CZ283072B6

CZ283072B6 - Způsob stanovení koncentrace různých látek

Info

Publication number: CZ283072B6
Application number: CS923743A
Authority: CZ
Inventors: Erling Sundrehagen
Original assignee: Axis Biochemicals Asa
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1991-06-20
Publication date: 1997-12-17
Also published as: HU215555B; HUT65621A; FI925781A; NO924912L; DE69108554D1; JP2517187B2; US5352616A; HU9204073D0; SK374392A3; FI925781A0; NO924912D0; NO303852B1; ES2069902T3; CA2085579A1; AU8322891A; WO1991019983A1; DK0535162T3; DE69108554T2; EP0535162B1; EP0535162A1

Abstract

Způsob stanovení koncentrace různých látek, zejména variant ve skupině bílkovinných látek, oddělitelných od sebe frakcionačním systémem, spočívá v tom, že se skupina variant uvede do styku se skupinou značených bílkovinných specifických vazných látek pro tyto varianty za vzniku komplexů varianty a značené vazné látky a tyto komplexy se pak dělí ve frakcionačním systému na jednu nebo větší počet frakcí s obsahem komplexů, načež se stanoví množství značené vazné látky v jedné nebo ve větším počtu získaných frakcí, přičemž skupina specifických vazných látek má před reakcí v podstatě rovnoměrnou distribuci nebo mobilitu v použitém frakcionačním systému. Postup je zvláště vhodný pro analýzu variant transferrinu.ŕ

Description

Způsob stanovení koncentrace variant ve skupině bílkovinných látek, prostředek a analytický zkušební balíček k provádění způsobu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu stanovení koncentrace variant bílkovinných látek při použití různých reakčních činidel. Vynález se rovněž týká reakčních činidel a zkušebního balíčku pro toto použití.

Dosavadní stav techniky

Biologické molekuly, například enzymy, antigeny a jiné biologicky důležité bílkoviny, se často vyskytují ve formě skupin různých variant těchto látek, přičemž tyto varianty spojuje biologická funkce nebo vlastnost, například antigenní schopnost nebo enzymatická účinnost, přesto se však poněkud liší svou strukturou. Tyto variace struktury mohou být způsobeny rozdílem v primární, sekundární nebo terciární struktuře řetězce aminokyselin v bílkovinách nebo v polypeptidech, nebo může jít o rozdíly v uhlohydrátových skupinách lipidových částí molekuly. Přesto, že je společná vlastnost nebo funkce v dané skupině sloučenin zachována, určité rozdíly ve struktuře mohou měnit další vlastnosti sloučenin z dané skupiny, jako jsou velikost molekuly, náboj nebo izoelektrický bod pí, což opět mění chování těchto látek při různých frakcionačních a dělicích postupech, což je také možno využít pro izolaci jedné nebo většího počtu těchto látek ze směsi.

Enzymy se často vyskytují ve formě směsi různých variant, například izoenzymů, o řadě dalších biologických bílkovin je nyní rovněž známo, že existují ve dvou nebo větším počtu variant, které se často liší například mírou glykosylace bílkoviny nebo složením uhlohydrátové části. Relativní koncentrace takových variant v dané tkáni nebo tělesné tekutině je zpravidla stálá, může však být narušena u některých onemocnění nebo patologických stavů nebo v důsledku jiných poruch v těle. Je například známo, že se poměr glykosylovaného hemoglobulinu k neglykosylovanému hemoglobulinu zvyšuje v séru nemocných s cukrovkou. Podobně některé analyticky důležité bílkoviny, například myoglobiny, se mohou svou strukturou poněkud lišit v různých orgánech a mohou být uvolněny do krevního proudu při poškození buněk v důsledku onemocnění nebo poranění.

Měřením množství různých takových variant v krvi nebo jiné tělesné tekutině je tedy často možno stanovit diagnózu nebo odhadnout stav onemocnění nebo míru poškození buněk.

Zvláštní význam má stanovení koncentrace různých variant bílkoviny transferrinu v krevním séru. Transferrin se obvykle vyskytuje v sialylované formě, to znamená, že nese tři nebo větší počet sialylových zbytků. Avšak u chronických alkoholiků se zvyšuje relativní množství desialylovaného transferrinu s menším počtem, tj. dvěma nebo jedním uvedeným zbytkem ve srovnání se zdravými osobami, a to z původního množství 1 až 3 % na 6 až 25 % celkového obsahu transferrinu v séru nemocných. Desialylovaný transferrin, který je často uváděn také jako transferrin, chudý na uhlohydráty (CDT), je nyní považován za klinicky vhodné označení metabolismu při chronickém alkoholismu. Avšak současné metody stanovení různých variant této látky jsou náročné na čas a vyžadují velmi moderní biochemické zařízení. To znamená, že vzhledem ktomu, že není k dispozici jednoduchá a pohodlná zkouška, dovolující stanovit jednotlivé varianty transferrinu, je chronický alkoholismus stále ještě diagnostikován pouze na bázi klinické historie, informací, získaných od nemocných, a na řadě laboratorních zkoušek s omezenou citlivostí a specifičností. Hladina alkoholu v krvi je pro stanovení vhodná pouze v případě, že se krev odebírá v průběhu 24 hodin po požití alkoholu. Všechny klinické testy, které jsou v současné době k dispozici, mají příliš nízkou citlivost a specifičnost pro identifikaci všech chronických alkoholiků.

- 1 CZ 283072 B6

Mikroheterogenita transferrinu a jeho korelace s výskytem alkoholismu byla poprvé zjištěna v roce 1980, jak je popsáno v Stibler H., Sydow O, Borg S., Quantitative estimation of abnormal microheterogenity of sérum transferrin in alkoholics, Pharmac. Biochem. Behav, 1980, dodatek 5 13, 1, 47 - 51. Klinická důležitost tohoto jevu byla dále zkoumána a byly sledovány možnosti využít izoelektrického bodu a chromatografických metod pro kvantitativní oddělení různých variant transferrinu, jak bylo popsáno v publikacích Vestergerg U., Petren S. a Schmidt E.: Increased concentrations of a transferrin variant after alcohol abuse, Clinical Chemica Acta, 141 33 - 39, 1984. Storey E. L., Mack U., Powell L. W. a Halliday J. W., Use of chromatofocusing to ío detect atransferrin variant in sérum of alcoholic subjectets. Clin. Chem. 31: 154 - 1545, 1985.

Joustra a Blanche podali v roce 1984 ve Švédsku patentovou přihlášku, týkající se způsobu stanovení a Borg, Stibler a Joustra uveřejnili v roce 1984 postup, při němž se užívá aniontoměničové chromatografie na malém sloupci pro kvantitativní filtraci transferrinu bez uhlohydrátových skupin v séru v závislosti na spotřebě alkoholu, v publikaci Stibler H., Borg S. 15 a Joustra M., Alcoholism 10: 535 - 544, 1986, Joustra M. a Blanche C., švédská patentová přihláška 8400587-5. Tyto postupy jsou založeny na izokratickém dělení variant transferrinu v séru pomocí iontoměničové chromatografie s následným stanovením pomocí radioimunologického měření s využitím protilátek, čímž je možno stanovit v různých frakcích obsah transferrinu Tato technika odděluje všechny složky transferrinu s obsahem nejvýše 2 molekul kyseliny 20 sialové, izoelektrický bod je tedy na pH 5,65. Při použití tohoto postupu bylo možno jasně odlišit alkoholiků od 80 zdravých běžných konzumentů a 33 úplných abstinentů vzhledem k tomu, že izoelektrický bod pl byl u alkoholiků vyšší než pH 5,65.

