JPH08508297A

JPH08508297A - ヒト−プラズマ−グルタチオン−ペルオキシターゼの特殊免疫分析法、その実施のための道具、及び該分析法のためのオリゴペプチドと抗体

Info

Publication number: JPH08508297A
Application number: JP7507981A
Authority: JP
Inventors: ジャンソーディエール; アールノロメーング; パトリシアマレット
Original assignee: ビヨクシテック
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 1996-09-03
Also published as: FR2709492A1; FR2709492B1; DE69427854D1; AU689498B2; AU7617394A; US5861262A; EP0667897A1; WO1995006719A1; CA2148268A1; EP0667897B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、プラズマ−グルタチオン−ペルオキシダーゼ（pl.GPx）をpl.GPx配列から選択されたオリゴペプチドに対する抗体を利用して、特定の免疫学的検定法に基づき分析検査するための新しい方法に関する。また、本発明はオリゴペプチドと特殊抗体にかかる。また、本発明は該方法を実施するためのキットに関する。本発明は、医学治療の分野や、pl.GPxの濃縮の変化に関連した病理学の発展観察に応用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト−プラズマ−グルタチオン−ペルオキシターゼの特殊免疫分析法、その実施のための道具、及び該分析法のためのオリゴペプチドと抗体本発明はヒト−プラズマ−グルタチオン−ペルオキシターゼ（pl.Gpx）を分析する方法、及び該分析方法を実施するための使用可能状態のセットに関し、また本発明は、pl.GPxのペプチド列と該列を持つインビトロ合成物の選択、及び該列に抗し、pl.GPxを特に認識する抗体の生産及び利用に基づくものである。３種類のヒト−プラズマ−グルタチオン−ペルオキシターゼが特徴付けられている。それらは、プラズマ−グルタチオン−ペルオキシターゼ（pl.Gpx）と、基本的に親水性基質に対して作用する細胞間グルタチオン−ペルオキシターゼ（c. Gpx）と、及びリン脂質過酸化水素や他の脂質基（PHGPx）に対して作用するグルタチオン−ペルオキシターゼである。これらの酵素はグルタチオン（GSH）により過酸化水素（H₂O₂又はROOH）の減少を促進する。これらの酵素はそのアクテイブサイト（active site）内にセレノシステイン（selenocystein）を含むセレノプロテイン（selenoprotein）である。c.GPxとpl.GPxはホモテトラマー（homote tramers）であるが、PHGPxは専ら単量体である。［Biochim.Biophys.Acta,839,6 2−70(1985)］元来プラズマから精製されるため［J.Biol.Chem.,262,No.36,17398-17403(198 7);Arch.Biochem.Biophys.,256,No.2,677-686(1987)］、pl.GPxはプラズマタンパク質量全体の０．００７％を占める。pl.GPxはヒトの母乳からも分離される［ J.Nutr.,121,No.8,1243-1249(1991)］。糖タンパク質の性質として、pl.GPxは、分子量９４kDaのホモテトラマーの状態で存在する［J.Biol.Chem.,262,No.36,17398-17403(1987)］。分子量２１．５から２３kDaであることを特徴とするそれぞれのサブユニットは［J.Biol.Chem., 262,No.36,17398-17403(1987);J.Biochem.,108,145-148(1990)］、そのアクティブサイト内にセレノシステインを含有する。最近、ラットによる研究により、pl.GPxは、主に腎細胞により合成されていることを示されており（Yoshimura et al.J.Biochem.109;(1991);918-923）、また、別の研究ではヒト本来の腫瘍肝細胞列（HepG2）はこのpl.GPxを合成可能であるということを示している（AVISSAE et al.J.Biol.Chem.264;1989;15850-15855 ）。