JPS61501111A - アルコ−ル摂取量を測定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プル中のイソトランスフェリンを定量することによってヒトのアルコール摂取量 （ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ）を測定することに係る。この方法は、成る０［のイ ソトランスフェリンがヒトのアルコール摂取量と相関関係にあるという知見を応 用するものである。これらイソトランスフェリンとは別の名称のものく別個のも の〉は不適当であり、本発明の実施に際して何らの制限を与えるものではない。

イソトランスフェリンとアルコール摂取量との相関関係に基いて、本発明は各々 の特殊な状態での十分な治療プログラムを決定する上での有用な手段となりつる 。

ｐＨおよびｐＨは温度やイオン濃度によって変化する。本川１ｉＩ書中に記載し たＣＩＨおよびｏＩ値は２３℃の温度に＃３ける値であり、かつ当該ｏＨまたは ｐＨ−ｏｆになるようにギ酸で緩衝させたごペラジン（トータル２０ｎ＋Ｍ　） の水溶液中で測定した値である。従って、本発明は記載した特別な値に制限され るものとして解釈されるべきではない。本発明は、別の温度およびイオン濃度で 相当するｐｚ、ｉよびｐＨを含む何れの場合ち包含する。

血清サンプル中のイソトランスフェリン含１を測定する方法として二つの方法が 既に提案されている。一つの方法は等電集束（ＩＥＦ）をベースとする方法であ る［ステイーブラー。

ニー／　チ（Ｓ　（ｉｂｌｃｒ、Ｈ）、ボルグ、ニス（Ｂｏｒｇ、　Ｓ、Ｉｒ１ ３よびアレギュランダ、　シー、（Ａｌｌｅｇｕｌａｎｄｅｒ、Ｃ，）　、アク タ　メト・スカンド、（Ａｃｔａ　Ｍｅｄ、５ｃａｎｄ、　＞　２０６（１９７ ９）、ｐ、２７５−８１１、この方法は、電界の作用下でｏＨ勾配に移動する別 のイソトランスフェリン類は個々のイソ形態のｌ）Ｉ値に依って別の距離をカバ ーするであろうという事実を利用している。更にこれらの個々に異なるｐ［値は イオン化基の含みが異なることに起因している。我々の特別のケースでは、ＤＩ ｍの差異は特にシされたイソトランスフェリン類はＯ〜５のシャル酸基を有しか つ夫々６ｉ、５．９．５．７，５．５，５．３および５．１の等電点を有するも のと考えられる。これらのイソトランスフェリン類は同じ順で夫々アジア０（ａ ｓｉａｌｏ）　（−ランスフェリン、モノシフ０トランスフエリン、ジシアロト ランスフエリン、トリジアロトランスフェリン、テトラシアロトランスフエリン およびペンクシアロトランスフェリンと呼称される。各イソトランスフェリンは 実際には複数のイントランスフェリン乞購成すると後で知見される可能性がある 。しかし、簡明化のためにここではそれらが各１つの物質として取り吸われる。

前記した二つの方法のうち第２の方法は、イソトランスフェリンによって末端カ ルボヒトレート基の種類が異なる現象を応用するものである。従って、例えばデ シアロ型は少なくとも１つのカルボヒトレート鏡上のシャリル（５ｉａｌｙｌ） 　Ｗを欠く特徴を有する。この第２の方法の骨組で利用されている手段の１つ［ セルベン、イー、（Ｃｃｒｖ６ｎ、Ｅ）ら、アブプサラ　ジェー・メト、サイ、 （ＩＪｏｓａｌａ　Ｊ　、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、）８６ｘｘ　（１９８１）　ｐ 、３９−５３］は、デシアロトランスフェリンの末１１としてガラクトースが存 在するという仮定に基ずく。そこで、セルベン、イーらは、レクチンと前記に仮 定した末端ガラクトースとの間の生物学的特異的アフィニティー反応を得るため にガラクトース結合レクチンと使用する方法を促案している。＆初に、ｆｆ１ｔ 　Ｔ７Ｆサンプルを免疫吸着剤と接触させて、トランスフェリン（そのイソ型に 関係なく）を前記吸着剤に結合させる。次いで、トランスフェリン担持吸着剤を 分離し、そこに付着しているデシアロトランスフェリンを標識ガラクトース結合 レクチンを用いて検出する。

