DE69920512T2

DE69920512T2 - Teststab für kohlenhydrat-freien transferrintest

Info

Publication number: DE69920512T2
Application number: DE69920512T
Authority: DE
Inventors: Erling Sundrehagen
Original assignee: Axis Shield ASA; Axis Shield PoC AS
Current assignee: Axis Shield ASA; Axis Shield PoC AS
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1999-12-10
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2019-12-11
Also published as: NO20012815L; JP2002532718A; AU1671700A; EP1141714A1; GB9827411D0; EP1141714B1; DE69920512D1; WO2000036418A1; NO20012815D0; US6716641B1; DK1141714T3; ATE277351T1; CA2353380A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Dipstick-Test zum Nachweis und zur Quantifizierung eines Analytengehalts in einer Probe. Der Test ist besonders brauchbar beispielsweise bei der Diagnose und der Überwachung von Alkoholismus durch den Nachweis von Asialotransferrin oder Kohlenhydrat-freiem Transferrin (CFT).
Viele biologische Proteine liegen in zwei oder mehr varianten Formen vor, die sich häufig im Grad der Glykosylierung des Proteins oder in der Kohlenhydratzusammensetzung per se unterscheiden. Andere Variationsformen können mit dem Lipidgehalt oder der Zusammensetzung des Moleküls, oder sogar mit Unterschieden der Primär-, Sekundär- oder Tertiärstrukturen des Proteins gegeben sein. Die relativen Konzentrationen solcher Varianten in einem bestimmten Körpergewebe oder einer Körperflüssigkeit sind im Allgemeinen konstant, können aber bei bestimmten Krankheiten oder krankhaften Zuständen oder als Ergebnis anderer störender Einflüsse auf den Körper gestört sein. Beispielsweise ist bekannt, dass das Verhältnis von glykosylierten zu nicht-glykosylierten Hämoglobinen im Serum von Patienten, die an Diabetes leiden, erhöht ist. In ähnlicher Weise können einige Strukturproteine, beispielsweise Myoglobine, in unterschiedlichen Organen geringe strukturelle Unterschiede aufweisen und nach einer Zellschädigung durch Krankheit oder Verletzung in den Blutstrom freigesetzt werden.
Somit kann durch Messen der Konzentrationen verschiedener Varianten eines Proteins im Blut oder einer Körperflüssigkeit von Interesse eine Diagnose oder Beurteilung einer Krankheit oder eines zellulären Schadens getroffen werden.
Serum-Transferrin ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 80 kD, das eine einzelne Polypeptidkette mit zwei N-verknüpften Polysaccharidketten umfasst. Diese Polysaccharidketten sind verzweigt und jede Kette kann in entweder zwei oder drei Antennen enden, von denen jede endständige Sialinsäurereste aufweist.
Wong und Regoeczi berichteten in Int. J. Peptide Res. (1977) 9:241-248, dass menschliches Transferrin natürlicherweise heterogen war und in varianten Formen mit unterschiedlichen Sialysierungsgraden auftrat. Bis vor kurzem nahm man im Allgemeinen an, es gäbe sechs solcher Varianten, die Pentasialo-, Tetrasialo-, Trisialo-, Disialo-, Monosialo- und Asialotransferrine. Viele Forscher, die auf dem Gebiet der chromatographischen Analyse von Transferrinen arbeiten, berichteten jedoch, dass die Konzentrationen von Monosialotransferrin sehr niedrig sind.
Die Asialo-, Monosialo-, Disialo- und Trisialovarianten werden in Fachkreisen oft kollektiv als Kohlenhydrat-defizientes Transferrin oder CDT bezeichnet.
Beim normalen gesunden Individuum scheint die Tetrasialovariante zu überwiegen; jedoch wurde berichtet, dass die Asialo-, Monosialo-, Disialo- und zu einem gewissen Grad die Trisialovarianten, d.h. CDT im Blut von Alkoholikern in erhöhten Konzentrationen auftreten (siehe van Eijk et al. (1983) Clin Chim Acta 132:167-171, Stibler (1991) Chin Chim 37:2029-2037 und Stibler et al. in "Carbohydrate-deficient transferrin (CDT) in serum as a marker of high alcohol consumption", Advances in the Biosciences, (Hrsg. Nordmann et al), Pergamon, 1988, Bd. 71, Seiten 353-357).
Von CDT wurde gezeigt, dass es ein effektiver Marker für Alkoholkonsum ist, insbesondere für den Nachweis und die Überwachung chronischen Alkoholkonsums. Eine verlässliche Überwachung der Blutalkoholkonzentration ist nur möglich, wenn eine Blutprobe innerhalb von 24 Stunden nach Alkoholkonsum entnommen wird, und übliche Tests (z.B. die Quantifizierung von γ-Glutamyltransferase oder die Messung des durchschnittlichen Volumens der Blutkörperchen) können für das Screenen auf übermäßige Alkoholaufnahme bei Patienten mit Leberkrankheiten nicht zuverlässig verwendet werden.
Frühe Untersuchungen zeigten, dass der Verlust der Sialinsäurereste mit Änderungen im isoelektrischen Punkt (pI) der Transferrinmoleküle korreliert ist, beispielsweise weist Asialotransferrin einen pI von 5,9 auf, Disialotransferrin einen pI von 5,7, usw. Die Erkenntnis, dass das CDT-Profil von Alkoholikern sich von dem von Abstinenzlern oder Personen mit normalem Alkoholkonsum unterscheidet, führte zusammen mit der Identifizierung der relativen Mengen jeder CDT-Isoform auf der Grundlage des pI zur Entwicklung mehrerer diagnostischer Tests für CDT, die in der Patentliteratur und der wissenschaftlichen Literatur beschrieben sind.
In der US-A-4 626 355 (Joustra) von Pharmacia AB wird ein Chromatographietest offenbart, bei dem eine Anionenaustauschsäule verwendet wird, um die Elution von Asialo-, Monosialo- und Disialo-CDT aus der Probe zu ermöglichen, während die „normalen" Tetra- und Pentasialovarianten auf der Säule zurückgehalten werden.
Ein Test unter Verwendung von isoelektrischer Fokussierung und von Immunfixierungstechniken wurde zur Beurteilung des Disialotransferringehalts einer Probe von Dumon et al., (1996) Clin. Biochem. 29(6): 549-553 vorgeschlagen.
Diese Verfahren zur CDT-Analyse nach dem Stand der Technik beruhen jedoch auf Unterschieden im pI oder der Ladung der verschiedenen Transferrinisomere. Solche Verfahren beruhen normalerweise auf relativ komplexen Vorgehensweisen.
Man nahm traditionellerweise an, dass CDT durch einen Verlust des endständigen Sialinsäurerests der Kohlenhydrat-Seitenketten entsteht, und darauf gründen sich die verschiedenen Tests nach dem Stand der Technik auf der Grundlage von pI oder Ladung (nämlich darauf, dass ein Verlust einer geladenen Zuckergruppe die Ladung und den pH der Isoform insgesamt verändern würde).
Durch Freisetzung der N-Glycane aus jeder Isoform von Transferrin und deren Analyse über Anionenaustauschchromatographie bei hohem pH zeigten jedoch neuere Untersuchungen (beispielsweise von Landberg et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Comm. 210(2): 267-274), dass im Widerspruch zu dieser Auffassung das Vorliegen von Disialo- und Asialotransferrinen vielmehr mit dem Verlust einer bzw. beider gesamter Kohlenhydrat-Ketten aus dem Transferrin-Polypeptid korreliert zu sein scheint. Diese „Deglykosylierung" wird noch nicht vollständig verstanden.
Die Kohlenhydrat-Ketten können zwei- oder dreifache Antennenstruktur aufweisen, und somit wird jede Kohlenhydrat-Kette in ihrem normalen Zustand zwei oder drei Sialinsäurereste tragen, einen am Ende jeder Antenne. Es kann vorkommen, dass die Kohlenhydrat-Ketten in einem einstufigen Prozess an ihrer Basis von den Transferrinmolekülen abgespalten werden, d.h. an einem Asparaginmolekül im Aminosäurerückgrat des Proteins, wobei keine Zuckerreste an der jeweiligen Glykosylierungsstelle zurückbleiben. Alternativ können einzelne oder mehrere Zuckerreste nacheinander aus den Transferrinmolekülen verloren gehen, was zu einem allmählichen Verlust an Kohlenhydratgehalt führt. Es ist auch möglich, dass die CDT-Transferrinmoleküle auf Grund anormaler enzymatischer Gykosylierungsprozesse von Anfang an nicht richtig glykosyliert wurden.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt wird im Stand der Technik die Idee favorisiert, dass entweder eine Messung aller CDT-Varianten, d.h. eine Messung von Asialo-, Monosialo-, Disialo- und Trisialotransferrin, oder mindestens eine Messung von zwei oder mehr CDT-Varianten nötig ist, um eine sinnvolle klinische Beurteilung zu treffen, oder dass eine Messung des Disialotransferrins selbst nötig ist.
Im Widerspruch zu dieser unter Fachleuten vorherrschenden Meinung entwickelten und beschrieben die Anmelder in der WO 99/00672 eine neue Art von Test zum Nachweis Kohlenhydrat-freier Transferrine (CFTs). Dieser Test beruht auf dem Prinzip, dass das Vorliegen von Transferrin-Isoformen, die völlig frei von Kohlenhydrat sind, d.h. Kohlenhydrat-freies Transferrin (CFT), auch bei Fehlen jeglicher Information hinsichtlich des Vorliegens irgendwelcher anderer CDT-Varianten (d.h. Monosialo-, Disialo- oder Trisialotransferrinvarianten) ein starker Indikator für Alkoholismus ist. Der Test ist robust, einfach und schnell durchführbar, und ist leicht automatisierbar oder kompatibel mit vorhandenen Laborroutineverfahren für die klinische Diagnostik. Dies wird durch das Abtrennen der Kohlenhydrat-enthaltenden Transferrine von einer Probe erreicht, indem man sie mit einem Kohlenhydrat-bindenden Liganden in Kontakt bringt und das Kohlenhydratfreie Transferrin nachweist und misst, das in der abgetrennten, nicht-bindenden Fraktion enthalten ist. Jedoch wurde bisher nicht vorgeschlagen, diesen Test in Form eines Dipsticks herzustellen.
Dipsticks stellen eine Anwendungsform in fester Phase dar, die auf diagnostischem Gebiet allgemein verwendet wird, und bilden tatsächlich die Grundlage vieler Testkits für den Hausgebrauch, z.B. Schwangerschaftstests für den Hausgebrauch. Im Stand der Technik wurden viele Arten von Dipstick-Tests vorgeschlagen, und viele davon beruhen auf den Prinzipien der Bindungsaffinität eines Analyten für einen bestimmten Bindungspartner. Viele verschiedene Kombinationen von Analyt:Bindungspartner wurden erfolgreich in Dipstick-Tests verwendet, und viele unterschiedliche Techniken wurden entwickelt, mit denen sichtbare Ergebnisse erhalten werden können.
Beispielsweise offenbart die WO 94/15215 von Medix Biochemica einen Teststreifen zur Analyse von Umweltschadstoffen und verwendet ein mobiles Markierungsreagens, das mit einem immobilisierten Testbereich in einem leeren Raum zwischen einer Testmembran und einem rückwandigen Streifen, der eine Reaktionskammer bildet, in Kontakt tritt. Dieser Test ist geeignet für eine große Vielfalt von Analyten, einschließlich biologischer Verbindungen zur Diagnose physiologischer Zustände beim Menschen.
Die US 4,435,504 offenbart einen Dipstick-Test, der die Quantifizierung des Analytengehalts einer Probe ermöglicht, wobei der Analyt das immobilisierte Bindemittel auf dem Dipstick in einer bestimmten Entfernung vom Auftragungspunkt der Probe absättigt und dadurch zu einer Messung des Analytengehalts führt.
Die US 5,075,078 von Abbott Laboratories offenbart einen verbesserten Dipstick-Test, der die Visualisierung positiver und negativer Ergebnisse durch spezifische Orientierung der immobilisierten Kontrollzone in einem Plus- und einem Minus-Format ermöglicht.
Die US 5,290,678 und die US 5,658,801 von Spectral Diagnostics Inc. offenbaren diagnostische Testskits zur Diagnose von Myokardinfarkt unter Verwendung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper zum Testen auf spezifische Proteine im Blut oder in Serumproben.
