HU215555B

HU215555B - Eljárás variánsok koncentrációjának meghatározására, valamint az eljárásban használható analitikai vizsgálati készlet

Info

Publication number: HU215555B
Application number: HU9204073A
Authority: HU
Inventors: Michael John Holmes
Original assignee: Axis Biochemicals Asa
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1991-06-20
Publication date: 1999-01-28
Also published as: HUT65621A; NO303852B1; FI925781A0; EP0535162A1; AU8322891A; NO924912L; HU9204073D0; CA2085579A1; US5352616A; FI925781A; NO924912D0; ES2069902T3; WO1991019983A1; DE69108554D1; SK279009B6; DE69108554T2; EP0535162B1; JPH06502912A; AU654497B2; JP2517187B2

Abstract

A találmány szerinti eljárás prőtein jellegű, frakciőnáló rendszerbenelválasztható analitvariánsők pőpűlációjában lévő variánsőkalcsőpőrtja kőncentrációjának meghatárőzására szőlgál. Az el árássőrán a variánsők pőpűlációját jelzett, prőtein jellegű, az analithőzspecifikűsan kötődő partnerek pőpűlációjával érintkeztetik, a kapőtt,jelzett, kötődő partner/analit kőmplexeket a frakciőná ó rendszerbenkőmplex alakú analitvariánsők alcsőpőrtját tartalmazó, egy vagy többfrakcióra választják szét, és az így kapőtt, egy vagy több frakcióbanmeghatárőzzák a jelzett mennyiséget, ahől a sp cifikűsan kötődő,jelzett partnereknek a reakció előtti frakciőnáló rendszerben egységesnévleges előszlású vagy mőbilitású pőpűlációját alkalmazzák. Atalálmány tárgyköréhez tartőzik tővábbá az eljárásban használhatóanalitikai vizsgálati készlet. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás protein jellegű, frakcionáló rendszerben elválasztható analitvariánsok populációjában lévő variánsok alcsoportja koncentrációjának meghatározására. A találmány az eljárásban használható analitikai vizsgálati készletre is vonatkozik.

Biológiai rendszerek molekulái, így enzimek, antigének és egyéb biológiailag fontos proteinek gyakran variánsok populációjaként fordulnak elő, amelyek bár közös biológiai funkciót vagy tulajdonságot, így antigén tulajdonságot vagy enzimatikus aktivitást mutatnak - szerkezetüket tekintve csekély mértékben eltérőek. Ezen szerkezetbeli eltérés lehet a proteinek vagy polipeptidek primer, szekunder vagy tercier szerkezetében fennálló különbségek, vagy a kapcsolódó szénhidrátok vagy a molekula lipidszerkezete terén meglévő különbségek következménye. Bár adott populációban a variánsmolekulák között a közös jellemző tulajdonság vagy funkció megőrződik, szerkezetüknek ilyen eltérései gyakran megváltoztatják a variánsok egyéb tulajdonságait, így méretét, izoelektromos pontját (pl), ami viszont megváltoztatja viselkedésüket különböző frakcionáló és elválasztó rendszerekben, és alapul szolgálhat variánsok elegyében lévő egy vagy több variáns elválasztásához.

Enzimek gyakran fordulnak elő variánsokként, így izoenzimekként, és számos más biológiai proteinről tudjuk, hogy két vagy több variáns alakjában léteznek, amelyek gyakran a protein glikozilezési fokában vagy a szénhidrát összetételében különböznek. Az ilyen variánsok egymáshoz viszonyított koncentrációja adott testszövetben vagy testnedvben általában állandó, ez azonban megváltozhat bizonyos betegségek, kóros állapotok vagy a testre ható egyéb zavaró hatások következtében, így ismert például, hogy cukorbetegek szérumában megnövekszik a glikozilezett hemoglobin aránya a nem glikozilezett hemoglobinhoz viszonyítva. Bizonyos analitikai szempontból fontos szerkezeti proteinek, így a mioglobinok hasonlóképpen a különböző szervekben csekély szerkezeti eltéréseket mutathatnak, és betegség vagy sérülés okozta sejtkárosodás folytán a véráramba juthatnak.

Ily módon a vérben vagy egyéb testszövetben vagy testnedvben lévő különböző variánsok koncentrációjának meghatározása útján diagnózist lehet felállítani, vagy meg lehet állapítani kóros állapotot vagy sejtsérülést.

Ebből a szempontból különösen fontos a szérumban lévő transzferrin protein különböző variánsai koncentrációjának meghatározása. A transzferrin általában szíalílezett, azaz három vagy több szialilcsoportot tartalmazó alakban fordul elő. Az idült alkoholistákban az alkoholt nem fogyasztókhoz viszonyítva a dezszialilezett transzferrin, azaz a két vagy kevesebb szialilcsoportot tartalmazó transzferrin a szokásos 1-3%-ról 6-25%-ra növekszik. A gyakran szénhidráthiányos transzferrinnek (CDT) nevezett dezszialilezett transzferrint újabban a krónikus alkoholizmus klinikailag megbízható jelzőszámának tekintik. A transzferrinvariánsok szokásos meghatározási eljárásai azonban időigényesek és bonyolult biokémiai berendezéseket igényelnek. A dezszialilezett transzferrin jelzőszám egyszerű és kényelmes vizsgálata hiányában ezért a krónikus alkoholistát jelenleg is klinikai esettanulmány, az alkoholfogyasztásra vonatkozóan magától a betegtől származó információ és számos, korlátozott érzékenységű és szelektivitású laboratóriumi vizsgálat alapján diagnosztizálják. A vér alkoholszintje csak akkor megbízható mérőszám, ha a vérből az alkoholfogyasztást követően 24 órán belül vesznek mintát. Az összes jelenlegi kémiai klinikai vizsgálat érzékenysége és szelektivitása túl alacsony ahhoz, hogy valamennyi alkoholista azonosítására alkalmas lenne.

A transzferrin mikroheterogenitását és az alkoholfogyasztással mutatott korrelációját 1980-ban ismerték fel [Stibler H., Sydow O. és Borg S.: Pharmac. Biochem. Behav, 13, 1, 47-51 (1980)]. Ezen mikroheterogenitás klinikai jelentőségét tovább kutatták, és a különböző transzferrinvariánsok kvantitatív elválasztására izoelektromos, illetve kromatográfiás fokuszáláson alapuló módszereket tanulmányoztak [Vesterberg O., Petren S. és Schmidt E.: Clinical Chemica Acta, 141, 33-39 (1984); Storey E. L„ Mack U., Powell L. W. és Halliday J. W.: Clin. Chem. 31, 1543-1545 (1985)]. Joustra és Blanche 1984-ben eljárásra vonatkozó szabadalmi bejelentést tettek Svédországban, Stibler, Borg és Joustra pedig 1984-ben kis méretű oszloppal végzett anioncserés kromatográfiás eljárást ismertettek a szérumban lévő, az alkoholfogyasztástól függő szénhidráthiányos transzferrin kvantitatív szűrésére [Stibler H., Borg S. és Joustra M.: Alcoholism 10, 535-544 (1986); 8400587-5 számú svéd szabadalmi bejelentés]. Ezek az eljárások a szérummintákban lévő transzferrinvariánsok frakcióinak izokratikus ioncserés kromatográfiás elválasztásán alapulnak, amit a különböző frakciók transzferrintartalmának kettős antitesttel végzett radioimmunológiai meghatározása követ. Ez az ioncserés kromatográfiás eljárás a 2 vagy annál kevesebb sziálsavcsoportot tartalmazó összes transzferrinkomponenst elválasztja, amelyeknek izoelektromos pontja pH 5,65 felett van. Ezen módszerrel 77 alkoholista egyértelműen elkülöníthető volt 80 egészséges „normál fogyasztótól” és 33 teljesen antialkoholista személytől, akikben a pH 5,65 feletti izoelektromos pontú transzferrinvariánsok tartalma nagyobb.

Ezeknek a módszereknek az a fő nehézsége, hogy lefolytatásuk bonyolult és időigényes. Kétlépcsős eljárást igényelnek, amely magában foglalja a szérummintákban lévő transzferrinvariánsok kromatográfiás elválasztását, majd az így elválasztott transzferrinvariánsok mennyiségi meghatározását immunológiai vizsgálat útján.

