SE501668C2 - Kvantifiering av CD-transferrin vid hög alkoholkonsumtion med HPLC - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 501 668 beroende på järnmättning, innehåii av siaiinsyra (SA) eiïer aminosyra- utbyten. Efter fuiïbordad järnmättning (2 Fe atomer per moïekyï) upp- deïas transferrin normait i 4 isoformer benämnda efter sina ungefärii- ga isoeiektriska punkter (pl) pI 5,2 (5 SA), pI 5,4 (4 SA, huvudfrak- tion), pI 5,6 (3 SA) samt pI 5,7 (2 SA). Små mängder av transferrin med pI 5,6 och 5,7 finns i normait serum. Den isoform som k1art ökar i serum från aïkohoiister är pl 5,7.AFraktionen pI 5,7 är normait mindre än 0,8 2 av den totaia mängden/transferrin, men kan öka mer än tiofai- digt efter kraftig aikohoikonsumtion. Efter omåttiigt drickande kan en ytteriigare fraktion pI 5,9 (0 SA) uppträda. Fraktionerna pI 5,7 och pI 5,9 representerar transferrin med koihydratbrist (CDT).

Syftet med denna uppfinning är att utveckia ett förfarande med HPLC (High Performance Liquid Chromatography (högtrycksvätskekromatografi)) som är Iämpïigt för rutiniaboratoriearbete för att identifiera per- soner med hög risk för aikohoiberoende och utvärdera dess sensitivitet och specificitet för detektering av kraftig aikohoikonsumtion i angiv- na befoïkningsgrupper. Ändamåiet är att erbjuda en sådan metod som är ïämpad för kïinisk rutinverksamhet och som specifikt mäter koncentra- tionen av CDT, viiket är en 1ämp1ig biokemisk markör för kraftig aiko- hoikonsumtion under de närmast föregående veckorna. Ändamåiet uppfyiis med ett förfarande såsom angivet i huvudkravet nedan.

Uppfinningsförfarandet förkiaras närmare nedan med stöd av några figurer, där fig 1 visar kromatogram för isotransferrin från prover från personer med varierande a1koho1konsumtion, fig 2 visar hur koncentrationen av CDT avtar efter avsiutat drickande hos fyra kraftigt förgiftade patienter, fig 3 visar i tabeiiform den använda saitgradienten vid separering av isotransferrin, och fig 4 visar CDT-nivåer i serum från personer med oiika aikohoiin- tag. 10 15 20 25 30 35 501 668 Prover bereddes genom att färskt b1odserum e11er serum som hade varit fruset vid -20 °C under mindre än 6 månader mättades med järn genom tilïsats av 25 pï NaHC03 (500 mmoï/1) och 18 P1 FeC13 (10 mmoï/1) per m1 serum. Efter bïandning och ïagring vid +8 °C över natten fä11- des ïipoproteinerna ut genom ti11förse1 av 10 pi dextransuïfat (10 %, w/v) och 50 pï CaC12 (1 mo1/1) per m1 serum. Denna bïandning ïagrades under 30-60 min vid +8 °C och centrifugerades sedan vid 10 000 x g under 10 min. Vätskefasen späddes femfa1digt med vatten och överfördes ti11 en autoinjektor för HPLC.

Isotransferrinerna separerades på en jonbytarko1onn, Mono QlR> HR 5/5 (Pharmacia Biotechno1ogy, Sverige) från andra serumproteiner med en saïtgradient under 32 min innefattande regenerering. Utgångsbuf- fert A var Bis Tris 20 mmo1/1, pH 6,2. Buffert B var buffert A pïus NaC1, 350 mmoï/1, vid samma pH. Lösningen C, NaC1, 1 mo1/1, användes för regenerering. Innan användning avïuftades samtïiga ïösningar och dessa fiitrerades genom ett fiïter med porstor1eken 0,45 pm. Prover på 200 p1 injicerades, där fïödeshastigheten hö11s vid 1 m1/min med gradi- entprofi1en visad i tabe11en i fig 3.