Keiner der im Stand der Technik verwendeten oder vorgeschlagenen Dipstick-Tests ist geeignet zum Nachweis des Vorliegens von CFTs, um eine Diagnose auf Alkoholismus oder Alkoholmissbrauchs zu ermöglichen, oder um tatsächlich selektiv jede beliebige Variante oder Gruppe von Varianten eines Analyten selektiv nachzuweisen. Diese Dipstick-Tests sind für eine große Vielfalt von Analyten geeignet, aber sie beruhen auf der Verwendung eines spezifischen Bindungspartners für den Analyten wodurch es schwierig sein kann, sinnvolle Ergebnisse zu erhalten, wenn die zu analysierenden Proben mit einiger Wahrscheinlichkeit Varianten des Analyten enthalten und es erwünscht ist, nur eine Variante oder eine Gruppe von Varianten nachzuweisen.
Erfindungsgemäß wurde nun eine neue Form von Dipstick-Test entwickelt, die überraschenderweise besonders geeignet ist, um unter solchen Umständen sinnvolle Ergebnisse zu erhalten. Der erfindungsgemäße Dipstick-Test ist beispielsweise besonders brauchbar beim Nachweis und der Quantifizierung jedes beliebigen Analyten, der natürlicherweise im Körper in einer Anzahl varianter Formen vorliegt, insbesondere varianter Formen mit Kohlenhydrat-enthaltenden und Kohlenhydrat-freien Varianten. Der erfindungsgemäße Dipstick-Test ermöglicht die Unterscheidung verschiedener varianter Formen eines solchen Analyten.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung dementsprechend einen Dipstick zur Bestimmung des Gehalts einer Analytenvariante (einer „Ziel-Analytenvariante") in einer Mischung von Analytenvarianten in einer Probe bereit, umfassend:

a) einen Probenauftragungsbereich,
b) einen „Screening-Bereich" mit einem immobilisierten bindenden Liganden, der eine
Bindungsaffinität für eine Variante (Varianten) des Analyten aufweist, welche nicht
bestimmt werden soll (sollen) (d.h. Nichtziel-Analytenvariante(n));
c) einen Konjugatbereich, der ein Nachweisreagens umfasst;
d) einen Lesebereich zum Nachweis des Analyten.

Der erfindungsgemäße Dipstick ist besonders geeignet zum Nachweis von Transferrin-Isoformen, die vollständig frei von Kohlenhydrat sind, d.h. Kohlenhydrat-freiem Transferrin (CFT).
Ein weiterer Vorteil eines Dipstick-Testformats besteht darin, dass dieses ein schnelles und bequemes einstufiges Verfahren mit sich bringt, das an jedem Ort und zu jeder Zeit durchgeführt werden kann. Ein spezielles Training zur Ausführung des Tests unter Verwendung eines Dipstick-Tests ist nicht erforderlich, da die Ergebnisse innerhalb von kurzer Zeit erhalten werden und durch das sichtbare Ergebnis auf dem Dispstick leicht interpretiert werden können. Spezielle Reagenzien zur Durchführung des Tests sind nicht erforderlich, da alle erforderlichen Reagenzien und Nachweismaterialien im Dipstick enthalten sind.
Die Diagnose und Beurteilung kann somit in praktischer Weise während des Besuchs in der Klinik eines Allgemeinmediziners oder sogar während eines Hausbesuchs bei einem Patienten durchgeführt werden, und könnte von einer Schwester oder einem Doktor vorgenommen werden, ohne dass dafür die Verwendung teurer Laborausrüstung oder das Einsenden der Proben zur Analyse durch ein externes Labor nötig wäre.
Der Begriff „Dipstick" bezeichnet jede Vorrichtung, die in eine Probe getaucht werden kann oder auf die eine Probe aufgetragen werden kann, und die eine Diffusion oder einen Transport der Probe entlang einer oder mehrerer ihrer Dimensionen ermöglicht. Dies umfasst jede der bekannten, für das Testen und die Analyse biologischer Proben geeigneten Dipstick-Formate, die dem Fachmann geläufig sind, ist aber nicht darauf beschränkt. Der erfindungsgemäße „Dipstick" ist somit in anderen Worten eine Testvorrichtung mit festem Träger. Die übliche dem Fachmann bekannte „Dipstick"-Konfiguration ist praktisch, aber die Erfindung umfasst alle Konfigurationen von Testvorrichtungen mit festem Träger, die dem Fachmann bekannt sind. Vorteilhafterweise sind die Bereiche auf dem Dipstick in einer solchen Weise in derselben Ebene angeordnet, dass das Material (z.B. Probenflüssigkeit und/oder Reagenzien) vom ersten zu nachfolgenden Bereichen fließen kann, vorzugsweise nacheinander von Bereich zu Bereich. Obwohl die bevorzugte Gestalt die Form eines Streifens aufweist, können jede andere Gestalt oder Form aus einer großen Vielfalt von Gestalten und Formen verwendet werden, solange die Gestalt und Form eine Wahrnehmung der hier beschriebenen verschiedenen Funktionen durch die getrennten Bereiche ermöglicht. Vorteilhafterweise sieht die Konfiguration des Dipsticks so aus, dass die Flussrichtung im Allgemeinen parallel zur Länge des Dipsticks verläuft. Der erfindungsgemäße Dipstick kann somit als den dem Fachmann bekannten Immunchromatographieteststreifen ähnlich angesehen werden, ist aber nicht auf die Verwendung von „Immuno"-Reagenzien, d.h. Antikörpern, beschränkt wie nachfolgend ausführlicher dargelegt wird. Erfindungsgemäße Dipstickstrukturen, -bauarten oder -konfigurationen können jeglichen solchen entsprechen, die dem Fachmann als üblich bekannt und in der Literatur, einschließlich den vorstehend aufgeführten Patentanmeldungen, beschrieben sind.
Der Begriff „Bestimmung des Gehalts" umfasst sowohl die Quantifizierung im Sinne des Erhaltens eines absoluten Werts der Menge der Zielanalytenvariante(n) in der Probe als auch der semiquantitativen und qualitativen Beurteilungen oder Bestimmungen. Ein Index, Verhältnis, Prozentsatz oder jede andere Angabe des Gehalts oder der Menge oder auch des Vorliegens oder Fehlens einer Ziel-Variante kann beispielsweise in Relation zur Gesamtpopulation der Analyenvariante (d.h. allen Analytenvarianten) erhalten werden.
Insbesondere werden Formate unter visuellem Auslesen (Beurteilungen oder Bestimmungen) umfasst.
Der zu bestimmende Analyt kann jeder Analyt von klinischer oder diagnostischer Bedeutung sein, z.B. jedes Biomolekül, das in varianten Formen auftritt (z.B. Isoformen). Vorzugsweise wird er jedoch ein Protein sein, und noch bevorzugter ein Protein mit varianten Formen, die sich im Kohlenhydratgehalt und/oder der Kohlenhydratzusammensetzung unterscheiden. Während Analyten mit klinischer Bedeutung bevorzugt sind, also Analyten, die im Körper vorkommen, werden auch andere Analyten, z.B. solche mit umweltbezogener oder gerichtsmedizinischer Bedeutung, umfasst, beispielsweise Analyten, die für das Testen von Kontamination z.B. von Lebensmitteln oder Wasser von Bedeutung sind.
Der erfindungsgemäße Dipstick ist insbesondere beim Nachweis oder der Messung von Ziel-Analytenvarianten brauchbar, die entweder kein Kohlenhydrat enthalten, z.B. CFT (oder Asialotransferrin, das nun nach Ansicht einiger frei von allen Kohlenhydraten und nicht nur frei von Sialinsäuregruppen ist) oder die in Vergleich mit Nichtziel-Varianten des fraglichen Analyten einen veränderten Kohlenhydratgehalt aufweisen. Insbesondere können hierzu Asialo-Verbindungen erwähnt werden, beispielsweise Asialotransferrin, Asialoorosomucoid, Asialofetuin oder Asialoceruloplasmin.
Die Ziel-Analytenvariante, d.h. die zu bestimmende Analytenvariante, kann somit eine einzelne Variante sein, z.B. eine Proteinvariante, die vollkommen frei von Kohlenhydrat ist, wie beispielsweise CFT, oder Asialotransferrin (ungeachtet dessen, ob dieses als völlig frei von Kohlenhydraten oder nur als aller seiner Sialogruppen verlustig angesehen wird), oder eine Gruppe oder Teilmenge von Varianten (z.B. Transferrinvarianten, welche Sialogruppen verloren haben, aber noch restliche Oligosaccharidketten unterschiedlicher Zusammensetzung aufweisen können). Wie nachfolgend ausführlicher beschrieben wird, können die Ziel-Varianten auch Varianten von CDT umfassen, z.B. Mono- und Asialotransferrine oder Di-, Mono- und Asialotransferrine. Der Begriff „Analytenvariante" umfasst somit eine oder mehr als eine Variantenart.
Die Probe kann jede Analyten-enthaltende Probe sein, die getestet werden soll, wird aber vorzugsweise eine Körperflüssigkeit einschließlich Synovialflüssigkeit, Fruchtwasser oder Cerebrospinalflüssigkeit sein, im Allgemeinen jedoch Blut oder eine von Blut abgeleitete Probe oder Harn. Die Probe kann jedoch jede klinische Probe oder jede die Umwelt betreffende Probe sein und kann klinische Proben umfassen, bei denen irgendein Körpergewebe oder Zellen aufgebrochen oder anderweitig in flüssiger oder Suspensionsform vorbereitet sind. Die Probe kann insbesondere jede Transferrin-, Orosomucoid-, Fetuin- oder Ceruloplasmin-enthaltende Probe aus dem Körper sein. Wenn eine aus dem Blut abgeleitete Probe verwendet wird, wird die Probe für die Analyse vorzugsweise zellfrei sein, und daher können entweder Serum oder Plasma verwendet werden. Vor der Auftragung auf den Dipstick zur Bestimmung des Analyten kann die Probe vorbehandelt werden, beispielsweise kann sie durch Zugabe von Puffer oder jedes anderen geeigneten wässrigen Mediums verdünnt werden.
Der Probenauftragungsbereich ermöglicht der Probe den Eintritt in den Dipstick und kann in jedem Format vorliegen und aus jedem Material bestehen, welches dies ermöglicht. Der Probenauftragungsbereich besteht vorzugsweise aus Glasfasern, Zellulosederivaten, anderen Polymeren, gewebten Fasern oder nicht-gewebten Filtern, kann aber aus jedem anderen geeigneten Material bestehen, das erforderlichenfalls dazu dient, das Eindringen der Probe zu verzögern, die Probe zu verteilen und irgendwelche Partikel zu entfernen, die in der Probe vorhanden sein könnten. Die Technologie dafür ist Standard und dem Fachmann allgemein bekannt. Der Probenauftragungsbereich kann praktischerweise auch Mittel zur Bestimmung des Volumens der Probe, die weiter in den Dipstick fließt, umfassen oder enthalten. Dies wird nachfolgend ausführlicher besprochen.
Der „Screening-Bereich" mit einem immobilisierten bindenden Liganden liegt vorzugsweise sehr nahe am Probenauftragungsbereich und steht entweder direkt oder indirekt mit dem Probenauftragungsbereich in Kontakt, so dass die Probe vor dem Eintritt in den Konjugatbereich in den Screening-Bereich und durch den Screening-Bereich fließen kann. Praktischerweise ist der Screening-Bereich so angeordnet, dass er durch Kapillarfluss mit dem Probenauftragungsbereich in Verbindung steht. Verfahren und Mittel zur Erzielung solcher funktioneller Erfordernisse sind ein allgemeines Merkmal der Dipstick-Technologie und sind dem Fachmann bekannt. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann der Screening-Bereich einen integralen Teil des Probenauftragungsbereichs bilden, z.B. kann der immobilisierte bindende Ligand in Merkmal (b) des Dipsticks in dem Probenauftragungsbereich enthalten sein, oder derselbe Bereich kann sowohl als Probenauftragungsbereich als auch Screening-Bereich dienen. Der Screening-Bereich und der Probenauftragungsbereich können in anderen Worten ein und derselbe Bereich sein.