A fentiek alapján igény mutatkozik analitvariánsok vegyes populációjában lévő különböző analitvariánsok megbízható és egyszerű vizsgálatára, különösen a különböző transzferrinvariánsok javított meghatározási módszerére.

A klinikai szempontból érdekes ilyen analitvariánsok általában protein jellegűek, és gyakran van egy könnyen azonosítható, protein jellegű kötődő partnerük, amellyel komplexet alkotnak. Az analitvariáns legtöbb2

HU 215 555 Β szőr antigén, és így a kötődő partner antitest, bár számos proteinről ismert, hogy sajátosan kötődik más proteinekhez vagy peptidekhez, ezért azok kötődő partnernek tekinthetők. A haptoglobin protein például sajátosan kötődő partner a hemoglobin számára. Az ilyen kötődő partnerek jelezhetők például enzimmel vagy egyéb jelzett atommal vagy csoporttal, és így használhatók a kérdéses analitvariánsok jelzésére a meghatározásukra irányuló vizsgálatokban.

A találmány azon az elven alapszik, hogy jelzett kötődő partnerek útján a protein jellegű analitvariánsok elválasztásuk előtt jelezhetők, így az elválasztást követően az elválasztott frakciókban a jelzőanyag meghatározása biztosítja a variánsok viszonylagos mennyiségének mennyiségi meghatározását. Fontosnak találtuk azonban azt, hogy az analitvariánsokat a jelzett kötődő partnerek olyan populációjával reagáltassuk, amely az elemzendő különböző analitvariánsok mindegyikére nézve reakcióképes, azonban a választott frakcionáló vagy elválasztó rendszerben egységes névleges eloszlású vagy mobilitású.

Egy ilyen eljárás lefolytatása alapvetően egyszerűbb, mint az ismert megoldásoké, amelyek elválasztást alkalmaznak, majd ezt az elválasztott frakciókon végzett hagyományos immunológiai vizsgálatok követik.

A fentiek alapján a találmány eljárás protein jellegű, frakcionáló rendszerben elválasztható analitvariánsok populációjában lévő variánsok alcsoportja koncentrációjának meghatározására. Az eljárás során a variánsok populációját jelzett, protein jellegű, az analithoz specifikusan kötődő partnerek populációjával érintkeztetjük, a kapott jelzett kötődő partner/analit komplexeket a frakcionáló rendszerben komplex alakú analitvariánsok alcsoportját tartalmazó egy vagy több frakcióra választjuk szét, és az így kapott egy vagy több frakcióban meghatározzuk a jelzett mennyiséget, ahol a specifikusan kötődő jelzett partnereknek a reakció előtt a frakcionáló rendszerben egységes névleges eloszlású vagy mobilitású populációját alkalmazzuk.

A leírásban a „protein jellegű” kifejezésbe az összes molekulát beleértjük, amely lényegében protein természetű, többek között mind a peptideket, mind a polipeptideket, amelyekhez további nem protein természetű csoportok, így lipid- vagy szénhidrátcsoportok kapcsolódhatnak.

Minthogy a kötődő partner/analitvariáns komplexben lévő kötődő partner a választott frakcionáló rendszerben egységes névleges eloszlású vagy mobilitású, a kötődő partner/analitvariáns komplexek mobilitásában vagy eloszlásában mutatkozó különbségek a komplexekben lévő variánsok különbségeinek, más szóval az analiteltérésnek a következménye. Az így kapott kötődő partner/analitvariáns komplexek egy vagy több frakcióját elválaszthatjuk a kiválasztott frakcionáló rendszerrel, és az egyes elválasztott frakciókban meghatározhatjuk a jelzett anyag mennyiségét.

A találmány továbbá analitikai vizsgálati készletet biztosít, amely a találmány szerinti eljárásban használható készítményt tartalmazza a frakcionáláshoz szükséges reagensek és/vagy anyagok mellett.

Az analitvariánsok kedvező módon adott pufferrendszerben mutatott töltésüknek megfelelően eltérnek egymástól, és így könnyen elválaszthatók töltésen alapuló rendszer, így ioncserés kromatográfiás vagy elektroforetikus eljárás útján. Az analitvariánsok ezenkívül különbözhetnek az izoelektromos pont (pl) tekintetében, és így elválaszthatók izoelektromos fokuszálási vagy kromatográfiás fokuszálási eljárás útján. Éne a célra alkalmazhatjuk a „Mono-P” oszlopot és a „Polybuffer” kromatográfiás fokuszálási rendszert (gyártó cég: Pharmacia, Svédország). A komplexek izoelektromos fokuszálásához használhatunk kétdimenziós géllapokat, egy további változatként a komplexeket azonban elválaszthatjuk agarózgélben végzett egyszerű elektroforézis útján is. A találmány szerinti eljárásban az ioncserélő közeg és a szilárd fázisok széles választékát használhatjuk. Az ilyen közegeken lévő ionizálható kémiai csoportok többek között lehetnek amincsoportok vagy szulfonált vagy karboxilezett csoportok, amelyeknek hordozói lehetnek üveggyöngyök, részecskék, gélek, membránok, szűrők vagy bármilyen egyéb alkalmas szilárd fázis. Jóllehet az ilyen frakcionáló rendszerek használata egyszerű, és jó eredményeket adnak, ezért a találmány értelmében előnyösen ezeket alkalmazzuk, használhatunk bármilyen más frakcionáló rendszert, amelyben az analit változó, a kiválasztott kötődő partner pedig állandó.

Gyantát vagy szemcsés anyagot alkalmazhatunk felzagyolt adag alakjában vagy oszlopokban. Az oszlopok eluálása történhet só- vagy pH-gradiens vagy izokratikus eluálás útján. Gyakorlati szempontból előnyösen felzagyolt adagot és izokratikus eluálást használunk. Különösen előnyösnek bizonyultak a mágnesezhető részecskék. Az ioncserélő szilárd fázist merev háromdimenziós szerkezetek vagy ioncserélő szűrők is alkothatják. Ha szűrőt alkalmazunk, a szűrést végezhetjük a felülettel párhuzamosan, így radiális irányban vagy egy szűrőszalag mentén.

A találmány analitikai vizsgálati készletet is biztosít, amely az elválasztási lépés elvégzéséhez szükséges reagensek és komponensek mindegyikét vagy azok közül számosat tartalmaz a jelzett kötődő partner mellett.

Az ilyen reagensek és anyagok általában magukban foglalnak puffersókat vagy -oldatokat; felületaktív anyagokat, így a Tween márkanevű anyagot és hasonlókat; konzerválószereket, így nátrium-azidot; a frakcionálási lépés elvégzéséhez szükséges különböző géleket, gyantákat vagy egyéb közegeket, adott esetben használatra kész alakban összeállítva, így oszlopokként és hasonló megoldásokként.

Az előzőekben tárgyaltaknak megfelelően a kötődő partner/analitvariáns komplexek képződését követően a komplexeket izoláljuk, és meghatározzuk a komplexeket tartalmazó frakció(k)ban a jelzett anyag mennyiségét.

Ezeket a jelzett anyagokat a technika állása szerint ismert bármilyen hagyományos jelzési rendszer alkothatja. A jelzett anyagok így lehetnek fluoreszcens, színezett, radioaktív vagy enzimatikus anyagok, azok mennyiségét meghatározhatjuk ismert eljárásokkal. Rá3

HU 215 555 Β dioaktív jelzett anyagokat általában a radioimmunológiai vizsgálatokban szokásosan használt radioizotópok közül választunk, így az lehet ¹²5i. a szakirodalom számos fluoreszcens vagy színezett jelzőanyagot ismertet. Alkalmas fluoreszcens színezőanyagok lehetnek többek között a dimetil-amino-naftalin, fluoreszcein, diklórtriazinil-amino-fluoreszcein vagy fluoreszcens fémvegyületek. Színezett jelzőanyagok lehetnek többek között a 4-dimetil-amino-benzol, 4-N,N-dimetil-amino-azobenzol, trinitro-benzol, benzofurazinok, tetrametil-rodamin, texasvörös, morfolino-rodamin és származékai, azobenzolok, antrakinonok, oxazinok, tiazinok, triazinok, porfirinek, fikobilinek, klorofillok, indigófestékek és azok analógjai vagy származékai.