Hlavní obtíží při provádění těchto postupů je jejich veliká pracnost a spotřeba velkého množství 25 času. Při dvoustupňovém postupu je nutno chromatografícky oddělit varianty transferrinu ve vzorku séra a pak varianty imunologicky kvantitativně stanovit.

Bylo by proto zapotřebí navrhnout jednoduchou a snadnou zkoušku pro různé varianty stanovené látky ve směsi, zvláště pro stanovení různých variant transferrinu.

Varianty uvedených látek jsou obvykle bílkovinné povahy a často je možno snadno identifikovat další specifickou bílkovinu, s níž tyto látky vytvářejí komplex. Většinou mají varianty antigenní účinek a vaznou látkou je tedy protilátka, i když často také se mohou bílkoviny vázat specificky na jiné bílkoviny nebo peptidy tak, že jde prostě o vazné partnery. Například bílkovina hapto35 globin se specificky váže na hemoglobin. Tuto specifickou vaznou látku je pak možno značit, například enzymem nebo určitým atomem nebo skupinou a pak užít při zkoušce k označení varianty, která má být stanovena.

Vynález je založen na myšlence, že varianty je možno označit před jejich izolací při využití 40 značených specifických vazných látek, které po oddělení umožní kvantitativní stanovení relativního množství varianty. Bylo zjištěno, že by se varianty měly uvést do reakce se skupinou značených vazných látek, které reagují s různými variantami analyzované látky, avšak mají v podstatě rovnoměrnou distribuci nebo pohyblivost ve zvoleném frakcionačním nebo dělicím systému.

Takový postup je podstatně jednodušší než známé systémy, v nichž po oddělení následovala běžná imunologická zkouška s použitím již oddělených frakcí.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tedy tvoří způsob stanovení koncentrace variant ve skupině bílkovinných látek, oddělených od sebe frakcionačním systémem. Postup se provádí tak, že se skupina variant uvede do styku se skupinou značených bílkovinných specifických vazných látek pro tyto varianty za vzniku komplexu varianty a značené vazné látky, a tyto komplexy se pak dělí ve frakcionačním systému na jednu nebo větší počet frakcí s obsahem komplexů, načež se stanoví množství značené vazné látky v jedné nebo ve větším počtu získaných frakcí, přičemž skupina značených bílkovinných specifických vazných látek má před reakcí v podstatě rovnoměrnou distribuci nebo mobilitu v použitém frakcionačním systému.

Pod pojmem bílkovinný se rozumí všechny molekuly, které mají v podstatě bílkovinnou povahu, to znamená peptidy i polypeptidy, tyto látky mohou obsahovat skupiny nebílkovinné povahy, například lipidové nebo uhlohydrátové skupiny.

Vzhledem k tomu, že specifická vazba látek v komplexu s hledanou variantou má v podstatě rovnoměrnou distribuci nebo pohyblivost ve zvoleném frakcionačním systému, je výsledný rozdíl mezi pohyblivostí nebo distribucí vzniklého komplexu způsoben rozdílem ve variantě v tomto komplexu. To znamená, že je možno od sebe oddělit jednu nebo větší počet frakcí s obsahem různých komplexů a pak stanovit množství značené látky v každé frakci.

Podstatu vynálezu tvoří také reakční činidlo k provádění způsobu podle vynálezu, které obsahuje značené bílkovinné vazné látky, například protilátky nebo jejich imunoreaktivní fragmenty, které mají v podstatě rovnoměrnou pohyblivost nebo distribuci v jednom nebo ve větším počtu frakcionačních systémů.

Vynález se rovněž týká analytického zkušebního balíčku, obsahujícího reakční činidla a/nebo jiné materiály k provedení frakcionace.

Varianty zkoumané látky se obvykle liší v daném pufru svým nábojem a je tedy obvykle možno je snadno oddělit například chromatografií na iontoměniči nebo elektroforézou. Další možností je využít odlišné izoelektrické body pí k oddělení uvedených látek, například s použitím sloupce Mono-P a systému Polybuffer (Pharmacia, Švédsko). Využití izoelektrického bodu komplexu je možno uskutečnit ve dvourozměrných vrstvách gelu, neboje možno komplexy od sebe oddělit jednoduchou elektroforézou na agarosovém gelu. Při provádění způsobu podle vynálezu je možno užít celou řadu iontoměničů a pevných fází. Ionizovatelnými chemickými zbytky v těchto prostředích mohou být například zbytky aminu nebo sulfonované nebo karboxylované zbytky, nosičem může být gel, membrána, filtr, částicový materiál, kuličky nebo jakákoliv jiná vhodná pevná fáze. Přestože takové frakcionační systémy mají jednoduché použití, poskytují dobré výsledky a jsou tedy při provádění způsobu podle vynálezu výhodné, je možno užít i jiné frakcionační systémy, využívající některou vlastnost variant, v nichž je zvolená vazná látka stálá.

Pryskyřice nebo částicový materiál je možno užít ve formě suspenzí nebo ve sloupcích, které je možno promývat gradientem soli nebo pH nebo izokratickým způsobem. Z praktického hlediska je výhodné použití suspenze po vsázkách a izokratické eluce. Zvláště výhodné jsou magnetizovatelné částice. Iontoměničová pevná fáze může být také tvořena pevnou trojrozměrnou strukturou nebo iontoměničovým filtrem. V případě, že se použije filtru, je možno filtraci provádět paralelně vzhledem k povrchu filtru, to znamená radiálně nebo podél proužku filtru.

Všechna nebo alespoň některá z různých reakčních činidel a složek k provádění postupu je možno dodat ve formě zkušebního balíčku spolu se značenými vaznými látkami.

Tato reakční činidla a materiály obvykle zahrnují roztoky pufiů, smáčedla, například Tween^Ra podobně, konzervační látky, například azid sodíku, různé gely, pryskyřice nebo jiná prostředí, jichž je zapotřebí pro frakcionaci popřípadě ve formě, již připravené pro použití, například ve formě naplněných sloupců a podobně.

Jak již bylo uvedeno, po tvorbě komplexu varianty s vaznou látkou se komplex izoluje a stanoví se množství značené látky.

-3 CZ 283072 B6

Značení může být tvořeno jakýmkoliv běžným známým systémem, využívaným v oboru k označení. Může jít o fluorescenční látku, barevnou, radioaktivní nebo enzymatickou látku, která se pak stanoví běžným způsobem. Radioaktivní označení je obvykle tvořeno běžně užívanými radioisotopy, jako je I¹²⁵, a byla také popsána celá řada fluorescenčních a barevných látek pro toto použití. Z fluorescenčních látek je možno užít například dimethylaminonaftalen, fluorescein, dichlortirazinylaminofluorescein nebo fluorescenční kovové sloučeniny. Z barevných látek jde například o 4-dimethylaminobenzen, 4-N,N-dimethylaminoazobenzen, trinitrobenzen, benzofuraziny, tetramethylrhodamin, texaskou červeň, morfolinorhodamin a jeho deriváty, azobenzenv, antrachinony, oxaziny, thiaziny, triaziny, porfyriny, phycobiliny, deriváty chlorofylu, indigová barviva a jejich analogy a deriváty.

