SE440699B - Sett att medelst isotransferrinbestemning uppskatta en individs alkoholkonsumtion - Google Patents

Description

s#oo5s7-s i - L ¿ sig att var och en av dessa isotransferriner i sin tur består av olika isotransferriner. För enkelhets skull behandlas de namngivna föreningarna som enhetliga substanser.

I den andra alternativa metoden utnyttjas att de ändstående 7 kolhydratgrupperna i olika isotransferriner varierar. Sålunda innebär en desialoform av transferrin att en sialylgrupp saknas på minst en kolhydratkedja. I en metod (Cervën, E. et al.; Upsala J. Med. Sci. 86(l98l) s 39-53) utgår man från att galaktos uppträder som ändstående grupp hos desialotrans- ferriner. Följaktligen presenterar Cervën, E. et al. en lektinmetod som bygger på en biospecifik affinitetsreaktion mellan galaktos och ett galaktosbindande lektin. Metoden innebär att ett serumprov kontaktas med en immunadsorbent varvid transferrin, oberoende av isoform, bindes till adsor- benten. Immunoadsorbenten frånsepareras därefter och därtill bundet desialotransferrin detekteras med hjälp av märkt galaktosbindande lektin.

Båda dessa kända metoder lider av stora nackdelar. IEE- metoden är opraktisk och tidsödande för klinisk rutinverk- samhet. Vid våra försök att utveckla ett test enligt Cervên, E. et al. har vi funnit att det ej finns något samband mellan resultat enligt lektinmetoden och IEF-metoden. Metoderna mäter alltså olika saker. Någon signifikant skillnad finns ej heller mellan nykterister och alkoholmissbrukare i Cervêns metod. Detta beror troligtvis pà att desíalotransferriner även saknar galaktos och ej enbart sialinsyra, varvid tanken att mäta ett desialotransferrin med ett galaktosbindande ilektin är felaktig. Känt är också att affiniteten mellan lektin och socker är låg. Den höga bakgrunden i denna metod kan också orsakas av att det på den använda transferrin- adsorbenten finns sockergrupper som interfererar med lek- tinet.

Det finns alltså ett stort behov av en enkel och tillförlit- lig metod för att bestämma alkoholkonsumtion genom en iso- transferrinbestämning. Ändamålet med föreliggande uppfinning ga FBI 8400537 är att erbjuda en sådan metod som är lämpad för klinisk rutinverksamhet och som specifikt mäter koncentrationen av vissa isotransferriner som kan korreleras till alkoholkon- sumtion vilken skett under de senaste veckorna.

Dessa ändamål uppnås i uppfinningen genom att man i kropps- vätska som innehåller isotransferriner kvantifierar total- koncentrationen av vissa kombinationer av isotransferriner med pl större än 5,6. Kombinationerna ifråga är A. isotrans- ferriner med pI 5,7, 5,9 respektive 6,1, eller B. isotrans- ferriner med pl 5,9 respektive 6,1, eller C. isotransferrin med pI 6,1. Totalkoncentrationen svarande mot var och en av dessa kombinationer utgör ett mått på en individs alkohol- konsumtion under veckorna närmast före provtagningen.

Uppfinningen innebär att ett prov från kroppsvätskan ifråga under isokratiska förhållanden kontaktas med en jonbytes- adsorbent som delar upp isotransferrinerna i en fraktion I innehållande minst ett isotransferrin med pl större än 5,6 och en eller flera fraktioner innehållande huvuddelen (295 %) av övriga isotransferriner. Efter uppdelningen bestämmes mängden transferrin i fraktion I på i och för sig känt sätt. Denna mängd utgör ett mått på koncentrationen av de isotransferriner i provet som har pI större än 5,6 och som har överförts till fraktion I.

Fraktion I innehåller alltså isotransferrin enligt någon av kombinationerna A, B eller C ovan. Mindre mängder av iso- transferrin med pI mindre än 5,6 kan få förekomma i frak- tionen. Den eller de övriga fraktionerna innehåller alltså de isotransferriner som ej överförts till fraktion I. Även isotransferriner med pI större än 5,6 kan få förekomma i dessa fraktioner. Det är mycket viktigt att uppdelningen till fraktion I sker reproducerbart för prover som skall jämföras med varandra.