Der Screening-Bereich und die Probenauftragungsbereiche liegen praktischerweise in Form eines oder mehrerer Kissen vor, wobei der Screening-Bereich einen darauf oder darin immobilisierten bindenden Liganden aufweist. Solche „Kissen" sind wiederum Teil allgemein bekannter Dipstick-Technologie und werden nachfolgend ausführlicher beschrieben. Wenn mehr als ein Kissen verwendet wird, ist es wichtig, dass aufeinander folgende Kissen in funktionellem Kontakt miteinander stehen sollten, um einen freien Fluss der Probe durch den Dipstick zu ermöglichen. Wenn der Probenauftragungsbereich und der Screening-Bereich zusammen als integraler Teil des Dipsticks vorliegen, können der Screening-Bereich und der Probenauftragungsbereich die Form eines einzelnen Kissens oder einer Vielzahl von Kissen annehmen, von denen jedes für die Auftragung der Probe und das Screening der Variante des getesteten Analyten geeignet ist.
Der Zweck des Screening-Bereich besteht darin, solche Varianten des Analyten, die nicht nachgewiesen werden sollen, aus der Probe zu entfernen und somit deren Nachweis zu verhindern. In anderen Worten erfolgt ein „Herausscreenen" der Nichtziel-Varianten durch den Screening-Bereich, wodurch es nur den Ziel-Varianten ermöglicht wird, bis zum Nachweis zu gelangen (d.h. mit dem Konjugatbereich in Kontakt zu treten). Dieses Merkmal der Erfindung ermöglicht somit eine Unterscheidung der Ziel- und Nichtziel-Varianten des Analyten. Durch Verwendung eines bindenden Liganden mit einer Bindungsaffinität für eine Nichtziel-Variante (Nichtziel-Varianten) des Analyten kann der Ziel-Analyt den Screening-Bereich passieren, während die Nichtziel-Varianten des Analyten durch Bindung an den immobilisierten bindenden Liganden in dem Screening-Bereich zurückgehalten werden.
Der bindende Ligand, der in oder auf dem Screening-Bereich immobilisiert ist, ist ein jeder beliebige Ligand, der die Nichtziel-Variante(n), die nicht nachgewiesen werden soll(en), selektiv zu binden vermag. Der Begriff „Bindungsaffinität" bedeutet hier somit lediglich, dass das fragliche Reagens in Form eines bindenden Liganden einen gegebenen Bindungspartner zu binden vermag.
Beispielsweise im Fall von Nichtziel-Varianten, die sich von den Ziel-Varianten durch Vorliegen einer bestimmten Gruppe, z.B. einer Kohlenhydrat- oder einer Lipid- oder einer anderen Gruppe, z.B. einer prosthetischen Gruppe unterscheiden, kann der bindende Ligand somit jeder Ligand sein, der selektiv an diese Gruppe, aber nicht an die Ziel-Variante zu binden vermag.
Der immobilisierte bindende Ligand des „Screening-Bereichs" ist vorzugsweise eine Verbindung, die Kohlenhydrat-enthaltende Gruppen zu binden vermag, beispielsweise ein Lektin oder eine Mischung aus Lektinen. Besonders geeignete bindende Liganden sind z.B. SNA-Lektin, Con-A-Lektin und deren Mischungen, wobei diese Bindungspartner für Kohlenhydrat-enthaltende Transferrine sind.
Jeder bindende Ligand mit einer Affinität für eine Variante des Analyten, die in der Probe enthalten ist, oder jede Kombination davon kann somit verwendet werden, um den Ziel-Analyten von anderen Varianten des Analyten abzutrennen. Wenn die Ziel- Analytenvariante ein Kohlenhydrat-freies Protein ist, wobei eine oder mehrere Kohlenhydratenthaltende Varianten davon abgetrennt werden, wird der bindende Ligand ein Kohlenhydratbindender Ligand sein. Dies umfasst jeden Liganden, der irgendwelche Kohlenhydrat- oder Oligosaccharid- oder Zuckerstrukturen zu binden vermag. In dem erfindungsgemäßen Dipstick-Test können ein oder mehr Kohlenhydrat-bindende Liganden verwendet werden. Im Allgemeinen wird der Kohlenhydrat-bindende Ligand ein Protein sein, und sehr viele solcher Kohlenhydrat-bindender Proteine sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur umfassend beschrieben. Das Kohlenhydrat-bindende Protein kann beispielsweise ein Antikörper, entweder ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, oder ein Antikörperfragment sein, beispielsweise F(ab)-, F(ab')₂- oder F(v)-Fragmente. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können monovalent oder divalent sein und sie können über Hybridomtechnologie hergestellt werden oder synthetischen Ursprungs sein, wobei rekombinante DNA-Technologie oder chemische Synthese zu nennen wären. Beispielsweise könnten Einzelketten-Antikörper verwendet werden. Der Antikörper kann gegen beliebige Kohlenhydratbestandteile oder Kohlenhydraststrukturen, welche die Kohlenhydratketten glykosylierter Analytenvarianten (z.B. Transferrin) ausmachen, gerichtet sein oder dagegen erzeugt werden. Somit könnte beispielsweise ein Antikörper verwendet werden, der mit Sialinsäureresten reagiert oder für diese selektiv ist. Ein solcher Antikörper wird in dem Sialic Acid Deficient Enzyme Immunoassay (SDT-EIA) verwendet, der von Medichem, Stuttgart, Deutschland, erhältlich ist und in der WO 97/19355 beschrieben ist.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann das Kohlenhydrat-bindende Protein ein Lektin sein, das einzeln oder in Kombination mit anderen Lektinen oder anderen Arten Kohlenhydrat-bindender Proteine, beispielsweise Antikörper, verwendet wird. Jedes dem Fachmann bekannte Lektin kann in dem erfindungsgemäßen Dipstick-Test verwendet werden, wobei es pflanzlichen, tierischen, mikrobiellen oder jedes anderen Ursprungs sein kann. In der Literatur existieren zahlreiche Referenzen für unterschiedliche Lektine, die verwendet werden könnten, und viele sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Sigma.
Zusätzlich zu den klassischen Pflanzenlektinen, wie Concanavalin A (ConA) umfasst der allgemeine Begriff „Lektin" hier somit Kohlenhydrat-bindende Proteine aus Mikroorganismen (beispielsweise virale Hämagglutinine) und höheren Organismen, einschließlich beispielsweise Invertebraten und Säugetieren. Solche Kohlenhydrat-bindende Proteine aus Säugetieren umfassen Selektine und andere Säugetier-Lektine oder Zelladhäsionsmoleküle (siehe beispielsweise Varki (1992) Current Opinion in Cell Biology 4:257-266).
Wenn CFT oder ein anderes Kohlenhydrat-freies Protein die gewünschte Ziel-Variante ist, besteht ein funktionelles Erfordernis der Kohlenhydrat-bindenden Liganden, das diese für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Dipstick-Test geeignet macht, darin, dass sie Kohlenhydrat-freie Varianten, z.B. CFT, von anderen Kohlenhydrat-tragenden Analytenvarianten (z.B. Transferrinvarianten), die ein oder mehrere Oligsaccharidketten in vollständiger oder abgebauter Form tragen, abzutrennen vermögen.
Während eine einzelne Art von bindendem Liganden erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist es praktischer, mehr als einen solchen bindenden Liganden zu verwenden, und sogar noch praktischer, eine Anzahl unterschiedlicher Kohlenhydrat-bindender Liganden zu verwenden. Wenn der bindende Ligand ein Kohlenhydrat-bindender Ligand ist, kann jeder eine unterschiedliche Zucker- oder Oligosaccharidbindungskapazität aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird somit ein Satz verschiedener bindender Liganden mit unterschiedlicher Selektivität und Spezifität verwendet.
Wenn mehr als ein Ligand verwendet wird, können diese Liganden im Screening-Bereich entweder in zufälliger Mischung auf dem Dipstick-Träger immobilisiert sein, oder der Screening-Bereich kann aus einer oder mehreren unterschiedlichen, getrennten Zonen bestehen, von denen jede einen unterschiedlichen immobilisierten Liganden enthält. Der Screening-Bereich kann somit beispielsweise mehr als ein Kissen umfassen, auf dem ein oder mehrere bindende Liganden immobilisiert sind. Solange der Screening-Bereich seine Funktion der Abtrennung des nicht-bindenden Analyten (d.h. der Ziel-Variante) von den Varianten des Analyten, die an den bindenden Liganden binden, vor dem Kontakt der Probe mit dem Konjugatbereich erfüllt, kann die Abfolge der Bindungsliganden, die mit der Probe in Kontakt treten, in jeder sequentiellen Reihenfolge sein oder in gleichzeitigem Kontakt mit allen unterschiedlichen Liganden erfolgen.
Auf Grund der gesteigerten Bindungskapazität, die durch zwei oder mehr Liganden bereitgestellt werden kann, und somit der besseren Abtrennung der Transferrin-Isoformen werden Kombinationen verschiedener Liganden bevorzugt. Viele Kohlenhydrat-bindende Liganden, beispielsweise Lektine, weisen niedrige Bindungsaffinitäten für deren Zucker- oder Oligosaccharidbindungspartner auf, und die synergistische Bindungskapazität, die durch mehr als einen Liganden bereitgestellt wird, ist vorteilhaft.
Beispiele geeigneter Lektine sind RCA-I (Ricinus communis-Agglutinin), das an endständige Galaktose bindet (Kornfeld et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:6633) oder ConA (Concanavalin A), von dem die Bindung an Asparagin-verknüpfte Oligosaccharide mit hohem Mannosegehalt bekannt ist. Andere Möglichkeiten sind Crotalaria juncea-Lektin, das Galaktosereste bindet (Ersson (1977) Biochim. Biophys. Acta 494:51-60), Weizenkeim-Agglutinin oder Limulus polyphenus-Lektin, die Sialinsäure binden (Mandal and Mandal (1990) Experientia 46:433-441) oder Sambucus nigra-Agglutinin L (SNA), das Neu5Ac/(α2-6)Gal/GalNAc bindet (Shibuya et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:1596). Als Beispiel für ein aus einem Mikroorganismus stammendes Lektin wurde kürzlich ein Sialinsäure-spezifisches Lektin aus dem Darm bewohnenden Organismus Helicobacter pylori (Lelwala-Guruge et al. (1993) APMIS 101:695-702) aufgereinigt.
Es sind Lektine unterschiedlicher Selektivität und Spezifität bekannt. Während einige Lektine an einen einzelnen Zuckerrest an einer bestimmten Stelle in einer Oligosaccharidkette binden, beispielsweise RCA-I (aus Ricinus communis), das nur an endständige Galaktosereste bindet, können andere an komplexe Oligosacchariddeterminanten binden, beispielsweise Sambucus nigra L, das an Neu5Ac/(α2-6)Gal/GalNAc bindet. Alle davon fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Sialinsäure-bindende Lektine und andere Proteine stellen eine Klasse Kohlenhydratbindender Proteine dar, die für die vorliegende Erfindung besonders brauchbar sind (siehe beispielsweise die folgenden Publikationen für Listen geeigneter Lektine und deren Quellen: Mandal and Mandal (1990) Experientia 46:433-441); Zeng (1992) Z. Naturforsch, 47c:641-653, und Reuter und Schauer in Methods in Enzymology, Bd. 230, Kapitel 10 auf den Seiten 196-198).
In dieser Hinsicht verdienen besondere Erwähnung Sambucus nigra L.-Lektin (SNA), Sambucus sielbodiana-Lektin, Weizenkeim-Agglutinin, Maackia amurensis-Lektin, und E. coli K99-Lektin. SNA ist besonders effektiv, wenn es alleine verwendet wird, obwohl es in Kombination mit anderen Lektinen, z.B. ConA, gleichermaßen effektiv verwendet werden kann. Kombinationen von ConA mit SNA sind bevorzugt.
Einige besondere Kombinationen aus Kohlenhydrat-bindenden Liganden, die erfindungsgemäß brauchbar sind, sind Lektine aus Helicobacter pylori und Ricinus communis; Lektine aus Ricinus communis und Sambuccus nigra; Lektine aus Crotalaria junctae und Sambuccus nigra; Lektine aus Crotalaria junctae und Helicobacter pylori und Lektine aus Ricinus communis und Anti-Sialinsäure-Antikörper. Die am meisten bevorzugten Kombinationen sind solche, welche Galaktose-bindende und Sialinsäure-bindende Liganden beinhalten.