Az előzőekben tárgyaltak értelmében a kérdéses analithoz bármilyen protein jellegű kötődő partnert használhatunk, feltéve, hogy a választott frakcionáló rendszerekben egységes mobilitású vagy eloszlású. Antigének és haptének számára az antitestek általában előnyös kötődő partnerek, azonban használhatunk egyéb alkalmas kötődő partnerrendszereket, így haptoglobin-hemoglobin vagy hormon-receptor típusú rendszereket is.

Immunreaktív antitest fragmentumokat, így F(ab) vagy F(ab’)₂ fragmentumokat is használhatunk mindaddig, amíg a fragmentum viselkedése az adott frakcionáló rendszerben egységes marad. Az ilyen fragmentumok alkalmasan S-blokkoltak lehetnek többek között S-karboxi-metil-csoportokkal.

Ugyancsak használhatunk F(v) fragmentumokat, azaz F(ab) fragmentumok hipervariábilis tartományait, amelyek lehetnek szintetikus eredetűek, és előállíthatok rekombináns DNS-technológia vagy kémiai szintézis útján.

Azt állapítottuk meg, hogy amikor a jelzett antitest vagy F(ab)₂ fragmentum moláris mennyisége közelítőleg megegyezik az analit mennyiségével vagy meghaladja azt, szignifikáns keresztkötés lép fel annak következtében, hogy a jelzett reagensnek két antigénkötő helye van. Ez az analitmolekulák számát illetően csökkenti a vizsgálati eredmény értékét. Ezért számos esetben előnyös az analithoz monovalens jelzett kötődő partner, különösen F(ab) vagy F(v) fragmentumok vagy megfelelő antitestek használata.

Megjegyzendő, hogy az ilyen monovalens fragmentumok - különösen szintetikus előállítás esetén - csekélyebb változékonyságot mutatnak, és ha gondosan, egységes módon vannak jelezve, frakcionálási műveletet sem igényelnek annak biztosítására, hogy a kiválasztott frakcionáló rendszerben megfeleljenek az egységes mobilitás vagy eloszlás kritériumának.

A leírásban az egyszerűség kedvéért az „antitestek” kifejezés egyéb utalás hiányában magában foglalja az antitestek fragmentumait is.

A találmány szerinti eljárás különösen alkalmas a transzferrin különböző variánsai koncentrációjának meghatározására. A találmány egyik sajátos kiviteli alakja ezért eljárást biztosít a vérplazmában, szérumban, teljes vérben vagy hemolizátumban lévő, gyakran izotranszferrineknek nevezett transzferrinvariánsok meghatározására. Az előzőek értelmében a transzferrinvariánsok főleg a transzferrinmolekulákon lévő sziálsavcsoportok számában különböznek. A találmány szerinti új eljárás értelmében a mintát olyan jelölt antitestek populációjával érintkeztetjük, amelyek a humán transzferrinnel reakcióképesek, és elektroforetikus, ioncserés, kromatográfiás fokuszálási vagy izoelektromos fokuszálási frakcionáló rendszerben egységes névleges mobilitást vagy eloszlást mutatnak. Az antitestek kötődése előnyösen vas(III)ionokat tartalmazó pufferoldatban megy végbe, amely lehetővé teszi antigén/antitest komplexek képzését. Az ilyen antigén-antitest reakciók kedvezően a semleges pH-értékhez közel, előnyösen 5 és 9 közötti pH-értéknél, továbbá az ilyen antigén/antitest komplexek képződését nem gátló sókoncentráció és összetétel mellett mennek végbe.

A jelzett antitestek előnyösen monoklonális antitestek, azonban alkalmazhatunk poliklonális antitesteket is, minthogy az itt leírt tisztítási eljárások egységes tulajdonságokat biztosítanak.

Az antitranszferrin antitestek jelzett F(ab) vagy F(v) fragmentumai különösen a transzferrinvariáns elemzésben új anyagok. Még ha viszonylag nem egységesek is, jobb eredményeket adnak, mint a teljes antitestek. Különösen előnyösek a frakcionált, jelzett F(ab) és F(v) fragmentumok, amelyek egy vagy több frakcionáló rendszerben egységes mobilitásúak vagy eloszlásúak.

Az antitestekkel való kölcsönhatást megelőzően vagy azzal párhuzamosan vagy azt követően a minta transzferrinjeit telíthetjük vas(III)ionokkal. A transzferrinek telítése vas(III)ionokkal az antigén/antitest komplexek adott elválasztási rendszerekkel történő elválasztása előtt vagy azzal egyidejűleg általában szükséges a transzferrinvariánsok ezen eljárás szerinti analíziséhez, minthogy a variánsok vas(III)ion-tartalmában fennálló különbségek egyébként törlik azt az eloszlási mintát, amelyet az adott elválasztási rendszerben a sziálsavtartalomban lévő különbségek következtében kapunk.

A transzferrinvariáns elemzésére szolgáló, találmány szerinti eljárás előnyös változata szerint a variáns/antitest komplexek elegyét kromatográfiás fokuszálási, ioncserés, elektroforetikus vagy izoelektromos fokuszálási elválasztási rendszerben kezeljük. Minthogy a jelzett antitestek ezen elválasztási rendszerek egyikében egységes névleges mobilitásúak vagy eloszlásúak, ezen jelzett antitestek a transzferrinvariánsokkal (izotranszferrinekkel) az adott elválasztási rendszerek egyikében a mobilitás vagy eloszlás terén különbségeket mutató antigén/antitest komplexeket képeznek, ahol a mobilitás vagy eloszlás különbsége megfelel a transzferrinvariánsok között a mobilitás vagy eloszlás terén fennálló különbségeknek, de nem szükségszerűen azonosak azzal. A humán transzferrinre nézve reakcióképes és a tárgyalt elválasztási rendszerek egyikében egységes névleges mobilitású vagy eloszlású monoklonális antitesteket előállíthatunk hagyományos hibridóma eljárásokkal, amelyeket szükség esetén kémiai eljárásokkal módosíthatunk. A kívánt antitestek tisztítása általában szükséges, és azt előnyösen a tárgyalt rendszerek egyike, azaz kromatográfiás fokuszálási, ioncserélő kromatográfiás, izoelektromos fokuszálási vagy elektroforetikus eljárás útján végezhetjük el.

HU 215 555 Β

A találmány szerinti, a transzferrin elemzésére szolgáló vizsgálati készlet előnyösen jelzett antitranszferrin antitesteket vagy különösen előnyösen ilyen antitestekből származó jelzett F(ab) fragmentumokat tartalmaz legalább egy vas(III)ion sójával vagy oldatával együtt.

A találmány szerinti eljárás számos kiviteli alakjában előnyösek olyan jelzett antitestek vagy egyéb protein jellegű kötődő partnerek, amelyeknek izoelektromos pontja kiválasztott tartományokba esik, vagy amelyek a tárgyalt elválasztási rendszerben sajátos eloszlást vagy mobilitást mutatnak. Ilyen módosított proteinek előállítására a proteineket módosíthatjuk a jelzési lépés előtt vagy után. Az ilyen módosítások általában megváltoztatják a molekulában lévő, töltést hordozó csoportok, így savas vagy bázikus csoportok számát. Ilyen módosításokhoz használhatunk olyan reagenseket, amelyek a proteineket alkotó aminosavak oldalláncaival reagálnak [Glazer, Delange és Sigman: „Chemical modification of proteins”, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, New York, Oxford 1975]. Aminocsoportokat módosíthatunk többek között karbamilezéssel, acetilezéssel, benzilezéssel vagy szukcinilezéssel, karbonsavcsoportokat módosíthatunk észterezéssel és azáltal, hogy karbodiimidek vagy egyéb kapcsoló reagensek útján nukleofil csoportokat kapcsolunk hozzájuk. Hasonlóképpen módosíthatjuk antitestek vagy egyéb protein jellegű kötődő partnerek szénhidrátcsoportjait.