Speciella utföringsformer framgår av patentkraven vilka ingår som del i beskrivningen.

P3! 8400587-5 p'Provet kan vara ett kroppsvätskeprov, t ex ett serumprov som eventuellt spätts med lämplig buffert.

Både “batch"- och kolonnförfaranden kan användas för separa- 7 tionen. Genomsnittfackmannen avgör lätt med enkla försök om en metod är lämplig eller ej.

Normalt åstadkommer man vid jonbyteskromatografi av pro- teiner en separation med hjälp av gradient- eller stegvis eluering. Dessa metoder leder till praktiska svårigheter i klinisk rutinverksamhet. Genom att använda en anjonbytare med hög buffertkapacitet för ett pH som ligger i ett inter- 4 vall emellan de isoelektriska punkterna för trisialo- och asialotransferrin och som är ställd till ett pH i inter- vallet kan separationen lätt genomföras i ett steg och pà kort tid. Före kromatograferingen bör provet ha spätts med en katjonbuffert av ungefärligen samma pH som jonbytaren är ställd till. Kromatograferingen kan därefter ske genom att *det spädda provet sättes till och får rinna genom den aktuella jonbytaren, varefter det samlas upp. Ytterligare buffertlösning kan vid behov tillsättas, men är ej nödvändig enligt uppfinningen. Denna typ av kromatografi kallas 'isokratisk och sker vid konstant pH och konstant jonstyrka.

Beroende på pH separerar önskad kombination A-C ovan från övriga kända isotransferriner. Vid separationen utnyttjas jonbytarens pH och höga buffertkapacitet. Isotransferriner med pI lägre än jonbytarens pH adsorberas till denna under det att de med högre elueras.

Om en katjonbytare utnyttjas skall denna ställas med en anjonbuffert till ett pH i samma intervall som för anjon- bytaren. Provet spädes med anjonbuffert. Vid kromatografe- ringen kan, beroende på pH, önskad kombination av A-C ovan 840% adsorbera till jonbytaren. Katjonbytaren skall ha hög buffertkapacitet inom samma pH-intervall som en anjonbytare.

Uppfinningen ger i sin mest föredragna utföringsform (pH =g 5,65 1 0,02) hög korrelation med IEF-metoden. För pH-inter- vall 5,65 i 0,02 ger uppfinningen också en större diskri- minerande förmága för hög alkoholkonsumtion än vad IEF- metoden gör. Detta beror sannolikt på att man ej enbart mäter disialotransferrin utan även monosialo- och asialotrans- ferrin, som också är förhöjda vid hög alkoholkonsumtion.

En stor förbättring med isokratisk kromatografering enligt uppfinningen jämfört med IEF-metoden är den korta analys~ tiden. IEF-metoden tar ca 5 dagar till resultat, uppfinningen lä timme.

Nedan beskrives variabler som är av betydelse för att genom- föra den aktuella separationen med hjälp av isokratisk jonbyteskromatografi på en anjonbytare.

Lämpligaste pH för separationen avgörs av isoelektriska punkterna hos de isotransferriner man önskar separera.

Kliniskt intressanta är disialo-, monosialo- och asialo- transferrin med pI; 5,7, 5,9, 6,1 respektive. Övriga iso- transferriner, vilka ej är av kliniskt intresse i samband med alkoholmissbruk, är pentasialo-, tetrasialo- och trisialo- transferrin med pI 5,1, 5,3 och 5,5 respektive. För att uppnå god reproducerbarhet i separationen kan pH på jonbytaren väljas inom tre olika pH-intervall: A. 5,5 - 5,7, före- trädesvis 5,65 1 0,02, B. 5,7 - 5,9, företrädesvis 5,80 1 0,02 och C. 5,9 - 6,1, företrädesvis 6,00 i 0,02. Enligt alternativ A. ligger det valda pH-värdet mellan pl för trisialo- och disialotransferrin varför disialo-, monosialo- och asialoformerna passerar kolonnen och kan samlas upp. För B. och C. gäller analogt att monosialo- och asialotransferrin respektive enbart asialotransferrin passerar jonbytaren.