Wie vorstehend erwähnt, stellt der Nachweis von CFT eine bevorzugte erfindungsgemäße Anwendung dar, und dementsprechend sind bevorzugte Lektine solche, welche die Mono- und Oligosaccharid-Anordnungen der Kohlenhydrat-Seitenketten von Transferrin mit einem kD von 10⁴ oder mehr binden. Lektine mit niedrigerer Bindungsaffinität können auch verwendet werden, aber vorzugsweise bei höherer Dichte.
Wenn man die Probe, welche die Analytenvarianten umfasst, mit den auf dem Screening-Bereich immobilisierten bindenden Liganden in Kontakt bringt, werden alle oder im Wesentlichen alle der Varianten mit einer Bindungsaffinität für den bindenden Liganden in dem Screening-Bereich zurückgehalten. Wenn CFT der Analyt ist, können somit alle Transferrinvarianten (die CDT-Varianten umfassen können) mit Kohlenhydrat-Seitenketten oder Resten davon durch die Kohlenhydrat-bindenden Liganden zurückgehalten werden und nur das Kohlenhydrat-freie Transferrin wird nicht an die Liganden gebunden. Die nichtgebundene Fraktion, die das Kohlenhydrat-freie Transferrin enthält (d.h. die im Wesentlichen Kohlenhydrat-freie Fraktion), wandert dann entlang des Dipsticks in Richtung des Konjugatbereichs fort, wobei die anderen Varianten in dem Screening-Bereich zurückgelassen werden.
Es ist jedoch ersichtlich, dass andere Variationen der Erfindung möglich sind, und dass mit einer geeigneten Auswahl bindender Liganden jede gewünschte Untergruppe von Nichtziel-Varianten zurückgehalten werden kann. Somit können beispielsweise Lektine oder Antikörper mit einer Affinität für bestimmte Kohlenhydratgruppen ausgewählt werden, um Varianten zu binden, die solche Gruppen enthalten. Auf diese Weise können z.B. Sialoenthaltende Varianten durch Bindung an Sialinsäure-spezifische bindende Liganden zurückgehalten werden. Jedoch können Varianten ohne Sialo-Gruppen abgetrennt werden, selbst wenn sie andere Kohlenhydratgruppen aufweisen. Wie nachstehend weiter beschrieben wird, umfassen bevorzugte Untergruppen der gewünschten Ziel-Analytenvarianten Asialo-(CFT)- und Disialotransferrine oder Asialo-, Monosialo- und Disialotransferrine.
Wenn somit der Analyt ein Asialoprotein, wie beispielsweise Asialotransferrin ist, wird dieser den Screening-Bereich passieren, ohne zurückgehalten zu werden, während Varianten des Analyten wie Sialotransferrine (einschließlich Pentasialo-, Tetrasialo-, Trisialo, Disialo- und Monsialotransferrine) in dem Screening-Bereich zurückgehalten werden.
Die Erfindung ermöglicht somit die Abtrennung von Analytenvarianten auf der Grundlage der Kohlenhydratzusammensetzung ebenso wie des Kohlenhydratgehalts, und analoge Prinzipien treffen für andere chemische Gruppen wie beispielsweise Lipide zu, deren Gehalt oder Zusammensetzung zwischen unterschiedlichen Analytenvarianten variieren kann.
Der bindende Ligand ist in dem Screening-Bereich des Dipsticks immobilisiert, um die Abtrennung und den anschließenden Nachweis und die Messung der nicht-bindenden Fraktion zu erleichtern, welche den Ziel-Analyten enthält. Dem Fachmann ist die Immobilisierung einer großen Vielfalt bindender Liganden, wie beispielsweise Kohlenhydratbindender Liganden, allgemein bekannt.
Die bindenden Liganden können somit durch Bindung oder Kopplung an einen festen Träger immobilisiert werden. Dieser kann jeder der allgemein bekannten festen Träger oder Matrices sein, die gegenwärtig breite Verwendung finden oder für die Immobilisierung eines Liganden vorgeschlagen werden. Der feste Träger kann somit ein Teil der Basisstruktur des Dipsticks selbst sein oder eine Komponente sein, die in oder auf dem Dipstick bereitgestellt wird. Unterschiedliche Formen des festen Trägers oder der festen Matrix können somit Partikel, Folien, Gele, Filter, Membranen, Fasern oder Kapillaren oder Mikrotiterstreifen usw. umfassen. Insbesondere für die Anwendung in Form eines Dipsticks kann der Träger im Allgemeinen die Form einer Folie, eines Streifens, einer Membran oder von Teilchen annehmen. Der Träger kann in vorteilhafter Weise ein poröses Material oder ein Material mit großer Oberfläche sein oder solche Materialien umfassen. Der feste Träger kann praktischerweise aus Glas, Kieselerde, Latex oder einem polymeren Material, z.B. Glasfaser, Papier, Zellulose und Zellulosederivaten, wie beispielsweise Acetaten und Nitraten, Polyestern, Polykarbonaten und Polyvinylverbindungen, bestehen. Solche Materialien und deren Verwendung bei Dipsticks sind dem Fachmann allgemein bekannt. Techniken zur Bindung oder Kopplung des Liganden an den festen Träger sind ebenfalls allgemein bekannt und in der Literatur umfassend beschrieben (siehe beispielsweise Immobilised Affinity Ligand Techniques, Hrsg. Hermanson, Mallia und Smith, Academic Press Inc.).
Beispielsweise kann in einer bevorzugten Ausführungsform der bindende Ligand praktischerweise direkt kovalent an die Kissen des Screening-Bereichs und/oder des Probenauftragungsbereichs gebunden sein, wobei eine beliebige oder passende Kopplungschemie, z.B. ein Linker wie beispielsweise Bromcyan, verwendet wird. Alternativ kann in einer anderen bevorzugten Ausführungsform der bindende Ligand an Partikel, z.B. Latexpartikel, gebunden sein. Das Kissen oder die Kissen können beispielsweise in eine Lösung getaucht werden, welche ein Ligand-Latex-Konjugat enthält, und dann getrocknet werden. Die Partikel sind vorzugsweise größer als die Porengröße des Kissens, um sicherzustellen, dass sie aus dem Kissen nicht freigesetzt werden. Andere Verfahren zur Bindung oder Immobilisierung von Proteinen sind dem Fachmann ebenfalls allgemein bekannt.
Der erfindungsgemäße Dipstick kann eine Vielzahl von Formen annehmen. Die Dipstick-Technologie ist dem Fachmann allgemein bekannt, und im Allgemeinen ist jede beliebige Form von Dipstick bevorzugt, die für die Bereitstellung eines „Screening-Bereichs" geeignet ist. Im Allgemeinen wird ein Dipstick einen Probenauftragungsbereich in einer Form enthalten, die häufig als „Probenkissen" bezeichnet wird. Dieses erfüllt mehrere Funktionen, welche die Benutzung des Dipsticks unterstützen. Das Probenkissen vermag beispielsweise das Eindringen der Probe zu verzögern und/oder zur Verteilung der Probe über den Konjugatbereich beizutragen. Vorzugsweise vermag es auch Partikel aus der Probe zu entfernen, den pH-Wert oder die Viskosität der Probenlösung einzustellen, die Freisetzung des Nachweisreagens zu erleichtern, und Plasma oder Serum von Gesamtblut abzutrennen. Das Probenkissen bereitet somit die Probe auf effektive Weise für die Analyse im restlichen Teil des Dipsticks vor.
Probenkissen können üblicherweise aus einer Vielzahl von Materialien, wie beispielsweise Glasfaserfiltern, Zellulosederivaten (Papier), gewebten Fasern (Netzen) oder nicht-gewebten Filtern bestehen. Glasfaserfilter sind über einen weiten Bereich unterschiedlicher Produkte verfügbar, außerordentlich benetzbar, weisen mäßig niedrige Proteinbindungseigenschaften auf, können ein mäßiges bis hohes Bettvolumen aufweisen, haben aber nur eine geringe Zugfestigkeit, insbesondere in nassem Zustand. Zellulosederivate (Papier) sind ebenfalls in einer großen Vielfalt unterschiedlicher Produkte erhältlich, sehr benetzbar, weisen sehr niedrige Proteinbindungseigenschaften auf, können ein mäßiges bis hohes Bettvolumen aufweisen, haben aber eine sehr geringe Zugfestigkeit, insbesondere in nassem Zustand.
Gewebte Fasern (Netze) sind in einer eingeschränkteren Produktvielfalt erhältlich, sind außerordenlich benetzbar, weisen sehr geringe Proteinbindungseigenschaften und ein sehr niedriges Bettvolumen auf, haben aber den Vorteil einer hohen Zugfestigkeit, selbst in nassem Zustand. Nicht-gewebte Filter weisen ebenfalls eine hohe Zugfestigkeit selbst in nassem Zustand auf, sind in einer großen Produktvielfalt erhältlich, sind aber an sich nicht benetzbar und weisen mäßige Proteinbindungseigenschaften auf. Wie vorstehend erwähnt, kann der Probenauftragungsbereich praktischerweise Volumen bestimmende Mittel umfassen. Die Technologie dafür ist wiederum Standard. Diese Mittel können beispielsweise in Form eines Probenkissens vorliegen, das eine vorbestimmte Größe und/oder ein vorbestimmtes Hohlraumvolumen aufweist. Ein solches Kissen kann gegebenenfalls mit einer temporären Flüssigkeitsbarriere versehen sein, die eine Absättigung des Probenkissens ermöglicht, bevor die Flüssigkeit die Barriere auflöst und die Probe weiter in den Dipstick fließen kann. Beispiele für geeignete Barrieren umfassen getrocknete Kohlenhydrate, Proteine, Nukleinsäuren und organische oder anorganische Salze.
Der Konjugatbereich (c), in den die Probe fließt, nachdem ein „Screening" durch den Bereich (b) erfolgt ist, kann als diejenige Zone angesehen werden, deren Funktion in der Bereitstellung eines Mittels liegt, durch das die Ziel-Analytenvarianten nachfolgend nachgewiesen werden. Wie auch vorhergehende (und nachfolgende) Bereiche steht dieser Bereich somit in Fließverbindung mit einer vorangegangenen Zone (vorangegangenen Zonen), z.B. in Kapillarfließverbindung. Ein Nachweisreagens wird somit bereitgestellt, um dieser Funktionen nachzukommen. Das Nachweisreagens interagiert mit dem Ziel-Analyten und stellt eine nachweisbare Gruppe zum anschließenden Nachweis im Lesebereich bereit oder trägt eine solche nachweisbare Gruppe. Das nachweisbare Mittel oder die nachweisbare Gruppe, mit dem/der das Nachweisreagens versehen ist oder das/die das Nachweisreagens trägt, ist praktischerweise eine signalerzeugende Gruppe. Das Nachweisreagens kann somit eine signalgebende Substanz umfassen oder mit einer solchen signalgebenden Substanz konjugiert sein.
Das Nachweisreagens kann somit als Pendant zu den „Tracer"-Reganzien angesehen werden, die für die im Stand der Technik üblichen Dipstick/Teststreifen-Assays bekannt sind.
Das Nachweisreagens kann in Abhängigkeit vom Assayformat und den Nachweismitteln im Lesebereich usw. verschiedene Formen annehmen. Das Nachweisreagens ist in dem Konjugatbereich in einer solchen Weise „aufgetragen", dass das Nachweisreagens freigesetzt wird und in den Lesebereich transportiert werden kann, wenn die Probe durch den Konjugatbereich fließt (d.h. wenn der Bereich benetzt wird).
Gemäß den Vorgehensweisen und Techniken für Tests, die dem Fachmann standardmäßig bekannt sind, sind unterschiedliche Test-„Formate" möglich, beispielsweise Sandwich-, Kompetitions- und Inhibitionstests. Alle diese dem Fachmann bekannten Verfahren und Nachweismittel werden umfasst, und die Art des ausgewählten Tests kann die Wahl des Nachweisreagens bestimmen. Im Allgemeinen wird jedoch das Nachweisreagens einen Partner eines Paares aus affinitätsbindenden Partnern (d.h. ein Ligand oder ein Anti-Ligand, z.B. ein Antikörper oder ein Antigen/Hapten) sein oder ein solches Paar umfassen.
