durch komplementäres Binden zwischen dem Bindungselement und einem Anti-Bindungselement und Bilden eines unabhängigen Bands hiervon in einer Detektionszone, wo jede Anti-Bindungselement-Spezies mit der komplementären Basensequenz zur Sequenz einer Bindungselement-Spezies im Komplex immobilisiert ist; und
    • (5) Untersuchen oder Nachweisen des Markers, enthalten in dem in der Detektionszone gebildeten Band.
  • Das Assay-Kit der vorliegenden Erfindung ist ein Assay-Kit zum Untersuchen von zwei oder mehr Spezies von Analyten in einer Probe oder Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens hiervon in einer Probe, wobei das Assay-Kit umfasst: ein Reagenz und eine Assay-Vorrichtung eines getrennten Typs von Reagenz, worin das Reagenz zwei oder mehr Spezies von markermarkierten Liganden umfasst, jeder erzeugt durch Binden eines Markers an einen ersten Liganden, spezifisch reaktiv für eine spezifische Analyt-Spezies, und zwei oder mehr Spezies von Bindungselement-markierten Liganden, jeder erzeugt durch Binden eines Bindungselements, bestehend aus Nucleinsäuren mit einer vorbestimmten Basensequenz, abhängig von der spezifischen Analyt-Spezies, an einen zweiten Liganden, der spezifisch für die spezifische Analyt-Spezies reaktiv ist, und
    worin die Assay-Vorrichtung ein Entwicklungselement in einer Lagenform umfasst, wobei das Entwicklungselement Analyten, Reagenz und an das Reagenz gebundene Analyten durch ein Kapillarphänomen entwickeln kann, und zwei oder mehr Spezies von Anti-Bindungselementen, umfassend eine Nucleinsäure mit einer Basensequenz, komplementär zu einem im getrennten Reagenz enthaltenen Bindungselement, jeder Typ in der Detektionszone des Entwicklungselements unabhängig immobilisiert ist, wobei ein Komplex jeder Analyt-Spezies durch die komplementäre Bindung zwischen dem Bindungselement und einem Anti-Bindungselement in der Detektionszone abgefangen wird, wodurch ein unabhängiges Band gebildet wird.
  • Die Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist charakteristischerweise eine im Assay-Kit enthaltene Assay-Vorrichtung.
  • Weiterhin ist die Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung eine Assay-Vorrichtung zum Untersuchen von zwei oder mehr Spezies von in einer Probe vorhandenen Analyten oder zum Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens hiervon in der Probe, worin die Assay-Vorrichtung umfasst
    • (1) ein Entwicklungselement in Lagenform, das in der Lage ist, Analyten, Reagenz und an das Reagenz gebundene Analyten zu entwickeln;
    • (2) eine Beladungszone, um eine Flüssigkeitsprobe von außerhalb aufzunehmen, wobei die Beladungszone an einem Ende des Entwicklungselements in der Lagenform positioniert wird und in der Lage ist, eine Flüssigkeitsprobe von außerhalb aufzunehmen, und mit einer ausreichenden Zuführstärke, um die aufgenommene Flüssigkeitsprobe zum anderen Ende zu transferieren, um die zu analysierende Flüssigkeitsprobe zu einer Einschlusszone, in der die Reagenzkomponenten versiegelt vorliegen, zuzuführen;
    • (3) eine Einschlusszone, in der Reagenzkomponenten versiegelt vorliegen, einschließlich zwei oder mehr Spezies von markermarkierten Liganden, jeder erzeugt durch Binden eines Markers an einen ersten Liganden, der für eine spezifische Analyt-Spezies spezifisch reaktiv ist, und zwei oder mehr Spezies von Bindungselement-markierten Liganden, jeder erzeugt durch Binden eines Bindungselements, bestehend aus Nucleinsäure mit einer vorbestimmten Basensequenz, abhängig von der Analyt-Spezies, an einen zweiten Liganden, der für die spezifische Analyt-Spezies spezifisch reaktiv ist, wobei die Einschlusszone an einer Position nahe der Beladungszone angeordnet ist;
    • (4) eine Wasserabsorptionszone, angeordnet an einer Position getrennt von der Beladungszone, wobei die Zone in der Lage ist, die Analyten, das Reagenz und an das Reagenz gebundene Analyten nach Diffusion in das Entwicklungselement aufzunehmen, und
    • (5) eine Detektionszone, angeordnet zwischen der Einschlusszone und der Wasserabsorptionszone, wo zwei oder mehr Spezies von Anti-Bindungselementen, jedes mit einer Basensequenz, komplementär zu einem Bindungselement, immobilisiert sind, wobei ein aus einem markermarkierten Ligand, einer Analyt-Spezies und einem Bindungselement-markierten Ligand gebildeter Komplex, abhängig von den Analyt-Spezies, abgefangen und nachgewiesen werden kann. Erfindungsgemäß können zwei oder mehrere Analyt-Spezies mit einem einzelnen Kit oder einer Assay-Vorrichtung mit einer hohen Empfindlichkeit untersucht werden.
  • Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff "Ligand" ein Molekül mit einer biologischen Affinität für einen Analyten, das in der Lage ist, mit einer spezifischen Analyt-Spezies spezifisch zu reagieren, um ein Paar zu bilden. Erfindungsgemäß kann der Ausdruck "erster Ligand" und "zweiter Ligand" dieselben Eigenschaften haben oder nicht dieselben Eigenschaften haben. Wenn der Analyt ein Antigen darstellt, können der erste Ligand und der zweite Ligand Antikörper sein; wenn ein Analyt ein Antikörper ist, können der erste Ligand und der zweite Ligand Antigene darstellen. Ein weiteres Beispiel der Kombination des Analyten und der Liganden umfasst eine Kombination eines Rezeptors und Liganden, die in der Lage sind, am Rezeptor zu binden, eine Kombination einer Nucleinsäure und komplementärer Nucleinsäuren, die in der Lage sind, an die Nucleinsäuren zu binden, eine Kombination von Lecithin und spezifischen Zuckern, die in der Lage sind, an Lecithin zu binden.
  • Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck "Bindungselement" eine Nucleinsäure, die nicht an den Analyten bindet, aber eine von diesen Liganden unterschiedliche Reaktivität aufweist. Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff "Anti-Bindungselement" eine Nucleinsäure mit einer Basensequenz zumindest teilweise komplementär zur Basensequenz des "Bindungselements", und das Anti-Bindungselement bindet das Bindungselement in einer komplementären Art und Weise. Die Kombination des "Bindungselements" und des "Anti-Bindungselements" umfasst eine fast unbegrenzte Anzahl von Kombinationen, abhängig von den Basensequenzen der Nucleinsäure-Moleküle, die das Bindungselement und das Anti-Bindungselement aufbauen.
  • Hinsichtlich der komplementären Bindung zwischen dem Bindungselement und dem Anti-Bindungselement können einzelne Basensequenzen in zufriedenstellender Weise teilweise komplementär oder vollständig komplementär zu einander sein. Als die als das Bindungselement und Anti-Bindungselement dienenden Nucleinsäuren können DNA, RNA, Oligonucleotid und Polynucleotid, bevorzugt einschließlich eines Oligonucleotids einer Länge von 10 mer oder mehr bis 100 mer oder weniger verwendet werden.
  • Die Anti-Bindungselemente sind direkt oder indirekt durch eine Substanz gebunden und auf dem Entwicklungselement in einer Detektionszone immobilisiert. Beispielsweise sind die Anti-Bindungselemente durch kovalente Bindung einer Nucleinsäure als dem Anti-Bindungselement direkt auf dem Entwicklungselement immobilisiert, durch eine funktionelle Gruppe, eingeführt am 5'- oder 3'-Ende einer Nucleinsäure oder eingeführt in eine Base einer Nucleinsäure, mit einer in einem unlöslichen Träger als dem Entwicklungselement enthaltenen funktionellen Gruppe. Abhängig von den zu untersuchenden ein oder mehr Spezies von Analyten werden individuell unterschiedliche Basensequenzen für die Anti-Bindungselemente vorbestimmt und getrennt von einander immobilisiert in Form von Zonen in der Detektionszone.
  • Durch Biotin, eingeführt am 5'- oder 3'-Ende einer Nucleinsäure, oder durch Biotin, eingeführt in ein eine Nucleinsäure aufbauendes Nucleotid, sind Nucleinsäuren als Anti-Bindungselemente an Avidine oder Streptavidine, die zuvor an einen unlöslichen Träger als dem Entwicklungselement gebunden sind, wobei Nucleinsäuren indirekt auf dem Entwicklungselement immobilisiert sein können, gebunden.
  • Durch Binden einer Nucleinsäure, durch eine am 5'- oder 3'-Ende einer Nucleinsäure eingeführte funktionelle Gruppe oder eingeführt in eine Base der Nucleinsäure, an ein Protein, und dann Binden des Nucleinsäure-gebundenen Proteins an einen unlöslichen Träger als dem Entwicklungselement, können Nucleinsäuren als ein Anti-Bindungselement auf dem Entwicklungselement indirekt immobilisiert werden.
  • Als erfindungsgemäß einzusetzende Reagenzkomponente kann ein "markermarkierter Ligand", hergestellt durch Binden eines Markers an einen ersten Liganden, sowie ein "Bindungselementmarkierter Ligand", erzeugt durch Binden eines Bindungselements, bestehend aus Nucleinsäuren mit einer vorbestimmten Basensequenz, abhängig von der Analyt-Spezies, an einen zweiten Ligand, verwendet werden. Getrennt vom Entwicklungselement kann die Reagenzkomponente ein zu verwendendes Kit in Kombination mit dem Entwicklungselement aufbauen. Zusätzlich kann die Reagenzkomponente in befriedigender Weise in einem trockenen Zustand in der Einschlusszone des Entwicklungselements zurückgehalten werden.
  • Als ein im markermarkierten Ligand enthaltener Marker können speziell enzymatisch aktive Moleküle, Digoxigenin, Metallkolloid, gefärbter Latex, gefärbtes Liposom, Nucleinsäure, Biotin, Avidin, fluoreszierende Substanz, lumineszierende Substanz, Radioisotop und dergleichen Verwendung finden. Die Bedeutung des Ausdrucks "Färben" ist hier nicht auf die Abscheidung einer Farbe beschränkt, die visuell unterschieden werden kann, sondern umfasst auch die Abscheidung von fluoreszierenden Substanzen und lumineszierenden Substanzen.