プラズマ−グルタチオンの濃度は低いので、pl.GPxの主要な役割ははっきりしていない。pl.GPxのある特定の作用は、c.GPxの１０分の１以下である［Arch.Bi ochem.Biophys.,256,No.2,677-686(1987)］。ヒトpl.GPxの主な配列はcDNAから判定され、タカハシ等により誌上発表された［J.Biochem.,108;(1990);145-148］。pl.GPxの完全な配列を決定することやＮ −末端を見分けることは、グリコサイレーシヨン（glycosylation）がこの末端に影響を与えているため、不可能であった。従って、サブユニット当たりの残基の厳密な数は、不明である。 pl.GPxは、構造の面から見ると、c.GPxとかなり異なる。即ち、分子構造のためのグリコサイレーションと分子内ジスルフィドブリッジが存在せず［Arch.Bio che.Biophys.,256,677-686(1987);Blood,73,318-323(1989)］、また、二つの酵素間の配列相同が少ない（約４４％［Nucleic Acids Res.,15;(1987);5484;Nucl eic Acids Res.,15;(1987);7178］）。プラズマ内におけるpl.GPxレベルの測定は、人体におけるセレンの欠乏を示す状態の良き指針である。人体でのセレンの欠乏と供給の影響の度合いを計るために設定された実験の体系内で、グルタチオン−ペルオキシダーゼの平均レベルは、プラズマ形態のものが含まれるか細胞形態のものが含まれるかによって、同率で変化することはないことが観察されている。従って、プラズマ形態のpl.GPxレベルは治療を開始してから数日のうちに上昇し始め、２週間から４週間後には正常値に達する。c.GPxの正常値が回復するのに要する時間はこれより長く、３カ月から４カ月である［Amer.J.Clin.Nutr.,41;(1985);735-747］。また、過去のラットを用いた研究によると、数多くの腎臓病例がpl.GPxの測定により検出することが可能であった。現在のどの酵素活動の分析検査方法も、生体液中や組織抽出物中における pl.GPxの明確な検出方法を見いだしていない。最も一般的に用いられるグルタチオンペルオキシダーゼの活動の分析検査方法は、原時点で過剰なグルタチオン還元酵素による、減少したグルタチオンの再生を活用した酵素カップリングを含む。この反応は、減少した余因数であるNADPH の酸化に伴うものである。この余因数の消滅率は、時間の関数として簡単に観察できる。このような条件下において、NADPHの酸化の力学はグルタチオンの酸化の力学に対応し、結果としてヒドロペルオキシドの減少の力学に対応する。しかし、pl.GPx又はc.GPxに特異なヒドロペルオキシド基質は存在しない。従って、c.GPxの活動と、pl.GPxの活動を区別することは、現時点では不可能である。 c.GPxの主要な活動はpl.GPxの約１０倍以上であることから、c.GPxの質量における１％の含有量は、pl.GPxの活動量を１０％の単位で過評価を引き起こすおそれがある。従って、血液標本における少量の溶血の発生は、循環プラズマや血清のpl.GPx活動の計算において、大きな誤差を生じさせる。本発明における目的は、pl.GPxとc.GPxを区別すること、特にpl.GPxを免疫酵素法を用いて分析することができる新規のGPxの分析検査方法を開発するものである。pl.GPxを分析するための免疫学を用いた方法は、pl.GPxとc.GPxの主要な配列の相同性が高く、抗体と２種類の分子の間で反応が起こるため、まだ開発されていない。上記課題を解決するために、出願人は −pl.GPxの誌上発表された配列から導きだされた種々の合成オリゴペプチドの免疫原性を評価し、 −オリゴペプチドとその一連の変位体を、特に選択された配列のための抗体の生産を実験動物において誘引する、免疫原性の共役根の形態で使用するために選択し、 −該抗体がpl.GPxを特に認識することを実証し、 −pl.GPxの検定法を該抗体による免疫捕獲に基づいて開発し、 −該抗体を使用可能状態の分析検査キットに取り入れた。 pl.GPxの、誌上発表された配列（タカハシ、上記及び図１参照）はソフトウエアを用いて研究されたもので、このソフトウエアは、ペプチド列が浸水性と柔軟性を持つ外形を持つことを定義し、引いては、ペプチド列の分子表面における可能な形状を定義することを可能にするものである。