Jak již bylo svrchu uvedeno, je možno pro variantu stanovované látky užít jakoukoliv specifickou bílkovinnou vaznou látku, která má rovnoměrnou pohyblivost nebo distribuci ve zvoleném fřakcionačním systému. Pro antigeny a hapteny jsou obvykle výhodnými vaznými látkami protilátky, je však možno užít podle situace i jiné systémy, jako jsou haptoglobinhemoglobin nebo hormon-receptor.

Užít je možno také imunoreaktivní fragmenty protilátek, například F(ab) nebo F(ab')₂, pokud zůstává v daném fřakcionačním systému chování fragmentu stálé. Takové fragmenty mohou být chráněny na atomu síry například S-karboxymethylovou skupinou.

Fragmenty F(v), to znamená hypervariabilní oblasti fragmentů F(ab), je možno rovněž použít a tyto fragmenty mohou mít i syntetický původ a je možno je získat z rekombinantní DNA nebo chemickou cestou.

Bylo zjištěno, že v případě, že molámí množství značeného fragmentu protilátky F(ab)₂ je přibližně stejné nebo je v přebytku vzhledem ke zkoumané variantě, dochází ve značné míře ke zkřížené vazbě vzhledem kdivalentní reaktivitě značeného reakčního činidla. Tím dojde k nízkému odhadu počtu stanovených molekul. V řadě případů je tedy výhodnější užít monovalentní značené vazné látky, zvláště fragmenty F(ab) nebo F(v) příslušných protilátek.

Je nutno uvést, že tyto monovalentní fragmenty jsou méně variabilní, zvláště v případě, že byly získány synteticky, a v případě, že byly pečlivě rovnoměrně značeny, není nutno použít fřakcionačního stupně k dosažení rovnoměrné pohyblivosti nebo distribuce ve zvoleném fřakcionačním systému.

Pro jednoduchost se pod pojmem protilátky v průběhu přihlášky rozumí také fragmenty protilátek, není-li výslovně uvedeno jinak.

Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný pro analýzu množství různých variant transferrinu. Ve zvláštním provedení se tedy vynález týká způsobu stanovení variant transferrinu, často nazývaných izotransferiny, v krevní plazmě, séru, krvi nebo hemolyzátu. Jak již bylo uvedeno, liší se varianty transferrinu od sebe převážně různým počtem zbytků kyseliny sialové v molekule transferrinu. Nový postup podle vynálezu s výhodou spočívá v tom, že se vzorek uvede do styku se skupinou značených protilátek, reaktivních vzhledem k lidskému transferrinu s v podstatě rovnoměrnou pohyblivostí nebo distribucí ve fřakcionačním systému ze skupiny elektroforéza, iontoměničová chromatografie, chromatografie nebo stanovení pomocí izoelektrického bodu. S výhodou se vazba protilátky uskuteční v roztoku pufru s obsahem železitého iontu, toto prostředí je vhodné pro tvorbu komplexu antigenu a protilátky. Reakce tohoto typu dobře probíhá v blízkosti neutrálního pH, s výhodou v rozmezí 5 až 9 při koncentraci soli, která nebrání tvorbě komplexu antigenu a protilátky.

-4CZ 283072 B6

Značenými protilátkami jsou s výhodou monoklonální protilátky, je však možno použít i polyklonální protilátky vzhledem ktomu, že popsané čisticí postupy zajišťují rovnoměrné využití i těchto protilátek.

Značené fragmenty F(ab) nebo F(v) protilátek proti transferrinu jsou nové látky, které je možno zvláště využít při analýze variant transferrinu. I když jsou poměrně neuniformní, je možno při jejich použití získat lepší výsledky než při použití úplných protilátek. Frakcionované značené fragmenty F(ab) a F(v) s rovnoměrnou pohyblivostí v jednom nebo větším počtu frakcionačních systémů jsou zvláště výhodné.

Transferriny ve vzorku je možno nasytit železitými ionty před vazbou na protilátky nebo současně s ní. Nasycení transferrinu před vazbou nebo současně s ní za oddělení komplexu antigenu a protilátky je obvykle velmi vhodné, protože jinak by rozdíly v obsahu železitých iontů v jednotlivých variantách porušily distribuci v uvedených dělicích systémech tak, že už by nedocházelo k dělení pouze na základě rozdílu v obsahu kyseliny sialové.

Výhodné provedení způsobu podle vynálezu pro analýzu variant transferrinu tedy spočívá v tom, že se směs komplexů varianty a protilátky podrobí chromatografií, chromatografií na iontoměniči, elektroforéze nebo dělení na základě izoelektrického bodu. Vzhledem k tomu, že značené protilátky mají v těchto systémech v podstatě rovnoměrnou pohyblivost nebo distribuci, je rozdíl pohyblivosti nebo distribuce vytvořeného komplexu způsoben v podstatě rozdílem v pohyblivosti nebo distribuci varianty transferrinu a často jí také odpovídají. Monoklonální protilátky, reagující s lidským transferrinem, s v podstatě rovnoměrnou pohyblivostí nebo distribucí v dělicích systémech je možno získat běžným způsobem zhybridomů a je možno je v případě potřeby modifikovat chemickým způsobem. Tyto protilátky je obvykle nutno čistit, k čištění se s výhodou užijí tytéž systémy, jakých se pak užije ke stanovení množství jednotlivých variant.

Zkušební balíček pro použití při analýze transferrinu s výhodou obsahuje značené protilátky proti transferrinu, zvláště výhodně jde o značené fragmenty Fab těchto protilátek, současně zkušební balíček obsahuje alespoň jednu železitou sůl nebo její roztok.

V některých provedeních způsobu podle vynálezu je výhodné použít značené protilátky nebo jiné specifické bílkovinné vazné protilátky se specifickým rozmezím izoelektrických bodů nebo se zvláštním typem distribuce nebo pohyblivosti v dělicím systému. K získání takových látek je možno bílkoviny modifikovat před značením nebo po něm. Taková modifikace obvykle změní počet skupin, nesoucích náboj, například kyselých nebo bazických skupin v molekule. Takové modifikace je možno dosáhnout použitím reakčních činidel, reagujících s postranními řetězci aminokyselin v bílkovinách, tak jak bylo popsáno například v Glazer, Delange a Sigman: Chemical modification of proteins, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, New York, Oxford, 1975 a v další příslušné literatuře. Jako příklad je možno uvést, že zbytky aminu je možno modifikovat karbamylací, acetylací, benzylací nebo sukcinylací a zbytky karboxylových kyselin je možno modifikovat esterifikací nebo vazbou na nukleofily při použití karbodiimidů nebo dalších vazných činidel. Podobně je možno modifikovat také uhlohydrátové skupiny v protilátkách nebo jiných vazných látkách bílkovinné povahy.