  • Erfindungsgemäß ist das "Entwicklungselement" in Form einer Lage und kann einen Analyten, Reagenz und an das Reagenz gebundene Analyten in einer chromatographischen Art und Weise entwickeln. Als das Entwicklungselement können bevorzugt poröse unlösliche Träger, noch spezieller einschließlich poröse Kunststoffträger, poröse Celluloseträger und anorganische poröse Träger Verwendung finden. Noch spezieller können Cellulose, Nitrocellulose, Celluloseacetat, Nylon, Siliciumdioxid oder Derivate hiervon, die alle porös sind, verwendet werden. In den auf dem Entwicklungselement gebildeten einzelnen multiplen Zonen können verschiedene Materialien verwendet werden oder in Kombination verwendet werden. In einigen Fällen kann eine Fläche jeder der vielen Zonen mit demselben Material als dem Material auf der anderen Fläche oder mit einem anderen Material aus dem Material auf der anderen Fläche verstärkt werden. Zusätzlich können diese Zonen im allgemeinen trocken sein, wenn sie für den Assay nicht verwendet werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt schematisch ein Beispiel des Reagenz als einer Komponente des Assay-Kits für ein oder mehr Spezies von den betreffenden erfindungsgemäßen Analyten;
  • 2 zeigt schematisch ein Beispiel der Assay-Vorrichtung als einer Komponente des erfindungsgemäßen Assay-Kits;
  • 3 zeigt schematisch den Zustand der in Abhängigkeit der Analyt-Spezies durch ein einfaches klinisches Diagnoseverfahren unter Verwendung des in 1 und 2 gezeigten Assay-Kits gefangenen markermarkierten Immunkomplexe;
  • 4 zeigt eine weitere Ausführungsform der Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, die Reagenz in trockenem Zustand integriert enthält;
  • 5 zeigt ein Beispiel, wie die Assay-Vorrichtung von 4 zu verwenden ist, worin die Zusammensetzung des im trockenen Zustand in der Einschlusszone 18 der Assay-Vorrichtung enthaltenen Reagenzes gezeigt ist, vorausgesetzt, dass die jeweiligen Analyten Antigene A, B und C darstellen;
  • 6 zeigt schematisch den Zustand der in Abhängigkeit der Analyt-Spezies durch ein einfaches klinisches Diagnoseverfahren unter Verwendung der in 4 gezeigten Assay-Vorrichtung eingefangenen markermarkierten Immunkomplexe;
  • 7 zeigt das Prinzip, wie eine Nucleinsäure als Analyt der erfindungsgemäßen Detektionszone einzufangen ist, worin der Analyt die Nucleinsäure ist, enthaltend die Oligonucleotide ON3 und ON2 in deren Sequenz;
  • 8 zeigt Nucleinsäure-markierte IgG-Antikörper, enthaltend ein Antikörperelement, bestehend aus Nucleinsäuren, eingeführt in den IgG-Antikörper auf einem unlöslichen Träger in der Detektionszone als einer Assay-Vorrichtung zum Nachweis eines Analyt-Antigens;
  • 9 zeigt den Zustand von Sandwich-Immunkomplexen, eingefangen auf der in 8 gezeigten Detektionszone;
  • 10 zeigt Nucleinsäuren 27, immobilisiert durch Biotin-Avidin-Reaktion, durch Binden von biotinylierten Nucleinsäuren, erzeugt durch Einführen eines Biotins in eine Nucleinsäure auf immobilisierten Avidinen, erzeugt durch Immobilisieren von Avidinen durch physikalische Adsorption auf einer Detektionszone;
  • 11 zeigt immobilisierte Nucleinsäuren als eine Ausführungsform, abweichend von den Nucleinsäuren, immobilisiert durch die Biotin-Avidin-Reaktion, wie gezeigt in 10, worin ein Nucleinsäure-Biotin-Avidin-Komplex gebunden wird durch komplementäre Bindung von Nucleinsäuren an den Nucleinsäure-Biotin-Avidin-Komplex, gezeigt in 10;
  • 12 zeigt Mittel zum Platzieren eines Teststreifens als der Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in einem Gehäuse;
  • 13 zeigt eine Assay-Vorrichtung in einem Streifen, wie in Beispiel 5 verwendet;
  • 14 zeigt eine in Beispiel 8 eingesetzte Assay-Vorrichtung, worin der Querschnittsabschnitt der Assay-Vorrichtung entlang der longitudinalen Richtung gezeigt ist;
  • 15 ist eine Seitenansicht der in Beispiel 8 verwendeten Assay-Vorrichtung und
  • 16 zeigt eine in Beispiel 8 verwendete Assay-Vorrichtung, worin die obere Flächenansicht der Assay-Vorrichtung gezeigt wird.
  • Beste Ausführungsform der Erfindung
  • 1 zeigt schematisch ein Beispiel des Reagenz als einer Komponente des Assay-Kits für zwei oder mehr Spezies von den betreffenden erfindungsgemäßen Analyten, worin die objektiven Analyten drei Spezies von Antigenen sind, nämlich die Antigene A, B und C. In 1 sind alle Komponenten im Rahmen in einem Reagenz enthalten, und das Reagenz kann in einem trockenen Zustand oder in einer Flüssigkeit vorliegen. In 1 stellen α A, α B und α C Antikörper dar, die jeweils individuell gegen die Antigene A, B und C sind. Die Antikörper α A, α B und α C sind durch individuelle Marker gebunden, so dass diese Antikörper als markermarkierte Antikörper dienen. Die in die individuellen Antikörper eingeführten Marker können gleich oder verschieden sein. Drei Spezies von Antikörpern, nämlich α A, α B und α C, gebunden an die Oligonucleotide ON1, ON2 und ON3, mit voneinander unterschiedlichen Sequenzen, sind in dem Reagenz enthalten, und diese drei werden als Antikörper-Oligonucleotid-Bindungsprodukte definiert. Das den Assay-Kit aufbauende Reagenz kann in flüssigem oder trockenem Zustand sein.
  • 2 zeigt schematisch ein Beispiel der Assay-Vorrichtung als einer Komponente des erfindungsgemäßen Assay-Kits, das in Kombination mit dem Reagenz von 1 verwendet werden kann. In 2 stellt 1 ein Entwicklungselement dar, umfassend ein Stück Streifen einer porösen Lage; 2 stellt eine Beladungszone dar, angeordnet an einem Ende des Entwicklungselements 1, um eine beladene Flüssigkeitsprobe und eine Reagenzmischung zu absorbieren, um sie zum Entwicklungselement 1 zu liefern; 3 stellt eine Absorptionszone dar, die in der Lage ist, Analyten, Reagenz und an das Reagenz gebundene Analyten aufzunehmen, nach Transfer und Diffusion in das Entwicklungselement. Zwischen der Beladungszone 2 und der Absorptionszone 3 ist die Detektionszone 4 angeordnet, worin die erste Detektions zone 5 mit immobilisiertem Oligonucleotid ON1' mit einer komplementären Basensequenz zu Oligonucleotid ON1, die zweite Detektionszone 6 mit immobilisiertem Oligonucleotid ON2' mit einer komplementären Sequenz zu Oligonucleotid ON2 und die dritte Detektionszone 7 mit immobilisiertem Oligonucleotid ON3' mit einer komplementären Sequenz zu Oligonucleotid ON3 einzeln getrennt in einem Streifenmuster gebildet werden.
  • Ein einfaches klinisches diagnostisches Verfahren unter Verwendung des Assay-Kits, umfassend eine Kombination des Reagenz von 1 und des Entwicklungselements von 2 ist nachfolgend gezeigt. Unter Verwendung einer Antigene A, B und C als Analyten enthaltenden Flüssigkeitsprobe wird die Probe mit dem Reagenz in einem Behälter gemischt, um eine immunologische Affinitätsreaktion zu bewirken. Die resultierende Reaktionslösung wird auf die Beladungszone 2 des Entwicklungselements 1 gegeben. Die Reaktionlösung kann befriedigend in einer derartigen Art und Weise aufgegeben werden, dass die Beladungszone 2 in die Reaktionslösung eingetaucht wird, oder die Reaktionslösung wird tropfenweise auf die Beladungszone 2 gegeben, oder die Reaktionslösung wird auf die Zone 2 beschichtet. Die Reaktionslösung enthält Analyten, Reagenz und markermarkierte Immunkomplexe der mit dem Reagenz komplexierten Analyten. Die Reaktionslösung wird durch ein Kapillarphänomen im Entwicklungselement 1 zur Detektionszone 4 transferiert oder diffundiert, wo die markermarkierten Immunkomplexe durch die komplementäre Bindung zwischen einem immobilisierten Oligonucleotid mit einer vorher auf Basis jeder Analyt-Spezies bestimmten Basensequenz und einem die markermarkierten Immunkomplexe enthaltenden Oligonucleotid abgefangen wird.
  • 3 zeigt schematisch den Zustand der durch ein einfaches klinisches Diagnoseverfahren unter Verwendung des in den 1 und 2 gezeigten Assay-Kits in Abhängigkeit von den Analyt-Spezies gefangenen markermarkierten Immunkomplexe.
  • Als die Reagenzkomponenten der vorliegenden Erfindung können der erste im markermarkierten Ligand und der zweite in einem Nucleinsäure-markierten Ligand enthaltene Ligand dieselbe Reaktivität oder eine unterschiedliche Reaktivität von einander aufweisen. Zusätzlich kann die Kombination des ersten Liganden mit dem zweiten Liganden eine Kombination eines monoklonalen Antikörpers und eines polyklonalen Antikörpers sein, beide gegen dasselbe Antigen, eine Kombination von polyklonalen Antikörpern und eine Kombination von monoklonalen Antikörpern mit verschiedenen Bindungsstellen.
  • Erfindungsgemäß kann eine Mischung von in einer Flüssigkeitsprobe enthaltenen Analyten als Assay-Subjekte untersucht werden, wobei die Analyten unabhängige Verbindungen sind, die niemals zur selben Kategorie gehören. Beispielsweise können Antigen, Antikörper und Nucleinsäure gleichzeitig untersucht werden. Erfindungsgemäß können zusätzlich antagonistische oder nicht-antagonistische Assay-Verfahren in einer Vielzahl von Modellen verwendbar sein, ohne eine spezifische Begrenzung auf das Sandwich-Verfahren, wie oben beschrieben.
  • Weil eine fast unbegrenzte Anzahl von Basensequenzen als die die Nucleinsäure aufbauende Basensequenz verfügbar sein können, sind eine unbegrenzte Anzahl von Analyten in der Detektionszone nachweisbar.
  • 4 zeigt eine weitere Ausführungsform der Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, die eine Assay-Vorrichtung darstellt, die Reagenz in trockenem Zustand integriert enthält. In der Assay-Vorrichtung von 4 bedeutet 11 ein Entwicklungselement, prinzipiell umfassend ein Bandstück einer Lage einer bandähnlichen porösen Lage, das mit einer verstärkenden Lage, wenn nötig, verbunden ist; 12 bedeutet eine Beladungszone, angeordnet an einem Ende des Entwicklungselements 11, um beladene Flüssigkeitsprobe zu absorbieren, um die Flüssigkeitsprobe zur Einschlusszone 18 und dem Entwicklungselement 11, das das Reagenz enthält, zu befördern; 13 bedeutet eine Absorptionszone, die in der Lage ist, Analyten, das Reagenz und mit dem Reagenz gebundene Analyten nach dem Transfer und der Diffusion in das Entwicklungselement 11 aufzunehmen. Der Unterschied zu der in 2 gezeigten Assay-Vorrichtung ist, dass die Einschlusszone 18, die darin Reagenzkomponenten versiegelt, in engem Kontakt zwischen dem Entwicklungselement 11 und der Beladungszone 12 so angeordnet ist, dass die von der Beladungszone 12 zur Einschlusszone 18 beförderte Flüssigkeitsprobe zum Entwicklungselement 11 transferiert werden könnte.
  • Die Detektionszone 14 ist zwischen der Einschlusszone 18 und der Absorptionszone 13 im Entwicklungselement 11 angeordnet, worin die erste Detektionszone 15 mit immobilisiertem Oligonucleotid ON1' mit einer komplementären Basensequenz zu Oligonucleotid ON1, die zweite Detektionszone 16 mit immobilisiertem Oligonucleotid ON2' mit einer komplementären Sequenz zu Oligonucleotid ON2 und die dritte Detektionszone 17 mit immobilisiertem Oligonucleotid ON3' mit einer komplementären Sequenz zu Oligonucleotid ON3 einzeln getrennt in einem Streifenmuster gebildet sind.
  • Als ein Beispiel, wie die Assay-Vorrichtung von 4 zu verwenden ist, wird ein Fall beschrieben, worin eine zu untersuchende Flüssigkeitsprobe tatsächlich nur Antigen A und Antikörper C enthält, vorausgesetzt, dass die subjektiven Analyten Antigene A und B und Antikörper C darstellen. 5 zeigt die Zusammensetzung des in diesem Fall in trockenem Zustand in der Einschlusszone 18 enthaltenen Reagenzes. Verglichen mit der Reagenzzusammensetzung von 1 ist die Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Ausführungsform einfach wie folgt modifiziert: Der markermarkierte Antikörper α C ist markermarkiertes Antigen C und Oligonucleotid ON3-markierter Antikörper α C ist Oligonucleotid ON3-markiertes Antigen C.