これにより、一連のオリゴペプチドは、１３から１６のアミノ酸の長さをし、pl.GPx配列の大部分を占めるように重複した配列を有するものが選ばれ、合成された。アクティブサイトを取り巻き構成する配列は、c.GPxとの相同が大き過ぎるため取り除かれた。これらのオリゴペプチドはウサギに注射するために、ウシ血清アルブミン（BS A）上にハプテンとしてグラフトされる。第一段階では、相同なシステムにおいて、このウサギから血清が収集され、免疫原として利用されるペプチドに抵抗する抗体タイターが測定された。そして、潜在的に診断テストに利用することのできる抗体を選択するためにpl.GPxに対抗する抗体タイターが測定された。結果は、可溶抗原が存在している場合の他の滴定及び比較テストにより裏付けられた。従って、出願人は、誌上発表されている（同参考）配列のpl.GPx配列の残基Gl u１０８からLys１２０につながる配列を持つオリゴペプチドを選択した。このオリゴペプチドは本発明の基礎を構成する。本発明は、オリゴペプチドの合成を容易にすること、又は更に安定した分子を精製することができるという技術上の理由から、この配列のうちの一つ又は二つのアミノ酸を同等のアミノ酸で置き換えた変位体に応用できる。従って、置き換え無しに、オリゴペプチド全体の空間的な構成や親水性、又は免疫原性を修正することができる。また、本発明は、Ｎ末端もしくはＣ末端、又はこれら両端において数アミノ酸分だけ短いもしくは長いような、この配列の変位体（これらの変位体は、化学合成や自然発生分子の酵素消化により得ることができる）にも、その変位体が選択された配列と同じ特性を持つ抗体の誘導を許すものであるならば、つまり、特に pl.GPx向けの抗体であるならば、応用することができる。このようにして定義されたオリゴペプチドは免疫原として、オバアルブミン、又は血清アルブミンタイプなどのキャリアタンパクと結合したハプテンの形態で利用される。選ばれたオリゴペプチドの合成は、固体状態合成器（solid-phase synthesize r）によりアミノ酸をＣ末端からＮ末端の方向へ加えることにより、従来の条件下で行なわれた。合成中、Ｃ末端もしくはＮ末端に、選ばれた配列の一部ではないアミノ酸が、オリゴペプチドとキャリアタンパクのカップリングを許すために加えられる。このようにして得られた免疫原性共役根は、高タイターで抗体を得るために、従来の方法によると、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギなど）に注射されていた。本発明は、また、上に定義された免疫原性共役根の利用結果として生産される抗体に関する。これらの抗体は、免疫原性共役根においてハプテンの働きをする同じオリゴペプチドをグラフトされたセファローズタイプゲルに、親和力クロマトグラフ法を適用することにより精製される。これは望ましい特性を持つ抗体を選択するためである。これは、オリゴペプチドを選択するために利用され、精製された抗体が、他のグルタチオンペルオキシターゼを除く、特に自然発生したpl .GPxを感知することを示す同じ滴定により制御される。また、本発明は、同様の特性を示し、免疫原として本発明のオリゴペプチドを用いる周知の手順によって誘導され、公知の方法によって精製されるモノクロナル抗体にも応用可能である。また、本発明は、上記に定義された抗体により免疫捕獲をすることによりpl.G Pxを分析検査する新規の方法に関する。以下、抗体は、第二の「リビーリング（ revealing）抗体」により「捕獲された」pl.GPxのリビーリング結果である「抗ペプチド抗体」を示し、このタイプの方法は一般に「サンドイッチ分析検査法」と呼ばれる。従って、本発明の方法は、 −抗ペプチド抗体を支持体にバインドし、 −分析対象の生体物質のサンプル内におけるpl.GPxを該抗体により免疫捕獲し、 −分類された抗自然pl.GPx抗体により免疫捕獲されたpl.GPxを現出させる。免疫捕獲による分析基本を変えずに、実施例を構成することは可能であり、これは本発明の一部を構成するものである。一本方法の好適な実施例によれば、抗ペプチド抗体は公知のタイプのプレート又は希釈滴定のためのマイクロプレートウェル、又はポリスチレンビーズ、あるいは他の抗体と連結可能な素材である支持体にバインドされている。 −このようにして連結された抗体は、特に分析検査されるサンプル内に存在するpl.GPxの免疫捕獲をすることができる。特に前者のサンプルは連続的に希釈されることが望ましい。 −このように抗ペプチド抗体に捕獲されたpl.GPxは、検出の感度を向上させるために分類した第二抗体の助けにより明らかにされる。この第二タイプの抗体、つまりリビーリング抗体は、精製されたpl.GPxで動物に免疫を付けた後に、手に入れることができる。これらの抗体はカプロン酸と、硫酸アンモニウムを使用した二重抽出により精製される。そして、これらは酵素とカップリングすることにより分類される。この酵素の活動は基質（substrate）の存在により比色法（ELI SAタイプテスト）を用いることによって明らかになるか、もしくは放射性同位体（RIAタイプテスト）で分類されるか、又は、蛍光性基質として分類される。第二タイプの抗体は選択的に、モノクロナル抗体でもよい。 −分析検査用サンプルのpl.GPxタイターは、精製されたpl.GPxの標準サンプルを基に設定された基準曲線と比較することによって判定される。本発明に関する方法は、特性が非常に高いことを特徴とし（つまり、プラズマ pl.GPxを認知し、他の物質を排除する）、これは、該目的のために選択された抗ペプチド抗体を利用することにより実現される。また、本発明は、上記分析検査方法実施用の使用可能状態のキット、又はセットに関する。このキットは、下記の様に構成される。即ち、 −従来の方法による、抗ペプチド抗体が結合した好ましくは９６のウェルを持ち、そのウェルの全表面がカバーされた、分割可能もしくは不可能な滴定板と、 −好ましくは緩衝溶液（トリス、リン酸塩）と、NaClと、０．１から１％の濃度のタンパク質（カゼイン、オバアルブミン、血清、アルブニンなど）と、界面活性剤と、保存剤（ナトリウムアジド又はメルチオレート(merthiolate)）とで構成されるサンプルを希釈するための溶液及び、タンパク質以外の同成分構成の洗浄溶液と、 −ヒトプラズマから精製されたpl.GPxで構成されるフリーズドライされた標準物と、 −抗体を明らかにするための分類された抗pl.GPxの溶液と（これらの抗体はポリクロナルもしくはモノクロナルで、従来の手順によれば精製されたヒトpl.GPx を用いて免疫を付けた結果製造されるものであり、また、ビオチン又はリビーリング酵素（アルカリ性フォスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ）のどちらかに分類される。この抗体溶液はトリス又は１５０mMのNaCl、０．１から１％の過負荷タンパク質（血清アルブミン、オバアルブミン、又はカゼイン）、グリセロール、保存剤を成分とするリン酸塩緩衝剤中で準備される）、 −例えば、アルカリ性フォスファターゼの為のpNPP（４−ニトロフェニルフォスフェイト、4-nitrophenylphosphate）、ペルオキシターゼのためのオルト−フェニレンジアミン（ortho-phenylenediamine）など、抗体分類を明らかにする為の基質により構成される。本発明にかかるキットは、生体液中又は、組織抽出物中のpl.GPxの分析検査、特に腎臓又は肝臓病理学の診断や、治療上の観察、及びセレン不足に関する状態の診断や、治療上の観察に使用可能である。潜在的に本発明は、次に挙げるものを含む。即ち、 −セレン不足、特に栄養不良状態に関するものでは、溶腸性又は腸管外への人工栄養治療を受けている年配者や患者に関する状態の診断、 −腎不全、特に透析患者の診断、及び治療上の観察、 −肝臓又は腎臓グラフトの急性拒否反応の早期診断、 −特定の肝腫瘍の診断又は、これらの腫瘍の化学治療の観察。以下に示す例は、本発明の開発に関わる特定の見地とその実施例を、発明の趣旨を限定しない範囲で示すものである。図１は、cDNAの原子配列から推測されるプラズマ−グルタチオン−ペルオキシダーゼの基本配列を示す。これは、タカハシＫ．、アカサカＭ．、ヤマモトＹ．、コバヤシＣ．、ミゾグチＪ．、コヤマＪ．により、（１９９０）、J.Biochem.,1 08,145−148に発表されている。下線の付されたアミノ酸はpl.GPxとc.GPxに共通である。図１は、本発明の実施に必要不可欠なものではないが、読み易くするためにこの説明に付け加えてある。例１−オリゴペプチドの合成と選択。 