Det använda HPLC-systemet bestod av pump nr 2941 (Pharmacia Biotech- noïogy, Sverige), en Jasco 870 UV-detektor försedd med ett fiïter på 460 nm och en 10 mm f1ödesce11 ti11samans med en vo1fram1ampa. Sys- temet innehöïi en autoinjektor Waters WISP 715, med ett kyïsystem för 96 prover. En integrator, Schimazu CR 5A, användes för att beräkna topparean enïigt “va11ey-va11ey" principen.

Isotransferriner har pl me11an ca 5,2 och 5,9. Optimaï separering av de mest negativa isoformerna erhå11s vid pH 6,2. Ti11satsen av NaHC03 tiïïsammans med FeC13 ger en optimai och stabiï järnmätt- nad. Utfä11ning av Iipoproteiner förbättrar separeringen av isoformen pI 5,9 som kan gömmas under ß-ïipoprotein-fraktioner hos vissa patien- ter. Fasteprov med ïägre Iipoproteinnivåer kan inte användas vid arbe- te med aïkohoïister vid öppen vård. Fig 1 visar kromatogram efter HPLC från kraftigt, måttïigt och norma1drickande individer, där även isofor- men pI 5,9 uppträder i det första mönstret. Absorbansen av kompïexet Fe-transferrin vid 460 nm är ungefär 1/10 av absorbansen vid 280 nm, 10 15 20 25 30 35 501 668 men är mycket tydïig för transferrinfraktionerna. Mängden CD-transfer- rin, pI 5,7, representerar endast 0,2-0,8 % (mede1värdet 32 standardav- vikeiser) av det totaia transferrinet hos absoïutister och sådana som dricker sporadiskt. Detta värde berodde ti11 en dei på integreringsför- farandet för kromatografikurvan. Något högre värden fick man med bas- ïinjeintegrering, men "vaïiey-va11ey" metoden var mer reproducerbar.

I fig 1 avser A prov från en individ som har konsumerat 300 g a1ko- hol/24 h, B prov från en individ som har konsumerat 70 g a1koho1/24 h och C visar ett normait mönster. De skuggade områdena visar CDT, dvs isotransferrin med pl 5,7 (*) och pI 5,9 (**). De övriga topparna i kromatogrammen, räknat från höger, avser pI 5,2, 5,4 resp 5,6. Av kromatogrammen framgår tydiigt att den dominerande fraktionen är pI 5,4. Vidare framgår att värdena på CDT är förhöjda vid kraftig aïkoholkonsumtion. Absorbansen av kompiexet Fe-transferrin mättes vid 450 nm.

CD-transferrins haïveringstid studerades genom att mäta CDT pl 5,7 hos fyra kraftigt förgiftade patienter var dag under femton dagars sjukhus- visteise under vi1ken tid ingen återgång ti11 alkohoimissbruk uppträd- de. Den totaïa transferrinkoncentrationen mättes i varje prov (g/1) och CDT beräknades och gavs som mg/1 i ett ha1v1ogaritmiskt diagram (fig 2). Totaï transferrinkoncentration ökade med tiden hos vissa pati- enter vid sjukhusviste1sen. Haïveringstiden för varje kurva avïästes från dess Tinjära Tutning. Det fanns en Titen ski11nad meïian enskilda patienter och medeïvärdet T1/2 beräknades ti11 9,5 1 1 dag.