Bei einem Test vom Sandwich-Typ weist das Nachweisreagens eine Bindungsaffinität für den Analyten auf (d.h. vermag an den Analyten zu binden). Bei einem Kompetitionstest vermag das Nachweisreagens mit dem Analyten um die Bindung an eine Bindungsstelle (z.B. einen Bindungspartner) zu konkurrieren. Praktischerweise ist ein Nachweisreagens somit der Analyt oder ein Analogon des Analyten oder umfasst einen Analyten oder ein Analogon des Analyten (unterscheidet sich aber von dem Ziel-Analyten dadurch, dass es „nachweisbar" ist, d.h. eine nachweisbare Gruppe aufweist). Solche „konkurrierenden Moleküle" sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.
Bei einem Inhibitionstest ist das Nachweisreagens ein solches Nachweisreagens, dessen Bindung an eine Bindungsstelle (z.B. einen Bindungspartner) durch das Vorliegen eines Analyten inhibiert wird. Das Nachweisreagens kann somit eine Bindungsaffinität für den Analyten aufweisen.
Der Begriff „interagiert mit dem Ziel-Analyten" beinhaltet somit verschiedene Formen der Wechselwirkung, und umfasst ebenso Nachweisreagenzien, die mit dem Analyten konkurrieren, als auch solche, die eine Bindungsaffinität für den Analyten aufweisen. Jede Form der Wechselwirkung mit dem Analyten, welche die Bestimmung des Vorliegens oder der Menge einer Ziel-Analytenvariante ermöglicht, ist im Schutzumfang der Erfindung umfasst.
Der das „Nachweisreagens" umfassende Konjugatbereich besteht praktischerweise aus einem Material, durch das die Probe fließen kann. Das Nachweisreagens wird im Konjugatbereich des Dipstick zurückgehalten oder gehalten. Der Analyt passiert den Konjugatbereich. Der Fluss der Probe zum und durch den Konjugatbereich setzt das Nachweisreagens in praktischer Weise frei. Der Fluss der Probe ermöglicht somit eine Freisetzung des Nachweisreagens und dessen Durchfluss zum Lesebereich. Das Nachweisreagens kann mit dem Analyten im Konjugatbereich oder im Lesebereich oder in beiden „interagieren". Falls das Nachweisreagens eine Bindungsaffinität für den Analyten aufweist, bindet der Analyt somit an das Nachweisreagens, an das beispielsweise eine signalerzeugende Substanz konjugiert ist, und der Analyt kann dadurch mit der signalerzeugenden Substanz markiert werden. Geeignete Beispiele für signalerzeugende Substanzen sind, ohne darauf beschränkt zu sein, farbige Partikel, Kolloide, Farbstoffe, Enzyme, Radioisotope, chemolumineszente oder fluoreszente Moleküle. Besonders bevorzugte signalerzeugende Substanzen beim erfindungsgemäßen Dipstick sind Partikel, z.B. Goldkolloid-Partikel und farbige Latexpartikel, wie beispielsweise blaue Latexpartikel. Solche Partikel können auf einfache Weise mit dem bindenden Liganden des Nachweisreagens beschichtet sein oder diesen auf andere Weise tragen. Andere geeignete signalerzeugende Substanzen umfassen Tracer, Marker und Markierungsstoffe, die dem Fachmann allgemein bekannt sind und von diesem in der Immunoassay-Technologie oft verwendet werden. Jede solcher verfügbaren signalerzeugenden Substanzen könnte für jeden Typ von erfindungsgemäßem Nachweisreagens verwendet werden.
Ein Nachweisreagens mit einer Bindungsaffinität für den Analyten kann ein jeder beliebige Ligand sein, der selektiv an den Analyten im Allgemeinen oder an den Ziel-Analyten im Besonderen zu binden vermag.
Das Nachweisreagens kann somit ein Affinitätsbindungspartner für den Analyten sein oder einen solchen Affinitätsbindungspartner umfassen. Ein solcher Bindungspartner oder Ligand wird praktischerweise und im Allgemeinen ein Protein sein. Der bindende Ligand kann vorteilhafterweise ein Antikörper oder ein Antikörperfragment sein (beispielsweise wie vorstehend besprochen).
Der erfindungsgemäße Dipstick-Test wird vorzugsweise in Verbindung mit der Analyse von Transferrinvarianten, z.B. CFT oder Asialotransferrin verwendet, und somit ist der bindende Ligand des Nachweisreagens (der „zweite bindende Ligand" des Dipstick) vorzugsweise ein Anti-Transferrin-Antikörper oder ein Fragment davon. Das Nachweisreagens kann, wie vorstehend erwähnt, auch der Analyt sein oder diesen umfassen (wobei als „Analyt" hier der Analyt im Allgemeinen oder die Ziel-Analytenvariante im Besonderen gemeint ist) oder ein Fragment oder ein Teil oder ein Analogon davon. Das Analogon kann beispielsweise ein Molekül oder eine Substanz sein, die mit dem Analyten um die Bindung an einen Bindungspartner zu konkurrieren vermag. Das Analogon kann somit ein Derivat des Analyten oder eine Analytenvariante sein, oder ein Molekül mit einer räumlichen Konfiguration usw., die der des Ziel-Analyten oder der Analytenvariante ähnelt. Im Fall der Bestimmung von Transferrinvarianten kann das Nachweisreagens somit ein Transferrinmolekül oder ein Fragment davon sein. Im Fall eines solchen „Kompetitor"-Nachweisreagens kann dieses ebenfalls an eine signalerzeugende Substanz, z.B. Partikel, konjugiert oder daran gebunden sein.
Der Lesebereich zum Nachweis des Analyten kann von dem Konjugatbereich getrennt sein oder ein Teil davon sein. Der Lesebereich sollte wenigstens für die Bestimmung des Vorliegens des Analyten geeignet sein, oder kann in ausgefeilterer Form die Quantifizierung der Menge des Analyten in der Probe ermöglichen. Dem Fachmann sind zur Quantifizierung des Analyten verschiedene Verfahren bekannt, beispielsweise kann eine Reihe von Kissen aufeinanderfolgend auf dem Dipstick verwendet werden, um die Menge des vorhandenen Analyten anhand der Farbe jedes Kissens und der Anzahl von Kissen, die sich färben, zu zeigen. Der Lesebereich umfasst vorzugsweise einen festen Träger (z.B. eine Membran, vorzugsweise eine Nitrozellulosemembran), auf dem ein Einfangreagens immobilisiert ist. Das Einfangreagens dient dazu, das Nachweisreagens „einzufangen" und es auf einer festen Oberfläche oder in immobilisierter Form zu „fixieren", um einen Nachweis des Nachweisreagens und ein „Lesen" des Tests im Lesebereich zu ermöglichen. Dieser Einfang kann direkt oder indirekt erfolgen. Ein an den Analyten gebundenes Nachweisreagens kann somit durch Bindung des Einfangreagens an den gebundenen Analyten eingefangen werden. Alternativ kann das Nachweisreagens direkt an das Einfangreagens binden.
Die Wahl des Einfangreagens hängt von dem verwendeten Nachweisreagens und/oder dem Typ des Tests-Formats ab. In einem Test vom Sandwich-Typ bindet das Einfangreagens spezifisch nur an den Analyten (und nicht an das Nachweisreagens). Das Nachweisreagens ist somit nur indirekt gebunden, indem es an den Analyten gebunden ist.
In einem Test vom Kompetitionstyp vermag das Einfangreagens sowohl an den Analyten als auch an das Nachweisreagens zu binden, wodurch sowohl das Nachweisreagens als auch der Analyt um eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen auf dem Einfangreagens konkurrieren werden.
In einem Test vom Inhibitionstyp ist das Einfangreagens nur für das Nachweisreagens spezifisch (und bindet nicht direkt an den Analyten).
Das Einfangreagens ist in jedem Fall ein bindender Ligand (oder Bindungspartner) entweder für den Analyten oder für das Nachweisreagens oder für beide.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nachweisreagens vorzugsweise einen zweiten bindenden Liganden mit einer Bindungsaffinität für den Analyten, und vorzugsweise ist eine signalerzeugende Substanz daran konjugiert. Der Lesebereich umfasst vorteilhafterweise als Einfangreagens auch einen dritten Liganden mit einer Bindungsaffinität für den Analyten, und wenn der Analyt den Lesebereich erreicht, kann eine Markierung durch den zweiten, an die signalerzeugende Substanz konjugierten Liganden auftreten oder nicht. Bei dieser Ausführungsform ist der Test somit ein Test vom Sandwich-Typ.
Typischerweise sind sowohl der zweite Ligand aus dem Konjugatbereich und der dritte Ligand aus dem Lesebereich Anti-Analyt-Antikörper (z.B. Anti-Transferrin-Antikörper), obwohl jeder andere geeignete Antikörper oder jeder andere Ligand mit einer Bindungsaffinität für den Analyten gleichermaßen gut verwendet werden könnte. Wenn jedoch Antikörper verwendet werden, sind Paare Analyten-bindender Antikörper mit Bindungsaffinität für unterschiedliche Epitope auf dem Analyten geeignet. Diese Antikörper können polyklonalen oder monoklonalen Ursprungs sein, und immunoreaktive Fragmente von Antikörpern können ebenfalls verwendet werden, ebenso wie andere Arten von bindenden Liganden, die für den Analyten, z.B. Transferrine, spezifisch sind.
In einem Test vom Inhibitionstyp vermag das Nachweisreagens den Analyten zu binden und kann somit vom selben Reagenstyp sein wie vorstehend für den Sandwich-Test besprochen wurde. In diesem Fall vermag jedoch der dritte Ligand im Lesebereich (d.h. das Einfangragens) nur an das Nachweisreagens zu binden, und nicht an den Analyten.
In diesem Fall kann das Nachweisreagens (dritter Ligand) somit beispielsweise ein Protein sein, das an Antikörper oder Fragmente davon zu binden vermag, z.B. ein Protein, das an den Fc-Teil von Antikörpern zu binden vermag, z.B. Protein A oder Protein G oder Domänen oder Teile davon, oder es kann wirklich ein Antikörper sein, der spezifisch an das Nachweisreagens zu binden vermag, z.B. ein Antikörper, der das Nachweisreagens an einer anderen Stelle bindet als der Analyt.
In einem Test vom Kompetitionstyp kann das Einfangreagens dem Einfangreagens der vorstehend beschriebenen Ausführungsform des Sandwich-Tests entsprechen. Das Nachweisreagens kann beispielsweise Transferrin oder ein Transferrin-Analogon sein, das an eine signalgebende Substanz konjugiert ist.
Die Wahl des Antikörpers (oder anderer bindender Liganden) wird von einer Anzahl von Faktoren, einschließlich der für den Test erforderlichen Sensitivität, bestimmt. Wenn ein monoklonaler Antikörper sowohl als der zweite „Konjugatbereich"-Ligand als auch als der dritte „Lesebereich"-Ligand gewählt wird, kann eine hohe Sensitivität des Tests erreicht werden. Der Antikörper weist vorzugsweise einen hohen Spezifitätsgrad für den Analyten (oder, falls zutreffend, für das Nachweisreagens) auf, so dass ein geringer Grad an Hintergrundbindung auftritt. Andererseits können polyklonale Antikörper verwendet werden und, falls dies der Fall ist, im Allgemeinen ein monoklonaler Antikörper in Verbindung damit für den alternativen Liganden. Wenn ein monoklonaler Antikörper als der dritte „Lesebereich"-Ligand verwendet wird, kann die Sensitivität im Allgemeinen schlechter sein, ein hoher Hintergrund und spezifische Bindung können auftreten und es kann erforderlich sein, die polyklonalen Antikörper mit Affinitätsreinigungstechniken zu behandeln. Wenn ein monoklonaler Antikörper als der zweite „Konjugatbereich"-Ligand verwendet wird, kann im Allgemeinen ein höherer Grad an Sensitivität erreicht werden, z.B. mittlere Sensitivität, aber es kann weiterhin der Nachteil eines hohen Hintergrunds an unspezifischer Bindung und die Notwendigkeit der Behandlung der polyklonalen Antikörper durch Affinitätsreinigungstechniken bestehen.
Wie vorstehend erwähnt, weist das Nachweisreagens eine nachweisbare Gruppe auf, praktischerweise eine signalerzeugende Gruppe, oder wird mit einer solchen nachweisbaren Gruppe versehen. Dies kann eine beliebige, dem Fachmann bekannte signalerzeugende Substanz sein.