これら公知の方法にはどちらも重大な欠点がある。ＩＥＦ法は非実用的で、多く の時間を要し臨床的なルーチンワークとするには遣さない。セルベン、イー、ら の方法を更に開発すべく行なった伐々の研究過程で、我々はｌレクチン法で得ら れた結果とＩＥＦ法で得られた結果との間には相関関係がないことを発見した。

従って、これらの方法が同じ項目を測定していないことが明白である。加えて、 セルベン法によると中毒型のアルコール摂取者と非アルコール摂取者との間に有 意な差を得ることができない。この理由は多分、デシアロトランスフェリン（ｄ ｅｓｉａｌｏｔｒａｎｓｒｅｒｒｉｎ）がシセル酸の他にガラクトースをも欠い ており、ガラクトース結合レクチンを用いてデシアロトランスフェリンを測定す るという概念がまさに根本的に間違っているのであろう。更に、レクチンと糖と の間のアフィニティーが弱いことは周知事項である。この方法を用いた時に遭遇 する高いバックグランド値は、使用したトランスフェリン吸着剤上に存在し、レ クチンを干渉する傾向を有する糖（ｓｕｇａｒ）基に因る。

そこで、イソトランスフェリン検定テストを用いてアルコール摂取量を測定する ための１！！！単で信頼ひきる方法の必要性が認識されている。本発明の一つの 目的（ま、臨床的なルーチンワークに適しており、テスト前数週間における被験 者のアルコール摂取量と相関関係にあるものとしてイソトランスフェリンの９度 ３特異的に測定する方法を提供することにある。

本発明によれば、イソトランスフェリン含有体液中の５６を超える１）ＩＩＩを 有するイソトランスフェリン類の成る組合せの総濃度を定損することによって、 前記目的は達成される。これらの組合せは、（Ａ＞　ＤＩ５．７，５．９および ６１のイソトランスフェリン’Ａ：　＜［３）ｐＩ５゜９Ｆ３よび６．１のイソ トランスフ１リン類：または（Ｃ）ｐＩ６．１のイソトランスフェリンである。

組合せ（Ａ＞、（Ｂ）または（Ｃ）のイソトランスフェリン類の総濃度は、サン プル採取画数′Ａ間におけるヒトのアルコール摂取量の尺度である。

本発明の一実施態様によれば、ヒト体液サンプルを吸着剤と接触させる。前記吸 着剤はイソトランスフェリンのみ（１ｎｔｅｒｓｅ）を分離さぜうる作用を有す るものであり、それによって５．６より大きいＤＩを有するイソトランスフェリ ンを少なくとも１種含有する画分（１）と残りのイソトランスフェリンのバルク （２９５％）を含有する１種もしくはそれ以上の両分に分離される。この分１１ 、両分（Ｉ）のトランスフェリン口が公知の方法に従って測定される。このるは 、サンプル中の、ａｔが５．６を超えることを特徴としかつ両分（１）に移行し てきたこれらイソトランスフェリンｆｆ１０度の尺度である。

画分（１）は上記組合せ（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）の何れかのイソトランスフ ェリンを含む。この画分中に　ｐＩが５．６未満のイソトランスフェリンも少量 存在する。１種もしくはそれ以上の両分には、両分（Ｉ）に移行されなかったイ ソトランスフェリンが含まれ、実際にはｐｌが５．６以上のイソトランスフェリ ンも含まれろる。前記両分＜１）を与える分離が比較されるべきサンプルに対し ても再現可能な方法で実施されることが看要である。

特別の実施悪様については請求の範囲に記載する。

サンプル（ユ体液サンプル、例えば血漬サンプルで、所望により適当なバッファ ーで希釈してもよい。

吸着法はがなり自由に選択され、前記分離を行うのに有効である限りどんな方法 でも使用可能である。クロマトグラフィー法の中で、いわゆるバッチ法およびカ ラムを使用する方法が挙げられる。当業界の平均的技術を有するオペレーターで あれば、その方法が各個々の場合に適しているが否かを簡単なテストでたやすく 見つけ出すことができる。現在の技術水準で最も有利な方法はイオン交換クロマ トグラフィー法であるが、ここでの対象となるイソトランスフェリンに対して高 い選択性を有する他の吸着方法を使用することもできる。