A találmány szerinti jelzett glükoprotein kötődő partnerek kompozícióinak előállításához gyakran szükséges módosítások kényelmes módszere a glükoproteinek szénhidrátcsoportjainak oxidálása perjodáttal, amit a kapott aldehid olyan reagensekkel lejátszódó reakciója követ, amelyek savas vagy bázikus csoportokat visznek be. Diszulfidhidakat tartalmazó proteinekhez alkalmas további módszer a cisztin diszulfidhídjainak részleges redukálása a proteinek aminosavak alkotta polipeptidláncai között. Különösen az antitestek tartalmaznak számos ilyen diszulfidhidat, és a diszulfídhidak közül nem mindegyik, de számos szabad tiolokká redukálható anélkül, hogy ez az antitestek antigénekkel szembeni affinitását módosítaná. Ezek a kötések, és így a kapott tiolok az antitestek végső tartományában helyezkednek el, távol az antitestek antigénekhez kapcsolódásának helyeitől. Az ilyen redukálószerekre nem korlátozó értelmű példák a 2-tioetanol és ditiotreitol. A redukálószer eltávolítását követően savas vagy lúgos csoportok bevitelére alkalmas reagenseket kapcsolunk a szabad tiolokhoz egyetlen vagy két lépésből álló eljárásban a tiolcsoportokkal és a nukleofil csoportokkal reagáló kettős funkciójú kapcsolószerekkel, amelyek többek között lehetnek szulfoszukcinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-1 -karboxilát, szulfo-szukcinimidil-(4-jód-acetil)-amino-benzoát vagy egyéb szukcinimidil-maleimidtartalmú reagensek. Egy másik lehetőségként a savas vagy lúgos csoportokat bevivő reagenst kapcsolhatjuk helyettesített piridil-diszulftdok vagy tioltartalmú reagensek útján, amelyek helyreállítják a diszulfidkötést, azonban savas vagy bázikus kémiai tulajdonságokat hordozó kémiai helyettesítőt tartalmaznak.

A találmány egyik sajátos kiviteli alakjában a nukleofil reagenst alkothatja savas polimer, így az aminosavakon egy vagy több savas oldalláncot tartalmazó polipeptid.

A szénhidrát módosításának és/vagy a végső tartományban lévő cisztin redukálása útján történő módosításnak az az előnye, hogy az így kapott antitestek antigénhez kötődő helyeit csekély mértékben zavarja. Savas karakterű polipeptideket azonban az antitestek polipeptidszerkezetének lizincsoportjaihoz vagy egyéb csoportjaihoz is kapcsolhatunk.

A transzferrinvariánsok elemzése szempontjából különös jelentőségűek azok, amelyekhez legfeljebb két sziálsavcsoport kapcsolódik, és amelyeknek pl-értéke meghaladja a legalább három sziálsavcsoportot tartalmazó transzferrinvariánsok értékét. A találmány szerinti eljárás egyik változatában anioncserélő gyantákat alkalmazunk olyan pH-értéknél és a pufferoló só olyan koncentrációjánál és összetételénél, ahol a legalább három sziálsavcsoportot tartalmazó transzferrinvariánsok antigén/antitest komplexei kötődnek az anioncserélő szilárd fázishoz, ezzel szemben a legfeljebb két sziálsavcsoportot tartalmazó transzferrinvariánsok antigén/antitest komplexei nem kötődnek. A találmány szerinti eljárás ezen változatában előnyösen olyan jelzett - szükség esetén módosított - antitesteket használunk, amelyek az anioncserélő szilárd fázishoz kötődnek, így csak azon jelzett antitestek maradnak oldatban, amelyek legfeljebb két sziálsavcsoportot tartalmazó transzferrinvariánsokkal alkottak komplexeket. Ezt szemlélteti sematikusan az 1. ábra. A mindenkori elválasztáshoz a pH-értéket és a puffer összetételét a jelzett monoklonális antitestek és a képződött komplexek pl-értéke alapján választjuk meg. Elválasztás után - amit ha a szilárd fázis felzagyolt adag alakjában van, centrifugálás vagy szűrés útján, ha a szilárd anioncserélő fázis mágnesezhető, akkor mágneses elválasztás útján, vagy pedig ha a szilárd fázis rögzített vagy oszlop alakban van, eluálás útján végzünk megmérjük az oldatban maradt jelzett anyagot az antigén/antitest komplexek koncentrációjának meghatározására, ami a legfeljebb két sziálsavcsoportot tartalmazó transzferrinvariánsok koncentrációjának felel meg.

A találmány szerinti eljárást lefolytathatjuk úgy, hogy a jelzett kötődő partnerek fölöslegben vannak az analit (az összes variáns) teljes mennyiségéhez viszonyítva, vagy pedig az analit van feleslegben a kötődő partnerekhez viszonyítva. Ha a kötődő partnereket használjuk feleslegben, a különböző variánsok teljes koncentrációjának megfelelő jeleket kapunk. Ha a jelen lévő analit van feleslegben, valamennyi variáns összkoncentrációjához viszonyítva kapjuk a különböző variánsok relatív mennyiségét.

Ha a jelzett kötődő partnert használjuk feleslegben, akkor előnyösen monovalens változatát alkalmazzuk. Az előzőek értelmében a bivalens kötődő partnerek, így az antitestek hajlamosak arra, hogy keresztkötést létesítsenek két különböző analitmolekula között különösen akkor, ha megközelítőleg ekvimoláris mennyiségben használjuk azokat. Ezért előnyösen F(ab) vagy F(v) fragmentumokat használunk erre a célra.

HU 215 555 Β

Kötődő partnerrendszer esetén az antigén analitokhoz antitesteket vagy azok fragmentumait használva, ha feleslegben használjuk az antigént, szükség esetén módosított, adott esetben immobilizált antigéneket alkalmazó affinitás-kromatográfiás eljárással tisztított, jelzett antitesteket használhatunk. Ezért az antitestek vagy fragmentumok közel 100%-a immunreaktív lehet, ami a vizsgálatban nagyon csekély szintre csökkenti a komplex állapotba nem jutott szabad antitestek vagy fragmentumok részarányát. Ezáltal csökkenthetjük vagy elkerülhetjük az antigénvariáns elemzési módszerében potenciálisan rejlő zavaró hatásokat.

A találmány szerinti megoldás előnye az immunológiai mennyiségi meghatározás és a frakcionálás egyesítése egy műveletben azáltal, hogy a jelzett kötődő partnerek és a különböző analitvariánsok között képződő komplexeket elválasztjuk, amit az immunológiai kiértékelés követ. így a találmány értelmében lehetővé válik a transzferrinek és egyéb analitvariánsok meghatározása a technika állása szerinti eljárásoknál sokkal könnyebben, különösen a kis sziálsavtartalmú transzferrinvariánsok meghatározása céljából az alkoholfogyasztás szempontjából vizsgált személyekből származó plazma vérszérumában.

A következőkben a találmányt nem korlátozó értelmű példákkal szemléltetjük, hivatkozva a csatolt rajzokra.

Az 1. ábra sematikusan bemutatja különböző számú sziálsavcsoportot tartalmazó transzferrinvariánsok elválasztását szilárd fázisú anioncserélővei.

A 2. ábra gélt mutat be izoelektromos fokuszálás után, amelyen módosított és jelzett antitestek pl-értéke látható humán transzferrinnel szemben.

A 3. ábra grafikusan ábrázolja az anti-transzferrin FITC-származékok elválasztását ioncserés kromatográfia útján erős anioncserélő oszlopon (puffer: 20 mmol/1 nátrium-foszfát, pH 6,5). A folytonos vonal az UV-elnyelést mutatja 280 nm hullámhosszon, a szaggatott vonal a sógradienst jelenti (mól NaCl-egységekben kifejezve).

A 4. ábra a 2. ábrán bemutatott módon kapott FITC antitranszferrin-származékok három szomszédos frakciójának további elválasztását mutatja be erős anioncserélő oszlopon végzett ismételt kromatográfiás eljárás útján. (Puffer: 20 mmol/1 nátrium-foszfát, pH=6,5.)

Az 5. ábra ioncserés kromatográfiás eljárással kapott FITC útján jelzett anti-transzferrin monoklonális antitestekkel elegyített szérumminták frakcióinak fluoreszcens jeleit tünteti fel grafikusan. (A jelölések magyarázata: □ alkoholista széruma + antialkoholista széruma.)