  • Wenn eine die Analyt-Antigene A und C enthaltende Flüssigkeitsprobe auf die Beladungszone 12 gegeben wird, bildet das Antigen A mit dem markermarkierten Antikörper α A und Oligonucleotid ON1-markiertem Antikörper α A einen Sandwich-Immunkomplex, während die Analyten zusammen mit der Reagenzkomponente durch ein Kapillarphänomen transferiert werden, um die erste Detektionszone 15 für den Antigen A-Assay zu erreichen, wo das Antigen A durch die zu einander komplementären Basensequenzen der Oligonucleotide abgefangen wird. Der Antikörper C bildet mit dem markermarkierten Antigen C und dem Oligonucleotid ON3-markierten Antigen C einen Sandwich-Immunkomplex, um die dritte Detektionszone 17 zu erreichen, wo der Antikörper C durch die zu einander komplementären Basensequenzen der Oligonucleotide abgefangen wird. Da Antigen B in der Flüssigkeitsprobe nicht vorhanden ist, wird kein Sandwich-Immunkomplex gebildet, und daher wird Oligonucleotid ON2-markierter Antikörper α B in der zweiten Detektionszone 16 für den Antigen B-Assay abgefangen. Die Antigene A und C werden untersucht oder die Gegenwart dieser wird durch die Marker nachgewiesen, enthalten in den somit auf den individuellen Detektionszonen 15, 16 und 17 abgefangenen Sandwich-Immunkomplexen, so dass das Fehlen von Antigen B angezeigt wird. 6 zeigt schematisch das Auftreten der jeweils in Abhängigkeit von jeder Spezies der Analyten gefangenen markermarkierten Immunkomplexe.
  • 7 zeigt das Prinzip, wie die Nucleinsäuren in den erfindungsgemäßen Detektionszonen abzufangen sind. In 7 ist der Analyt 43 eine Nucleinsäure, enthaltend Oligonucleotide ON3 und ON2 in der Sequenz. Das Prinzip kann in befriedigender Weise für den Analyten angewendet werden, der eine Einzelstrang-Nucleinsäure oder eine Doppelstrang-Nucleinsäure darstellt. Das in der Detektionszone 40 immobilisierte Anti-Bindungselement 41 ist eine Oligonucleotid ON1 enthaltende Nucleinsäure. Die Reagenzkomponenten umfassen den markermarkierten Liganden 44 und Nucleinsäure-markierten Liganden 42; der markermarkierte Ligand 44 ist eine markergebundene Nucleinsäure mit Oligonucleotid ON3' mit einer komplementären Basensequenz zur Basensequenz von Oligonucleotid ON3 im Analyt 43; ein Nucleinsäure-markierter Ligand 42 ist eine Nucleinsäure, enthaltend Oligonucleotid ON2' mit einer komplementären Basensequenz zur Basensequenz von Oligonucleotid ON2 im Analyt 43 und einem Bindungselement-Oligonucleotid ON1' mit einer komplementären Basensequenz zur Basensequenz des Oligonucleotids ON1 in dem auf der Detektionszone 40 immobilisierten Anti-Bindungselement 41.
  • Unter Verwendung des Assay-Kits oder der Assay-Vorrichtung, enthaltend ein derartiges erfindungsgemäßes Reagenz, wird ein objektiver Nucleinsäure-Analyt abgefangen, und dessen Bindungsmodell ist in 7 gezeigt. Während das Reagenz und eine Flüssigkeitsprobe im Entwicklungselement der Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung entwickelt werden, treten die folgenden Reaktionen durch die wechselseitigen Reaktionen des Analyten, des Reagenzes und des immobilisierten Anti-Bindungselements auf; die komplementäre Bindung zwischen Oligonucleotid ON1 im Anti-Bindungselement 41 und Oligonucleotid ON2' im Nucleinsäure-markierten Ligand 42, die komplementäre Bindung zwischen Oligonucleotid ON2' im Nucleinsäure-markierten Ligand 42 und Oligonucleotid ON2 im Analyt 43 und die komplementäre Bindung zwischen Oligonucleotid ON3 im Analyt 43 und Oligonucleotid ON3' im markermarkierten Ligand 44. Dann wird ein den Marker und den Analyt 43 enthaltender Komplex auf dem Anti-Bindungselement 41 abgefangen.
  • Entsprechend dem Assay-Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Komplexe von Substanzen mit biologischer Affinität, wie Immunkomplexe, vor dem Zugeben zur Assay-Vorrichtung oder in einem frühen Stadium nach dem Zugeben erzeugt. Durch die Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung hat die komplementäre Bindung zwischen Nucleinsäuren als den für das Abfangen der Komplexe von Substanzen mit biologischer Affinität einzusetzenden Bindungselementen und Anti-Bindungselementen einen höheren Grad an Übereinstimmung bei höherer Stabilität, was stärker gefördert wird als eine Immunreaktion. Daher können derartige Substanzkomplexe mit biologischer Affinität effizient an die Festphase gebunden werden. Daher ist der Assay mittels der Assay-Vorrichtung viel empfindlicher als bei der herkömmlichen Immunchromatographie.
  • Wenn eine Kombination zwischen einer Nucleinsäure und einer Nucleinsäure mit einer geringen Übereinstimmung an komplementärer Bindung ausgewählt wird, kann im Gegensatz hierzu die Nachweisempfindlichkeit mittels der Sequenz der Nucleinsäure gesteuert werden, ohne dass die Reduktion der Menge eines Antikörpers mit zu geringer Empfindlichkeit, die schließlich auftritt, wenn ein Antikörper bei hohem Titer verwendet wird, weil die Reaktion einer Nucleinsäure bei niedriger Stabilität schwächer ist als die Immunreaktion, nötig ist. Eine derartige Kontrolle kann niemals durch herkömmliche Immunchromatographie verwirklicht werden. Die vorliegende Erfindung kann charakteristischerweise diese Kontrolle als erstes verwirklichen. Wenn eine Vielzahl von Elementen gleichzeitig bestimmt werden soll, insbesondere einzelne Elemente mit verschiedenen normalen und unnormalen Bereichen, erfordert dies manchmal die Modifikation der Konzentration und Menge eines Antikörpers. Erfindungsgemäß kann jedoch die Einstellung bedeutend vereinfacht werden.
  • Verschiedene Verfahren können als Immobilisierungsmittel der Nucleinsäuren verwendbar sein, die als Anti-Bindungselemente dienen, immobilisiert auf der Detektionszone des erfindungsgemäßen Entwicklungselements. Am 5'- oder 3'-Ende einer Nucleinsäure als einem Anti-Bindungselement oder an der Position einer geeigneten funktionellen Gruppe in den Nucleinsäuren außer den Enden, können Nucleinsäuren befriedigenderweise direkt oder durch eine eingeführte funktionelle Gruppe an einen wasserunlöslichen Träger in der Detektionszone kovalent gebunden werden. Nucleinsäuren können in befriedigender Weise durch eine in eine Nucleinsäure aktiv eingeführte funktionellen Gruppe, oder direkt oder durch eine eingeführte funktionelle Gruppe, an einen wasserunlöslichen Träger in der Detektionszone kovalent gebunden werden.
  • Ein weiteres Immobilisierungsmittel für Nucleinsäuren in der Detektionszone ist das Einschieben einer anderen Substanz zwischen diese, wodurch ein Binden in befriedigender Weise durchgeführt werden kann. Durch einleitendes Binden einer Nucleinsäure, beispielsweise durch Binden aufgrund von biologischer Affinität oder kovalenter Bindung an eine durch physikalische Adsorption auf der Detektionszone immobilisierte Substanz, kann das resultierende Bindungsprodukt dann beispielsweise durch physikalische Adsorption auf der Detektionszone immobilisiert werden. Bei den 5'- oder 3'-Enden vom Nucleotid oder bei der Position einer geeigneten funktionellen Gruppe, eingeführt in eine geeignete Position des Nucleotids, wird beispielsweise eine auf der Detektionszone physikalisch absorbierbare andere Substanz durch die funktionelle Gruppe gebunden, die dann auf der Detektionszone adsorbiert wird. Beispielsweise ist ein Protein eine auf dem unlöslichen Träger physikalisch adsorbierbare Substanz; beispielsweise wird die SH-Gruppe in die Aminogruppe des Proteins eingeführt, und durch die Reaktion der SH-Gruppe mit der an die 5'-Enden des Oligonucleotids eingeführten Maleimidgruppe wird das Protein, das auf der Detektionszone durch eine derartige physikalische Adsorption immobilisiert werden kann, zusammen kovalent gebunden.
  • Die Bindung einer anderen Substanz an eine Nucleinsäure kann aus der biologischen Affinität außer der oben beschriebenen kovalenten Bindung abgeleitet werden. Eine derartige andere Substanz umfasst beispielsweise ein Protein. Beispiele des Proteins umfassen Avidin, Rinderserum Albumin, Immunglobulin und dergleichen. Wenn Immunglobulin immunologische Affinität zu einem Analyten aufweist, kann die Assay-Empfindlichkeit durch Verwendung der immunologischen Bindung mit dem Analyt weiter erhöht werden.
  • 8 zeigt Nucleinsäure-markierte IgG-Antikörper 19 mit einem Anti-Bindungselement, bestehend aus Nucleinsäuren 20, eingeführt in den IgG-Antikörper, in einem immobilisierten Zustand auf einen unlöslichen Träger in der Detektionszone, als einer Assay-Vorrichtung zum Bestimmen eines Antigens, das den Analyten darstellt. Zwei Nucleinsäuren 20, 20 werden zuvor in den Nucleinsäuremarkierten IgG-Antikörper 19 mit immunchemischer Aktivität eingeführt, und ein derartiger Nucleinsäure-markierter IgG-Antikörper 19 wird auf der Detektionszone 14 adsorbiert, wo die Nucleinsäure 20 sich in einem durch den IgG-Antikörper immobilisierten Zustand befindet.
  • 9 zeigt den Zustand eines Sandwich-Immunkomplexes, abgefangen auf der in 8 gezeigten Detektionszone 14. In 9 werden zwei Spezies von Immunkomplexen auf dem Nucleinsäuremarkierten IgG-Antikörper 19 abgefangen. Einer der Komplexe ist ein aus Antigen 22 als dem Analyten, Nucleinsäure-markiertem Antikörper 21 und markermarkiertem Antikörper 23 gebildeter Sandwich-Immunkomplex. Der andere Komplex ist ein aus dem markermarkierten Antikörper 23 und Antigen 22 gebildeter Immunkomplex.
  • Noch spezieller wird durch Immobilisieren des mit Nucleinsäure 20 eingeführten Nucleinsäuremarkierten IgG-Antikörpers 19 in der Detektionszone 14 in 9 das Antigen 22 aufgrund der komplementären Bindung zwischen der Nucleinsäure 24 im Nucleinsäure-markierten Antikörper 21 als eine Reagenzkomponente und der Nucleinsäure 20 im Nucleinsäure-markierten IgG-Antikörper 19 nachgewiesen, aber zusätzlich wird das durch die immunchemisch aktive Wirkung des IgG-Antikörpers an sich gebundene Antigen 22 ebenfalls nachgewiesen.
  • Nach dem herkömmlichen Verfahren können nur zwei Moleküle eines Assay-Subjekts an ein Molekül einer immobilisierten immunchemisch aktiven Substanz gebunden werden. In verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können jedoch mehrere Moleküle eines Antigens als Assay-Subjekt gebunden werden als im Assay nach dem herkömmlichen Verfahren, so dass mehrere Markierungsmarker gebunden werden können. Daher hat das Assay-Verfahren der vorliegenden Erfindung eine höhere Nachweisempfindlichkeit als die Nachweisempfindlichkeit des herkömmlichen Assay-Verfahrens.
  • 10 zeigt Nucleinsäure 27, immobilisiert durch Biotin-Avidin-Reaktion, durch Binden einer biotinylierten Nucleinsäure, erzeugt durch Einführen von Biotin 26 in die Nucleinsäure 27, auf ein immobilisiertes Avidin, erzeugt durch Immobilisieren von Avidin durch physikalische Adsorption auf der Detektionszone 14.
  • 11 zeigt eine immobilisierte Nucleinsäure als eine Ausführungsform, die sich von der Nucleinsäure, immobilisiert durch Biotin-Avidin-Reaktion, wie in 10 gezeigt, unterscheidet, worin ein Nucleinsäure-Biotin-Avidin-Komplex gebunden wird durch komplementäre Nucleinsäure-Bindung an den in 10 gezeigten Nucleinsäure-Biotin-Avidin-Komplex, um die Nucleinsäure zu Immobilisieren. Noch spezieller wird der bei den in 10 gezeigten Mitteln hergestellte Nucleinsäure-Biotin-Avidin-Komplex zuvor an die Detektionszone gebunden, und dann bildet eine biotinylierte Nucleinsäure, erzeugt durch Einführen von Biotin 26 in die Nucleinsäure 28 mit einer komplementären Basensequenz zu der Sequenz der zuvor immobilisierten Nucleinsäure 27, zusammen mit Avidin 25 einen Komplex, an den dann ein Komplex, enthaltend die Nucleinsäure 28, durch die komplementäre Bindung mit der Nucleinsäure 27 an den zuvor erwähnten Nucleinsäure-Biotin-Avidin-Komplex gebunden wird, um die Nucleinsäure 28 zu immobilisieren.