タンパクをイオン交換グＯマドグラフィーにかける場合、これらの分離は通常勾 配または逐次溶離を用いて行なわれる。臨床的ルーチンワークにおいて、これら の方法には実用上の困難さを伴なうが、トリジアロトランスフェリンと７シアロ トランスフエリンの等電点間の範囲のｐＨで＾い緩衝能を有しがっ前２範囲のＩ ）ＨＩＣ設定される隘イオン交換体を用いると、分離は一段階で短時間にＢ単に 実施されうる。クロマトグラフィー法を実施する前に、サンプルをイオン交換体 が設定されたと殆んど同じ　ｐＨを有する陽イオン性バッファーを用いて希釈す べきである。次いで、クロマトグラフィー法が実施されうる。ＩＩＩら、希釈サ ンプルを充填し、イオン交換体中を流し、次いで採取する。必要ならば、より多 くのバッファー溶液を添加してもよいが、本発明を実施ケるのに必ずしも必要で ない。この種のり０マドグラフィーは、“イソクラティック”と呼称される。一 定のＣＩＨＪ’５よび一定のイオン強度で実施される。使用されるｏＨに依って 、所望の祖合せ（△）、（Ｂ）または（（１）の１つが１１！の公知のイソトラ ンスフェリン類から分離される。この方法では、イオン交換体のＯＨおよび高い 緩衝能が所望の分離を得るために利用されている。イオン交換体のＤＨよりも低 いｏｆを有するイソトランスフェリンはイオン交換体に吸着され、より高い　Ｏ ｌを有するイソトランスフェリンが溶離される。

イオン交換体が陽イオン交換体の場合には、陰イオン交換体について上で言及し たと同じ範囲内に　Ｉ）Ｈを調整しなければならない。この調整は陰イオン性バ ッファーを用いて行なわれる。

ザンブルも陰イオン性バッファーで希釈される。次いで、クロマトグラフィーを 用いてｐＨに依って所望の組合せ（△）。

（８）または（Ｃ）の一つをイオン交換体に吸着させる。陽イオン交換体は、前 記した陰イオン交換体と同じｐＨ範囲内で高い団扇能力を有していなければなら ない。

最も好ましい具体例（ｏＨ＝５．６５±０．０２）では、本発明はＩＥＦ法と高 い相関関係を示す。５，６５±０．０２のＤＨ範囲では、本発明はＩＥＦ法に比 べて高いアルコール摂取色をより優れた識別力でもって検知する。これは多分、 本発明方法がジシアロトランスフエｌノンのみならず、アルコール摂取量が高い 場合には高レベルで存在するモノシアローおよびアシアロトランスフェリンとも 測定するからであろう。

本発明のイソクラティッククロマトグラフィーは、ＩＥＦ法に比べて分析に要す る時間が短縮されるという大きな利点を有する。ＩＥＦ法の場合各結果を得るに 要する時間が約５日間であるのに対して、本発明方法を使用した場合には、約１ ５時間で済む。

前記した変数は、陰イオン交換体を用いるイソクラティックイオン交換クロマト グラフィーによる分ｙ１１す実施するために重要である。

分離に最も適したｐＨは、分離されるべきイソトランスフェリンの等電点によっ て決定される。臨床上興味あるイソトランスフェリン類は夫々　Ｉ）Ｉ　５．７ ，５．９および６．１のジシアロー、モノシアローおよびアシアロトランスフェ リンである。過剰のアルコール摂取量の状況下で臨床的な関連性のない他のイソ トランスフェリン類は、夫々　ｐ（５，１，５，３および５５のペンタシアロー 、テトラシアロー、およびトリジアロトランスフェリンである。より高い再現性 の分離法を達成するために、イオン交換体に対するＩ）Ｈを下記の３つの範囲内 の何れかで選択することが適当である。（Ａ）　ｐＨ５，５〜５．７、好ましく は５６±００２；（Ｂ）　ｐＨ５，７〜５．９、好ましくは５８±０．０２．　 （Ｃ）　Ｉ）Ｉ−１５，９〜６．１、好ましくは６．００±０．０２゜また別の （Ａ）の場合選択ざ机だ　Ｉ）Ｈ値は、夫々トリーおよびジシアロトランスフエ リンのｏｌｆｆｉの中間であり、従って、ジンアロ。モノシフ０およびアシシロ 型がカラムを通過して束められうる。別の（Ｂ）の場合、モノシアロトランスフ エリンおよびアシアロトランスフェリンがイオン交換体を通過する。別の（Ｃ） の場合アシアロトランスフェリンが通過する。これら別の（Ａ）、（Ｂ）および （Ｃ）を規定するときにｔよ、配ち好ましい具体例での本発明によりモノシアロ ーおよびアシアロトランスフェリンの潜在性を十分考慮することが可能である。