Vhodným postupem pro modifikace, jichž je často zapotřebí při výrobě značených glykoproteinových vazných látek, je oxidace uhlohydrátových skupin glykoproteinů působením jodistanu s následnou reakcí vzniklého aldehydu s reakčními činidly, zavádějícími kyselé nebo bázické skupiny. Vhodným postupem pro bílkoviny s disulfidovými můstky je částečná redukce disulfidových můstků cystinu mezi polypeptidovými řetězci aminokyselin v bílkovině. Zejména protilátky obvykle obsahují několik disulfidových vazeb, z nichž je část možno převést na volné thioly bez destrukce afinity protilátky pro příslušný antigen. Tyto vazby a tím i výsledné thioly jsou uloženy v místech protilátky, vzdálených od vazného místa protilátky pro antigen. Příkladem vhodných redukčních činidel mohou být 2-thioethanol a dithiothreitol. Po odstranění

-5CZ 283072 B6 redukčního činidla se pro volný thiol užijí reakční činidla pro zavedení kyselých nebo bázických skupin, jde obvykle o bifunkční vazné látky, reagující s thiolovou skupinou a nukleofilní skupinou, jako jsou sulfosukcinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylát, sulfosukcinimidyl-(4-jodacetyl)aminobenzoát nebo jiná činidla s obsahem sukcinimidylmaleimidu, postup se může provádět v jednom nebo ve dvou stupních. Je také možno reakční činidlo pro zavedení kyselých nebo bázických skupin navázat pomocí substituovaných pyridylsulfídů nebo reakčních činidel s obsahem thiolových skupin za opětného vzniku disulfidové vazby, avšak s obsahem chemické skupiny kyselé nebo bázické povahy.

Ve zvláštním provedení vynálezu může být nukleofilní reakční činidlo tvořeno polymerem kyseliny, například polypeptidem s jedním nebo větším počtem kyselých postranních řetězců v aminokyselinách.

Výhodou modifikace uhlohydrátu a/nebo modifikace redukcí cystinu v oblasti, vzdálené od místa pro vazbu antigenu, je malá interference s tímto místem ve vzniklé protilátce. Kyselé polypeptidy je však možno vázat také na zbytky lysinu nebo na jiné zbytky polypeptidové struktury protilátek.

V případě analýzy variant transferinu jsou v popředí zájmu ty varianty, které nesou nejvýše dva zbytky kyseliny sialové a mají izoelektrický bod pí vyšší než varianty, obsahující alespoň tři zbytky kyseliny sialové. Při provádění způsobu podle vynálezu je například možno využít iontoměničovou pryskyřici při pH a při koncentraci pufru, při níž se komplex antigenu a protilátky varianty transferrinu s alespoň třemi zbytky kyseliny sialové váže na pevnou fázi aniontoměniče, kdežto komplex varianty s nejvýše dvěma zbytky kyseliny sialové se neváže.

V tomto případě jsou výhodné značené protilátky, popřípadě modifikované, které se váží na pevnou fázi aniontoměniče, takže v roztoku zůstává pouze značená protilátka, která vytvořila komplex s variantou transferrinu s nejvýše dvěma zbytky kyseliny sialové. Postup je schematicky znázorněn na obr. 1. Hodnota pH a složení pufru se volí v závislosti na izoelektrickém bodu značené monoklonální protilátky a vytvořeného komplexu. Po oddělení, například odstředěním nebo filtrací v případě, že pevnou fází je suspenze, nebo magneticky v případě, že pevná fáze iontoměniče je magnetizovatelná, nebo elucí v případě sloupce se měří množství označení, zbývající v roztoku čímž se stanoví koncentrace komplexu antigenu a protilátky, která odpovídá koncentraci varianty transferrinu s nejvýše dvěma zbytky kyseliny sialové.

Způsob podle vynálezu je možno provádět při použití značených vazných látek v přebytku vzhledem k celkovému množství všech přítomných variant, nebo při použití přebytku variant vzhledem k vazným látkám. V případě, že se užijí v přebytku specifické vazné látky, zjistí se celková koncentrace různých variant. V případě, že se užijí v přebytku varianty, získají se signály, týkající se relativního množství různých variant v celkovém množství všech variant.

V případě, že má být užita v přebytku specifická vazná látka, jde s výhodou o monovalentní vaznou látku. Jak již bylo svrchu uvedeno, bivalentní vazná látka, například protilátka, má tendenci k vazbě na dvě různé molekuly, zvláště v případě, že se dávkuje v přibližně ekvimolámím množství. Z tohoto důvodu jsou pro toto použití výhodné fragmenty F(ab) nebo F(v).

V případě, že se v systému vazné látky, kterou je protilátka nebo její fragment, a antigenu použije antigen v přebytku, je možno užít značenou protilátku, popřípadě modifikovanou a čištěnou afinitní chromatografií při použití imobilizovaného antigenu. Přibližně 100 % protilátek nebo fragmentů je pak imunoreaktivních, čímž je možno snížit frakci volných protilátek, netvořících komplex, nebo jejich fragmentů na velmi nízké množství. Tímto způsobem je možno snížit nebo zcela vyloučit potenciální interference při tomto postupu.

Výhodou způsobu podle vynálezu je kombinace imunologického kvantitativního stanovení a frakcionace v jediném stupni. Této výhody je dosaženo oddělením komplexů, vytvořených

-6CZ 283072 B6 mezi značenými vaznými látkami a různými variantami stanovených látek s následným kvantitativním stanovením imunologickým způsobem. Pomocí způsobu podle vynálezu je tedy možno stanovit množství transferrinů a variant jiných látek daleko snadněji než dříve, zvláštním příkladem je stanovení variant transferrinů s nízkým obsahem kyseliny sialové v krevním séru nebo v plazmě u osob s vysokou spotřebou alkoholu.

Vynález bude dále popsán v souvislosti s přiloženými výkresy:

Na obr. 1 je schematicky znázorněn způsob dělení variant transferrinů s různým obsahem kyseliny sialové při použití iontoměniče.

Na obr. 2 je znázorněno stanovení množství transferrinů pomocí izoelektrického bodu na gelu.

Na obr. 3 je graficky znázorněno dělení FITC-derívátů proti transferrinů chromatografii na sloupci silného aniontoměniče, jako pufr se užije 20 mM fosforečnan sodný o pH 6,5. Plná čára uvádí absorpci v ultrafialovém světle při 280 nm, přerušovaná čára gradient M chloridu sodného.

Na obr. 4 je graficky znázorněno další dělení rechromatografií tří sousedních frakci derivátů FITC proti transferrinů z obr. 2 na sloupci silného aniontoměniče, jako pufr byl užit 20 mM fosforečnan sodný o pH 6,5.

Na obr. 5 je graficky znázorněna analýza pomocí fluorescenčních signálů frakcí vzorku séra po přidání FITC-značených monoklonálních protilátek proti transferrinů po chromatografii na iontoměniči, čtverečky je znázorněno sérum alkoholika, křížky sérum normální osoby.

Na obr. 6 jsou graficky znázorněny fluorescenční signály z frakcí, získaných chromatografii komplexů monoklonálních protilátek proti transferrinů na iontoměniči. Bylo užito disialotransferrinu (čtverečky) a tetrasialotransferrinu (křížky).

Na obr. 7 jsou graficky znázorněny výsledky preparativní chromatografie značených nečištěných monoklonálních protilátek proti transferrinů na aniontoměniči.

Na obr. 8 je graficky znázorněna pohyblivost jedné frakce, získané chromatografii z obr. 7 v aniontoměničovém systému.