  • Die Nucleinsäure-immobilisierte Detektionszone, erlangt durch die in 11 gezeigten Mittel, wird dreidimensional in der Detektionszone wachsen gelassen und kann daher mehrere Nucleinsäuren als Bindungselemente als die in der Ausführungsform von 10 gezeigten Nucleinsäure-Immobilisierungsmittel enthalten, so dass die Zone mehrere Immunkomplexe mit der resultierenden hohen Nachweisempfindlichkeit abfangen kann.
  • Unter Verwendung von Streptavidin anstelle von Avidin, eingesetzt in den zwei Arten von Ausführungsformen, kann gleichzeitig ein Nucleinsäure-gebundener unlöslicher Träger hergestellt werden. Durch die obige Art und Weise kann die Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung erlangt werden. Die Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann einfach als Teststreifen eingesetzt werden. Auch kann der Teststreifen zur Verwendung in einem Gehäuse platziert sein. Weil Blut, Serum und Plasma, die von Patienten gesammelt werden, üblicherweise hochgradig mit infektiösen Mikroorganismen kontaminiert sind, sollte der Möglichkeit einer Infektion Rechnung getragen werden, wenn die Assay-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung einzeln als Teststreifen verwendet wird. Um die Infektionsproblematik zu verringern und den Teststreifen direkt mit den Händen zu handhaben, ist das Platzieren und Handhaben des Teststreifens in einem Kunststoffgehäuse und dergleichen eine bevorzugte Ausführungsform.
  • Als ein Mittel zum Platzieren des Teststreifens in einem Gehäuse kann beispielsweise ein in 12 gezeigtes Mittel in befriedigender Weise verwendet werden. Noch spezieller wird der Teststreifen zuvor in einem Kunststoffgehäuse 29 mit zwei Öffnungen versiegelt, worin eine Öffnung eine Probenbeladungsöffnung 30 ist, angepasst an die Beladungszone des Teststreifens, während die andere Öffnung ein Detektionsfenster 31 in der Detektionszone ist, wo eine abgefangene Nucleinsäure auf dem Teststreifen gebunden wird, wodurch das Auftreten des abgefangenen Analyts in der Detektionszone beobachtet werden kann. Mittels des im Kunststoffgehäuse 29 platzierten Teststreifens kann die Möglichkeit einer Infektion durch Proben für Individuen, die mikrobiologische Labortests durchführen, bedeutend verringert werden. Beispiele bevorzugter Kunststoffe als Material des Kunststoffgehäuses 29 umfassen Polyethylen, Polystyrol, Polypropylen, Acrylsäure, Ethylenvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid und dergleichen.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen im Detail beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Verfahren 1: Herstellung eines biotinylierten Oligonucleotids
  • Wie unten gezeigt, werden Oligonucleotide, die jeweils eine Aminosäure am 5'-Ende aufweisen, individuell synthetisch unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers, 391 A, hergestellt von Perkin Elmer, Co., erzeugt.
    Aminogruppe-GAA TTC CCG GGG ATC CGT CG
    (nachfolgend bezeichnet als Paar 1+)
    Aminogruppe-CGA CGG ATC CCC GGG AAT TTC
    (nachfolgend bezeichnet als Paar 1–)
    Aminogruppe-AAC GGA ATC TAA TCA GGA GG
    (nachfolgend bezeichnet als Paar 8+)
    Aminogruppe-CCT CCT GAT TAG ATT CCG TT
    (nachfolgend bezeichnet als Paar 8–)
  • Von diesen Oligonucleotiden wurden jeweils 300 nMol in 0,1 M MOPS-Puffer, pH 7,0, enthaltend 1 mM EDTA, gelöst, zu dem N-Hydroxysuccinimid-Biotin zugegeben wurde (30 μMol; NHS-Biotin, hergestellt von Pierce, Co.), aufgelöst in N',N'-Dimethylformamid (nachfolgend bezeichnet als DMF), zur Reaktion bei 37°C für 1 Stunde. Nach der Umsetzung wurden biotinylierte Oligonucleotide durch Ethanol-Ausfällung abgetrennt. Durch das Verfahren wurden Oligonucleotide jeweils mit einer mit fast 80 bis 90% biotinylierten Sequenz gewonnen.
  • Verfahren 2: Herstellung von Anti-HBs-Antikörper und Anti-CRP-Antikörper
  • Antikörper gegen Hepatitis-Typ B-Oberflächen-Antigen (nachfolgend bezeichnet als HBs) wurden hergestellt durch Immunisieren eines Kaninchen oder einer Maus mit HBs, erworben von Meiji Milk Products Industry K. K., in einer üblichen Art und Weise, und Herstellen eines polyklonalen Antikörpers aus dem Kaninchen oder eines monoklonalen Antikörpers durch Klonen aus der Maus. Antikörper gegen C-reaktives Protein (nachfolgend bezeichnet als CRP) wurde hergestellt durch Immunisieren eines Kaninchens oder einer Maus mit CRP, erworben von Sapporo Laboratory Test Center, in einer üblichen Art und Weise, und Herstellen eines polyklonalen Antikörpers aus dem Kaninchen oder eines monoklonalen Antikörpers durch Klonen aus der Maus. Die einzelnen Antikörper wurden in den Zustand von IgG gereinigt, das dann den nachfolgenden Experimenten unterzogen wurde.
  • Verfahren 3: Herstellung von kolloidalem Gold-markierten Anti-HBs-Antikörper und kolloidalem Gold-markierten Anti-CRP-Antikörper
  • Polyklonaler Kaninchen-Anti-HBs-Antikörper, hergestellt bei Verfahren 2, wurde mit kolloidalem Gold markiert. Noch spezieller wurde ein kolloidaler Gold-markierter polyklonaler Kaninchen-Anti-HBs-Antikörper hergestellt durch Verwendung von kolloidalem Gold eines Teilchendurchmessers von 10 nm, hergestellt von Zaimed, Co., nach dem Immun-Goldverfahren, herausgegeben von Yokota et al., Soft Science, 1992. In ähnlicher Weise wurde der monoklonale Maus-Anti-CRP-Antikörper mit kolloidalem Gold markiert.
  • Verfahren 4: Herstellung von Oligonucleotid-markiertem Antikörper (Anti-CRP-IgG-markiert mit Paar 8+, BSA-markiert mit Paar 1–, Anti-HBs-IgG-markiert mit Paar 1+)
  • Das polyklonale Kaninchen-Anti-HBs-IgG (10 mg), gewonnen in Verfahren 2, wurde in 0,2 M Natriumborat-Puffer, pH 8,5 (2,3 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von DMF (0,25 ml), mit S-Acetylmercaptosuccinsäureanhydrid (1,33 mg) darin gelöst, und die resultierende Mischung wurde einer Umsetzung für 1 Stunde bei 37°C unterzogen. Nach der Umsetzung wurden einzeln 1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 1 M Hydroxylamin, pH 7,0, mit einer Menge von jeweils 0,5 ml zur resultierenden Reaktionsmischung zur weiteren Umsetzung für 30 Minuten bei 37°C zugegeben.
  • Nachfolgend wurde die resultierende Lösung auf eine Säule mit 1 cm Durchmesser und 45 cm Länge gegeben, die zuvor mit Sephadex G-25, hergestellt von Pharmacia, Co., gefüllt, und mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, enthaltend 5 mM EDTA, equilibriert wurde, um Anti-HBs-IgG mit eingeführter Sulfhydrylgruppe zu gewinnen. Die Ausbeute von Anti-HBs-IgG mit eingeführter Sulfhydrylgruppe betrug 9,74 mg. Nach dem Verfahren von Y. Oku et al. (Microbiol. Immunol., 32, 807–816, 1988) wurde die Sulfhydrylgruppe bestimmt. Es wurde bestätigt, dass 2,84 Moleküle der Sulfhydrylgruppe pro 1 Molekül IgG eingeführt waren.
  • Alternativ wurde DMF (300 μl) mit darin gelöstem N-(ε-Maleimidcaproyloxy)succinimid (nachfolgend bezeichnet als EMCS; 10 mg) zu 0,1 M 3-Morpholinopropansulfonsäure (nachfolgend bezeichnet als MOPS)-Puffer, enthaltend 303 nMol Paar 1–, pH 7,0 (0,8 ml), zur Umsetzung für 30 Minuten bei 37°C zugegeben. Nach der Umsetzung wurde Oligonucleotid mit eingeführter Maleimidgruppe durch Ethanol-Ausfällung gereinigt. Das Oligonucleotid wurde mit einer Ausbeute von 225 nMol gewonnen. Es wurde durch Bestimmung der Maleimidgruppe bestätigt, dass 1,2 Moleküle der Maleimidgruppe in 1 Molekül des Oligonueleotids eingeführt waren.
  • Nachfolgend wurde das gewonnene Anti-HBs-IgG mit eingeführter Sulfhydrylgruppe mit dem Oligonucleotid mit eingeführter Maleimidgruppe gemischt und diese zusammen für 1 Stunde bei 37°C umgesetzt, und die resultierende Mischung wurde auf eine Säule mit 1,5 cm Durchmesser und 45 cm Länge gegeben, die zuvor mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, enthaltend 5 mM EDTA, equilibriert wurde. Die Absorption der resultierenden Fraktionen wurde bei 280 nm und 260 nm gemessen, um eine Fraktion, entsprechend dem Oligonucleotid-markierten Anti-HBs-IgG, zu sammeln, die dann durch eine Ultrafiltrationsmembran YM-30, hergestellt von Millipore, Co., konzentriert wurde.
  • Die Protein-Konzentration der gesammelten Fraktionen wurde unter Verwendung eines Protein-Assay-Kits (BCA-Protein-Assay-Kit, hergestellt von Pierce, Co.) untersucht. Es wurde angezeigt, dass die Konzentration 2,12 mg/ml war. Der Komplex wird nun abgekürzt als "Anti-HBs-IgG, markiert mit Paar 1–".
  • Durch dasselbe oben beschriebene Verfahren wurden die folgenden markierten Produkte hergestellt; mit Paar 8+ markiertes Anti-CRP-IgG, hergestellt durch Einführen des Paar 8+ in das monoklonale Maus-Anti-CRP-IgG, gewonnen in Verfahren 2; BSA, markiert mit Paar 1–, hergestellt durch Einführen des Paar 1– in Rinderserum Albumin (nachfolgend bezeichnet als BSA), und Anti-HBs-IgG, markiert mit Paar 1+, hergestellt durch Einführen des Paar 1+ in Anti-HBs-IgG.
  • Verfahren 5: Herstellung von Oligonucleotid-markiertem Anti-HBs-Fab'
  • Das polyklonale Kaninchen-Anti-HBs-IgG (12,72 mg), gewonnen in Verfahren 2, wurde in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 4,5, gelöst, zu dem zur Umsetzung für 15 Stunden bei 37°C Pepsin (0,25 mg; Boehringer-Mannheim, Co.) zugegeben wurde. Nach der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung dann auf eine Säule mit 1,5 cm Durchmesser und 45 cm Länge gegeben, die zuvor mit Ultrogel AcA44-Harz, hergestellt von IBF biotechniques Co., gefüllt und mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, equilibriert wurde. Eine Fraktion entsprechend F(ab')2 wurde gesammelt und konzentriert. Zu 4,94 mg des resultierenden F(ab')2 wurde Mercaptoethylamin auf eine Endkonzentration von 10 mM zur Umsetzung für 90 Minuten bei 37°C zugegeben. Nach der Umsetzung wurde die Mischung auf eine Säule mit 1,0 cm Durchmesser und 45 cm Länge gegeben, die zuvor mit Sephadex G-25 gefüllt, und mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, equilibriert wurde. Eine Fraktion, entsprechend dem Fab' mit freiliegender Sulfhydrylgruppe im flexiblen Bereich wurde gesammelt und dann mit YM-30 konzentriert, um Fab' mit eingeführter Sulfhydrylgruppe zu gewinnen. Fab' (3,3 mg) wurde gewonnen. Weiterhin wurde die Sulfhydrylgruppe bestimmt. Es wurde angezeigt, dass 1,12 Moleküle der Sulfhydrylgruppe pro 1 Molekül Fab' eingeführt waren.