陰イオン交換体が充分に満足いく分離能を発揮するためには、所与の分離範囲で ルめて窩くかつ一定の緩衝能を有していなければならない。この能力は、イオン 交換体１００ｍあたり　３ミリグラム当はｔ上でなければならず、５〜６５のｐ Ｈ（１）恥囲でＣＩ）（単位を有していなければならない。

適当なイオン交換体としては、ポリイオン交換体Ｐ　Ｂ　Ｅ　９４（ファルマシ ア　ファイン　ケミカル　アーベー、スウェーデン）が挙げられる。この交換体 のベースは、エーテル結合を介して、モノサッカライド中位に何随した多数のる Ｉ（電基を有する架橋アガロースであり、前記荷電基（ｃｈａｒｇｅｄ　ｇｒｏ ｕｐｓｌは所与のＩＩＨ範囲で高くかつ一定の緩ｖＪｊ能を与えるべく特異的に 選定される。

サンプル溶液を導入する前に、イオン交換体は前記ｐｌ−１範囲（△）、（Ｂ） または（Ｃ）の何れかに台数するｐＨに調整されなけ机ばならない。

本方法を実施する場合、５０〜１５０４の吸肴剤容呈が適当である。希釈サンプ ルの容量は、イオン交換体のＣＩＨや分離結果に悪影響を及ぼさないならば吸着 耐容ｊの５〜１０倍でありうる。

分離ｔま広い範囲例えば１５〜３５℃、特に２＋−２５℃の温度で行なわれる。

バッファーは、陰イオン交換体に瑳酌作用物質が吸着されるのを防ぐのために陽 イオンタイプでなければならない。パ陽イオンタイプバッファー”とは、緩衝作 用成分が所与のｐＨで潜在的に陽イオン性であるバッファーを宿ず。バッ２？− 拗買のｐｉ（ａｔ７）［は、分離法のｏＨｉ囲（ａｔ−＋　５−６．５１１．： 、好マシクは前記したＤＨに囲（△）、（Ｂ）または（Ｃ）の１つの範囲に入る ように選択されるのが適当である。バッファーの暖田能力は鳥くなければならな いが、本発明方法においてはイオン交換体で十分な緩衝作用が得られるので臨界 的な因子ではない。

バッファーの温度依存関係はイソトランスフェリンの口Ｉのそれと類似していな ければならない。

イオン強度は、上記した叩出でＯＨ依存性である分離の実際の過程に彰雷を及ぼ さないように低くしなければならない。バッファー物質の適者な濃度は２０−３ ０ｍＭのは範囲にあり、反対にＷＪ電したイオンの濃度は２５−５０ｍＭである 。

現在までに知られている緩衝系の中で、最良のものは次のちのであると知見され ている。所望のｐＨ！！にギ酸ひ調整された、２０ｍＭピペラジン６水和物−ギ 酸またｔま３０ｍＭビス−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンーギ酸て゛ある 。前記ｏＨｌは、所望の分局１法に依存１ろ値である。ごベラジニウムイオンｐ Ｋａは２３５℃で５，５６である。［ハンドブック　オブ　ケミストリーアンド 　フィジックス　（）−１ａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ Ｐ　ｈｙｓｉｃｓ）。

サンプルの各組は分離法に対する臨界的な因子ではない。

イオン交換体の容積が（仮に）１００成であれば、最終容重２００−１０００４ にバッファーで希釈された血清１０−１５成をサンプル容量とすることが１当ぐ あり、これをカラムの１に？主人する。