Na obr. 9 je graficky znázorněna fluorescence frakcí komplexů FITC-Fab-transferrinu ze vzorků séra těžkého alkoholika (trojúhelníčky) a normální osoby (kroužky) při použití sloupce aniontoměniče (mono Q).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Z běžně dodávané tekutiny, produkované u myší hybridomem, vytvářející IgG proti transferrinů, byly čištěny monoklonální protilátky chromatografii na iontoměniči a chromatograflí na gelu při použití fosfátového pufru. Imunologická afinita protilátek byla stanovena mikrotitračním systémem ELISA při použití imobilizovaného lidského transferrinů a polyklonální protilátkou IgG proti myší tkáni, konjugovanou s peroxidázou z roztoku. Čištěné protilátky proti transferrinů byly dialyzovány proti 0,1 M pufru s kyselinou octovou o pH 5,6 a oxidovány jodistanovými ionty s konečnou koncentrací 50 mM. Po odstranění jodistanových iontů chromatografii na gelu byly protilátky uvedeny do reakce s polypeptidem kyselé povahy vzorce

-7CZ 283072 B6

N-ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu-glu-COOH v 50 násobném molámím přebytku vzhledem k protilátkám s následnou stabilizací vazby působením iontů kyanoborohydridu v roztoku v konečné koncentraci 15 mM. Výsledné modifikované protilátky byly dialyzovány proti 0,1 M pufru s uhličitanem sodným o pH 9,5 a pak uvedeny do reakce s 2-thioethanolem v konečné koncentraci 10 mM na dobu 30 minut při teplotě místnosti s následným odstraněním 2-thioethanolu chromatografií na gelu ve fosfátovém pufru při pH 7,4. Polypeptid vzorce

N-ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu-glu-COOH byl uveden do reakce s výsledným volným thiolem bílkoviny při použití sulfosukcinimidyl-4-(Nmaleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylátu při molámím poměru protilátky, vazného činidla apeptidu 1 : 33 : 40. Po následující dialýze proti uhličitanovému pufru se modifikované protilátky uvedou do reakce s fluoresceinisothiokyanátem a pak se čistí chromatografií na gelu.

V každém stupni uvedené modifikace se stanoví afinita antigenu, bylo možno pozorovat jen velmi malé snížení afinity. Na obr. 2 jsou znázorněny výsledky dělení podle izoelektrického bodu elektroforézou na gelu (Phast systém, Pharmacia), kde je zřejmé snížení pí. Hlavní frakce modifikovaných a značených protilátek má pí, které je obdobné nebo nižší jako pí izotransferrinu s nejvýše dvěma zbytky kyseliny sialové. Na obr. 2 má označení a) až e) následující význam:

a) lidský transferrin,

b) nemodifikovaná monoklonální protilátka IgC proti transferrinu,

c) totéž jako b), avšak řetězec ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu-glu- byl vázán na uhlohydrátovou skupinu,

d) totéž jako c), avšak svrchu uvedený řetězec byl vázán v místě, vzdáleném od místa vazby protilátky na transferrin,

e) totéž jako d), avšak na bílkovinu je vázán fluoresceinisothiokyanát.

K provádění způsobu podle vynálezu je nutná v podstatě rovnoměrná distribuce nebo pohyblivost protilátek v příslušném dělicím systému. V případě, že tato podmínka není zachována, znemožní heterogenita komplexu protilátky oddělení komplexu protilátky s antigenem a jeho kvantitativní stanovení.

Na obr. 3 je znázorněna heterogenita modifikovaných monoklonálních protilátek při vyhodnocení preparativní aniontoměničovou chromatografií. Přerušované vertikální čáry uvádějí odebrání 20 frakcí k získání frakcí s úzkým rozmezím pH.

Na obr. 4 jsou znázorněny výsledky analytické chromatografie podílů ze tří různých sousedních frakcí, získaných při uvedené preparativní chromatografii. Je zřejmé, že v případě každé frakce bylo dosaženo téměř rovnoměrné pohyblivosti. Ještě homogennější frakce je možno získat při použití méně strmého gradientu při eluci, opakovanou chromatografií nebo jinou chromatografíckou technikou. Mimoto je možno užít i v kombinaci se svrchu uvedeným postupem preparativní dělení na základě izoelektrického bodu.

V případě, že se zkoumaný vzorek smísí se značenými monoklonálními protilátkami proti lidskému transferrinu s rovnoměrnou mobilitou nebo distribucí, vznikají komplexy antigenu a protilátky s různou mobilitou nebo distribucí, přičemž tyto vlastnosti komplexu odrážejí rozdíly mezi variantami transferrinu. Různé komplexy je pak možno od sebe oddělit chromato

-8CZ 283072 B6 grafu' na iontoměniči, elektroforézou, využitím izoelektrického bodu nebo jinými technickými postupy, při nichž se využívá rozdílu v elektrickém náboji vytvořených komplexů.

Příklad 2

Analýza vzorků sér alkoholiků a nealkoholiků

Pevná fáze:

Pevnou fází je sloupec s objemem 1 ml, naplněný polystyrénovými částicemi s kvartemím aminem a substituovanými zbytky na povrchu částic (Mono-Q sloupec, Pharmacia, Uppsala, Švédsko).

Eluční činidlo:

mM bis-tris-pufru se 100 mM chloridu sodného, pufr má pH 6,50.

Provedení zkoušky:

Vzorek séra s objemem 10 mikrolitrů se smísí s roztokem citrátu železitého ve dvacetinásobném molámím přebytku vzhledem k obsahu transferrinu ve vzorku, pak se přidá monoklonální protilátka myši proti lidskému transferrinu, která je reaktivní se všemi variantami lidského transferrinu a která byla modifikována a značena fluoresceinem a pak čištěna, takže má velmi rovnoměrnou mobilitu v použitém systému iontoměniče a v pufru, použitém pro eluci, molámí koncentrace transferrinu v séru a protilátky je 1 : 1. Po krátké inkubaci 5 až 10 minut při teplotě místnosti se sloupec po nanesení komplexu promyje a pak se dále vymývá elučním pufrem Odebírají se frakce s objemem 1,0 ml a měří se fluorescence frakcí (excitace 485 nm, emise 520 nm, měřeno spektrofotometrem Shimadzu RF-540).

Na obr. 5 je znázorněna typická křivka, získaná při použití sér alkoholiků a nealkoholiků. Pro srovnání je uvedena odpovídající křivka, získaná při použití roztoku vzorků čištěného disialoa tetrasialotransferrinu místo vzorku séra. Tato křivka je znázorněna na obr. 6.

Příklad 3

Analýza frakce protilátek, užité v příkladu 2

Na obr. 7 je znázorněn chromatogram s výsledky preparativní chromatografie značené nečištěné monoklonální protilátky z příkladu 2 na aniontoměniči. Při této chromatografii byly odebírány frakce s objemem 0,5 ml a na obr. 8 je znázorněn chromatogram, který prokazuje, že každá frakce má velmi úzké rozmezí mobility v použitém systému aniontoměniče při chromatografii, nebo je v tomto smyslu zcela homogenní. Chromatografie byla prováděna na sloupci aniontoměniče mono Q HR5 (Pharmacia) při použití systému Pharmacia Fast Liquid Chromatography. Uvedený iontoměnič je silný aniontoměnič s kvartemími amoniovými skupinami, uložený ve sloupci s výškou 50 mm a vnitřním průměrem 5 mm. Sloupec byl uveden do rovnovážného stavu ve 20 mM tris pufru o pH 8,0 (pufr A) při průtoku 1 ml/min. Vzorek byl desetkrát zředěn pufrem A před vstříknutím do sloupce v objemu 20 mikrolitrů. Pak byl vzorek vymýván zvyšováním obsahu chloridu v pufru, zvyšováním obsahu pufru B (20 mM tris, 0,7 M NaCl, pH 8) od 0 do 0,35 M chloridových iontů v průběhu průtoku 20 ml elučního pufru. Průchod vzorku byl zaznamenáván měřením absorbance elučního roztoku při 280 nm.