  • Alternativ wurde das Paar 1+ Oligonucleotid (250 nMol) in 0,1 M MOPS-Puffer, pH 7,0, enthaltend 1 mM EDTA, gelöst, wozu DMF, enthaltend EMCS (7,7 mg), zur Umsetzung für 1 Stunde bei 37°C zugegeben wurde. Das Oligonucleotid mit eingeführter Maleimidgruppe wurde durch Ethanol-Ausfällung gereinigt und dann in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, enthaltend 5 mM EDTA, gelöst. Das gewonnene Oligonucleotid mit eingeführter Maleimidgruppe betrug 231 nMol, und es wurde angezeigt, dass 0,73 Moleküle Maleimidgruppe pro 1 Molekül des Oligonucleotids eingeführt waren.
  • Das resultierende Fab' mit eingeführter Sulfhydrylgruppe und das Oligonucleotid mit eingeführter Maleimidgruppe wurden zusammen gemischt und für 1 Stunde bei 37°C umgesetzt, und nach der Umsetzung wurde die Mischung auf eine Säule von 1,5 cm Durchmesser und 45 cm Länge gegeben, die zuvor mit Ultrogel ACA44 gefüllt, und mit 0,1 M Natriumphosphat-Puffer, pH 6,0, enthaltend 5 mM EDTA, equilibriert wurde. Die Absorption der resultierenden Fraktionen wurde bei 280 nm und 260 nm gemessen, um eine Fraktion, entsprechend dem Oligonucleotid-markierten HBs-Fab' zu sammeln, die dann durch eine Ultrafiltrationsmembran YM-30, hergestellt von Millipore, Co., konzentriert wurde. Die Protein-Konzentration der gesammelten Fraktion wurde unter Verwendung eines Protein-Assay-Kits (BCA-Protein-Assay-Kit, hergestellt von Pierce, Co.) untersucht. Es wurde angezeigt, dass die Konzentration 5,72 mg/ml betrug.
  • Verfahren 6: Herstellung von (Paar 1–)-gebundener Membran
  • 10 mg Avidin wurden in Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung (20 ml; PBS(–), hergestellt von Nissui Pharmceuticals, Co., Ltd.) gelöst und dann eine Membran, geschnitten in 5 × 10 cm große Stücke (SPHF-Membran, hergestellt von Millipore, Co.), 1 Stunde in die Lösung bei Raumtemperatur eingetaucht und dann mit destilliertem Wasser gespült. Nach dem Spülen wurde das Membranstück an Luft getrocknet. Unter Verwendung eines weichen Stifts (hergestellt von Platinum Fountain Pen Co.), imprägniert mit 258 mMol/ml Biotin-markiertem Paar 1–, hergestellt im Verfahren 1, wurde eine vertikale Linie zur 5 cm-Seite gezogen, um die Seite in Hälften zu teilen, um das Biotin-markierte Paar 1– an die Avidin-gebundene SPHF-Membran zu binden. Nach Trocknen an Luft wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur ein Blockieren mittels eines Blockierungsmittels (Block Ace, hergestellt von Snow Brand Milk Products, Co.) durchgeführt und daraufhin die resultierende Membran mit destilliertem Wasser gespült und an Luft getrocknet, um die (Paar 1–)-gebundene Membran herzustellen. Nachfolgend wurde die Membran in ein 0,5 cm breites und 5 cm langes Stück geschnitten, und an einem Ende des Stücks wurde ein Glasfilter (hergestellt von Whatman, Co.; nachfolgend bezeichnet als GF) mit einer Klammer befestigt und unter Trockenbedingungen gelagert.
  • Verfahren 7: Abfangen von Sandwich-Immunkomplex auf der Membran
  • Unter Verwendung einer Lösung von Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung (hergestellt von Nissui Pharmaceuticals Co.; PBS(–)) mit Zugabe von 0,1% BSA und 0,35 M Natriumchlorid (nachfolgend bezeichnet als MPBS), wurde (Paar 1+)-markiertes Anti-HBs-IgG, wie hergestellt in Verfahren 4, auf eine Endkonzentration von 1,54 μg/ml eingestellt und kolloidales Gold, hergestellt in Verfahren 3 (mit kolloidalem Gold markierter Anti-HBs-Antikörper), auf eine Absorption von 0,5 bei 520 nm eingestellt. HBs-Antigen wurde dann zu den resultierenden einzelnen markierten Produkten auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml, 50 ng/ml oder 0 ng/ml zugegeben, und 100 μl von jeder der Lösungen wurde in Teströhrchen aufgeteilt. Die in Verfahren 6 hergestellte (Paar 1–)-gebundene Membran wurde rasch in das Teströhrchen gegeben, wobei man den GF nach oben hielt, um die Reaktivität zu untersuchen. Die Reaktivität wurde bei HBs-Endkonzentrationen von 100 ng/ml und 50 ng/ml überprüft. Keine Reaktivität wurde bei der Kontrolllösung, enthaltend kein HBs darin (0 ng/ml), gefunden. Die Ergebnisse zeigen an, dass ein Sandwich-Immunkomplex aus (Paar 1+)-markiertem Anti-HBs-IgG, dem HBs-Antigen und mit kolloidalem Gold markiertem Anti-HBs-Antikörper gebildet wurde, worin das Paar 1+ im Sandwich-Immunkomplex und das Paar 1– in der (Paar 1–)-gebundenen Membran in komplementärer Art und Weise miteinander gebunden waren, wodurch der Sandwich-Immunkomplex auf der Membran abgefangen wurde.
  • Beispiel 2
  • Verfahren 1: Herstellung von (Paar 1+)-markiertem Avidin und (Paar 1–)-markiertem Avidin
  • Das Biotin-markierte Paar 1+ (112 nMol), hergestellt im Verfahren 1 in Beispiel 1, wurde mit Avidin (1,52 mg) in MPBS (0,7 ml) 3 Stunden bei 37°C umgesetzt und daraufhin die Mischung zu Ultrogel AcA44-Harz, hergestellt von IBF biotechniques, zugeführt, das zuvor mit PBS equilibriert wurde, um Paar 1+-markiertes Avidin zu gewinnen. Durch dasselbe Verfahren wurde zusätzlich Paar 1+-markiertes Avidin gewonnen.
  • Verfahren 2: Herstellung von Oligonucleotid-Avidin-Matrix-gebundener Membran
  • Avidin (10 mg) wurde in Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung (hergestellt von Nissui Pharmceuticals, Co., Ltd., PBS(–)) gelöst und dann eine Membran, geschnitten in 5 × 10 cm große Stücke (SPHF-Membran, hergestellt von Millipore, Co.), 1 Stunde in die Lösung bei Raumtemperatur eingetaucht und dann mit destilliertem Wasser gespült. Nach dem Spülen wurde das Membranstück an Luft getrocknet. Unter Verwendung eines weichen Stifts (hergestellt von Platinum Fountain Pen Co.), imprägniert mit 258 mMol/ml Biotin-markiertem Paar 1–, hergestellt im Verfahren 1, wurde eine vertikale Linie zur 5 cm-Seite gezogen, um die Seite in Hälften zu teilen, um das Biotin-markierte Paar 1– an die Avidin-gebundene SPHF-Membran zu binden. Nach Trocknen an Luft wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur ein Blockieren mittels eines Blockierungsmittels (Block Ace, hergestellt von Snow Brand Milk Products, Co.) durchgeführt und daraufhin die resultierende Membran mit destilliertem Wasser gespült und an Luft getrocknet, um die (Paar 1–)-gebundene SPHF-Membran herzustellen. Die (Paar 1–)-gebundene SPHF-Membran reagierte in MPBS, enthaltend Paar 1+ – markiertes Avidin (1 μg/ml) und Paar-1– -markiertes Avidin (2 μg/ml), für 1 Stunde bei Raumtemperatur, um eine Oligonucleotid-Avidin-Matrix-gebundene Membran herzustellen. Die Membran wurde mit destilliertem Wasser gespült und an Luft getrocknet. Nachfolgend wurde die Membran in ein 0,5 cm breites und 5 cm langes Stück geschnitten, und an einem Ende des Stücks wurde ein GF mit einer Klammer befestigt und unter Trockenbedingungen gelagert.
  • Verfahren 3: Abfangen von Sandwich-Immunkomplex auf der Membran
  • Unter Verwendung von MPBS wurde (Paar 1+)-markiertes Anti-HBs-IgG, wie in Verfahren 4 in Beispiel 1 hergestellt, auf eine Endkonzentration von 1,54 μg/ml eingestellt und mit kolloidalem Gold markiertem Anti-HBs-Antikörper, wie in Verfahren 3 in Beispiel 1 hergestellt, auf eine Absorption von 0,5 bei 520 nm eingestellt. HBs-Antigen wurde dann zu den resultierenden einzelnen markierten Produkten auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml, 80 ng/ml, 60 ng/ml, 40 ng/ml, 20 ng/ml, 0 ng/ml zugegeben und 100 μl von jeder der Lösungen in Teströhrchen aufgeteilt. Die in Verfahren 2 in Beispiel 2 hergestellte Oligonucleotid-Avidin-Matrix-gebundene Membran wurde rasch in die Teströhrchen gegeben, während man den GF nach oben hielt, um die Reaktivität zu untersuchen. Folglich wurde die Reaktivität bei den HBs-Endkonzentrationen von 100 ng/ml, 80 ng/ml und 60 ng/ml bestimmt. Keine Reaktivität wurde bei Konzentrationen unter 40 ng/ml gefunden.
  • Beispiel 3
  • Verfahren 1: Herstellung von (Paar 1–)-gebundener SPHF-Membran
  • Unter Verwendung eines weichen Stifts (hergestellt von Platinum Fountain Pen Co.), imprägniert mit 2 mg/ml (Paar 1–)-markierter BSA, wie in Beispiel 1, Verfahren 4, hergestellt, wurde eine vertikale Linie zu der 5 cm-Seite einer Membran, die in eine Größe von 5 × 10 cm (SPHF-Membran; hergestellt von Millipore, Co.) geschnitten war, gezogen, um die Seite in Hälften aufzuteilen, um das BSA durch physikalische Adsorption an die Membran zu binden. Nach Trocknen an Luft wurde ein Blockieren mittels eines Blockierungsmittels (Block Ace; hergestellt von Snow Brand Milk Products, Co.) für 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt und nachfolgend die resultierende Membran mit destilliertem Wasser gespült und an Luft getrocknet, um (Paar 1–)-gebundene SPHF-Membran herzustellen. Nach Trocknen der Membran an Luft wurde die Membran in ein 0,5 cm breites und 5 cm langes Stück geschnitten, an einem Ende des Stücks wurde ein GF mit einer Klammer fixiert und unter Trockenbedingungen gelagert.
  • Verfahren 2: Abfangen von einem Sandwich-Immunkomplex auf der Membran
  • Unter Verwendung von MPBS wurde (Paar 1+)-markiertes Anti-HBs-IgG, wie hergestellt in Verfahren 4 in Beispiel 1, auf eine Endkonzentration von 1,54 μg/ml eingestellt und mit kolloidalem Gold markierter Anti-HBs-Antikörper, wie hergestellt in Verfahren 3 in Beispiel 1, auf eine Absorption von 0,5 bei 520 nm eingestellt. HBs-Antigen wurde dann zu den resultierenden einzelnen markierten Produkten auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml oder 0 ng/ml eingestellt, und 100 μl von jeder der Lösungen wurde auf Teströhrchen verteilt. Im Verfahren 1 in Beispiel 3 hergestellte (Paar 1–)-gebundene SPHF-Membran wurde rasch in die Teströhrchen gegeben, während man den GF nach oben hielt, um die Reaktivität zu untersuchen. Folglich wurde die Reaktivität bei den HBs-Endkonzentrationen von 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 10 ng/ml und 5 ng/ml bestimmt. Keine Reaktivität wurde bei Konzentrationen von 0 ng/ml gefunden.