Alternativen A, B och C gör att uppfinningen i sina mest föredragna utföringsformer kan ta hänsyn till förekomst av monosialo- och asialotransferrin. _ 8400-587-5 6 För att möjliggöra en god separation med en anjonbytare bör den i.sig ha en mycket hög och jämn buffertkapacitet i det aktuella separationsintervallet. Kapaciteten bör vara mer än 3 milliekvivalenter per 100 ml jonbytare och pH-enhet i pH-intervallet 5 - 6,5.

Exempel på en lämplig jonbytare är polyjonbytaren PBE 94 ÅPharmacia Fine Chemicals AB, Sweden). Denna är baserad på tvärbunden agaros till vilkens monosackaridenheter ett stort antal laddade grupper är kopplade via eterbindningar. De 'laddade grupperna på jonbytaren är speciellt utvalda för att ge en hög och jämn buffertkapacitet över det aktuella pH- omrâdet.

Jonbytaren bör innan provlösning tillsättes konditioneras till pH enligt något av pH-intervallen A, B eller C nämnda OVâII.

Praktiskt lämplig adsorbentvolym är 50 - 150 /ul. Det spädda _provets volym kan vara 5 - 10 gånger adsorbentvolymen utan att påverka jonbytarens pH och separationen.

Separationen kan genomföras vid temperaturer i ett brett intervall, t ex 15 - 35 °c speciellt 21 - zs °c.

Bufferten skall vara av katjontyp för att inte buffrande esubstanser skall kunna adsorbera till anjonbytaren. Med buffert av katjontyp avses en buffert vars buffrande kompo- nent kan förekomma som katjon vid aktuellt pH. Lämpligt är att buffertsubstansens pKa-värde ligger i det aktuella omrâdet för separationen, d v s pH 5 - 6,5, företrädesvis inom något av pH-intervallen A-C ovan. Buffertkapaciteten bör vara hög men är ej kritisk enligt uppfinningen, eftersom jonbytaren svarar för den buffrande förmågan. Bufferten bör ha ett liknande temperaturberoende som isotransferrinernas pI.

W 8400587 Jonstyrkan bör vara låg, för att inte påverka separationen, som ju avgörs av pH-värdet. Lämplig koncentration av buffert- substans är 20 - 30 mM, vilket medför en motjonskoncentration på 25 - 50 mM.

De hittills studerade optimala buffertsystemen har funnits vara: 20 mM piperazinhexahydrat - myrsyra alternativt 30 mM Bis (2-hydroxyetyl)piperazin - myrsyra, ställd med myrsyra till önskat pH beroende på önskat separationsalternativ. pKa för piperaziniumjonen är 5,56 vid 23,5 OC (Handbook of Chemistry and Physics).

Provvolymen är ej kritisk för separationen. Till 100 /ul jonbytare är det lämpligt med provvolymer på 10 - 50 /ul serum spätt med buffert till en slutvolym på 200 - l 000 /ul som hälles på kolonnen.