吸着剤１００バに対しては、サンプル容儀どして、適）≦なバッファーで５柊的 に５００成に希釈された血清２０成がむ過客９であると考えられている。

分離後の測定方法が°″公知方法で”行なわれるという前記の記通りよ、この工 程中、十分な感度とｆｔ異性を有する何れの方法をも用いることができると理解 されたい。現在利用されているより好ましい方法の多くは、この測定のために抗 原−抗体反応を応用している。すなわち、これらの方法はいわゆる免疫学的測定 法の多くを占めている。免疫学的分野に属する多くの方法が当業者にとって公知 である。これらの方法の全てが基本的に本発明に適用可能である。但し、特別の 反衝に固有の待顕性。

感度あるいは選択性のような因子を考慮するとその中の幾つかが他よりも適して いる。標識反応物質の少なくとも１種を利用する方法が一例として挙げられる。

この種の測定方法は文献（ＶＡえばＧ８−△−１５５２６０７号明細書およびＧ ８−へ一１５４８７４１号明［Ｌに詳しく記載されている。別の測定方法は混濁 度測定法（光散乱免疫検定法）、［プライス、シー・ビー、（ｐｒｉｃｅ　Ｃ， Ｐ、　）ら、アメ・クリ・バイオケム・（Ａｍ、ＣＩｉｎ、８１ｏｃｈｅｍ、　 ）　２０（１９８３）、　Ｄｌ−４４］　Ｏよび“ゾルパーティクル　イムノア ッセイ”−例えば免疫化学的に２６もしくは多価の抗原（トランスフェリン）と の反応による抗体７ｉ国ゴールド粒子の凝集［ルーベリング、ジェー、エッチ。

（ｌ　ｅｕｖｃｒｉｎｇ、　Ｊ　、　Ｈ、）ら、ジエー、イム、メス、（Ｊ。

ｌ　ｍｍ、　Ｍｅｃｈ、ｌ　６２（１９８３）ｐ、１６３１７４　］　テある。

成る揚台には、一般的に前記したタイプの測定方法は、抗原−抗体アフィニティ ー以外の生物学的に特異的なアフィニティー関係を利用するものでのる。これら は同等にして行なわれる。

幾つかの種の他の生物学的に特異なアフィニティーを有する生化学的物質の対と しては、プロティンＡ−ｔｇＧ：　カルボハイドレート−レクチン：Ｃｔｑ−イ ムノコンプレックス；ＲＦファクター−イムノコンプレックス（ｉｍｍｕｎｏｃ ｏＩＩｌｐｌｅｘ）　；ビオチン−アビジン：等が例示される。

本発明をシくの非限定的実施例にもとずい℃説明する。実施例のうち一つは従来 公知の方法に関連した比較研究のためのものである。

トランスフェリンを（１）中毒型アルコール摂取者からの血清プール及び（ｉｉ ）供血者からの血清プールから精製した。次いでトランスフェリンを個々のイソ トランスフェリン（ペンタシアロー、テトラシアロー、トリジアロー、ジシアロ ー、モノシアローおよびアジア０トランスフエリン）にＦＰＬＣ系（ファルマシ ア　ファイン　ケミカル　アーベー、スウ：−デン）で分離した。

イオン交換体は陰イオン交換体カラム＜Ｍｏｎｏ−Ｑ、ファルマシア　ファイン 　ケミカル　アーベー、スウェーデン）であり、使用した溶離系は２種の溶液、 即ち溶液Ａ　＝　５　Ｍ　′ｌｌ！酸でｏＨｅ、ａに′３４整された２　０　ｍ 　Ｍピペラジン６水和物と溶液Ｂ＝５Ｍギ酸でＯＨ４，８に調整された２０ｍＭ ピペラジン６水和物の継次的温合物（ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ　ｍ１ｘｅｓ）を用 いて得られた４９　Ｍ勾配である。これら２種の溶液の組合せにより　ｐＨ６， ８〜４８の範囲の線（ＩＨ勾配が得られる。系は２３℃にコントロールされる。