A 6. ábra antitranszferrin monoklonális antitestek és humán transzferrin közötti diszialkomplexek (O) és tetraszialkomplexek (+) ioncserés kromatografálással kapott frakcióinak fluoreszcenciás jeleit mutatja be grafikusan.

A 7. ábra jelzett, nem tisztított monoklonális antitranszferrin antitestek preparatív anioncserés kromatográfiás előállításának eredményeit mutatja be grafikusan.

A 8. ábra a 7. ábra szerinti kromatográfiás művelettel kapott egyik frakció anioncserélő rendszerben mutatott mobilitását mutatja be grafikusan.

A 9. ábra krónikus alkoholista (-Δ-) és normál (...o...) egyed szérummintáiból származó FITC-FABtranszferrin-komplexek anioncserélő (Mono Q) oszlopról eluált frakcióinak fluoreszcenciális eredményeit mutatja be.

A példákban használt antitestek szállítója: Chemicon International, Temcula, CA, USA.

1. példa

Kereskedelemben kapható, anti-transzferrin IgG termelő hibridóma egerekben termelt aszciteszből monoklonális antitesteket tisztítottunk ioncserés kromatográfiás és foszfátpufferben végzett gélkromatográfiás eljárással. Az antitestek immunaffmitását mikrotitráló ELISArendszerben vizsgáltuk, ehhez immobilizált humán transzferrint és oldatban lévő peroxidáz-konjugált poliklonális anti-egér-IgG antitesteket használtunk. A tisztított anti-transzferrin antitesteket 5,6 pH-jú 0,1 mol/1 ecetsavpufferrel szemben dializáljuk, és (50 mmol/1 végső koncentrációjú) peijodátionokkal oxidáltuk. Miután a perjodátionokat gélkromatográfiás úton eltávolítottuk, az antitesteket hozzájuk képest 50-szeres moláris feleslegben lévő N-Ala-Ala-Ala-Ala-Glu-GluGlu-Glu-Glu-COOH savas polipeptiddel reagáltattuk, amit a kötések stabilizálása követett (15 mmol/1 végső koncentrációjú) oldatban lévő cián-bór-hidrid-ionok útján. A kapott, módosított antitesteket 9,5 pH-jú 0,1 mol/1 nátrium-karbonát pufferoldattal szemben dializáltuk, majd 30 percen keresztül szobahőmérsékleten 10 mmol/1 végső koncentrációjú 2-tioetanollal reagáltattuk, ezt követően 7,4 pH-jú foszfátpufferben végzett gélkromatográfiás eljárással eltávolítottuk a 2-tioetanolt. Az N-Ala-Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-GluCOOH savas polipeptidet reagáltattuk a protein kapott szabad tiolcsoportjaival, ehhez szulfo-szukcinimidil-4(N-maleimido-metil)-ciklohexán-1 -karboxilátot használtunk, ahol az antitest, a kapcsoló reagens és a peptid mólaránya 1:33:40 volt. Ezt követően karbonátpufferrel szemben végzett dialízis után a módosított antitesteket fluoreszcein-izotiocianáttal reagáltattuk, majd gélkromatográfiás eljárással tisztítottuk. Ezen módosítások minden lépése után vizsgáltuk az antigén affinitását, és csak nagyon csekély csökkenést tapasztaltunk. A 2. ábra gélelektroforézis során (Phast System, Pharmacia) végzett izoelektromos fokuszálás eredményeit mutatja, amelyből kitűnik a pl értékében elért csökkenés. Módosított és jelzett antitestek alapvető frakciójának pl-értéke a legfeljebb két sziálsavcsoportot tartalmazó izotranszferrinéhez hasonló vagy annál kisebb. A 2. ábrán használt jelölések magyarázata a következő:

a) humán transzferrin

b) módosítatlan monoklonális IgG antitranszferrin

c) ugyanaz mint b), de N-Ala-Ala-Ala-AlaGlu-Glu-Glu-Glu-Glu a szénhidrátcsoportokhoz van kapcsolva.

d) ugyanaz, mint c), de azon kívül Ala-Ala-AlaAla-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu a végső tartományhoz van kapcsolva.

e) ugyanaz, mint d), de a proteinnel fluoreszceinizotiocianátot reagáltattunk.

HU 215 555 Β

A találmány szerinti eljárás lefolytatásához az szükséges, hogy az antitestek eloszlása vagy mobilitása a megfelelő elválasztási rendszerben egységes névleges legyen. Ha ez nem áll fenn, az antitestkomplexek heterogenitása lehetetlenné teszi az antitestek különböző antigénvariánsokkal alkotott komplexei elválasztását és mennyiségi meghatározását.

A 3. ábra a módosított monoklonális antitestek preparatív anioncserés kromatográfia útján kimutatott heterogenitását szemlélteti. A szaggatott függőleges vonalakkal határolt oszlopok 20 frakció összegyűjtését jelzik a preparatív anioncserés kromatografálás során abból a célból, hogy szűk pH-tartományú frakciókat kapjunk.

A 4. ábra a tárgyalt preparatív kromatográfiás eljárásban kapott három különböző szomszédos frakció alikvot részeivel lefolytatott kromatográfiás analízis eredményeit mutatja szemléltetve azt, hogy mindegyik frakciót közel egységes mobilitás jellemzi. Még egységesebb frakciókat kaphatunk, ha az eluálás során kisebb meredekségű gradiensprofílt, ismételt vagy egyéb kromatográfiás eljárást alkalmazunk. Alkalmazhatunk izoelektromos vagy kromatográfiás fokuszálást vagy pedig kombinálhatjuk a két módszert.

Ha a vizsgálati mintát a tárgyalt, egységes vagy közel egységes mobilitású vagy eloszlású, jelzett monoklonális anti-humán-transzferrin antitestekkel keveijük, a megfelelő elválasztási rendszerben különböző mobilitású vagy eloszlású antigén/antitest komplexek képződnek, amelyek tükrözik a különböző transzferrinvariánsok különbségét. A különböző antigén/antitest komplexeket ioncserés kromatográfia, kromatográfiás fokuszálás vagy izoelektromos fokuszálás vagy elektroforézis vagy a képződött komplexek elektromos töltésében fennálló különbségeket hasznosító egyéb kémiai eljárások útján választjuk el.

2. példa

Alkoholisták és antialkoholisták szérummintáinak elemzése

Szilárd fázis:

Polisztirolrészecskékkel töltött 1 ml térfogatú oszlop, ahol a felületi csoportok kvatemer aminnal vannak helyettesítve (Mono Q típusú oszlop, gyártó cég: Pharmacia, Uppsala, Svédország).

Eluálószer:

100 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 6,50 pH-jú 20 mmol/1 bisz-Tris puffer.

Vizsgálati eljárás:

Egy 10 μΐ térfogatú szérummintát transzferrintartalmára vonatkoztatva 20-szoros moláris feleslegben vas(III)-citrát-oldattal kevertünk össze, majd a humán transzferrin valamennyi variánsára nézve reaktív monoklonális egér-antihumán-transzferrin antitesteket adtunk hozzá, amelyek módosították és fluoreszceinnel jelzettek, továbbá a tárgyalt ioncserélő rendszerben a transzferrin 1:1 moláris szérumkoncentrációja és a tárgyalt eluálószer-puffer esetén nagyon homogén mobilitás eléréséig van tisztítva. Szobahőmérsékleten rövid (5-10 perc) ideig végzett inkubálást követően az elegyet átbocsátottuk az oszlopon, amit az eluálószerpufferrel végzett további eluálás követett. 1,0 ml térfogatú frakciókat gyűjtöttünk össze, és meghatároztuk a frakciók fluoreszcenciáját (gerjesztés: 485 nm, emisszió: 520 nm, a mérést RF-540 típusú Shimadzu spektrofotométerrel végeztük). Az 5. ábra alkoholisták és antialkoholisták szérumával kapott jellemző eredményeket tüntet fel. A 6. ábra összehasonlításul szérum helyett tisztított diszial- és tetraszial-transzferrinek oldatmintáival kapott megfelelő eredményeket mutat.