-9CZ 283072 B6

Příklad 4

Příprava fluoresceinem značených fragmentů Fab monoklonální protilátky s v podstatě rovnoměrnou mobilitou v matrici aniontoměniče

Z běžně dodávaného myšího ascitu byly chorobné nahromadění tekutiny v břišní dutině při použití standardní technologie s použitím hybridomu, produkujícího IgG proti transferrinu, čištěny monoklonální protilátky chromatografií na iontoměniči s následnou chromatografií na gelu k rozdělení podle velikosti molekul ve fosfátovém pufru. Pak byl pufr změněn na uhličitanový pufr a pak byly protilátky IgG štěpeny působením papainu v kombinaci s dithiothreitolem za vzniku fragmentů Pab protilátek. Po této enzymatické modifikaci byly volné thiolové skupiny včetně volných thiolových skupin protilátky blokovány jodacetamidem, který rovněž přeruší účinky enzymu. Vzniklé fragmenty Fab se pak čistí kombinací dialýzy a chromatografie na aniontoměniči.

Čištěné fragmenty Fab protilátky se pak dialyzují proti uhličitanovému pufru o pH 9,5 a pak se modifikují fluorescein isothiokyanátem. Fluorescein se váže na aminoskupiny protilátky a fragment Fab, značený fluoresceinem, se čistí chromatografií, která dělí molekuly podle velikosti, načež se izoluje frakce značeného fragmentu Fab chromatografií na sloupci aniontoměniče. Tato frakce má vysoký stupeň homogenity, pokud jde o izoelektrický bod, a má tedy také v podstatě rovnoměrnou mobilitu v matrici aniontoměniče.

Imunologická afinita značeného fragmentu Fab se zkouší mikrotitračním systémem ELISA při použití imobilizovaného lidského transferrinu a polyklonální protilátky IgG proti myší tkáni, vázané na peroxidázu.

Příklad 5

Příprava AMCA-značených fragmentů Fab monoklonální protilátky s v podstatě rovnoměrnou mobilitou v matrici aniontoměniče

Z běžně dodávaného ascitu myší byly pomocí standardní technologie při použití hybridomu, produkující IgG proti transferrinu, čištěny monoklonální protilátky chromatografií na iontoměniči s následným dělením chromatografií na gelu podle velikosti ve fosfátovém pufru. Pufr byl pak vyměněn za uhličitanový pufr a pak byly protilátky IgG rozštěpeny na fragmenty Fab působením papainu v kombinaci s dithiothreitolem. Po této enzymatické modifikaci byly všechny thiolové skupiny včetně volných thiolových skupin protilátky blokovány jodacetamidem, který rovněž ukončí účinek enzymu. Vytvořené fragmenty Fab se pak čistí kombinací dialýzy a chromatografie na aniontoměniči.

Čištěné fragmenty protilátky se pak čistí dialýzou proti boritanovému pufru o pH 8,0 a pak se přidá N-hydroxysukcinimid kyseliny 7-amino-4-methylkumarin-3-octové (AMCA-NHS). AMCA-NHS se přidá ve formě roztoku v DMSO a reaguje s volnými aminoskupinami molekuly Fab. Komplex AMCA-Fab se čistí chromatografií, dělící podle molekulové hmotnosti, a pak ještě chromatografií na aniontoměniči, čímž se získá frakce s v podstatě rovnoměrnou mobilitou v matrici aniontoměniče.

Imunologická afinita značeného fragmentu Fab se zkouší pomocí mikrotitračního systému ELISA při použití imobilizovaného lidského transferrinu a polyklonálních protilátek IgG pro myši, které byly konjugovány s peroxidázou.

- 10CZ 283072 B6

Příklad 6

Příprava RESO-značených monoklonálních fragmentů Fab s v podstatě rovnoměrnou mobilitou v matrici aniontoměniče

Z běžně dodávaného ascitu myší byly pomocí standardní technologie při použití hybridomu, produkujícího IgG proti transferrinu, čištěny monoklonální protilátky chromatografii na iontoměniči s následným dělením chromatografii na gelu podle velikosti ve fosfátovém pufru. Pufr byl pak vyměněn za uhličitanový pufr a pak byly protilátky IgG rozštěpeny na fragmenty Fab působením papainu v kombinaci s dithiothreitolem. Po této enzymatické modifikaci byly všechny thiolové skupiny včetně volných thiolových skupin protilátky blokovány jodacetamidem, který rovněž ukončí účinek enzymu. Vytvořené fragmenty Fab se pak čistí kombinací dialýzy a chromatografie na aniontoměniči.

Čištěné fragmenty protilátek se dialyzují proti 0,1 M uhličitanovému pufru o pH 8,5. Pak se v molámím přebytku přidá N'-hydroxysukcinimidester kyseliny N-(resorufin-4-karbonyl)piperidin-4-karboxylové (RESOS) v roztoku DMSO a tato látka se nechá reagovat s aminoskupinami protilátky při inkubaci při teplotě místnosti. Značený fragment Fab se pak čistí chromatografii na sloupci, který dělí molekuly podle hmotnosti a pak chromatografii na aniontoměniči. Izoluje se frakce s v podstatě rovnoměrnou mobilitou v matrici aniontoměniče.

Imunologická afinita takto značeného fragmentu Fab se pak zkouší při použití mikrotitračního systému ELISA a imobilizovaného lidského transferrinu, jako mobilní fáze se užije roztok polyklonální protilátky IgG proti myší tkání, konjugované s peroxidázou.

Příklad 7

Stanovení desialylovaného transferrinu v séru nemocných

Zkouška na desialylované transferriny se provádí na vzorcích séra, nasycených železem. Sycení železem se provádí tak, že se přidá 5 mikrolitrů chloridu železitého s koncentrací 0,25 mg/ml v 0,2 M tris-maleátovém pufru o pH 7,0 ke 20 mikrolitrům séra a směs se pak inkubuje 20 minut při teplotě místnosti.

Zkoumaný roztok je tvořen 10,2 mikrolitry séra, nasyceného železem a přidaného k 500 mikrolitrům 20 mM tris-HCl, 70 mM NaCI, 0,05 % Tween-20 o pH 8,0 s obsahem 5 x ΙΟ’⁸ M FETC-Fab (fragment Fab proti transferrinu, značený fluoresceinem, podle příkladu 4). Uvedený roztok se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti a pak se materiál dělí na sloupci silného aniontoměniče. 500 mikrolitrů roztoku, obsahujícího komplex FITC-Fab-fragmentu a transferrinu, se pak dělí elucí sloupce při použití 20 mM TRIS-HC1, 70 nM NaCI, 0,05 % Tween, při pH 8,0, použitým sloupcem je Mono Q (Pharmacia).

Na obr. 9 jsou znázorněny výsledky eluce komplexu FITC-Fab a transferrinu ze vzorků séra, odebraných od těžkých alkoholiků a od normálních osob. Fluorescence ve frakci 1 je mírou nenavázaného fragmentu Fab, fluorescence ve frakcích 3 až 7 odpovídá množství FITC-Fab, vázaného na desialylovaný transferrin a fluorescence ve frakcích 9 a následujících odpovídá množství FITC-Fab, vázaného na normální transferrin. Rozdíly ve fluorescenci ve frakcích s číslem nižším než 7 od sebe odlišují těžké alkoholiky a osoby, u nichž k alkoholismu nedošlo.