トランスフエリンサンプルを初期ＤＨが６８のカラムに適用する。口のｐＨで全 てのイソトランスフェリンが負のｆ？　Ｑを有し、従ってイオン交換体に何着し ている。ＯＨが勾配の範囲内に低下すると、各イソトランスフェリンの電荷が負 からより小さな負（１ｅｓｓ　ｎｅｏａｔｉｖｅ）、遂にはぜ口へと段階的に変 化する。

イソトランスフェリンがゼロの電荷に移行する正しいｐＨ条件で（、！、イソト ランスフェリンからイソトランスフェリンｑ２化するであろう。そのＮ荷がゼロ のとき、トランスフェリンはイオン交換体から遊離されるであろう。次いでそれ は溶が液中に同伴されなからカラムから溶離される。゛等電点″は、イソトラン スフェリンの電荷がゼロになる点である。イソトランスフェリンがカラムを離れ るときをみるために分光光度計が使用ざ机、この段階で各イソトランスフェリン に対する分光光度計の読みに相当する両分が集められる。これらの画分中には各 種ゼロ荷電イソトランスフェリンが含まれているが、この両分のＤＨを測定する ：各々の場合、この測定したＩ）Ｈは画分中のイソトランスフェリンの等電点（ ｐｉ）に直接相当する。

これらの実験は、実施例２と同じバッファー系（２０ｍＭピペラジン６水ＨＪ物 −ギ酸）、同じ濃度（２３℃）で行なわれた。従って、得られたｐｉ値は、探し められているイソトランスフェリンを分離するためのｐＨを現定するために使用 されうる。

こうして本実施例で測定した各イソトランスフェリンのｐｉ値は次の通りである 。

テトラシア口　５３　５３ モノシアロ　ｆｎｄ　５９ アシアロ　ｆｎｄ　６．１ “ｒｏｄ”は濃度が検出するには余りに低すぎるために“″検出できない両分” を指す。

粒子懸濁物を沈降させて得られたポリイオン交換体ＰＢＥ９４（）７ルマシア　 ファイン　ケミカル　アーベー、スウエデン）ｌｏｏｍを２４％エタノール（水 中、Ｖ／Ｖ）９００ｄと混合して、スラリーを形成した。このスラリーから　１ −をピペットでマイクロカラムに移した。ゲルをカラム中にｌさせ、大部分のエ ノタノールをデカントさせると、ゲル沈ＩＴｈのみがカラムに残った。

次いで、ゲルをピペラジン６水和物−ギ酸バッファー＜５Ｍギ酸でＤＨ５，６５ ［１整されかつ　０１％ツイーン■２０［ポリオキシエチレンソルビタン　ラウ レート、アトラス　ケミカル　インド、インク（△ｃｌａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　ｌ　ｎｄ　ｌ　ｎｃ）］を０合するピペラジン中０．０２０Ｍ＞　１．５戒で 所望ｐＨに２３℃で調整した。全てのバッフ？−溶液がカラムを通過したあとに 〈杓４５分）、ゲルを使用した。

イソトランスフェリン分離 血清サンプル２０成を上記ピペラジンバッファー　４８０ｄで希釈し、調整した （　ｃｏｎｄｉＮｏｎｅｄ）マイクロカラムに添加した。溶９ｉｔ液（５００Ｉ Ｊｉ）を試験管に集めた。約１５分後カラムからの滴下が化アガロース（粒径１ −５４）は、Ｕ　Ｓ　Ｐ　３６４５８５２に記載されたようにして活性化された ＣＮＢｒであった。

活性化された粒子１０ｇに、羊−抗家兎抗体５ｄおよびＧ、　ＩＭＮａ　ＨＣＯ ３（ｐＨ８＞　４５Ｉｌｌｉ！ヲ添加シタ。コノ混合物を＋４℃で一晩インキユ ベートした。その後、ゲルを２０００にｌで１０分間遠心分離にかけ、次いで１ Ｍ−Ｎａ　（ｌ含有トリスバッファー（０，０５Ｍ＋−リス−（ヒドロキシメチ ル）アミノメタン、’１４Ｍて・ｐＨ８，１に調整されている）、次いで１Ｍ　 ＮａＣｆ）含有アセテートバッファ−（０，ＩＭ、　ｍ！ｌｉＴ：　ｐｚ４．ｏ に調整されている）で洗浄した。ゲル土の残留活性！′ｌ：ｅ、至温で６０分間 に亘ってＩ７タノールアミン（１，０Ｍ、塩酸ひｐＨ９，０に調整されている） を用いてブロックした。、最後に、ゲルをトリスバッフ？−，アセテートバッフ ァーで２回洗浄し、０．４５Ｍ　Ｎａ　（、ｊ’　、　０．０２％　−１■ Ｎａ　Ｎ３および０１％ツイ−７２０を含有するホスフェートバッファー　＜０ ．０５Ｍ、１）Ｎ７．４　）で濃度１ｏｍｇ／ｄに希釈した。