Den hittills funna optimala provvolymen till 100 /ul adsor- bent har funnits vara 20 /ul serum spätt till 500 /ul slut- volym med lämplig buffert. ' Att bestämningen efter separationen sker på i och för sig känt sätt, innebär att varje metod med tillräcklig känslighet och specificitet kan utnyttjas. En stor grupp av sådana metoder, som är aktuella och föredragna, bygger på en antigen-antikroppsreaktion för bestämning, d v s den tillhör den stora gruppen immunologiska bestämningsmetoder. För fackmannen är ett stort antal sådana tekniker kända. Poten- tiellt är de alla applicerbara på uppfinningen, även om vissa är mer lämpade än andra, t ex p g a i den speciella tekniken inbyggd specificitet, sensitivitet eller selektivitet. Här kan nämnas sådana tekniker som utnyttjar minst en märkt reaktant. Sådana bestämningsmetoder finnes utförligt be- skrivna i litteraturen, se t ex beskrivning och krav i GB-A-1552607 och GB-A-1548741. Alternativa bestämningsmetoder är turbidimetrisk bestämning (ljusspridande "immunoassays") (Price, C.P. et al.; Am. Clin. Biochem. 20(1983) s 1-14) och _a4oos87-5 "Sol Particle Immunoassay" - t ex agglutinering av antikropp- belagda guldpartiklar genom reaktion med immunokemiska bi- eller multivalenta antigen (transferrin) (Leuvering, J.H. en a1.; (J. Imm. Mach. ezussa) s 163-174).

I vissa fall kan man i de aktuella bestämningsmetoderna, ekvivalent med en affinitet mellan ett antigen och motsvar- ande antikropp, även utnyttja andra biospecifika affiniteter.

Exempel på föreningar med sådan annan affinitet till varandra är Protein A-IgG, kolhydrat-lektin, Clq-immunkomplex, RF- faktor - immunkomplex, Biotin-avidin o s v.

Uppfinningen skall nu ytterligare belysas med ett antal 7icke¥begränsande utföringsexempel av vilka ett innebär en jämförande studie med tidigare kända metoder.

Snlfüü txempel 1 šestämning av isotransferrinernas pI Cransferrin renades fram dels ur en serumpool från alkohol- nissbrukare och dels ur en serumpool från blodgivare. Trans- Eerrinet separerades sedan upp i de olika isotransferrinerna (pentasialo-, tetrasialo-, trisialo-, disialo-, monosialo- och asialotransferrin) i ett FPLC-system (Pharmacia Fine Chemicals AB, Sverige). En anjonbytarkolonn användes (Mono-Q, Pharmacia Fine Chemicals AB, Sverige) och som elueringssystem användes en linjär pH-gradient som åstad- kommes genom att successivt blanda två lösningar med var- andra. Lösning A = 20 mM piperazinhexahydrat pH = 6,8 ställd med 5 M myrsyra, och lösning B = 20 mM piperazinhexahydrat pH = 4,8 ställd med 5 M myrsyra. På detta sätt åstadkommer man en linjär pH-gradient från pH 6,8 till 4,8. Systemet är tempererat till 23 OC.

Transferrinprovet appliceras på kolonnen som har start pH - 6,8. Transferrinet kommer vid detta pH att ha en negativ laddning och fastnar alltså pá jonbytaren. Då pH sänks i gradienten kommer transferrinets laddning att successivt övergå från negativ till positiv. Dà transferrinets laddning är lika med noll kommer det att lossna fràn jonbytaren och följa med eluenten genom kolonnen. Definitionen på isoelek- trisk punkt är just då proteinets laddning är lika med noll.

Med en spektrofotometer bestämmer man när proteinet (trans- ferrinet) lämnar kolonnen och man samlar då upp fraktioner som motsvarar spektrofotometerutslag för respektive iso- transferrin. I dessa fraktioner som innehåller de olika oladdade isotransferrinerna mäter man pH som i respektive fall direkt motsvarar isoformens isoelektriska punkt (pl).

Försöken har alltså utförts med samma buffertsystem (20 mM piperazinhexahydrat-myrsyra) och vid samma temperatur (23 OC) som använts i Exempel 2. De funna pl-värdena är således användbara för att bestämma pH för separation av de aktuella isotransferrinerna. squosev-s '10 Je pl-värden som uppmätts på detta sätt är för respektive Lsotransferrin: 7 Alkohol- _ Blodgivare missbrukare çentasialo' 5,l ~ 5,1 tetrasialo '5,3 5,3 trísialo 5,5 5,5 iisialo 5,7 5,7 nonosialo - 5,9 6,1 asialo - - = Motsvarande fraktion ej detekterbar p g a alltför låg koncentration ry» 8400! ll Exempel 2 Isokratisk kromatografi för separation och bestämning av de aktuella isotransferrinerna Packning av gel i kolonner 100 ml sedimenterad polyjonbytare PBE 94 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Sweden) blandades med 900 ml 24 % etanol (v/v i vattenï till en slurry. Ur denna slurry pipetterades l ml till en mikrokolonn. Gelen fick sedimentera i kolonnen och därefter dekanterades huvudparten av etanolen så att endast sedimenterad gel återstod i kolonnen.