Die signalerzeugende Substanz ist jedoch vorzugsweise dergestalt ausgebildet, dass sie für Nachweis- und Quantifizierungszwecke einfach sichtbar gemacht werden kann. Einige Markierungen erfordern für deren Sichtbarmachung die Zugabe anderer Reagenzien, und andere können die Verwendung eines bestimmten Instruments zu diesem Zweck erforderlich machen. Wenn die signalerzeugende Substanz beispielsweise ein Enzym ist, ist die Zugabe eines Substratreagens erforderlich, und fluoreszierende Moleküle können über standardmäßige Techniken der Exzitation/Abstrahlung nachgewiesen werden, welche dem Fachmann allgemein bekannt sind. Wenn Reflektormeter zum Nachweis elektromagnetischer Strahlung oder Scanner zum Nachweis von Radioisotopen verwendet werden, ist dafür eine Instrumentierung erforderlich. Andererseits können farbige Substanzen von der Person, die den Test durchführt, nachgewiesen und direkt sichtbar erfasst werden. Somit sind jedes beliebige Verfahren zur Sichtbarmachung und jede beliebige signalerzeugende Substanz, welche ohne die Benutzung weiterer Ausrüstung oder weiterer Reagenzien außer den in dem Dipstick enthaltenden auskommt, bevorzugt.
Partikelmarkierungen, die direkt sichtbar sind (z.B. mit bloßem Auge), werden besonders bevorzugt. Diese können in Form fester Partikel vorliegen, die z.B. selbst farbig sind, oder als Vesikel, die eine sichtbare Substanz, z.B. einen Farbstoff oder eine andere farbige Substanz enthalten. Solche Vesikel können z.B. Liposomen oder ähnliche Vesikel sein, Zelleichen von Erythrozyten, Polymermikrokapseln usw. Weitere Partikel umfassen polymere Kerne, die mit einer signalerzeugenden Substanz beschichtet sind, oder Partikel einer wässrigen Dispersion eines hydrophoben Farbstoffs oder Pigments.
Die sichtbare Partikelmarkierung kann auch aus sichtbaren Polymerpartikeln wie beispielsweise farbigen Polystyrolpartikeln bestehen, die beispielsweise eine kugelförmige Gestalt aufweisen.
Als stellvertretende Beispiele weiterer Partikelmarkierungen, durch die das Nachweisreagens sichtbar wäre, können erwähnt werden: Ferritin, Phycoerythrine oder andere Phycobili-Proteine; präzipitierte oder unlösliche Metalle oder Legierungen; Pigmente oder Derivate davon aus Pilzen, Algen oder Bakterien, beispielsweise bakterielle Chlorophylle; Pflanzenmaterialien oder Derivate und dergleichen.
Ein bindender Ligand (oder Analyt oder ein Analogon eines Analyten usw.) kann zur Herstellung eines Nachweisreagens zur erfindungsgemäßen Verwendung mit der Partikelmarkierung über Verfahrensweisen markiert werden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, wobei die verwendete Verfahrensweise beispielsweise von dem bindenden Liganden usw. und der Partikelmarkierung abhängt. Solche Techniken umfassen Adsorption, kovalente Kopplung, Derivatisierung und Aktivierung und dergleichen.
Der Konjugatbereich liegt praktischerweise in Form eines Konjugatkissens vor, und dieses erfüllt vorteilhafterweise eine Reihe unterschiedlicher Funktionen. Dementsprechend vermag das Konjugatkissen vorzugsweise ein gleichbleibendes Volumen an Nachweisreagenslösung aufzunehmen und zu halten, und das Probenvolumen effizient und in gleichbleibender Weise in den Lesebereich, z.B. zur Membran des Lesebereichs, zu übertragen. Vorzugsweise vermag der Konjugatbereich auch die Stabilität des Nachweisreagens aufrechtzuerhalten. Dies bedeutet, dass das Nachweisreagens bei Lagerung als trockener Feststoff mindestens ein Jahr, vorzugsweise mindestens 18 Monate und noch bevorzugter zwei Jahre, drei Jahre oder länger als fünf Jahre stabil sein sollte. Vorzugsweise vermag das Konjugatkissen das Nachweisreagens auch in gleichbleibender Weise und quantitativ freizusetzen. Das Konjugatkissen besteht vorzugsweise aus Glasfaserfiltern, Zellulosederivaten (Papier) oder nicht-gewebten Filtern, welche Eigenschaften aufweisen, die im Zusammenhang mit bevorzugten Materialien für das Probenkissen vorstehend erläutert wurden. Anders als bei den Probenkissen ist gewebtes Fasermaterial jedoch für die Konjugatkissen weniger bevorzugt.
Das Nachweisreagens kann über jedes geeignete Mittel, z.B. Adsorption usw., in dem Konjugatkissen gehalten oder zurückgehalten werden, wobei dies in der Dipstick-Technologie Standard ist.
Eine weitere Funktion des Konjugatkissens kann in der Kontrolle des Volumens der Probe liegen, die analysiert wird. Nur das Probenvolumen, das vor oder zusammen mit dem Nachweisreagens wandert, kann zu dem Signal beitragen. Die Sensitivität des Tests kann somit durch die Eigenschaften des Konjugatkissens reguliert werden. Beispielsweise kann eine geringere Sensitivität des Tests vorliegen, wenn im Wesentlichen das gesamte Konjugat freigesetzt wird, nachdem fünf Mikroliter Probe den Konjugatbereich passiert haben. Eine höhere Sensitivität des Tests kann vorliegen, wenn beispielsweise 25 Mikroliter der Probe erforderlich sind, bevor das gesamte Konjugat freigesetzt wird. Alternativ kann eine variable Sensitivität des Tests erreicht werden, wenn das Konjugat manchmal freigesetzt wird, nachdem fünf Mikroliter Probe den Konjugatbereich passiert haben, und manchmal nachdem 25 Mikroliter Probe den Konjugatbereich passiert haben. Es ist jedoch ersichtlich, dass die in diesen Beispielen genannten Volumen von 5 und 25 Mikrolitern die Prinzipien der Sensitivität des Tests beispielhaft wiedergeben und nicht darauf beschränkt sind. Größere und kleinere Probenvolumen können in Abhängigkeit von der Kapazität des Dipsticks den selben Effekt bewirken, wobei die Kapazität von einer Reihe von Faktoren abhängt, einschließlich der Zahl der verwendeten Konjugatkissen und der Kapazität jedes Konjugatkissens, ebenso wie von der Menge an Nachweisreagens, die in dem Konjugatkissen enthalten ist.
Gemäß Prinzipien, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, können Signalverstärkungssysteme in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Nachweisreagens/Nachweis-Mitteln verwendet werden. Wenn ein Nachweisreagens beispielsweise eine Partikelmarkierung als signalerzeugende Gruppe umfasst, kann das Verstärkungssystem dementsprechend ein sekundäres Partikel mit einer Bindungsaffinität für die Partikelmarkierung des Nachweisreagens (d.h. des „ersten Partikels") umfassen. Das Verstärkungsreagens kann somit ein Partikel (z.B. eine Partikelmarkierung wie vorstehend besprochen) sein, die an einen bindenden Liganden für z.B. ein Antigen oder Epitop auf dem ersten Partikel konjugiert ist. Das erste Partikel kann eine Reihe von Bindungsstellen für das Verstärkungsreagens aufweisen, und somit kann die Bindung eines einzelnen ersten Partikels im Lesebereich zur Bindung einer Vielzahl sekundärer Partikel führen und somit eine Signalverstärkung erreicht werden.
Es können weitere Signalverstärkungssysteme verwendet werden, ebenso wie andere Nachweismittel. Beispielsweise können in ähnlicher Weise Enzyme oder Antikörperkonjugate in Verbindung mit einem Enzymsubstrat verwendet werden. In dieser Hinsicht sind beispielsweise chemilumineszente Substrate brauchbar und können im Rahmen von Signalverstärkung verwendet werden. Solche Systeme können brauchbar sein, wenn Analyten in niedrigen Konzentrationen vorliegen.
Im Allgemeinen können die Probenvolumen und die Nachweistechnologie in den Konjugat- und/oder Lesebereichen in Abhängigkeit von den gewählten Lesemodalitäten und der Konzentration der nachzuweisenden Ziel-Analytenvariante ausgewählt werden. In dem selben Dipstick können Kombinationen verschiedener Modalitäten verwendet werden, was eine Vorrichtung mit zwei- oder mehrstufiger Sensitivität ermöglicht.
Das Konjugatkissen kann gleichzeitig mit dem Nachweisreagens weitere Reagenzien enthalten, was zu einer Reihe von Vorteilen führen kann. Das Konjugatkissen kann beispielsweise zusätzlich zum Nachweisreagens weitere Reagenzien enthalten, die in der Lage sind, eine nicht-spezifische Bindung des Nachweisreagens und/oder Analyten zu verhindern. Damit würde das Erfordernis der Behandlung des Lesebereichs mit blockierenden Agentien zur Verhinderung unspezifischer Bindung in dem Lesebereich beseitigen oder vermindern. Diese Möglichkeit ist jedoch ebenfalls vorgesehen. Dementsprechend kann das Konjugatkissen im Vorfeld mit blockierenden Agenzien beladen werden, so dass diese zusammen mit dem Nachweisreagens freigesetzt werden und in den Lesebereich fließen. Beispiele für blockierende Agenzien sind Albumin, Casein und Gammaglobulin. Weitere übliche blockierende Agenzien, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden. Vorzugsweise wird Rinderserumalbumin (BSA) verwendet. Weitere geeignete blockierende Agenzien umfassen eine lange Liste von Proteinen und Polyvinylalkohol, SDS und andere dem Fachmann bekannte Materialien. Falls es erwünscht ist, dass das blockierende Agens keine unerwünschten Gruppen wie beispielsweise Kohlenhydrate oder Sialinsäurereste enthalten soll, können diese unter Verwendung üblicher Mittel, z.B. Enzyme, aus dem blockierenden Agens entfernt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst der Lesebereich einen Einfang-(Test)-Bereich und einen Kontroll-(Negativ)-Bereich. Der Einfangbereich umfasst ein darauf immobilisiertes Einfangreagens, wobei das Einfangreagens vorzugsweise, wie vorstehend beschrieben, ein Antikörper gegen den Ziel-Analyten ist.
Die Einfangreagens-Antikörper binden an den Analyt-Nachweisreagens-Komplex, so dass der Analyt-Nachweisreagens-Komplex im Einfangbereich nachgewiesen werden kann. Der Einfangbereich kann somit beispielsweise das in einem erkennbaren Muster, z.B. einem quer zur Flussrichtung der Probe angeordneten Streifen, immobilisierte Einfangreagens umfassen, wodurch eine nachweisbare „Positivlinie" gebildet wird, wenn die Probe am Einfangbereich vorbeiwandert.
Der Kontrollbereich umfasst ein ebenfalls in einem erkennbaren Muster an die Membran gebundenes immobilisiertes Reagens, welches das Nachweisreagens einfängt und ein nachweisbares Signal liefert, wenn der Test ordnungsgemäß verwendet wurde, beispielsweise die Bildung einer farbigen Linie. Der Kontrollbereich liefert ein identifizierbares Signal, ob es eine identifizierbare Positivlinie gibt oder nicht, d.h. der Kontrollbereich bringt ein nachweisbares Signal hervor, falls der Test ordnungsgemäß verwendet wurde, unabhängig davon, ob irgendein Analyt in der analysierten Probe vorlag.
Wenn ein kolorimetrisches Nachweismittel verwendet wird, d.h. wenn das Nachweisreagens an eine signalerzeugende Substanz konjugiert ist und die signalerzeugende Substanz sichtbar ist, wie beispielsweise ein farbiges Latexpartikel, dann ist die Farbe, die auf der Positivlinie hervorgebracht wird, im Allgemeinen proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe.
In der praktischen Anwendung wird die Negativkontrolllinie im Allgemeinen durch irgendein nicht-gebundenes Nachweisreagens gebildet, das durch das nach Freisetzung des Nachweisreagens in das Konjugatkissen eintretende Probenvolumen über die Einfangzone hinaus getragen wird.