  • Beispiel 4
  • Verfahren 1: Herstellung von [(Paar 1–) + (Anti-HBs-IgG)]-gebundender SPHF-Membran
  • Unter Verwendung eines weichen Stifts (hergestellt von Platinum Fountain Pen Co.), imprägniert mit 0,5 mg/ml (Paar 1–)-markiertem Anti-HBs-IgG, wie in Beispiel 1, Verfahren 4, hergestellt, wurde eine vertikale Linie zur 5 cm-Seite einer Membran, die in eine Größe von 5 × 10 cm (SPHF-Membran; hergestellt von Millipore, Co.) geschnitten war, gezogen, um die Seite in Hälften aufzuteilen, um das (Paar 1–)-markierte Anti-HBs-IgG durch physikalische Adsorption an die Membran zu binden. Nach Trocknen an Luft wurde ein Blockieren mittels eines Blockierungsmittels (Block Ace; hergestellt von Snow Brand Milk Products, Co.) für 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt und nachfolgend die resultierende Membran mit destilliertem Wasser gespült und an Luft getrocknet, um [(Paar 1–) + (Anti-HBs-IgG)]-gebundene SPHF-Membran herzustellen. Nach Trocknen der Membran an Luft wurde die Membran in ein 0,5 cm breites und 5 cm langes Stück geschniten und an einem Ende des Stücks wurde ein GF mit einer Klammer fixiert und unter Trockenbedingungen gelagert.
  • Verfahren 2: Abfangen eines Sandwich-Immunkomplex auf der Membran
  • Unter Verwendung von MPBS wurde (Paar 1+)-markiertes Anti-HBs-Fab', wie hergestellt in Verfahren 5 in Beispiel 1, auf eine Endkonzentration von 1,54 μg/ml eingestellt, und das kolloidale Gold, wie hergestellt in Verfahren 3 in Beispiel 1, auf eine Absorption von 0,5 bei 520 nm eingestellt. HBs-Antigen wurde dann zu den resultierenden einzelnen Produkten auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 2,5 ng/ml oder 0 ng/ml eingestellt, und 100 μl von jeder der Lösungen wurde auf Teströhrchen verteilt. Die [(Paar 1–) + (Anti-HBs-IgG)]-gebundene SPHF-Membran, hergestellt in Beispiel 4, wurde schnell in die Teströhrchen gegeben, während man den GF nach oben hielt, um die Reaktivität zu untersuchen. Folglich wurde die Reaktivität bei den HBs-Endkonzentrationen von 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml und 2,5 ng/ml bestimmt. Keine Reaktivität wurde bei Konzentrationen von 0 ng/ml gefunden.
  • Beispiel 5
  • Aufbau der Assay-Vorrichtung
  • 13 zeigt eine Assay-Vorrichtung in Streifenform, wie in Beispiel 5 verwendet. Im Streifen von 13 bedeutet 109 einen Tageslicht-Projektorfilm, hergestellt von Highland, Co., zur Verwendung als Verstärkungsträgerfilm in der Assay-Vorrichtung in Beispiel 5. Ein SPHF-Membran-Streifen 102 klebt über die gesamte Fläche des doppelseitigen Bandes 107 (hergestellt von Nichiban, Co.), außer beiden Enden des doppelseitigen Bands 107, um den Film lose zu unterstützen und ein Entwicklungselement aufzubauen. Die SPHF-Membran 102 wird mit dem gleichen Verfahren wie dem Verfahren 6 des Beispiels 1 hergestellt, worin Paar 1– an eine Zwischenposition der Detektionszone 106 gebunden wird.
  • An einem Ende des Entwicklungselements ist die Beladungszone 101 angeordnet, umfassend einen Filter, zuvor mit einem Blockierungsmittel (Block Ace; hergestellt von Snow Brand Milk Products, Co.) zum Blockieren bearbeitet, und zusätzlich ist eine die Reagenzkomponenten einschließende Einschlusszone 105 zwischen der Beladungszone 101 und dem Entwicklungselement und in engem Kontakt mit der Zone und dem Element angeordnet, so dass eine aufgegebene Flüssigkeitsprobe hiervon transferiert werden kann. Die Einschlusszone 105 ist aus einer Glaspapierlage hergestellt (hergestellt von Millipore, Co.), zuvor mit einem Blockierungsmittel (Block Ace; hergestellt von Snow Brand Milk Products, Co.) bearbeitet zum Blockieren, sowie der Einschlusszone 105, die darin mit kolloidalem Gold markiertes Kaninchen-Anti-HBs-IgG 103 (0,15 μg) und (Paar 1+)-markiertes Anti-HBs-IgG 104 in vorgegebener Menge versiegelt. Das mit kolloidalem Gold markierte Kaninchen-Anti-HBs-IgG 103 wird im Verfahren 3 in Beispiel 1 hergestellt, und das (Paar 1+)-markierte Anti-HBs-IgG 104 wird im Verfahren 4 in Beispiel 1 hergestellt. Am anderen Ende des Entwicklungselements wird die den GF umfassende Absorptionszone 108 angeordnet. Der derart hergestellte Streifen zum Nachweis von HBs-Antigen hat eine Breite von 5 mm und eine Länge von 60 mm und wird unter trockenen Bedingungen gelagert.
  • Analysebeispiel
  • Zur Beladungszone 101 der Assay-Vorrichtung zum Nachweis von HBs-Antigen, wie aufgebaut im Verfahren des vorliegenden Beispiels 5, wurde MPBS (100 μl), eingestellt auf 100 ng/ml HBs-Antigen, zugegeben, während zur Beladungszone 101 einer anderen derartigen Assay-Vorrichtung zum Nachweis von HBs-Antigen MPBS (100 μl), das keines enthielt, zugegeben wurde. 30 Minuten später wurde die Reaktivität bei den einzelnen Assay-Vorrichtungen beurteilt. Eine Färbung von kolloidalem Gold wurde in der Nachweiszone des Streifens bei Zugabe von 100 ng/ml HBs-Antigen beobachtet, aber keine Färbung wurde bei dem Streifen mit einfacher Zugabe von MPBS beobachtet.
  • Beispiel 6
  • Aufbau der Assay-Vorrichtung
  • Eine Nylon-Membran (Biodyne C; hergestellt von Pall, Co.) wurde in ein 5 × 10 cm großes Stück geschnitten, das dann 15 Minuten in eine EDC-Lösung eingetaucht, mit destilliertem Wasser gespült und an Luft getrocknet wurde, um ein aktiviertes Biodyne C herzustellen. Auf dem aktivierten Biodyne C wurde eine vertikale Linie zur 5 cm-Seite gezogen, um die Seiten in Hälften aufzuteilen, wobei ein weicher Stift (hergestellt von Platinum Fountain Pen, Co.), imprägniert mit 20 μg/ml des Paar 1– mit eingeführter Aminogruppe, hergestellt im Verfahren 1 des Beispiels 1, verwendet wurde, um das Paar 1– an das Biodyne C zu binden. Das Biodyne C wurde mit destilliertem Wasser gespült und mit einem Blockierungsmittel (Block Ace; hergestellt von Snow Brand Milk Products, Co.) blockiert, gefolgt von einem weiteren Spülen und Trocknen an Luft. Nach dem Trocknen an Luft wurde das Biodyne C mit einem Papierschneider in ein 0,5 cm breites und 5 cm langes Stück geschnitten, und ein GF an einem Ende befestigt. Dann wurde das resultierende Biodyne C bei trockenen Bedingungen gelagert.
  • Für die derart aufgebaute Assay-Vorrichtung zum Nachweis von HBs-Antigen wurde das in Verfahren 4 des Beispiels 1 hergestellte (Paar 1+)-markierte Anti-HBs-IgG auf eine Endkonzentration von 1,54 μg/ml eingestellt und in Verfahren 3 des Beispiels 1, hergestelltes kolloidales Gold auf eine Absorption von 0,5 bei 520 nm unter Verwendung von MPBS eingestellt.
  • Analysebeispiel
  • Zur Beladungszone der Assay-Vorrichtung zum Nachweis von HBs-Antigen, wie aufgebaut im Verfahren des vorliegenden Beispiels 6, wurde HBs-Antigen auf eine Endkonzentration von 20 μg/ml oder 0 ng/ml zugegeben. 100 μl hiervon wurden in ein Teströhrchen verteilt. Das im Verfahren des Beispiels 6 hergestellte (Paar 1–)-gebundene Biodyne C wurde rasch zugegeben, während man den GF nach oben hielt, um die Reaktivität zu untersuchen. Folglich wurde die Reaktivität bei der HBs-Endkonzentration von 20 μg/ml bestätigt. Keine Reaktivität wurde bei einer Null-Konzentration gefunden.
  • Beispiel 7
  • Aufbau der Assay-Vorrichtung
  • Eine SPHF-Membran, geschnitten in ein 5 × 10 cm großes Stück, wurde in Phosphat-gepufferte physiologische Salzlösung getaucht (20 ml; PBS(–); hergestellt von Nissui Pharmaceuticals, Co.), worin Avidin (10 mg) gelöst wurde, und die Membran wurde dann mit destilliertem Wasser gespült. Auf der gespülten und an Luft getrockneten Membran wurde eine Linie an einer Position 2 cm entfernt von einem Ende und vertikal zur 5 cm-Seite unter Verwendung eines weichen Stifts (hergestellt von Platinum Fountain Pen, Co.), imprägniert mit Biotin-markiertem Paar 1– mit einer Konzentration von 258 nMol/l, wie hergestellt im Verfahren 1 des Beispiels 1, gezogen, um das Biotin-markierte Paar 1– an die Avidingebundene SPHF-Membran zu binden. In ähnlicher Weise wurde eine Linie vertikal zu einer Position 2 cm entfernt vom anderen Ende unter Verwendung eines weichen Stifts (hergestellt von Platinum Fountain Pen, Co.), imprägniert mit dem Biotin-markierten Paar 8–, gezogen, um das Biotin-markierte Paar 8– an die Avidin-gebundene SPHF-Membran zu binden. Nach Trocknen der durch Biotin-Avidin-Bindung an Luft erzeugten (Paar 8–)-immobilisierten SPHF-Membran, wurde die Membran durch Behandlung mit einem Blockierungsmittel (Block Ace; hergestellt von Snow Brand Milk Products, Co.) 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und dann mit destilliertem Wasser gespült und daraufhin an Luft getrocknet. Nach dem Trocknen an Luft wurde die Membran in ein 0,5 cm breites und 5 cm langes Stück geschnitten, und dann wurde ein GF, hergestellt von Whatman, Co., an einem Ende mit einer Klammer fixiert. Die resultierende Membran wurde unter trockenen Bedingungen zur Verwendung in der Assay-Vorrichtung in Beispiel 7 gelagert.
  • Analysebeispiel
  • Unter Verwendung von MPBS, hergestellt durch Zugabe von 0,1% BSA und 0,35 M Natriumchlorid in Phosphat-gepufferter physiologischer Salzlösung (PBS(–); hergestellt von Nissui Pharmaceuticals, Co.), wurde eine Testlösung, so hergestellt, dass das (Paar 1+)-markierte Anti-HBs-IgG und das (Paar 8+)-markierte Anti-CRP-IgG, wie hergestellt in Verfahren 4 des Beispiels 1, jeweils bei einer Endkonzentration von 1,54 μg/ml vorlagen und mit kolloidalem Gold markiertes Anti-HBs-IgG und mit kolloidalem Gold markiertes Anti-CRP-IgG, hergestellt im Verfahren 3 des Beispiels 1, eine Absorption von 0,5 bei 520 nm zeigten.
  • Vier verschiedene Proben wurden durch Zugabe von HBs-Antigen und CRP-Antigen, jeweils auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml in die Testlösung zugegeben, wobei nur HBs-Antigen auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml in die Lösung gegeben wurde, und nur CRP-Antigen auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml zugegeben, und keines der Antigene zur Testlösung gegeben wurde. 100 μl von jedem wurden in einzelne Teströhrchen aufgeteilt. Die Testvorrichtung, umfassend die im Verfahren des Beispiels 7 hergestellte (Paar 8–)-immobilisierte SPHF-Membran wurde rasch in die Teströhrchen gegeben, während man den GF nach oben hielt, um die Reaktivität zu bestimmen.