イソトランスフェリン測定 溶離液または既知ｊのトランスフェリンを含む試験呑に、次の順でピペットを用 いて移した。

１００成の　Ｉトランスフェリン（２２ｎＱ／　ｍＡ　）　［グリーンウッド（ Ｑ　ｒｅｅｎｗｏｏｄ）　、フンター（ＨＵＯｔｅｒ）がバイオケム　ジＬ＋、 （１３ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）８９（１９６３）、　ｌ）　１１４）に記載した如 くトランスフニリンのヨード化によって産生される１゜１００ｍの１：５００に 相承された家兎−抗トランスフェリン抗体溶Ｉ＆（Ｄ　Ａ　Ｋ　０ｐａｔｔｓ、 デンマーク）。

２成の（上記の如く）固相に固定されｒこ抗体（１００ｎｌｄ　＞　５試験管を 振とうせずに至温で６０分間インキュベートし、これ９２０００ｇで１０分間遠 心分子ｆｌした。上澄液をデカントざｌＩＣ捨でたく上記した（１１］き組成） 、。

試験管中の残留活性を１分間７Ｊンマカウンターで測定した。

これは、非アルコール摂取者および中毒型アルコール巴収者から得られた多くの 血清サンプルについて行なった。測定値を第１表に示す。

ＤＨ５，８０±０．０２にセットされた対応のビベラジンーギ酸バッファーを用 いて、総モノ−６よびアシアロトランスフェリンの対応する値を調べた。これら の値も第１表に示す。

未知サンプル中の上記イソトランスフェリンの含呈をこのようにして測定し、測 定値を既知量のトランスフェリンを含有する標準サンプルから得られた対応値と 比較する。

実施例３ レクチン法（セラベン。イー、ら、アップサラ　チェー９メト、サイ、　８Ｇ（ ＋９８１）、１）、３９．５２）およびＩＥＦ法（スティーブラ、−エッチ、１ 　ボルダ。ニス４．およびアレギュランダー、シー、アクタ、メト。スカンド、 　２０６（１９７９１ｐ、２７５−８４１を血清サンプルで実施した。サンプル 中の幾つかは実施例１と同じ時に同じヒトから得たものであった。実施例１で得 られた結果と合せてこれらの結果を第１表に示す。

この表から、次のことが明らかである。

＜１）ＩＥＦ法と本発明の新規な方法とには明白な相関関係がある（相関係数ｒ −０，７）： ■　レクチン法と本発明の新規な方法またはＩＥＦ法とにはこのような明らかな 相関関係がない： ■　本発明のｖｆｒ規な方法とＩＥＦ法では非アルコール摂取者を中毒型アルコ ール摂取者との間で有意と認められる程の差異が得られるのに対して、レクチン 法では有意な差異が得られない；および Ｖ４）　本願発明方法で得られた識別力ｉａ　Ｉ　Ｅ　Ｆ法のものに比べて優れ ている。

今までに得られた結果から、サンプル中のトランスフェリンが第２銖イオンで飽 和されているとアルコール摂取優との相関関係が改善される。これは血清サンプ ル中に濃クエン酸第２銖溶液を数層加えるかまたは余りｍ度の高くないクエン酸 第２鉄溶液中に一定櫨の血清を８釈することにより成し遂げられる。

第１表 ＩＥＦ法による　レクチン法による　本発明方法によるジシアロトランス　結合 放射性レクチン　ジー、モノ−、アジア０フエリン（χ）　トランスフェリンの 暑（埒／−血清） ７　１７２１８　６７　Ｎ。