Ein weiteres optionales Merkmal des erfindungsgemäßen Dipstick ist ein absorbierendes Kissen, das praktischerweise am Ende des Dipsticks angeordnet ist, vorzugsweise jenseits des Lesebereichs an dem Ende, das dem Probenauftragungsbereich entgegengesetzt ist. Das absorbierende Kissen ist so konzipiert, dass es die Probe absorbiert, nachdem diese den Einfangbereich passiert hat, und die Kapazität des absorbierenden Kissens bestimmt vorzugsweise das Volumen der getesteten Probe.
Der Dipstick kann vorzugsweise einen Plastikträger umfassen, an den eines oder alle der Konjugatkissen, der Lesebereich (z.B. Membran) und das absorbierenden Kissen direkt oder indirekt angebracht sind, beispielsweise durch einen Klebstoff. Die Membran besteht vorzugsweise aus Nitrozellulose. Der Probenauftragungsbereich und/oder Screening-Bereich (z.B. Proben- und/oder Screeiningkissen) können ebenfalls direkt oder indirekt an dem Plastikträger angebracht sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Analyt über das Markierungsnachweismittel quantifiziert, und die Menge des Analyten, die den Lesebereich erreicht und im Lesebereich immobilisiert bleibt, ist somit proportional zur Menge des Analyten in der Probe.
In einer weniger bevorzugten Ausführungsform wird jedoch die Gesamtmenge des Analyten, z.B. Transferrrin (d.h. alle Analytenvarianten) in der ursprünglichen Probe gemessen, und die Menge an Analyt, die nicht in dem „Screening-Bereich" zurückgehalten wird, kann dann durch Messung der Menge an Analyt (z.B. Transferrin) erfolgen, die nicht von dem ersten bindenden Liganden in dem Screening-Bereich zurückgehalten wird, d.h. die Menge an Analyt (z.B. Transferrin), die markiert und anschließend in dem Lesebereich immobilisiert wird.
Neben der zu untersuchenden Probe werden im Allgemeinen bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens Eichproben mit bekannten Analytengehalten beurteilt werden. Solche Bestimmungen können dazu verwendet werden, eine Eichkurve zu zeichnen, aus welcher der CFT-Gehalt der untersuchten Probe bestimmt werden kann. Im Falle von Transferrin werden vorzugsweise Eichproben mit Transferringehalten von bis zu 0,05 mg/ml (z.B. 0,002, 0,01, 0,02 und 0,03 mg/ml) verwendet. (Diese werden selbstverständlich nicht über die Kohlenhydrat-bindenden Liganden zur Abtrennung der Kohlenhydrat-enthaltenden Varianten geleitet).
Weiterhin kann über das erfindungsgemäße Testverfahren vorzugsweise der Gesamttransferringehalt der Probe bestimmt werden, wobei jede geeignete Vorgehensweise für den Test (z.B. Turbidimetrie usw.) verwendet werden kann. Vorzugsweise wird jedoch dieselbe Vorgehensweise für den Test verwendet, d.h. ein Dipstick-Test, z.B. ein Immunchromatographie-Teststreifen für „Gesamt"-Transferrin (d.h. alle Transferrinvarianten). Auf diese Weise kann der CFT-Gehalt als Prozentsatz des Gesamttransferrins (%CFT) bestimmt werden. %CFT kann ein genauerer Marker für Alkoholkonsum als Gesamt-CFT sein, und ein Schwellenwert, z.B. 1 %, kann gesetzt werden. Unter einem diagnostischen Gesichtspunkt ist jedoch vernünftigerweise anzunehmen, dass das Vorliegen irgendeines CFT auf Alkoholmissbrauch hinweist.
Alternativ dazu kann CFT als tatsächliche Konzentration bestimmt werden (d.h. als Masse pro Volumeneinheit.
Ein Auslesen zur Quantifizierung des Analyten kann beispielsweise durch Verwendung geeigneter Reflektometer oder wahlweise von PC-Flachscannern des in der WO 98132004 beschriebenen Typs erfolgen.
Die Eichung kann entweder durch Verwendung einer Eichprobe mit bekanntem Analytengehalt (z.B. Asialotransferrin) erfolgen, der über unabhängige Referenzmethoden gemessen wurde, wie beispielsweise der in Alcoholism: Clinical and Experimental Research Bd. 21, Nr. 9, Seiten 1710-171, 1997, „Transferrin isoform distribution: Gender and Alcohol Consumption" von Martensson et al. beschriebenen Methode. In dieser Publikation ermöglicht die Verwendung von HPLC-Isolierung, gefolgt von einer Quantifizierung des Transferringehalts jeder isolierten Fraktion über Radioimmunassay die Messung des Gehalts an Asialotransferrin in mg Asialotransferrin pro Liter oder als Prozentsatz des Gesamttransferringehalts.
Bei dem erfindungsgemäßen Dipstick-Test bringt man in der allgemeinsten Form einfach die Probe mit dem (den) bindenden Liganden (zum Zwecke des Screenens) in Kontakt und misst die abgetrennte Fraktion, die nicht bindet, oder weist diese Fraktion nach. Der bindende Ligand ist vorzugsweise ein Kohlenhydrat-bindender Ligand.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung somit einen Dipstick zur Bestimmung des Gehalts einer Analytenvariante (einer „Ziel-Analytenvariante") in einer Mischung von Analytenvarianten in einer Probe breit, umfassend:

a) einen Bereich, um eine Probe mit einem bindenden Liganden in Kontakt zu bringen, der eine Bindungsaffinität für eine Variante des Analyten aufweist, die nicht bestimmt werden sollen) (d.h. Nichtziel-Analytenvarianten), um die Abtrennung einer nicht-bindenden Fraktion zu ermöglichen, welche die zu bestimmende Analytenvariante enthält;
b) einen Bereich zur Bestimmung des Analytengehalts der nicht-bindenden Fraktion.

In einer bevorzugten Ausführungsform stellt dieser Aspekt der Erfindung einen Dipstick bereit, umfassend:

a) einen Bereich, um eine Probe und einen Kohlenhydrat-bindenden Liganden in Kontakt zu bringen, um die Abtrennung einer nicht-bindenden Fraktion zu ermöglichen, welche den zu bestimmenden Analyten enthält;
b) einen Bereich zur Bestimmung des Analytengehalts der nicht-bindenden Fraktion. Vorzugsweise ist der Kohlenhydrat-bindende Ligand ein Lektin oder eine Mischung von Lektinen, und der nachzuweisende Analyt ist CFT. Unter diesen Bedingungen kann die nicht-bindende Fraktion als im Wesentlichen Kohlenhydrat-frei angesehen werden. Wie vorstehend erwähnt, kann die nicht-bindende Fraktion alternativ zusätzlich zu dem CFT auch CDT-Varianten umfassen (insbesondere Mono- und/oder Disialotransferrine).

In einem bevorzugten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zur Bestimmung Kohlenhydrat-freien Transferrins in einer Körperflüssigkeit zur Verwendung bei der Beurteilung des Alkoholkonsums bereit, wobei man bei diesem Verfahren

a) eine Probe der Körperflüssigkeit mit einem Kohlenhydrat-bindenden Liganden in Kontakt bringt, um Kohlenhydrate oder Kohlenhydrat-enthaltende Reste in der Probe an den Liganden zu binden;
b) eine an diesen Liganden nicht-bindende Fraktion abtrennt und
c) den Transferringehalt in der Fraktion bestimmt, wobei der Kohlenhydrat-bindende Ligand auf einem Dipstick immobilisiert ist und wobei die Schritte des Abtrennens und Bestimmens (b) und (c) auf dem Dipstick stattfinden.

„Im Wesentlichen Kohlenhydrat-frei" bedeutet, dass die in dieser Fraktion enthaltenden Moleküle im Wesentlichen Kohlenhydrat-frei sind (d.h. wenigstens 60 % der Moleküle sind Kohlenhydrat-frei, z.B. wenigstens 70, 80, 90 oder 95 % sind Kohlenhydratfrei).
Für den fachkundigen Leser ist es in diesem Zusammenhang klar, dass auf Grund der Natur der wissenschaftlichen und analytischen Laborvorgehensweisen und der biologischen Materialien absolute Präzision und einheitliches Verhalten niemals garantiert werden können und dass eine 100 %ige Abtrennung nicht immer erreicht werden kann. In jedem solchen System muss ein gewisser Toleranzwert zugestanden werden, wobei dieses Prinzip von Fachleuten akzeptiert wird. In dem erfindungsgemäßen Trennungssystem kann die klinische Brauchbarkeit gewahrt bleiben, selbst wenn die Abtrennung nicht zu 100 % vollständig sein sollte.
Wenn der Analyt Transferrin ist, wurde insbesondere gefunden, dass Transferrinvarianten mit einem niedrigen Kohlenhydratgehalt (d.h. die CDT-Varianten Mono- und Disialotransferrin) mit einer niedrigen Affinität an die Kohlenhydrat-bindenden Liganden, insbesondere mit einer niedrigeren Affinität als die Transferrinvarianten mit einem höheren oder hohen Kohlenhydratgehalt (d.h. die höher sialysierten Transferrine Penta-, Tetra- und Trisialotransferrine) binden können, und somit nicht alle in der „bindenden" Fraktion zurückgehalten werden, wenn der Analyt Transferrin ist. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Abtrennungsschritts (d.h. im Screening-Bereich) können Kohlenhydrattragende Varianten von CDT (d.h. die niedriger sialysierten Varianten) dementsprechend mit geringerer Effizienz abgetrennt werden und somit zusammen mit CFT in die „nicht-bindende" Fraktion abgetrennt werden. Es wurde insbesondere festgestellt, dass ein Teil oder eine Fraktion des Disialo- und/oder Monosialotransferringehalts der Probe zusammen mit CFT (Asialotransferrin) in die „nicht-bindende" Probe abgetrennt werden kann. Anders ausgedrückt kann eine unvollständige Abtrennung von CFT erreicht werden, bei der die abgetrennte („nicht-bindende") Fraktion CFT und einige oder alle der Monosialotransferrine und einige der Disialotransferrine enthalten kann. Wie vorstehend erwähnt wurde, kann die Erfindung diese unvollständige Abtrennung von CFT tolerieren, ohne dass dadurch der klinische Wert des Tests beeinträchtigt würde.
Es wurde insbesondere festgestellt, dass die in einem gegebenen System erreichbare Abtrennung reproduzierbar ist, und da für eine gegebene Abtrennungsvorgehensweise die Art und Menge oder der Anteil der abgetrennten Varianten konstant (d.h. reproduzierbar) ist, kann diese unvollständige Abtrennung somit berücksichtigt werden – die tatsächlichen Mengen oder Anteile der verschiedenen abgetrennten Varianten spielen keine Rolle, solange die Abtrennung zwischen einzelnen Läufen reproduzierbar ist. Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, dass eine hohe Korrelation zwischen den Asialo-(CFT)- und Disialotransferringehalten in einer Probe besteht, und diese Disialofraktion bei der Bestimmung berücksichtigt werden kann, da Disialotransferrin ebenfalls ein aussagekräftiger Marker für Alkoholismus ist. Anders ausgedrückt können die Berechnungen unter Berücksichtigung der Mengen, Werte oder Konzentrationen, die für den Mono- und Disialogehalt der Probe bestimmt wurden, durchgeführt werden. Dies kann unter Verwendung mathematischer Methoden und Korrelationen erfolgen, die für den Fachmann Standard sind.
Alle Verfahren und Tests im Stand der Technik, einschließlich solcher, die gegenwärtig kommerziell angewandt werden, beruhen auf der Identifizierung und Quantifizierung unterschiedlicher Transferrinvarianten auf der Grundlage von Unterschieden der Ladung und folglich des pI der unterschiedlichen Varianten. Wenn die Primärstruktur, d.h. die Aminosäuresequenz der Transferrinvarianten konstant ist, entstehen diese Ladungsunterschiede durch Verlust negativ geladener Sialinsäurereste, wodurch der pI der Transferrinvarianten schrittweise mit jedem verlorenen Sialinsäurerest ansteigt.