  • Folglich waren die Proben, beide enthaltend die Antigene, an den Bindungsregionen von Paar 1– und Paar 8+ gefärbt. Die nur das HBs-Antigen enthaltende Probe war nur an der Bindungsregion von Paar 1– gefärbt. Die Probe, nur enthaltend das CRP-Antigen, war nur an der Bindungsregion von Paar 8+ gefärbt. Zusätzlich war die keines der Antigene enthaltende Probe an keiner der Bindungsregionen von Paar 1– und Paar 8+ gefärbt.
  • Beispiel 8
  • Aufbau der Assay-Vorrichtung
  • 14 bis 16 zeigen die im vorliegenden Beispiel 8 verwendete Assay-Vorrichtung; 14 zeigt die Querschnittsansicht entlang der Längsrichtung der Assay-Vorrichtung. 15 zeigt die Seitenansicht und 16 zeigt die obere Flächenansicht. In 14 bis 16 bedeutet 201 ein Kunststoffgehäuse, zusammengesetzt aus einem oberen Gehäuse 202 und einem unteren Gehäuse 203. Die in Beispiel 5 aufgebaute Streifen-Assay-Vorrichtung wurde im unteren Gehäuse 203 eingerichtet, über das das obere Gehäuse 202 einstückig aufgebracht wurde.
  • Die Proben-Beladungsöffnung 204 und das Detektionsfenster 205 sind an den Positionen des oberen Gehäuses 202, entsprechend der Beladungszone und der Detektionszone der Streifen-Assay-Vorrichtung, offen. Durch Anordnen der in Beispiel 5 aufgebauten Streifen-Assay-Vorrichtung im Gehäuse 201 wird die HBs-Antigen-Nachweis-Assay-Vorrichtung des Beispiels 8 aufgebaut. Die Vorrichtung wurde unter trockenen Bedingungen gelagert.
  • Analysebeispiel
  • Durch die Probe-Beladungsöffnung 204 der im Verfahren des Beispiels 8 aufgebauten HBs-Antigen-Nachweis-Assay-Vorrichtung wurde MPBS (100 μl), eingestellt auf 100 ng/ml HBs-Antigen, zugegeben, während MPBS (100 μl), das keines enthielt, zu einer weiteren derartigen zusätzlich hergestellten HBs-Antigen-Nachweis-Assay-Vorrichtung zugegeben wurde, und 30 Minuten später wurde die Reaktivität in der Detektionszone 106, gebunden mit Paar 1–, durch das Detektionsfenster 205 einzeln beobachtet. Das Färben von kolloidalem Gold wurde in der Assay-Vorrichtung unter Zugabe von 100 ng/ml HBs-Antigen beobachtet, aber kein Einfärben wurde in der Assay-Vorrichtung bei Zugabe von nur MPBS beobachtet.
  • Vergleichsbeispiel 1
  • Das vorliegende Vergleichsbeispiel 1 ist zum Vergleich der Nachweisempfindlichkeit des herkömmlichen Verfahrens, worin Antikörper als Bindungselemente auf der Detektionszone immobilisiert werden, mit der Nachweisempfindlichkeit der vorliegenden Erfindung.
  • Aufbau der Assay-Vorrichtung
  • Unter Verwendung eines weichen Stifts (hergestellt von Platinum Fountain Pen Co.), imprägniert mit 2,0 mg/ml Kaninchen-Anti-HBs-IgG, wurde eine Linie vertikal zur 5 cm-Seite einer in 5 × 10 cm große Stücke geschnittenen Membran (SPHF-Membran; hergestellt von Millipore, Co.) gezogen, um die Seite in Hälften aufzuteilen, um die Kaninchen-Anti-HBs-IgG durch physikalische Adsorption an die SPHF-Membran zu binden. Nach Trocknen an Luft wurde die Membran mit einem Blockierungsmittel (Block Ace, hergestellt von Snow Brand Milk Products, Co.) 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und daraufhin die resultierende Membran in destilliertem Wasser gespült, um die Kaninchen-Anti-HBs-IgG-gebundene SPHF-Membran zu gewinnen. Nach Trocknen an Luft wurde die Membran in ein 5 cm breites und 5 cm langes Stück geschnitten und an einem Ende des Stücks ein GF mit einer Klammer befestigt, um unter trockenen Bedingungen gelagert zu werden. Das resultierende Stück wurde definiert als die Assay-Vorrichtung des Vergleichsbeispiels 1. Wenn eine Kaninchen-Anti-HBs-IgG bei einer Konzentration über 2,0 mg/ml vorlag, wurde die nicht-spezifische Reaktion verstärkt. Daher wurde Kaninchen-Anti-HBs-IgG bei 2,0 mg/ml verwendet.
  • Analysebeispiel
  • Die Nachweisempfindlichkeit des herkömmlichen Verfahrens wurde bei den folgenden Versuchen beurteilt. Noch spezieller wurde eine Testlösung so hergestellt, dass im Verfahren 3 des Beispiels 1 hergestelltes kolloidales Gold eine Absorption von 0,5 bei 520 nm hatte. Zur resultierenden Lösung wurde HBs-Antigen auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 2,5 ng/ml oder 0 ng/ml zugegeben.
  • 100 μl der resultierenden jeweiligen Reagenz-Antigen-Mischung wurden in Teströhrchen verteilt. Die Assay-Vorrichtung des Vergleichsbeispiels 1, umfassend die Anti-HBs-IgG-gebundene SPHF-Membran, hergestellt im Verfahren des Vergleichsbeispiels 1, wurde rasch in die Teströhrchen gegeben, wozu die Mischungslösung der Antigenlösung und des Reagenz, wie hergestellt im Verfahren des Vergleichsbeispiels 1, zugegeben wurden, während man den GF nach oben hielt. Die Reaktivität wurde dann beurteilt. Folglich wurde die Reaktivität bei den End-HBs-Konzentrationen von 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml und 10 ng/ml bestätigt, aber keine Reaktivität wurde bei einer Konzentration von unterhalb 10 ng/ml gefunden.
  • Die Nachweisempfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde alternativ mit den nachfolgenden Versuchen beurteilt. Noch spezieller wurde eine Testlösung, hergestellt unter Verwendung von MPBS, so dass das (Paar 1+)-markierte Anti-HBs-Fab' bei einer Konzentration von 1,54 μg/ml vorlag, und in Verfahren 3 des Beispiels 1 hergestelltes kolloidales Gold bei einer Absorption von 0,5 bei 520 nm war. Zur resultierenden Lösung wurde HBs-Antigen auf eine Endkonzentration von 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 2,5 ng/ml oder 0 ng/ml zugegeben.
  • 100 μl der jeweils resultierenden Reagenz-Antigen-Mischung wurden in Teströhrchen verteilt. Die in Beispiel 4 hergestellte [(Paar 1–) + (Anti-HBs-IgG)]-gebundene SPHF-Membran wurde rasch in die Teströhrchen gegeben, während man den GF nach oben hielt. Die Reaktivität wurde dann beurteilt. Folglich wurde die Reaktivität bei den HBs-Endkonzentrationen von 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml und 2,5 ng/ml bestätigt, aber keine Reaktivität wurde bei einer Konzentration unter 10 ng/ml gefunden.
  • Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigen an, dass die Assay-Vorrichtung, umfassend Nucleinsäuren als das erfindungsgemäße Bindungselement und Anti-Bindungselement, eine 4-fach höhere Nachweisempfindlichkeit aufweist als die herkömmlichen immunchemisch aktiven Substanzen als Bindungselement und Anti-Bindungselement.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die komplementäre Bindung zwischen Nucleinsäuren als einem immobilisierten Anti-Bindungselement und Nucleinsäuren als einem Bindungselement, enthalten in einem erzeugenten Komplex, eine hochstabile Reaktion mit einem hohen Basen-Übereinstimmungsverhältnis, und kann noch stärker gefördert werden als die Immunreaktion, so dass biologische Substanz-Komplexe mit hoher Affinität effektiv an die Festphase gebunden werden können. Zum Immobilisieren von Nucleinsäuren als den Anti-Bindungselementen durch hochmolekulare Substanzen, wie Proteine, können Nucleinsäuren kleinerer Moleküle als denjenigen von Protein an die viel größere Anzahl an Protein- und Nucleinsäuremoleküle (Anti-Bindungselemente) gebunden werden, als die Zahl an Proteinmolekülen, die gebunden werden können. Daher können eine größere Anzahl von biologischen Substanz-Komplexen mit hoher Affinität, einschließlich Analyten, abgefangen werden, die eine hohe Empfindlichkeit gegenüber der herkömmlichen Immunchromatographie verwirklichen.
  • Erfindungsgemäß wird ein durch die Reaktion eines Analyten mit einem markermarkierten ersten Liganden und einem Nucleinsäure-markierten Liganden erzeugter Komplex durch Chromatographie transferiert und in der Detektionszone abgefangen, um die Menge hiervon zu untersuchen und dessen Gegenwart nachzuweisen, worin ein oder mehr Spezies von Analyten mit einer fast unbegrenzten Anzahl von Analyten untersucht oder nachgewiesen werden können durch Bilden von einzelnen Zonen, entsprechend einzelnen Spezies von Analyten, weil die Analyten durch die komplementäre Bindung zwischen den immobilisierten Nucleinsäuren und den im erzeugten Komplex enthaltenen Nucleinsäuren abgefangen werden können.
  • Entsprechend dem einfachen klinischen Laborverfahren der vorliegenden Erfindung kann die Nachweisempfindlichkeit von zu untersuchenden und nachzuweisenden Analyten in einfacher Art und Weise kontrolliert werden, indem das Übereinstimmungsverhältnis der komplementären Basen zwischen den einzelnen Nucleinsäuren in der komplementären Bindung der immobilisierten Nucleinsäuren und der den erzeugten Komplex enthaltenden Nucleinsäuren modifiziert wird. Dieses Merkmal ist insbesondere vorteilhaft zum gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl von Elementen, die erfordern, dass sich die normalen Bereiche und anormalen Bereich von einzelnen Elementen voneinander unterscheiden, was im wesentlichen die Modifikation der Konzentrationen und Mengen der Antikörper erfordert.

Claims (29)

  1. Assay-Verfahren zum Untersuchen der Mengen von zwei oder mehr Spezies von Analyten, die in einer Flüssigkeitsprobe vorliegen, oder Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens hiervon, umfassend: (1) in Kontakt bringen (1.1) einer Flüssigkeitsprobe mit (1.2) einem Reagenz, enthaltend (1.2.1) zwei oder mehr Spezies von markermarkierten Liganden, jeweils erhältlich durch Binden eines Markers an einen ersten Liganden, und (1.2.2) zwei oder mehr Spezies von Bindungselement-markierten Liganden, jeweils erhältlich durch Binden eines Bindungselements, bestehend aus Nucleinsäuren mit einer vorbestimmten Basensequenz, abhängig von der Analyt-Spezies, an einen zweiten Liganden, um spezifische Komplexe zu erzeugen, jeweils zusammengesetzt aus: (i) einer spezifischen Analyt-Spezies, (ii) einer spezifisch markermarkierten Ligand-Spezies, spezifisch bindend an die spezifische Analyt-Spezies und (iii) eine spezifische Bindungselement-markierte Ligand-Spezies, spezifisch bindend an die spezifische Analyt-Spezies; (2) Entwickeln der Spezies von erzeugten Komplexen durch ein Kapillarphänomen in einem Entwicklungselement in Lagenform; (3) Abfangen eines Komplexes, abhängig von der Analyt-Spezies, durch die komplementäre Bindung zwischen dem Bindungselement und einem Anti-Bindungselement in einer Detektionszone, erzeugt durch unabhängiges Immobilisieren von Anti-Bindungselementen, bestehend aus Nucleinsäuren, jeweils mit einer komplementären Sequenz zur Basensequenz einer Bindungselement-Spezies in den Komplexen, und hierdurch Bilden eines unabhängigen Bands und (4) Untersuchen oder Nachweisen des im Band in der Detektionszone gebildeten Markers.