Příklad 8

Stanovení množství desialylovaného transferrinu v séru nemocných při použití minisloupců pro jediné použití

- 11 CZ 283072 B6

Sloupce pro jediné použití se připraví z gelu silného aniontoměniče (Q-Sepharose, Pharmacia) při použití 0,5 ml gelu ve sloupci s vnitřním průměrem 0,7 cm. Sloupec je v rovnovážném stavu s 20 mM tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 při pH 8,0.

Test na minisloupci na desialylovaný transferrin se provádí při použití vzorků séra, nasycených železem. Sycení železem se provádí přidáním 5 mikrolitrů roztoku chloridu železitého s množstvím 0,25 mg/ml v 0,2 M tris-maleátovém pufru o pH 7,0 ke 20 mikrolitrům séra s následnou inkubací 20 minut při teplotě místnosti.

Zkoumaný roztok je tvořen 10,2 mikrolitry séra, nasyceného železem, toto množství se přidá do 500 mikrolitrů 20 mM tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 o pH 8,0 s obsahem 5 x 10'⁸ M FITC-Fab (Fab proti transferrinu, značený fluoresceinem podle příkladu 4). Tento roztok se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti a pak se dělí chromatografií na sloupci silného aniontoměniče. Na sloupec se nanese 100 mikrolitrů roztoku s obsahem komplexu transferrinu a FITC-Fab a k eluci komplexu desialylovaného transferrinu a FITC-Fab se užije 3,0 ml 20 mM tris-HCl, 70 mM NaCl a 0,05 % Tween-20 o pH 8,0. Veškerý eluát se shromáždí a měří se fluorescence z fluoresceinu, která se srovnává se standardním ředěním fragmentů Fab, značených fluoresceinem. Výsledky se užijí k odlišení alkoholiků od osob bez projevů alkoholismu.

V následující tabulce jsou shrnuty výsledky, získané ze sér alkoholiků a normálních lidí.

Tabulka sérum naměřená fluorescence % celkového množství

A		10,9
B		8,5
C	alkoholici	8,4
D		7,8
E		5,2
F	nealkoholici	4,8
G		4,8

Příklad 9

Test na desialylovaný transferrin CDT v séru (1)

Materiály:

i) Roztok A: 150 kBq/ml komplexu ¹²⁵I-antitransferrinu-Fab, 20 mM bis-TRIS, 3x7 x ΙΟ’⁵ M citronanu železitého, 66 mM NaCl, 5,9 mM HC1, 3,1 mM azidu sodíku, 0,05 % Tween-20, pH 7,0.

ii) Roztok B: 20 mM bis-tris, 55 mM NaCl, 5,9 mM HC1, 3,1 mM azidu sodíku, 0,05 % Tween-20, pH 7,0.

iii) Sloupce pro dělení: 0,5 ml gelu silného aniontoměniče (Q-Sepharose Fas Flow, Pharmacia) v rovnovážném stavu v roztoku B.

iv) Zkumavky.

- 12CZ 283072 B6

Reakční činidlo a sloupce se po delší dobu skladují při teplotě 4 až 8 °C.

Roztoky a sloupce se před použitím uvedou do rovnovážného stavu při teplotě místnosti.

Provedení zkoušky:

1: Příprava roztoku

1.1: 30 mikrolitrů séra se přidá ke 220 mikrolitrům roztoku Ave zkumavce. Užijí se běžné vzorky séra.

1.2: Vzorky se inkubují po dobu 1 až 10 minut při teplotě místnosti.

2: Příprava sloupce a dělení

2.1 Ze sloupce se odstraní přebytek roztoku tak, že se nejprve odstraní horní zátka a pak zátka na dně sloupce. Roztok se nechá protéci sloupcem a eluát se odloží.

2.2: Pod sloupec se umístí zkumavka.

2.3: Přidá se 200 mikrolitrů zkoumaného roztoku, přičemž se dbá toho, aby vzorek byl nanesen přímo na horní filtr ve sloupci. Vzorek se nechá nasáknout do filtru a až pak se provádí eluce přidáním 3,0 ml roztoku B. Eluát se odebírá tak dlouho, dokud ze sloupce vytéká.

3. Měření

3.1: Odebraný eluát se měří při použití gamma-počítače.

3.2: Vytvoří se referenční křivka při použití referenčních vzorků se známým obsahem CDT v %.

3.3: Obsah CDT v neznámém vzorku séra v % se vypočítá při použití referenční křivky.

Příklad 10

Test na desialylovaný transferrin CDT v séru (2)

Materiály:

i) Roztok A: 0,14 mg/ml Fab proti transferrinu, značeného fluoresceinem, 5 mM Tris, 55 mM NaCl, pH 8,0, 3,1 mM azidu sodíku.

ii) Roztok B: 20 mM bis-tris, 3,7 x 10'⁵ M citrátu železitého, 66 mM NaCl, 5,9 mM HC1, 3,1 mM azidu sodíku, 0,05 % Tween 20, pH 7,0.

iii) Roztok C: 20 mM bis-tris, 66 mM NaCl, 5,9 mM HC1, 3,1 mM azidu sodíku, 0,05 % Tween 20, pH 7,0.

iv) Roztok U: 1,0 M tris-jako báze, 3,1 mM azidu sodíku.

v) Sloupce pro dělení: 0,5 ml gelu silného aniontoměniče (Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia) v rovnovážném stavu v roztoku C.

- 13 CZ 283072 B6 vi) Zkumavky.

Reakční činidla a sloupce se po delší dobu skladují při teplotě 4 až 8 °C.

Roztoky a sloupce se před použitím uvádějí do rovnovážného stavu při teplotě místnosti.

Roztok A a roztoky, které tento roztok obsahují jako svou složku, je nutno chránit před světlem.

Provedení zkoušky

1:Každodenní příprava inkubačního roztoku.

1.1: Roztok B se smísí s roztokem A tak, že se smísí díl roztoku A a dílů roztoku B.

1.2: Roztok pro inkubaci se připravuje v dávce, dostačující pouze projeden den. Pro každou zkoušku je zapotřebí alespoň 230 mikrolitrů a navíc 20 mikrolitrů pro referenční měření.

.Příprava vzorku

2.1: 30 mikrolitrů séra se přidá ke 220 mikrolitrům inkubačního roztoku svrchu uvedeného složení ve zkumavce. Užívá se běžných vzorků séra.

2.2: Vzorky se inkubují po dobu 1 až 10 minut při teplotě místnosti.

.Příprava sloupce a dělení na sloupci

3.1. Ze sloupce se odstraní přebytečný roztok tak, že se nejprve vyjme horní zátka a pak zátka ze dna sloupce. Roztok se nechá protéci sloupcem a eluát se odloží.

3.2: Pod sloupec se umístí kyveta.

3.3: Přidá se 200 mikrolitrů zkoumaného roztoku a dbá se toho, aby vzorek byl přidán přímo na horní filtr sloupce. Vzorek se nechá vsáknout do filtru a až pak se přidá 3,0 ml roztoku C. Eluát se odebírá tak dlouho, dokud vytéká.

3.4: K eluátu se přidá 0,1 ml roztoku D a roztoky se promísí převrácením kyvety.

4:Měření

4.1: Měří se fluorescence odebraného roztoku. Excitace 485 nm (rozmezí 480 - 490 nm) a emise 520 nm (rozmezí 515 - 525 nm).