Die Primärstruktur des Transferrinpolypeptids ist jedoch bekannterweise polymorph und das vorwiegende Auftreten bestimmter Aminosäuresequenzisoformen ist je nach Rassenherkunft unterschiedlich. Beispielsweise besitzt im Vergleich zum „normalen" Transferrin, das in kaukasischen Populationen dominiert, die Transferrin D-Variante einen einzelnen, nicht-konservativen Aminosäureaustausch im Polypeptid-Rückgrat, der den isoelektrischen Punkt der Transferrinvariante beeinflusst. Die D-Variante ist in Populationen japanischen und schwarzafrikanischen Ursprungs verbreitet. Der nicht-konservative Aminosäureaustausch verändert die Nettoladung und damit den pI des Transferrin-Rückgrats mit dem Ergebnis, dass bei Untersuchungen mit isoelektrischer Fokussierung oder gleichwertigen Verfahren viele falsch-positive Ergebnisse für Japaner oder Schwarzafrikaner erstellt werden. Dies ist eindeutig nicht akzeptabel und bedeutet, dass in Populationen, in denen die Transferrin D-Variante verbreitet ist, ein zweiter Test durchgeführt werden muss, um festzustellen, welche Transferrinvariante bei dem untersuchten Individuum exprimiert wird. Dies erhöht in großem Maße die Gesamtkosten, den Zeitaufwand und die Komplexität der Beurteilung von Alkoholismus.
Da der erfindungsgemäße Test in seiner bevorzugten Ausführungsform, bei welcher der Analyt CFT (oder CFT zusammen mit CDT-Varianten) ist, ausschließlich auf dem Vorliegen oder Fehlen von Kohlenhydratresten, die mit dem Polypeptid-Rückgrat von Transferrin assoziiert sind, beruht, wird er nicht von Polymorphismen der Aminosäuresequenz beeinflusst und erzeugt damit keine falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnisse auf Grund der Polymorphismen der von dem klinisch untersuchten Individuum exprimierten Varianten. Die vorliegende Erfindung ist somit besonders vorteilhaft, da sie rassenunabhängig ist.
Die Erfindung wird nun durch die nachfolgenden nicht-beschränkenden Beispiele und die begleitenden Figuren veranschaulicht, wobei:
1 einen Dipstick gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zeigt. Mit Lektin beschichtete Partikel sind auf dem Probenkissen (2) gezeigt; mit Anti-Transferrin beschichtete Partikel sind auf dem Konjugatkissen (4) gezeigt; Einfangreagenzien (Anti-Transferrin-Antikörper) sind auf der Testlinie (6) und Einfangreagenzien (sekundäre Antikörper) auf der Kontrolllinie (7) gezeigt.
Der Dipstick besteht aus einem trockenen hydrophilen Dochtmaterial, wie beispielsweise Nitrozellulose, welches einen Träger umfassend ein Bindemittel und einen Klebstoff (1) für die verschiedenen Kissen und immobilisierten Zonen, die in ihm enthalten sind, bereitstellt. Die zu testende Probe wird auf den Probenauftragungsbereich (Probenkissen (2)) aufgetragen und wird durch natürliche Diffusion und unter Mithilfe des Adsorbersammelkissens (3), das am entgegengesetzten Ende des Dipstick bereitgestellt wird, durch den Dipstick gezogen. Immobilisierte Lektine werden auf dem ersten Teil des Dipstick entweder auf einem getrennten Kissen, das mit dem Probenauftragungskissen in Kontakt steht, oder auf dem Probenkissen selbst (wie in der Zeichnung gezeigt) bereitgestellt. Das Konjugatfreisetzungskissen (4) steht ebenfalls in Kontakt mit dem immobilisierten Lektinbereich, so dass die Bereiche miteinander in freier Fließverbindung stehen und die Probe wiederum der Reihe nach durch jeden Bereich fließt, z.B. entlang der Membran (5). Das Konjugatfreisetzungskissen (4) enthält das markierte Nachweisreagens, das beispielsweise aus einem Anti-Transferrin-Antikörper, der an eine blaue Latexpartikelmarkierung konjugiert ist, besteht. Der Lesebereich, der eine Testlinie (6) umfasst, und der Kontrolllesebereich, der eine Kontrolllinie (7) umfassen kann, stehen in Kontakt mit dem Konjugatfreisetzungsbereich (4), aber sind in einer Entfernung davon angeordnet, und auf ihnen sind die Antikörper in einem Streifen quer über den Dipstick immobilisiert, so dass ein farbiger blauer Streifen sichtbar wird, wenn die Asialotransferrinmarkierten Moleküle an die Antikörper gebunden werden. Die Stärke der auf dem Dipstick sichtbaren Farbe zeigt die Menge des in der Probe enthaltenen Asialotransferrins an und ermöglicht bei einem positiven Ergebnis das Stellen einer Diagnose auf Alkoholismus.
Beispiel 1 zeigt die Ergebnisse unter Verwendung eines Dipstick nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
Beispiel 1
Quantifizierung von CFT über immobilisiertes Lektin aus Sambuccus nigra in einem Dipstick-Format.

a. Man mischte eine 10 μl Serumprobe mit 0,5 ml 20 mM TRIS-Puffer pH = 7,5, der 150 mM Natriumchlorid enthielt.
b. Man tauchte einen Dipstick in die Mischung ein, so dass die Probe mit dem Probenauftragungsbereich des Dipstick in Kontakt trat, und ließ die Mischung durch Dochtwirkung durch die Dipstick-Vorrichtung wandern. Der verwendete Dipstick bestand aus einem Probenauftragungsbereich, der ein einzelnes aus Glasfasermaterial bestehendes Kissen umfasste, und dieses stand in direktem Kontakt mit einem zweiten Kissen (dem Screening-Bereich), das ebenfalls aus Glasfasermaterial bestand und auf dem SNA-Lektin und ConA immobilisiert waren. Der Dipstick wies einen Konjugatfreisetzungsbereich auf, der in Kontakt stand mit dem Lektin-enthaltenden „Screening-Bereich", und das Nachweisreagens war ein Anti-Transferrin-Antikörper, der mit einem blauen Latexpartikel markiert war. Hinter dem Konjugatfreisetzungsbereich enthielt der Dipstick einen Lesebereich, der Anti-Transferrin-Antikörper enthielt, die auf diesem auf dem Nitrozellulosemembran-Trägermaterial des Dipstick immobilisiert waren. Die immobilisierten Anti-Transferrin-Antikörper waren zusätzlich mit einem Blockierungsagens (BSA) beschichtet, um nicht-spezifische Proteinadsorption zu verhindern. Schließlich wurde ein Adsorbersammelkissen am entfernten Ende des Dipstick (d.h. dem zum Probenauftragungsbereich entgegengesetzten Ende) bereitgestellt, und dieser „zog" die Probe durch den Dipstick, so dass diese wiederum innerhalb eines vernünftigen Zeitrahmens nacheinander mit jedem der unterschiedlichen „Bereiche" des Dipstick in Kontakt trat.
c. Man maß die Farbintensität der Inspektionszone über Reflektometrie und berechnete den Asialotransferringehalt der Probe daraus.

Claims

Dipstick zur Bestimmung des Gehalts einer Ziel-Analytenvariante in einer Mischung von Analytenvarianten in einer Probe, umfassend: (a) einen Bereich, um eine Probe mit einem bindenden Liganden in Kontakt zu bringen, der eine Bindungsaffinität für eine Nichtziel-Analytenvariante aufweist, um die Abtrennung einer nicht-bindenden Fraktion zu ermöglichen, welche die Ziel-Analytenvariante umfasst; (b) einen Bereich zur Bestimmung des Analytengehalts der nichtbindenden Fraktion, wobei die Ziel-Analytenvariante eine Kohlenhydrat-freie Variante des Analyten ist.
Dipstick nach Anspruch 1, umfassend: (a) ein Probenauftragungsbereich (b) einen Screening-Bereich mit einem immobilisierten bindenden Liganden, der eine Bindungsaffinität für eine Nichtziel-Analytenvariante oder Nichtziel-Analytenvarianten aufweist, (c) einen Konjugatbereich, der ein Nachweisreagenz umfasst, (d) einen Lesebereich zum Nachweis des Analyten.
Dipstick nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kohlenhydrat-freie Variante Kohlenhydrat-freies Transferrin (CFT) oder Asialotransferrin ist.
Dipstick nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Ziel-Analytenvariante Kohlenhydrat-freies Transferrin und Disialotransferrin umfasst.
Dipstick nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Ziel-Analytenvariante Kohlenhydrat-freies Transferrin, Monosialotransferrin und Disialotransferrin umfasst.
Dipstick nach einem der Ansprüche 7 bis 5, wobei der bindende Ligand, der eine Bindungsaffinität für eine Nichtziel-Analytenvariante aufweist, selektiv an ein Oligosaccharid oder eine Zuckerstruktur oder an Kohlenhydrat-enthaltende Reste auf der Nichtziel-Variante zu binden vermag.
Dipstick nach Anspruch 6, wobei der bindende Ligand mit einer Affinität für eine Nichtziel-Analytenvariante ein Sialinsäure-bindendes Lektin ist.
Dipstick nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei mehr als ein bindender Ligand auf dem Screening-Bereich immobilisiert ist, wobei jeder unterschiedliche bindende Ligand eine unterschiedliche Selektivität und Spezifität aufweist.
Dipstick nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei das Nachweisreagenz eine signalerzeugende Gruppe umfasst.
Dipstick nach Anspruch 9, wobei die signalerzeugende Gruppe eine sichtbare partikuläre Markierung umfasst.
Dipstick nach Anspruch 10, wobei die partikuläre Markierung ein kolloidales Goldpartikel oder ein farbiges Latexpartikel ist.
Dipstick nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei das Nachweisreagenz einen zweiten Liganden mit einer Bindungsaffinität für den Analyten umfasst.
Dipstick nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei das Nachweisreagenz den Analyten oder ein Fragment oder einen Teil oder ein Analogon davon umfasst.
Dipstick nach Anspruch 12, wobei der zweite Ligand ein Anti-Transferrin-Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Dipstick nach einem der Ansprüche 2 bis 14, wobei der Lesebereich einen festen Träger mit einem darauf immobilisierten Einfang-Reagenz umfasst.
Dipstick nach Anspruch 15, wobei das Einfang-Reagenz ein dritter bindender Ligand ist, der eine Bindungsaffinität für den Analyten oder das Nachweisreagenz oder für beide aufweist.
Dipstick nach Anspruch 16, wobei der dritte bindende Ligand ein Antikörper gegen die Ziel-Analytenvariante ist.
Dipstick nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der bindende Ligand mit einer Bindungsaffinität für eine Nichtziel-Analytenvariante ein Kohlenhydratbindendes Lektin oder eine Mischung Kohlenhydrat-bindender Lektine ist, und die Ziel-Analytenvariante Kohlenhydrat-freies Transferrin (CFT) ist.
Verfahren zur Bestimmung von Kohlenhydrat-freiem Transferrin in einer Körperflüssigkeit zur Verwendung bei der Beurteilung des Alkoholkonsums, wobei man bei diesem Verfahren (a) eine Probe der Körperflüssigkeit mit einem Kohlenhydrat-bindenden Liganden qin Kontakt bringt, um Kohlenhydrate oder Kohlenhydrat-enthaltende Reste in der Probe an den Liganden zu binden; (b) eine an diesen Liganden nicht bindende Fraktion abtrennt und (c) den Transferringehalt in der Fraktion bestimmt, wobei der Kohlenhydrat-bindende Ligand auf einem Dipstick immobilisiert ist und wobei die Schritte des Abtrennens (b) und Bestimmens (c) auf dem Dipstick stattfinden.
Verfahren zur Bestimmung des Gehalts einer Ziel-Analytenvariante in einer Mischung von Analytenvarianten in einer Probe, wobei man bei diesem Verfahren die Probe mit einem Dipstick nach einem der Ansprüche 1 bis 18 in Kontakt bringt und den Gehalt der Ziel-Analytenvariante in der Probe bestimmt, wobei die Ziel-Analytenvariante eine Kohlenhydrat-freie Variante des Analyten ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Ziel-Analytenvariante Kohlenhydratfreies Transferrin, Monosialotransferrin und Disialotransferrin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei die Probe eine Körperflüssigkeit umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Körperflüssigkeit Harn oder Blut oder eine von Blut abgeleitete Probe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei die Ziel-Analytenvariante Kohlenhydrat-freies Transferrin und Disialotransferrin umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei der Bestimmungsschritt ein Quantifizieren des Kohlenhydrat-freien Transferrins oder der Kohlenhydrat-freien Ziel-Analytenvariante umfasst.