CDT-värden funna i prov från absoiutister och sådana som dricker spora- diskt (1aboratorieanstä11da) uppvisade en normaï fördeïning och var a11tid under 1 % med användning av "va11ey-va11ey" integrering (fig 4). B1and 284 män från den aïimänna stadsbefoïkningen tidigare registrerade med höga I-GT-värden angav 20 % en a1koho1konsumtion på 40-70 g/24 h. Hos dessa män var CDT-sensitiviteten 55 % och specifici- teten 91% med användning av gränsen 0,8 %. För de kraftigt förgiftade drickarna (70-500 g/24 h) var sensitiviteten nästan 100 %. ring av CDT uppträdde hos 84 % vid avvänjningsterapi. En de1 av dem Normaïise- har ännu inte nått sina normaïa CDT-nivåer. Ett visst drickande kan inte utes1utas vid behandïing med kaïciumkarbidtabietter. 10 l5 20 3 30 35 501 668 Förfarandet ger reproducerbara resultat och kan automatiseras för stora provserier. Prover från 40 patienter kan analyseras under 24 timmar. Kostnaderna för reagenser innefattande investeringar för HPLC är ca 30 % av reagenskostnaderna för engångsminikolonnerna kombinerade med radioimmunoassay (Pharmacia Diagnostics). Denna teknik måste köras dubbelt. En annan fördel med HPLC är det synliga dokumentet för speci- fik absorbans vid 460 nm, vilket är viktigt för transferrins genetiska variation. Serum från alkoholister är ofta lipemiskt och en del lipo- proteiner, liksom andra serumproteiner. kan fällas ut vid pH 6,2 vil- ket orsakar en gradvis ökning av kolonntryck. Det är därför lämpligt att använda två kolonner varigenom analyser kan utföras vid regenere- ring av en kolonn. Detta användningssätt har gett oss ett års erfaren- het (>1000 prover) utan problem. Genetiska varianter av transferrin uppskattas finnas hos ca 29 % av befokningen. De flesta av dem repre- senterar undertyper av den huvudsakliga TfC-fenotypen med mindre änd- ringar av pI. De påverkar inte kromatografimönstret. Endast TfBC-hete- rozygoter och TfCD-heterozygoter, frekvens 1-2 o/oo hos kaukasisk be- folkning, kommer att påverka kromatografikurvan. I dessa fall måste man bekräfta resultaten med isoelektrisk fokusering i ett specialise- rat laboratorium.

För att bekräfta förfarandet enligt uppfinningen togs albumin bort från serum genom förbehandling med Blue Sepharoselßl. Engångs- kolonner (polypropylen 5 ml, Pierce) packades med svälld Blue Sepharose Cl-68 (Pharmacia Biotechnology, Sverige) motsvarande 0,2 g (torr vikt). Efter sköljning enligt tillverkarens instruktioner fördes den lilla kolonnen till jämlikt med glycin, 100 mmol/l, pH 7.2. 100 Pl av den järnmättade vätskefasen utan lipoprotein blandades med 2 pl ß-merkaptoetanol 10 % (v/v) och fördes efter en timme vid rums- temperatur till minikolonnen. Serumproteiner eluerades med glycin, 100 mmol/l, pH 7,2.

De första 300 Pl av eluatet kasserades, 40 pl av nästa blandade 800 pl användes för isolektrisk fokusering. Varje kolonn kan användas flera gånger efter regenerering med urea 6 mol/l följt av glycin 0,1 mol/l, pH 7,0. 10 15 20 25 30 35 501 668 Isoe1ektrisk fokusering utfördes huvudsakiigen såsom beskrivits för a1-antitrypsin med föïjande modifieringar. Amfoiytbïandningen var ïika deiar Pharmaïytifii 4-6,5 och Pharma1yt(R> 5-6, totait 1,9 m1 per 30 m1 geiiösning. Samma förfarande kan utföras i mindre skaïa med användning av Phast-systemet (Pharmacia Biotechnoiogy, Sverige). Iso- transferriner kan verifieras genom immunofixering med användning av ceiiuiosaacetatmembran impregnerade med transferrinantikroppar. A11a patoïogiska resuitat från HPLC (CDT >0,8 %) har hitintiïis verifierats genom isoeiektrisk fokusering.

Serumets transferrinkoncentration bestämdes genom eiektroimmunoassay med användning av antiserum från Dako (Danmark).