3. példa

A 2. példában használt antitestfrakció elemzése

A 7. ábra kromatogramot mutat be a 2. példa szerinti jelzett, nem tisztított monoklonális antitestek előállítására végzett preparatív anioncserés kromatográfiás eljárás eredményeire vonatkozóan. Ezen kromatográfiás frakciók mindegyikéből 0,5 ml térfogatú mintát gyűjtöttünk össze, és a 8. ábrán bemutatott kromatogram azt szemlélteti, hogy az anioncserés kromatográfiás rendszerekben az egyes frakciók nagyon szűk vagy homogén mobilitásúak. A kromatográfiás eljárást Mono Q HR5 típusú anioncserélő oszlopon (gyártó cég: Pharmacia) folytattuk le, amelyet 8,0 pH-jú 20 mmol/1 Tris pufferrel (A puffer) hoztunk egyensúlyba, majd gradiens eluálást végeztünk a B pufferrel (0,7 mól NaCl-tartalmú A puffer).

4. példa

Anioncserélő mátrixon lényegében egységes mobilitású, fluoreszceinnel jelzett monoklonális Fab-fragmentumok előállítása

Kereskedelemben kapható, egerekben termelt aszciteszből IgG antitranszferrint termelő hibridómát használó eljárással monoklonális antitesteket tisztítottunk ioncserés kromatográfiás és azt követően foszfátpufferben végzett méretspecifikus gélkromatográfiás eljárás útján. Ezután a puffért karbonátpufferre cseréltük, mielőtt ditiotreitollal kombinált papain alkalmazása mellett az IgG antitesteket Fab antitest-fragmentumokká emésztettük. Ezen enzimatikus módosítás után a szabad tiolcsoportokat (az antitesten lévő szabad tiolcsoportokat is beleértve) jód-acetamiddal blokkoltuk, ami az enzimatikus aktivitást is megszünteti. A képződött Fabfragmentumokat dialízisből és anioncserés kromatográfiából álló kombinált eljárással tisztítottuk.

A tisztított antítestfragmentumokat (Fab) 9,5 pH-jú karbonátpufferrel szemben dializáltuk. A fluoreszcein az antitesten lévő aminocsoportokhoz kötődik. A fluoreszceinnel jelzett Fab tisztítását méretspecifikus kromatográfiás eljárással végezzük, mielőtt végül anioncserélő kromatográfiás oszlopról a jelzett Fab-frakciót izoláljuk. Ezt a frakciót az izoelektromos pont tekintetében nagyfokú homogenitás jellemzi, így anioncserélő mátrixon lényegében egységes mobilitású.

A jelzett Fab immunaktivitását mikrotitráló ELISArendszerrel vizsgáljuk immobilizált humán transzferrint és oldatban lévő peroxidáz-konjugált poliklonális antiegér-IgG antitesteket használva.

HU 215 555 Β

5. példa

Anioncserélő mátrixon lényegében egységes mobilitásit, AMCA-val jelzett monoklonális Fab-fragmentumok előállítása

Kereskedelemben kapható, egerekben termelt aszciteszből IgG antitranszferrint termelő hibridómát használó eljárással monoklonális antitesteket tisztítottunk ioncserés kromatográfiás és azt követően foszfátpufferben végzett méretspecifikus gélkromatográfiás eljárás útján. Ezután a puffért karbonátpufferre cseréltük, mielőtt ditiotreitollal kombinált papain alkalmazása mellett az IgG antitesteket Fab antitest-fragmentumokká emésztettük. Ezen enzimatikus módosítás után a szabad tiolcsoportokat (az antitesten lévő szabad tiolcsoportokat is beleértve) jód-acetamiddal blokkoltuk, ami az enzimatikus aktivitást is megszünteti. A képződött Fab-fragmentumokat dialízisből és anioncserés kromatográfiából álló kombinált eljárással tisztítottuk.

A tisztított antitestfragmentumokat 8-as pH-jú borátpufferrel szemben dializáljuk, mielőtt 7-amino-4metil-kumarin-3-ecetsav-N-hidroxi-szukcinimidet (AMCA-NHS) adunk hozzá. A DMSO-oldatban adagolt AMCA-NHS reagál a Fab-molekula szabad aminocsoportjaival. Az AMCA-Fab tisztítása méretspecifikus kromatográfiás eljárással, majd anioncserélő mátrixon lényegében egységes mobilitású frakció biztosítására anioncserés kromatográfiás eljárással történik.

6. példa

Anioncserélő mátrixon lényegében egységes mobilitású, RESO-val jelzett monoklonális Fab-fragmentumok előállítása

A tisztított antitestfragmentumokat 0,1 mol/1, 8,5 pH-jú karbonátpufferrel szemben dializáljuk. DMSO-oldatban moláris feleslegben lévő N-(rezorufin4-karbonil)-piperidin-4-karbonsav-N’-hidroxi-szukcinimid-észtert (RESOS) adunk hozzá, amely szobahőmérsékletű inkubálás közben reagál az antitest aminocsoportjaival. A jelzett Fab tisztítása méretspecifikus kromatográfiás eljárással történik, majd anioncserés kromatográfiás eljárást folytatunk le. Anioncserélő mátrixon lényegében egységes mobilitású frakciót izolálunk.

7. példa

Betegek szérumában lévő dezszialilezett transzferrinek vizsgálata

Dezszialilezett transzferrineket vassal telített szérumminták alkalmazásával vizsgáltunk. A vassal végzendő telítéshez 7-es pH-jú 0,2 mol/1 Tris-maleátban 5 μΐ 0,25 mg/ml koncentrációjú FeCl₃-oldatot adunk 20 μΐ szérumhoz, és szobahőmérsékleten 20 percen át inkubáljuk.

A vizsgálati oldatot úgy készítjük el, hogy 10,2 μΐ térfogatú, vassal telített szérumot adunk 500 μΐ 8,0-as pH-jú 20 mmol/1 Tris-HCl-, 70 mmol/1 NaCl- és 0,05% Tween-20 tartalmú oldathoz, amelyben még 5x10 ⁸mól FITC-Fab (a 4. példában leírtak szerinti, fluoreszceinnel jelzett anti-transzferrin-Fab) van. Erős anioncserélővei töltött oszlopon végzett elválasztás előtt ezt az oldatot 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az FITS-Fab/transzferrin komplexet tartalmazó oldat 500 μΐ-ét Mono Q típusú oszlopon (gyártó cég: Pharmacia) 8,0-as pH-jú, 20 mmol/1 Tris-HCl-, 70 mmol/1 NaCl- és 0,05% Tween-tartalmú eluálószerrel eluáljuk. A 9. ábra idült alkoholista és antialkoholista személy szérummintáiból eredő FITC-Fab/transzferrin komplexek eluálásával kapott eredményeket mutatja. Az 1. frakció fluoreszcenciájának eredete nem kötött Fab, a 3-7. frakciók fluoreszcenciáját dezszialilezett transzferrinhez kötött FITC-Fab, a 9-et meghaladó számú frakciók fluoreszcenciáját normál transzferrinhez kötött FITC-Fab okozza. A 7-nél kisebb sorszámú frakciók fluoreszcenciájának különbsége alapján az idült alkoholistákat és alkoholt nem fogyasztó személyeket megkülönböztethetjük egymástól.

8. példa

Betegek szérumában lévő dezszialilezett transzferrinek meghatározása egyszer használatos minioszloppal

Erős anioncserélő gélből (Q-Sepharose, gyártó cég: Pharmacia) egyszer használatos oszlopokat készítünk, ehhez 0,7 cm belső átmérőjű oszlopban 0,5 ml gélt használunk. Az oszlopot 8,0-as pH-jú, 20 mmol/1 Tris-HCl-, 70 mmol/1 NaCl- és 0,05% Tween-20-tartalmú oldattal egyensúlyi állapotba hozzuk.

Dezszialilezett transzferrineket a minioszlopon vassal telített szérumminták alkalmazásával vizsgáltunk. A vassal végzendő telítéshez 7-es pH-jú 0,2 mol/1 Trismaleátban 5 μΐ 0,25 mg/ml koncentrációjú FeClj-oldatot adunk 20 μΐ szérumhoz, és szobahőmérsékleten 20 percen át inkubáljuk.