  2. Assay-Verfahren zum Untersuchen der Mengen von zwei oder mehr Spezies von Analyten, die in einer Flüssigkeitsprobe vorliegen, oder Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens hiervon, umfassend: (A) Zugeben einer Flüssigkeitsprobe auf ein Entwicklungselement in Lagenform, wodurch die Flüssigkeitsprobe durch ein Kapillarphänomen im Entwicklungselement entwickelt wird; (B) Transferieren der Flüssigkeitsprobe, um die Probe mit einer Einschlusszone, die darin Reagenzkomponenten versiegelt, in Kontakt zu bringen, einschließlich (B1) zwei oder mehr Spezies von markermarkierten Liganden, jeweils erhältlich durch Binden eines Markers an einen ersten Liganden, spezifisch reaktiv für eine spezifische Analyt-Spezies, und (B2) zwei oder mehr Spezies von Bindungselement-markierten Liganden, jeweils erhältlich durch Binden eines Bindungselements, bestehend aus Nucleinsäuren mit einer vorbestimmten Basensequenz, abhängig von der Analyt-Spezies, an einen zweiten Liganden, spezifisch reaktiv für die spezifische Analyt-Spezies; (C) Entwickeln von Komplexen, jeweils zusammengesetzt aus (C1) einer spezifischen Analyt-Spezies, (C2) einer spezifischen markermarkierten Ligand-Spezies, spezifisch bindend an die spezifische Analyt-Spezies, und (C3) eine spezifische Bindungselement-markierte Ligand-Spezies, spezifisch bindend an die spezifische Analyt-Spezies, oder Entwickeln eines Reaktionsprodukts auf dem Bildungsweg oder nicht-umgesetzter Reagenzkomponenten durch ein Kapillarphänomen im Entwicklungselement; (D) Abfangen eines Komplexes, abhängig von der Analyt-Spezies, durch komplementäres Binden zwischen dem Bindungselement und einem Anti-Bindungselement und Bilden eines unabhängigen Bands hiervon in einer Detektionszone, wo jede Anti-Bindungselement-Spezies mit der komplementären Basensequenz zur Sequenz einer Bindungselement-Spezies im Komplex immobilisiert wird, und (E) Untersuchen oder Nachweisen des Markers, enthalten im Band, das in der Detektionszone gebildet wird.
  3. Assay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Nachweisempfindlichkeit zum Nachweis von Analyten eingestellt wird, indem das komplementäre Basen-Übereinstimmungsverhältnis von Nucleinsäuren, zusammengesetzt durch Bindungselemente und Anti-Bindungselemente, kontrolliert wird.
  4. Assay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der erste Ligand und der zweite Ligand immunchemisch aktive Substanzen darstellen.
  5. Assay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der erste Ligand und der zweite Ligand dieselbe Reaktivität zu der spezifischen Analyt-Spezies aufweisen.
  6. Assay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der erste Ligand und der zweite Ligand eine unterschiedliche Reaktivität für die spezifische Analyt-Spezies aufweisen.
  7. Assay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der erste Ligand und der zweite Ligand Nucleinsäuren darstellen, der erste Ligand eine Basensequenz aufweist, die in der Lage ist, an die Analyt-Nucleinsäure in einer komplementären Art und Weise zu binden, und der zweite Ligand eine Basensequenz aufweist, die in der Lage ist, an die Analyt-Nucleinsäure in einer komplementären Art und Weise zu binden.
  8. Assay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Immobilisierungsmittel eines auf dem Entwicklungselement immobilisierten Anti-Bindungselements eine kovalente Bindung hiervon darstellt, durch eine an das 5'-Ende oder 3'-Ende des Anti-Bindungselements oder in eine Base der das Anti-Bindungselement aufbauenden Nucleinsäure eingeführte funktionelle Gruppe, an eine funktionelle Gruppe eines unlöslichen Trägers als dem Entwicklungselement.
  9. Assay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Immobilisierungsmittel eines auf dem Entwicklungselement immobilisierten Anti-Bindungselements eine Bindung hiervon darstellt, durch das in das 5'-Ende oder 3'-Ende des Anti-Bindungselements eingeführte Biotin, oder das in eine Base der das Anti-Bindungselement aufbauenden Nucleinsäure eingeführte Biotin, an Avidin oder Streptavidin, das zuvor in einen unlöslichen Träger als dem Entwicklungselement eingeführt wird.
  10. Assay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Immobilisierungsmittel eines auf dem Entwicklungselement immobilisierten Anti-Bindungselements eine kovalente Bindung hiervon darstellt, durch eine funktionelle Gruppe, eingeführt am 5'-Ende oder 3'-Ende des Anti-Bindungselements, oder eingeführt in eine Base der das Anti-Bindungselement aufbauenden Nucleinsäure, an ein Protein, gefolgt von Binden des erhaltenen Nucleinsäure-gebundenen Proteins an einen unlöslichen Träger als dem Entwicklungselement.
  11. Assay-Verfahren nach Anspruch 10, worin das Nucleinsäure-gebundene Protein hergestellt wird durch Binden einer Nucleinsäure an Rinderserum Albumin.
  12. Assay-Verfahren nach Anspruch 10, worin das Nucleinsäure-gebundene Protein hergestellt wird durch Binden einer Nucleinsäure an Immunglobulin.
  13. Assay-Verfahren nach Anspruch 10 bis 12, worin das Protein eine immunchemische Aktivität für einen Analyten aufweist.
  14. Assay-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Marker ausgewählt ist aus Metallkolloid, gefärbtem Latex und gefärbtem Liposom.
  15. Assay-Kit zum Untersuchen von zwei oder mehr Spezies von Analyten in einer Probe oder Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens hiervon in einer Probe, wobei das Assay-Kit umfasst: (I) ein Reagenz, umfassend (Ia) zwei oder mehr Spezies von markermarkierten Liganden, jeweils erhältlich durch Binden eines Markers an einen ersten Ligand, spezifisch reaktiv für eine spezifische Analyt-Spezies, und (Ib) zwei oder mehr Spezies von Bindungselement-markierten Liganden, jeweils erhältlich durch Binden eines Bindungselements, bestehend aus Nucleinsäure mit einer vorbestimmten Basensequenz, abhängig von der spezifischen Analyt-Spezies, an einen zweiten Liganden, spezifisch reaktiv für die spezifische Analyt-Spezies, und (II) eine Assay-Vorrichtung eines getrennten Typs vom Reagenz, worin die Assay-Vorrichtung umfasst: (IIa) ein Entwicklungselement in Lagenform, worin das Entwicklungselement Analyten, Reagenz und an das Reagenz gebundene Analyten durch ein Kapillarphänomen entwickeln kann, und (IIb) zwei oder mehr Spezies von Anti-Bindungselementen, umfassend eine Nucleinsäure mit einer Basensequenz, komplementär zum Bindungselement, enthalten im getrennten Reagenz, wobei die Anti-Bindungselemente jeder Art unabhängig in einer Detektionszone des Entwicklungselements immobilisiert sind, wobei ein Komplex von jeder Analyt-Spezies durch komplementäre Bindung zwischen dem Bindungselement und einem Anti-Bindungselement in der Detektionszone abgefangen werden kann, wodurch ein unabhängiges Band gebildet wird.
  16. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 15 zur Verwendung in einem diagnostischen Kit nach Anspruch 15.
  17. Assay-Vorrichtung zum Untersuchen von zwei oder mehr Spezies von Analyten, die in einer Probe vorliegen, oder zum Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens hiervon in der Probe, worin die Assay-Vorrichtung umfasst: (a) ein Entwicklungselement in Lagenform, das in der Lage ist, Analyten, Reagenz und an das Reagenz gebundene Analyten durch ein Kapillarphänomen zu entwickeln; (b) eine Beladungszone, um eine Flüssigkeitsprobe von außerhalb aufzunehmen, wobei die Beladungszone an einem Ende des Entwicklungselements in der Lagenform positioniert wird und in der Lage ist, eine Flüssigkeitsprobe von außerhalb aufzunehmen und mit einer ausreichenden Zuführstärke, um die aufgenommene Flüssigkeitsprobe zum anderen Ende zu transferieren, um die zu analysierende Flüssigkeitsprobe zu einer Einschlusszone, in der die Reagenzkomponenten versiegelt vorliegen, zuzuführen; (c) eine Einschlusszone, in der Reagenzkomponenten versiegelt vorliegen, umfassend: (c1) zwei oder mehr Spezies von markermarkierten Liganden, jeweils erhältlich durch Binden eines Markers an einen ersten Liganden, spezifisch reaktiv für eine spezifische Analyt-Spezies, und (c2) zwei oder mehr Spezies von Bindungselement-markierten Liganden, jeweils erhältlich durch Binden eines Bindungselements, bestehend aus Nucleinsäure mit einer vorbestimmten Basensequenz, abhängig von den spezifischen Analyt-Spezies, an einen zweiten Liganden, spezifisch reaktiv für die spezifische Analyt-Spezies, wobei die Einschlusszone an einer Position nahe der Beladungszone angeordnet ist; (d) eine Wasserabsorptionszone, angeordnet an einer Position getrennt von der Beladungszone, wobei die Zone in der Lage ist, die Analyten, das Reagenz und an das Reagenz gebundene Analyten nach Diffusion im Entwicklungselement aufzunehmen, und (e) eine Detektionszone, angeordnet zwischen der Einschlusszone und der Wasserabsorptionszone, wo zwei oder mehr Spezies von Anti-Bindungselementen, jeweils mit einer Basensequenz, komplementär zu einer Bindungselement-Spezies unabhängig immobilisert sind, wobei ein aus einem markermarkierten Ligand, jeder Analyt-Spezies und einem Bindungselement-markierten Ligand gebildeter Komplex, abhängig von den Analyt-Spezies, abgefangen und nachgewiesen werden kann.
  18. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, worin der erste Ligand und der zweite Ligand immunchemisch aktive Substanzen darstellen.
  19. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, worin der erste Ligand und der zweite Ligand dieselbe Reaktivität für die spezifische Analyt-Spezies aufweisen.
  20. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, worin der erste Ligand und der zweite Ligand eine unterschiedliche Reaktivität für die spezifische Analyt-Spezies aufweisen.
  21. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, worin der erste Ligand und der zweite Ligand Nucleinsäuren darstellen; der erste Ligand eine Basensequenz aufweist, die in der Lage ist, an eine Analyt-Nucleinsäure in einer komplementären Art und Weise zu binden, und der zweite Ligand eine Basensequenz aufweist, die in der Lage ist, an eine Analyt-Nucleinsäure in einer komplementären Art und Weise zu binden.
  22. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, worin das Immobilisierungsmittel eines auf dem Entwicklungselement immobilisierten Anti-Bindungselements eine kovalente Bindung hiervon darstellt, durch eine in das 5'-Ende oder 3'-Ende des Anti-Bindungselements eingeführte funktionelle Gruppe oder eingeführt in eine Base der das Anti-Bindungselement aufbauenden Nucleinsäure, an eine funktionelle Gruppe eines unlöslichen Trägers als dem Entwicklungselement.
  23. Assay-Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, worin das Immobilisierungsmittel eines auf dem Entwicklungselement immobilisierten Anti-Bindungselements eine Bindung hiervon darstellt, durch das in das 5'-Ende oder 3'-Ende des Anti-Bindungselements eingeführte Biotin, oder das in eine Base der das Anti-Bindungselement aufbauenden Nucleinsäure eingeführte Biotin, an Avidin oder Streptavidin, das zuvor in einen unlöslichen Träger als dem Entwicklungselement eingeführt wird.
  24. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, worin das Immobilisierungsmittel eines auf dem Entwicklungselement immobilisierten Anti-Bindungselements eine kovalente Bindung hiervon darstellt, durch eine funktionelle Gruppe, eingeführt am 5'-Ende oder 3'-Ende des Anti-Bindungselements, oder eingeführt in eine Base der das Anti-Bindungselement aufbauenden Nucleinsäure, an ein Protein, gefolgt von Binden des erhaltenen Nucleinsäure-gebundenen Proteins an einen unlöslichen Träger als dem Entwicklungselement.
  25. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 24, worin das Nucleinsäure-gebundene Protein hergestellt wird durch Binden einer Nucleinsäure an Rinderserum Albumin.
  26. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 24, worin das Nucleinsäure-gebundene Protein hergestellt wird durch Binden einer Nucleinsäure an Immunglobulin.
  27. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 26, worin das Protein eine immunchemische Aktivität für einen Analyten aufweist.
  28. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, worin der Marker ausgewählt ist aus Metallkolloid, gefärbtem Latex und gefärbtem Liposom.
  29. Assay-Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, wobei die Assay-Vorrichtung in einem Gehäuse, hergestellt aus einem feuchtigkeitsbeständigen festen Material, angeordnet wird.
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