4.2: Vzorek pro nastavení nulové hodnoty.

3,0 ml roztoku C +

0,1 ml roztoku D.

4.3: Množství CDT v procentech v neznámém vzorku se stanoví ze standardní křivky, získané měřením hodnot standardních vzorců séra.

- 14CZ 283072 B6

Příklad 11

Frakcionace po vsázkách

Zkušební roztok:

300 mikrolitrů 20 mM bis-tris s 50 mM NaCi a 0,05 % Tween o pH 7,0 + 1,3 mikrolitrů 50 mM tris-maleátu, 9,25 mmol/litr citrátu železitého + 9 mikrolitrů roztoku, obsahujícího 0,5 mikrogramů Fab-fragmentů, značených fluoresceinem.

Částicový materiál:

Částice kvartemího aminu AQ (Dyno Particles, Norsko).

Provedení zkoušky:

1. Ke zkušebnímu roztoku se přidají 4 mikrolitiy vzorku zkoumaného séra.

2. Suspenze částkového materiálu ve 20 mM bis-tris pufru s 50 mM NaCl a 0,05 % Tween 20 opH7 se přidá do konečného objemu 40 % objemových částic v suspenzi a pak se suspenze 10 minut míchá, načež se odstředí 5 minut při 1500 g.

3. Měří se fluorescence supematantu.

Příklad 12

Fluorescenční značení fragmentů Fab protilátky

1. 2,5 mg Fab v 50 mM uhličitaném pufru opH 9,5 se přidá ke 25 mikrogramům fluoresceinisothiokyanátu FITC. FITC se připraví zFITC na celitu (10%) po rozpuštění v dimethylsulfoxidu.

2. FAB se inkubuje s roztokem FITC při teplotě místnosti ve tmě celkem 18 až 24 hodin.

3. Fab, značený fluoresceinem, se čistí chromatografií na sloupci pro dělení molekul podle velikosti (gel Superose 6 PrepGrade, Pharmacia, 1,30 cm). Značený fragment se vymývá pufrem s 10 mM fosforečnanu sodného a 0,5 M chloridu sodného opH 7,4. Izoluje se frakce, obsahující fragment protilátky.

4. Shromážděný roztok Fab, značeného fluoresceinem, se upraví tak, že se pufr změní na 2,5 mM tris-HCl o pH 8,0 a pak se dále zpracovává chromatografií na silném aniontoměniči.

Uvedený postup byl užit ke značení fragmentů Fab, získaných z monoklonálních protilátek, reaktivních se všemi variantami transferinu. Protilátky IgG proti transferrinu byly čištěny z běžně dodávaných ascitických tekutin, molekuly protilátky byly rozštěpeny působením papeinu a vytvořené volné thiolové skupiny byly blokovány navázáním jodacetamidu obvyklým postupem. Výsledné fragmenty Fab byly čištěny chromatografií na iontoměniči a pak značeny svrchu uvedeným způsobem.

- 15 CZ 283072 B6

Příklad 13

Značení fragmentů Fab protilátky jodem ^l25I

1. 5 mCi ¹²⁵I-Bolton Hunterova reakčního činidla, rozpuštěného v benzenu, se odpaří do sucha v proudu dusíku.

2. 0,65 mg Fab v roztoku v 0,1 M boritanovém pufru o pH 8,5 (0,96 ml) se přidá k reakčnímu činidlu ze stupně 1 a směs se inkubuje 30 minut v ledu za stálého protřepávání.

3. K ukončení reakce se přidá 0,5 ml roztoku 50 mM glycinu v 0,1 M boritanovém pufru o pH 8,5 a pak se roztok inkubuje v ledu ještě 10 minut.

4. Reakční roztok se pak chromatografuje na sloupci pro dělení molekul podle velikosti (Superose 6 PrepGrade, Pharmacia, 1 x 30 cm). Značený fragment Fab se vymývá 10 mM fosfátem sodným s0,l M chloridu sodného opH 7,4 a frakce s obsahem fragmentu protilátky se izoluje.

5. Ve frakci s ¹²⁵I-Fab se pufr nahradí 2,5 mM tris-HCI o pH 8,0 ultracentrifugací s oddělením sloučenin do určité molekulové hmotnosti 10 000 a frakce se zahustí na objem 1,5 ml.

6. Materiál se dále zpracovává chromatografií na silném iontoměniči.

Fragmenty Fab protilátky proti transferrinu, získané podle příkladu 12, byly značeny svrchu uvedeným způsobem.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob stanovení koncentrace variant ve skupině bílkovinných látek, oddělených od sebe frakcionačním systémem, vyznačující se tím, že se skupina variant uvede do styku se skupinou značených bílkovinných specifických vazných látek pro tyto varianty za vzniku komplexu varianty a značené vazné látky a tyto komplexy se pak dělí ve frakcionačním systému na jednu nebo větší počet frakcí s obsahem komplexů, načež se stanoví množství značené vazné látky v jedné nebo ve větším počtu získaných frakcí, přičemž skupina značených bílkovinných specifických vazných látek má před reakcí v podstatě rovnoměrnou distribuci nebo mobilitu v použitém frakcionačním systému.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že specifickou vaznou látkou pro varianty zkoumané látky jsou protilátky nebo jejich fragmenty.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že specifická vazná látka je monovalentní.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že specifickou vaznou látkou je fragment F(ab) protilátky.
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že frakcionační systém je založen na principu rozdílu v náboji nebo izoelektrickém bodu.

- 16CZ 283072 B6
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, že skupinou variant je skupina variant transferrinu.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se frakcionační systém volí ze 5 skupiny elektroforéza, použití iontoměniče, chromatografíe a využití dělení na principu rozdílu izoelektrického bodu.
8. Způsob podle nároků 6 nebo 7, vyznačující se tím, že se před dělením nebo současně s dělicím stupněm skupina variant transferrinu nasytí železitými ionty.
9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že se v podstatě homogenní distribuce nebo mobility skupiny specifických vazných látek v použitém frakcionačním systému dosáhne jejich modifikací a/nebo frakcionací.

.15
10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že varianty zkoumané látky jsou v přebytku vzhledem ke skupině vazných látek a stanoví se relativní množství různých variant vzhledem k celkové koncentraci všech variant.
11. Prostředek k provádění způsobu podle nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že 20 obsahuje skupinu značených bílkovinných vazných látek pro varianty zkoumané látky, přičemž tyto vazné látky mají v podstatě rovnoměrnou mobilitu nebo distribuci v jednom nebo ve větším počtu frakcionačních systémů.
12. Prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje fragmenty 25 F(ab) nebo F(v) protilátek proti transferrinu.
13. Analytický zkušební balíček k provádění způsobu podle nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že obsahuje prostředek podle nároku 11 nebo 12 spolu s reakčními činidly a/nebo materiály, jichž je zapotřebí k provedení frakcionace.
14. Analytický zkušební balíček podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje prostředek podle nároku 11 nebo 12 spolu s frakcionačním prostředím a jedním nebo větším počtem reakčních činidel ze skupiny pufry ve formě solí nebo roztoků, smáčedla a konzervační látky.
15. Analytický zkušební balíček podle nároku 14, vyznačující se tím, že obsahuje složky pro stanovení variant transferrinu a mimoto alespoň jednu sůl s obsahem železitého iontu v pevné formě nebo ve formě roztoku.