３　１８７３９　９３　）ＩＤ ６　ＮＯ’　１３４　ＮＯ ６Ｍｏ　１１５　１４０ ７　ＮＯ＋９４　Ｎｏ ８　１１０　１２９　ＮＯ ８ＮＯ１３７ＮＯ 中焉型　９　ＮＯ１３Ａ　ＮＤ アルコール摂取者　９　Ｎｏ　１９７　Ｎ０１０、　１７１２９　１５２　６５ １３　Ｎｏ　１６３　９４ １６　１７３０４　ＮＤ　ＮＤ ＮＤ　１６９３１　１６２　Ｎ０ ＮＯ−行なわず １）　ｐＨ５，６５をジシアロー、モノシアローおよびアシアロトランスフェリ ンを測定１′るために用いた。

２）　Ｉ）８５．８０をモノシアローおよびアシアロトランスフェリンを測定す るために用いた。

＝際調査報告 ｍ″Ａｓｅ＆ｃ′Ｉ＋＠ｐ　ＣＴ　／ｓε８５１０００６１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．個人から得られたイソトランスフェリン含有体液サンブル中のイソトランス フエリンを定量することによって個人のアルコール摂取量を測定する方法であっ て、個人のアルコール摂取量と定量した濃度値とを相関づけるために、体液サン プル中の（ａ）５．６以上のｐＩを有するイソトランスフェリンの総濃度、（ｂ ）５．８以上のｐＩを有するイソトランスフェリンの総濃度、または（Ｃ）６． Ｏ以上のｐＩ値を有するイソトランスフェリンの総濃度を定量することを特徴と する方法。 ２′５．６以上のｐＩを有するイソトランスフェリンを定量する訴求の範囲１の 方法。 ３．５．８以上のｐＩを有するイソトランスフェリンを定量する請求の範囲１の 方法。 ４．６．Ｏ以上のｐＩを有するイソトランスフェリンを定量する請求の範囲１の 方法。 ５．体液サンプルを吸着剤と接触させて、器量のイソトランスフェリンを （ｉ）５．６以上のｐＩを有するイソトランスフェリンを少なくとも１種含有す る画分（Ｉ）および （ｉｉ）５．６以上のｐＩを有し画分（Ｉ）に移行したイソトランスフェリンの バルクよりも低いｐＩ値を有する残りのイソトランスフェリンのバルクを含む１ 種もしくはそれ以上の画分に分離し、画分（Ｉ）中のイソトランスフェリンの総 量（画分（Ｉ）における総トランスフェリン量）を公知の方法で測定し、公知の 方法で５．６以上のｐＩを有し画分（Ｉ）に移行したサンプル中のイソトランス フェリンの総濃度と相関づける請求の範囲１の方法。 ６．サンプルを５−６．５のｐＨで高い緩衝能力を有するイオン交換体と接触さ せ、画分（Ｉ）および残りの画分への分離をｐＩ５．５のイソトランスフェリン のｐＩに等しいＰＨよりも低くない下限ｐＨ値とｐＩ６．１のイソトランスフェ リンのｐＩに等しいｐＨよりも高くない上限ｐＨ値の範囲のｐＨでイソクラティ ッククロマトグラフィー法により行なう請求の範囲５の方法。 ７．イソクラティッククロマトグラフィー法が、ｐＩ５．５のイソトランスフェ リンのｐＩに等しいｐＨの下限ｐＨ値とｐＩ５．７のイソトランスフェリンのｐ Ｉに等しいｐＨの上限ｐＨ値との範囲のｐＨで行なわれる請求の範囲６の方法。 ８．イソクラティッククロマトグラフィー法が、ｐＩ５．７のイソトランスフェ リンのｐＩに等しいｐＨの下限ｐＨ値とｐＩ５．９イソトランスフエリンのｐＩ に等しいｐＨの上限ｐＨ値との範囲のｐＨで行なわれる請求の範囲６の方法。 ９．イソクラティッククロマトグラフィー法が、ｐＩ５．９のイソトランスフェ リンのｐＩに等しいｐＨの下限ｐＨ値とｐＩ６．１のイソトランスフェリンのｐ Ｉに等しいｐＨの上限ｐＨ値との範囲のｐＨで行なわれる請求の範囲６に記載の 方法。