Därefter konditionerades gelen till önskat pH med 1,5 ml piperazinhexahydrat myrsyra buffert 0,020 M i piperazin ställd med 5 M myrsyra till pH 5,65 samt innehållande 0,1 % TweenR 20 (polyoxyetylen sorbitan laurat (Atlas Chemical Ind. Inc.))) vid 23 OC. När all buffertlösning runnit igenom kolonnen (ca 45 min) var gelen klar för användning.

Iso-transferrinseparation 20 /ul av ett serumprov späddes med 480 piperazinbuffert och tillsattes den konditionerade mikro- kolonnen. Eluatet (500 /ul ) samlades upp i ett provrör. När kolonnen slutat droppa, efter ca 15 min, kasserades kolonnen /ul av ovan beskriven och eluatet tillvaratogs.

Framställning av till fast fas kopplad antikrogg Agaros (partikelstorlek 1 - 5 /u) CNBr-aktiverades (analogt med US-P-3645852). Till 10 g aktiverade partiklar sattes 5 ml får-antikaninantikroppar och 45 ml 0,1 M NaHCO3, pH 8. Denna blandning inkuberades vid +4 OC över natt. Därefter centri- fugerades gelen vid 2 000 g i 10 minuter och tvättades med trisbuffert (0,05 M Tris(hydroxymetyl)aminometan ställd till pH 8,1 med saltsyra) innehållande 1 M NaC1 och därefter med acetatbuffert (0,1 M, ställd till pH 4,0 med saltsyra) 18400587-5 12' innehållande 1 M NaCl. Resterande aktiva grupper på gelen blockerades med etanolamin (1,0 M, ställd med saltsyra till pH 9,0) under 60 minuter i rumstemperatur. Slutligen tvät- tades gelen omväxlande med tris- och acetatbuffert två gånger och späddes till en koncentration av 10 mg/ml med fosfat- ïbuffert (0,05 M, pH 7,4) innehållande 0,15 M NaCl, 0,02 % Nana och 0,1 % TweenR 20. 0 Iso-transferrinbestämning Till eluatet eller ett provrör innehållande en känd mängd transferrin pipetterades i nämnd ordning: -_ 1100 /ul l25I-transferrin (22 ng/ml) (framställd genom jodering av transferrin enligt Greenwood, Hunter; siqchem. J. a9(19s3> S 114) 1 ' - 100 /ul anti-transferrinlösning spådd l:500, (DAKOpatts, Danmark) _ - 2 ml till fast fas kopplad antikropp 10 mg/ml (enligt ovan) Därefter inkuberades röret i 60 minuter vid rumstemperatur utan skak, varefter det centrifugerades vid 2~000 g i 10 minuter.

Sedan tvättades gelen tre gånger med 2 ml fosfatbuffert (komposition enligt ovan).

Kvarvarande radioaktivitet i röret mättes med en.'í-räknare under 1 minut. Dessa moment utfördes för ett antal serumprov erhållna dels från nykterister och dels från alkoholmisshrukare.

Mätvärden redovisas i Tabell 1.

Med hjälp av motsvarande piperazin-myrsyrabuffert ställd till pH = 5,80 1 0,02 bestämdes motsvarande värden för totalmängden mono- och_asialotransferrin. Mätvärden, visas i tabell 1.