Vårt förfarande ger automatiskt den beräknade procentdeien CDT från integratorn och eiiminerar behovet av specifik bestämning av transfer- rinkoncentration. Observationen av stora variationer av tota1 transfer- rinkoncentration hos kvinnor med ökningar beroende på järnbrist och östrogenadministrering och hos kraftigt berusade aikohoiister (inter- va11 1,1-3,6 g/1) vid detta arbete motiverar användningen av procent- deïen CDT av totai mängd transferrin snarare än absoiuta värden. HaTve~ ringstiden på ca 9,5 dagar för isoformen med pl 5,7 möjiiggör utvärde- ring av aïkohoikonsumtion under de senaste 1-3 veckorna eT1er verifie- rar en Tyckad behandiing. Detta resultat stämmer bättre med den pubii- cerade haiveringstiden på 8-10 dagar för normai transferrin snarare än de ny1igen uppskattade 15 dagarna för CDT.

När CDT-värdet är höjt är det en mycket tydiig markering av a1koho1- missbruk och mycket bättre än andra f n tiligängiiga bioiogiska mar- körer. I en utvärderad befolkning av medeiåiders män har de enskiïda individerna karaktäriserats mycket noggrant och föijts upp under 15 âr. Vid en uppföijning 1991 bedömdes aikohoikonsumtionen av två er- farna sköterskor och samtidigt uppsamïades biod för CDT. Vi fick en sensitivitet på 55 % hos gruppen som rapporterade en aikohoïkonsumtion större än 40 g/dag. vid studien av förgiftade individer som konsumerar mer än 70 g/dag var emeiïertid sensitiviteten nästan 100 %. Den höga specificiteten för absoiutister och sådana som dricker sporadiskt, nära 100 %, ger den siutsatsen att CDT har den högsta specificiteten av de tiiigängïiga bioiogiska markörerna.

Claims (1)

10 15 20 25 30 35 40 501 668 PATENTKRAV . Förfarande för separer1ng och kvant1f1er1ng av CD-transferrin 1 bïodserum, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v. att bïodserumet mättas med järn och att 1sotransferr1n separeras från andra se- rumprote1ner 1 en jonbytarkolonn med en sa1tgrad1ent, varv1d ett kromatogram tas fram med hjäïp av högtrycksvätskekromotagraf1 (HPLC). v11ket kromatogram visar förhâïïandet me11an 1sotrans- ferr1n med o11ka pI-värden. . Förfarande en11gt krav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att separeringen sker 1 en buffert1ösn1ng med pH 6.2. . Förfarande en11gt krav 1, k ä n n e t e c k n a t a v se1ekt1v absorbans v1d 460 nm av ett kompïex av Fe och transferrin. . Förfarande en11gt krav 3, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v,V att kromatograf1kurvan 1ntegreras med hjäïp av "va11ey-va11ey" metoden. . Förfarande en11gt krav 1, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att järnmättn1ngen sker genom t111sats av 25 p1 NaHCO3 (500 mm01/1) och 18 #1 FQCW3 (10 mmox/1) per m1 serum. . Förfarande en11gt krav 5, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att 11poprote1ner utfä11s efter bïandning och 1agr1ng v1d +8 °C över natt genom t111sats av 10 pï dextransuïfat (10 %,w/v) och 50 #1 CaC12 (1 mo1/1) per m1 serum. . Förfarande en11gt krav 6, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att den erhà11na bïandningen ïagras under 30-60 min v1d +8 °C och därefter centr1fugeras v1d ca 10 OOO x g under ca 10 m1n. . Förfarande en11gt krav 7, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att den centrifugerade b1andn1ngens vätskefas spädes femfa1d1gt med vatten. . Förfarande enïígt krav 8, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att den utspädda vätskefasen 1nj1ceras 1 en HPLC. iï-OT-OWLK/lqt; iß-æ-HILK/lld