A vizsgálati oldatot úgy készítjük el, hogy 10,2 μΐ térfogatú, vassal telített szérumot adunk 500 μΐ 8,0-as pH-jú 20 mmol/1 Tris-HCl-, 70 mmol/1 NaCl- és 0,05% Tween-20-tartalmú oldathoz, amelyben még 5x 10 ⁸ mól FITC-Fab (a 4. példában leírtak szerinti, fluoreszceinnel jelzett anti-transzferrin-Fab) van. Erős

HU 215 555 Β anioné serélővel töltött oszlopon végzett elválasztás előtt ezt az oldatot 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az FITC-Fab/transzferrin komplexet tartalmazó oldat 100 μΐ-ét felvisszük az oszlopra, és a dezszialilezett transzferrin/FITC-Fab komplexeket 3 ml 8,0-as pH-jú, 20 mmol/1 Tris-HCl-, 70 mmol/1 NaClés 0,05% Tween-20-tartalmú oldattal eluáljuk. Az eluátum teljes mennyiségét összegyűjtjük, és a fluoreszceintől eredő fluoreszcenciát méljük, és összehasonlítjuk a használt, fluoreszceinnel jelzett Fab-ffagmentumok szokásosan hígított oldatáéval. Az eredményeket idült alkoholisták és alkoholt nem fogyasztó személyek megkülönböztetésére használjuk.

A következő táblázat számos idült alkoholista és antialkoholista vizsgálati eredményeit tartalmazza.

Táblázat

Szérum	Etanolfogyasztás	Mért fluoreszcencia a teljes érték %-ában
A		10,9
B	alkoholisták	8,5
C		8,4
D		7,8
E		5,2
F	antialkoholisták	4,8
G		4,8

9. példa

Szérumban lévő dezszialilezett transzferrin (CDT) vizsgálata (I)

Anyagok

i) A oldat: 150 kBq/ml ¹²⁵I-anti-transzferrin-Fab, 20 mmol/1 bisz-Tris, 3,7xlO⁵ mól vas(III)-citrát, 66 mmol/1 NaCl, 5,9 mmol/1 HC1, 3 mmol/1 nátriumazid, 0,05% Tween 20, pH 7,0.

ii) B oldat: 20 mmol/1 bisz-Tris, 55 mmol/1 NaCl, 5,9 mmol/1 HC1, 3,1 mmol/1 nátrium-azid, 0,05% Tween 20, pH 7,0.

iii) Az elválasztáshoz használt oszlopok: 0,5 ml erős anioncserélő gél (Q-Sepharose Fást Flow, Pharmacia), amelyet a B oldattal hozunk egyensúlyi állapotba.

iv) Vizsgálati csövek

A reagenseket és az oszlopokat hosszabb időn keresztül 4-8 °C hőmérsékleten tároljuk.

Használat előtt az oldatokat és oszlopokat hagyjuk szobahőmérsékleten a hőegyensúly állapotába jutni.

Eljárás

1. Vizsgált oldat előállítása

1.1 Vizsgálati csőben lévő 220 μΐ A oldathoz 30 μΐ szérumot adunk. Csak valódi szérummintákat használunk.

1.2 A mintákat szobahőmérsékleten 1-10 perc időtartamig inkubáljuk.

2. Oszloppal végzett elválasztás

2.1 Az oszlopból eltávolítjuk a felesleges oldatot, ehhez először a felső, majd az alsó dugót húzzuk ki a csőből. Az oldatot hagyjuk átfolyni az oszlopon, majd az eluátumot eldobjuk.

2.2 Az oszlop alá egy csövet helyezünk.

2.3 200 μΐ térfogatú vizsgálandó oldatot adunk az oszlopra. Ügyelünk arra, hogy a vizsgálati mintát közvetlenül az oszlop tetején lévő felső szűrőre vigyük fel. A mintát hagyjuk beszivárogni a felső szűrőbe, mielőtt 3,0 ml B oldattal eluáljuk. Az oszlop eluálását az eluálószer áramlásának megszűnéséig folytatjuk.

3. Mérés

3.1 Az összegyűjtött oldatot γ-számlálóval vizsgáljuk.

3.2 Ismert%-os mennyiségben CDT-t tartalmazó referenciamintákkal kalibrációs görbét készítünk.

3.3 A kalibrációs görbe alapján meghatározzuk a szérumminták ismeretlen CDT-tartalmát.

10. példa

Szérumban lévő dezszialilezett transzferrin (CDT) meghatározása (2)

Anyagok

i) A oldat: 0,14 mg/ml mennyiségű, fluoreszceinnel jelzett anti-transzferrin-Fab, 5 mmol/1 Tris, 55 mmol/1 NaCl, pH 8,0, 3,1 mmol/1 nátrium-azid.

ii) B oldat: 20 mmol/1 bisz-Tris, 3,7x10 ⁵ mól vas(III)-citrát, 66 mmol/1 NaCl, 5,9 mmol/1 HC1,

3,1 mmol/1 nátrium-azid, 0,05% Tween 20, pH 7,0.

iii) C oldat: 20 mmol/1 bisz-Tris, 66 mól NaCl, 5,9 mmol/1 HC1, 3,1 mmol/1 nátrium-azid, 0,05% Tween 20, pH 7,0.

iv) D oldat: 1,0 mól Tris-alap, 3,1 mmol/1 nátriumazid.

v) az elválasztáshoz szükséges oszlopok: 0,5 ml erős anioncserélő gél (Q-Sepharose Fást Flow, gyártó cég: Pharmacia), amelyet C oldatban egyensúlyi állapotba hozunk.

vi) Vizsgálati csövek.

A reagenseket és oszlopokat hosszabb időtartamon keresztül 4-8 °C hőmérsékleten tároljuk.

Az oldatokat és az oszlopokat használat előtt szobahőmérsékleten egyensúlyi állapotba hozzuk.

Az A oldatot és az A oldatot tartalmazó oldatokat fénytől védeni kell.

Vizsgálati eljárás

1. Inkubációs oldat naponkénti készítése

1.11 rész A oldatot 10 rész B oldattal keverünk.

1.2 Az inkubációs oldatot csak egy napi vizsgálatra elegendő mennyiségben készítjük. Egy-egy vizsgálathoz legalább 230 μΐ, továbbá ellenőrző vizsgálat céljára 20 μΐ oldat szükséges.

2. Vizsgálati oldat készítése

2.1 Vizsgálati csőben lévő 220 μΐ térfogatú (előzőek szerinti) inkubációs oldathoz 30 μΐ szérumot adunk. Csak valódi szérummintákat használunk.

2.2 A mintákat 1-10 perc időtartamig inkubáljuk szobahőmérsékleten.

3. Oszloppal végzett elválasztás

3.1 Az oszlopból eltávolítjuk a felesleges oldatot, ehhez először a felső, majd az alsó dugót húzzuk ki a csőből. Az oldatot hagyjuk átfolyni az oszlopon, majd az eluátumot eldobjuk.

3.2 Az oszlop alá egy küvettát helyezünk.

HU 215 555 Β

3.3 200 μΐ térfogatú vizsgálandó oldatot adunk az oszlopra. Ügyelünk arra, hogy a vizsgálati mintát közvetlenül az oszlop tetején lévő felső szűrőre vigyük fel. A mintát hagyjuk beszivárogni a felső szűrőbe, mielőtt 3,0 ml C oldattal eluáljuk. Az oszlop eluálását az eluálószer áramlásának megszűnéséig folytatjuk.

3.4 Az összegyűjtött eluátumhoz 0,1 ml D oldatot adunk, és a küvetta megfordításával elkeverjük annak tartalmát.

4. Mérés

4.1 Az összegyűjtött oldatnak mérjük a fluoreszcenciáját. Gerjesztés: 485 nm (480-490 nm tartomány), emisszió: 520 nm (515-525 nm tartomány).

4.2 A nullpont beállításához használt minta:

3,0 ml C oldat + 0,1 ml D oldat

4.3 Ismeretlen mintában lévő CDT %-ban kifejezett mennyiségét meghatározhatjuk ismert összetételű szérumokkal végzett mérésekből szerkesztett kalibrációs görbe alapján.