Genom att jämföra de erhållna mätvärdena med motsvarande -värden erhållna från standardprov med kända transferrinhalter kan varje okänt provs innehåll av de aktuella isotransferrin- erna bestämmas. 057* f; 8læ0O5ë3'?-'5 13 Exempel 3 Jämförelse mellan uppfinningen, IBF-metoden och lektinmetoden Lektinmetoden (Cervën, E. et al.; Upsala J. Med. Sci. 86(l98l) s 39-53) och IEF-metoden (Stibler, H., Borg, S. och Allgulander, C.; Acta Med Scand 206(l979) s 275-Bl) genomfördes på serumprov varav vissa var tagna på samma personer och vid samma tillfälle som de i Exempel l. Resultaten tillsammans med de från Exempel 1 finns sammanställda i Tabell l.

Av tabellen framgår att: 1. Det finns ett klart samband mellan IEF-metoden och den patentsökta metoden (korrelationskoefficient r = 0,7). 2. Det inte finns något klart samband mellan lektinmetoden och uppfinningen samt IEF~metoden. 3. Den diskriminerande förmågan mellan nykterister och alkoholmissbrukare är signifikant för IEF och för uppfinningen, men inte för lektinmetoden. 4. Den diskriminerande förmågan är större för uppfinningen än för IEF-metoden. 8400587-5 14 Tabeu 1 Procentandel Bundet radioaktivt Mängd di-, mono-Å dísialo- lektin enligt asia1otransferrin} transferrin lektinmetod enligt uppfin- bestämd genom (cpm) ningen IEF-metoden (/ug/ml serum) J PH . 5,651) 5,803? 1 z - 47 11 f* f 3 - 73 '14 Nykteríster 5 - 51 17 5 17 018 641 18 ä 7 17 218 67 ~ å 3 18 739 93 - 6 - 134 - 6 - 115 - 7 - 194 - 8 - 129 - 8 - 137 - Alkohol- 9 - 134 - missbrukare 9 - 197 - 10 18 267 161 77 10 17.129 152 65 13 16 222 260 96 13 - 163 94 16 17 304 - - - 16 931 162 - 1) 2) bestämningar ej utförda pH = 5,65 avser bestämning av disialo-, monosialo- och asialotransferriner pH = 5,80 avser bestämning av monosialo- och asialo+ transferriner

Claims (1)

1. .k ä n n e t e c k n a t 840058 \5 PATENTKRAV Förfarande vid bestämning av en persons alkoholkonsumtion genom att kvantifiera isotransferriner som är relaterade till alkoholkonsumtion i ett kroppsvätskeprov härstammand från personen och innehållande sådana isotransferriner, av att provet underkastas isokratisk kromatografi pà en jonbytare som är ställd till ett pH i intervallet som i sin nedre gräns har pH = pI för ett isotransferrin med pI 5,5 och i sin övre gräns har pH = pl för ett isotransferrin med pl 6,1, så att isotransferrinerna i provet uppdelas i i) en fraktion I innehållande minst ett isotrans- ferrin med pl större än 5,6, och ii) en eller flera fraktioner tillsammans innehållande huvuddelen av övriga isotransferriner med pI mindre än pl för sådana isotransferriner med pI större än 5,6 som har överförts till fraktion I, varefter totalmängden isotransferrin(er) i fraktion I (= totalmängden transferrin i fraktion I) pà i och för sig känt sätt bestämmes och relateras till provets totalkoncentration av sådana isotransferriner med pl 5,6 som har överförts till fraktion I. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t av att den isokratiska kormatograferingen sker vid ett pH i intervallet som i sin nedre gräns har pH = pI för ett isotransferrin som har pl = 5,5 och i sin övre gräns har pH = pI för ett isotransferrin som har pI 5,7. aaoosav-s .__.__-__---- -' šb Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att den isokratiska kormatograferingen sker vid ett pH i intervallet som i sin nedre gräns har pH = pI för ett isotransferrin med pI 5,7 och i sin övre gräns har pH = pI för ett isótransferrin med pl 5,9. Fårfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att den isokratiska kormatograferíngen sker vid ett pH i intervallet sem i sin nedre gräns har pH = pl för ett isotransferrin som har pl 5,9 och i sin övre gräns har pH = pI för ett isotransferrin som har pl 6,1. "fa