11. példa

Adagokkal végzett frakcionálás

Vizsgálati oldat:

300 μΐ térfogatú, 50 mmol/1 NaCl és 0,05% Tweentartalmú, 7,0 pH-jú 20 mmol/1 bisz-Tris + 1,3 μΐ térfogatú, 9,25 mmol/1 vas(III)-citrát-tartalmú 50 mmol/1 Tris-maleát + 9 μΐ térfogatú, 0,5 pg fluoreszceinnel jelzett Fab-fragmentumokat tartalmazó oldat.

Részecskék:

AQ kvatemer aminrészecskék (gyártó cég: Dyno Particles, Norvégia).

Vizsgálati eljárás:

1. A vizsgálati oldathoz 4 μΐ szérummintát adunk.

2. 40 térfogat%-os részecskeszuszpenzióhoz tartozó végtérfogathoz szükséges mennyiségű, 20 mmol/1 bisz-Tris pufferben készített, 50 mmol/1 NaCl- és 0,05% Tween-tartalmú, 7-es pH-jú részecskeszuszpenziót adunk hozzá. A szuszpenziót 10 percen át keverjük, majd 1500 g mellett 5 percen keresztül centrifugáljuk.

3. Mérjük a felülúszó fluoreszcenciáját. ^{12 * * * * * * * * * * * * * * * * *}

12. példa

Antitest Fab-fragmentumok fluoreszcenciás jelzése

1. 50 mmol/1, 9,5 pH-jú karbonátpufferben lévő

2,5 mg Fab-t 25 pg fluoreszcein-izotiocianáthoz (FITC) adunk. Az FITC-t celiten lévő (10%-os), dimetil-szulfoxidban oldott FITC-ből állítjuk elő.

2. A Fab- és FITC-tartalmú oldatot 18-24 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk sötétben.

3. A fluoreszcein-Fab tisztítására molekulaméretre specifikus gélkromatográfiás eljárást alkalmazunk (Superose 6 PrepGrade, 1,30 cm, gyártó cég: Pharmacia).

A jelzett Fab-fragmentumot 7,4 pH-jú, 10 mmol/1 nátrium-foszfátot és 0,5 mól NaCl-t tartalmazó pufferrel eluáljuk. Az antitest frakcióját izoláljuk.

4. Az összegyűjtött fluoreszcein-Fab oldat pufferét

8,0 pH-jú 2,5 mmol/1 Tris-HCl pufferre cseréljük, majd az eljárást erős anioncserélőn végzett kromatografálással folytatjuk.

A fenti eljárást használtuk a transzferrin összes variánsával reakcióképes monoklonális antitestekből kapott Fab-fragmentumok jelzésére. Anti-transzferrin antitesteket (IgG) kereskedelmi forgalomban kapható aszciteszből tisztítás útján kaptunk, az IgG molekulákat papainnel emésztettük, és az ennek során képződött szabad tiolcsoportokat szokásos eljárásokat alkalmazva jód-acetamiddal blokkoltuk. A kapott Fab fragmentumokat ioncserés kromatográfiás eljárással tisztítottuk, majd az előzőekben ismertetett eljárással jelzetté tettük.

13. példa

Antitest Fab-fragmentumok jelzése ⁿ⁵ljódizotóppal

1. Benzolban oldott 5 mCi ¹²⁵I Bolton-Hunter-reagenst nitrogéngázzal szárítunk.

2. 0,96 ml térfogatú, 8,5 pH-jú 0,1 mol/1 borátoldatban oldott 0,65 mg Fab-ot adunk a ¹²⁵I Bolton-Hunterreagenshez, és jégen rázás közben 30 percen keresztül inkubáljuk.

3. A reakció megállítására 0,5 ml térfogatú, 8,5 pHjú, 0,1 mol/1 borátoldatban lévő 50 mmol/1 glicint adunk a reakcióelegyhez. Az oldatot jégen további 10 perc időtartamig inkubáljuk.

4. A reakcióelegyet méretspecifikus oszlopon (Superose 6, PrepGrade, 1x30 cm, gyártó cég: Pharmacia) kromatografáljuk. A jelzett Fab-fragmentumot

7,4 pH-jú, 10 mmol/1 nátrium-foszfát és 0,1 mól NaCltartalmú pufferrel eluáljuk. Az antitest frakcióját izoláljuk.

5. Az izolált ¹²⁵I-Fab pufferét 8,0 pH-jú 2,5 mmol/1 Tris-HCl pufferre cseréljük ultracentrifugálás útján, amelynek molekulatömeg szerinti szelektivitása 10000, majd a kapott terméket 1,5 ml térfogatra töményítjük be.

6. Az eljárást erős ioncserélőn végzett kromatografálással folytatjuk.

A 12. példában leírt eljárással kapott anti-transzferrin Fab-fragmentumokat az előzőekben ismertetett eljárással tettük jelzetté.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás protein jellegű, frakcionáló rendszerben elválasztható analitvariánsok populációjában lévő variánsok alcsoportja koncentrációjának meghatározására, azzal jellemezve, hogy a variánsok populációját jelzett, protein jellegű, az analithoz specifikusan kötődő partnerek populációjával érintkeztetjük, a kapott, jelzett, kötődő partner/analit komplexet a frakcionáló rendszerben komplex alakú analitvariánsok alcsoportját tartalmazó, egy vagy több frakcióra választjuk szét, és az így kapott, egy vagy több frakcióban meghatározzuk a jelzett mennyiséget, ahol a specifikusan kötődő, jelzett partnereknek a reakció előtti frakcionáló rendszerben egységes névleges eloszlású vagy mobilitású populációját alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1990. 06. 21.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az analit specifikusan kötődő partnereként antitestiét vagy annak fragmentumát használjuk. (Elsőbbsége: 1990.06.21.)

HU 215 555 Β
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az analit monovalens specifikusan kötődő partnerét használjuk. (Elsőbbsége: 1991.01. 30.)
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy specifikusan kötődő partnerként egy antitest F(ab) fragmentumát használjuk. (Elsőbbsége: 1990. 06. 21).
5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy töltésen vagy izoelektromos ponton alapuló frakcionáló rendszert használunk. (Elsőbbsége: 1990. 06.21.)
6. Az 1., 2., 4. és 5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás transzferrin variánsainak meghatározására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő anyagokat használjuk. (Elsőbbsége: 1990.06.21.)
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy frakcionáló rendszerként elektroforetikus, ioncserés, kromatográfiás fokuszálási vagy izoelektromos fokuszálási eljárást használunk. (Elsőbbsége: 1990. 06.21.)
8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztási lépés előtt vagy azzal egyidejűleg vas(III)-ionokkal telített transzferrinvariánsok populációját alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1990. 06. 21.)
9. Az 1., 2. és 4-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy modifikálással és/vagy frakcionálással a frakcionáló rendszerben egységes névleges eloszlásúvá vagy mobilitásúvá tett specifikusan kötődő partnerpopulációt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1990.06.21.)
10. Analitikai vizsgálati készlet az 1., 2. és 4-9. igénypontok bármelyike szerinti eljáráshoz, azzal jellemezve, hogy jelzett, protein jellegű, az analithoz specifikusan kötődő partnerek populációja mellett a frakcionáláshoz szükséges reagenseket és/vagy anyagokat tartalmaz. (Elsőbbsége: 1990.06.21.)
11. A 10. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy a jelzett, protein jellegű, az analithoz specifikusan kötődő partnerek populációja mellett frakcionáló közeget és egy vagy több adalékot, így puffersó(ka)t vagy pufferoldato(ka)t, felületaktív anyago(ka)t és/vagy konzerválószer(eke)t tartalmaz. (Elsőbbsége: 1991.06. 20.)
12. A 11. igénypont szerinti készlet transzferrin variánsainak meghatározására, azzal jellemezve, hogy legalább egy vas(III)-sót vagy -oldatot is tartalmaz. (Elsőbbsége: 1991. 06. 20.)
13. A 10. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy az analit monovalens specifikusan kötődő partnerét tartalmazza. (Elsőbbsége: 1991. 01. 30.)
14. A 10. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy antitranszferrin antitestek jelzett F(ab) vagy F(v) fragmentumait tartalmazza. (Elsőbbsége: 1991.