cDNAから推測され、タカハシ等によって誌上発表された（J.Biochem.108,(199 0);145−148,図１参照）pl.GPxのアミノ酸配列は、ソフトウエアによって分析され、その結果、親水性と基本配列の柔軟なプロファイルを定義することが可能となった。下記のオリゴペプチドは選択され、合成されたものである。オリゴペプチドは下記の条件下で準備された。 a）合成合成物の全体的な条件は、誌上発表された手順から抽出された［抗原としての合成ポリペプチド、M.H.V.VAN REGENMORTEL,J.P.GRIAND,S.MULLER & S.PLAUE,(1 988),Ed.R.H.BurdonとP.H.Van Knippenberg-Elsevier］。配列は固体の状態で「Ｃ−末端」から「Ｎ−末端」へ向けて合成された。この合成に使用されたアミノ酸の純度は、必ず９９％以上（HPLC純度）である。切断工程に関わる異なる試薬や溶剤（フッ化水素酸、エーテル、ｐ−クレゾール、トリフルオル酢酸）は最低９９％の純度を持つことが特徴である。沈殿と濾過をエーテルを用いて行なった後、ペプチドはトリフルオル酢酸（TF A）で溶解され、溶剤は蒸発され、ペプチドはエーテルと共に再沈殿する。 b）精製ペプチドの精製は、場合により異なるが、１０から２００ml／分の間の流出量でMPLC^*により行なわれる。使用された準備コラム（preparative column）は逆フェーズ（Ｃ₁₈コラム）を含む。分離は３０分以上のプログラムされたグラデイエント（２５から６０％TFA）を利用して、達成することができる。この精製による留分はＣ₁₈コラム上でHPLC＊により分析され、必要純度を持つもののみフリーズドライされる。＊MPLC＝中圧液体クロマトグラフ法＊HPLC＝高圧液体クロマトグラフ法 c）HPLC分析この分析はＣ₁₈コラム上で行なわれる。グラディエント（１０から６０％トリアチルアミンリン酸塩−TEAP−）は１５分以上プログラムされ、検出は紫外線分光光度検出器によって行なわれる。 d）共役根の準備オリゴペプチドは、動物の免疫プログラムの基本構成内で利用されるように、キャリアタンパクと結合される。共役根は必ず下記の構成による。即ち、＊一般的に、Ｎ又はＣ末端のいづれかに、アミノ酸（例えば、チロシンなど）を更にグラフトした、上記記載のオリゴペプチド配列の一つにより代表されるハプテン。追加の残基は、ペプチド合成中はいつもポリペプチド鎖中に組み入れられる。この追加のアミノ酸は、配列自体と、ポリペプチド構成をキャリアタンパクにカップリングさせるのに使用される二機能性の試薬（ビスジアゾゲンジジン（bisdiazobenzidine）、グルタルアルデヒド、ｍ−マイレンイミドベンゾイル −Ｎ−ヒドロオキシサクシミニドエスタ（m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccin imide ester）、カルボジイミド等）を連結する役割を果たす。＊オバアルブミン、つまりOVA等のキャリアタンパク、ウシ血清アルブミン、つまりBSA、鍵穴笠貝ヘモアニン（keyhole limpet hemocyaninつまりKLH）。−オリゴペプチドとウシ血清アルブミンのビスジアゾゲンジジンによるカップリング（BDB）このカップリング薬剤の利用は、Ｎ又はＣ末端における残基がチロシンである場合に特に勧める。BDBにカップリングする前に、ペプチドは特定の反応サイトを保護するためにどのような下準備をされてもよい。例えば、自由NH₂もしくはS H機能グループの保護の基本構成内で行なわれるシトラコノイル化がある。連結は下記の手順にしたがって実行される。即ち、ペプチドを、pH８．５の５０mM HERPESの緩衝剤０．２mg／ml中に溶解させ、反応グループと比較して１０モル過剰であるいくつかの部分に、シトラコン酸を加える。pHは苛性ソーダ１Ｍにより８．５から９の間に調整されている。適度に攪拌しながら、室温で１時間培養し、０．２Ｍの塩酸中で５mg／mlの濃縮度のベンジジンを用意し、ベンジジン溶液１ml毎に３．５mg亜硝酸ナトリウムを加え、このようにして準備されたBDBを使用する前に、４℃で攪拌しながら２時間培養する。以降の全ての工程は、４℃で行なわれる。２．５mgの血清アルブミンを、０、１３ＭのNaClを含む、pH９、０．１６Ｍホウ酸塩緩衝剤１０mlに溶解し、その後ペプチドを加えることにより、BSA／ペプチドのモル比が１／３０から１／４０になる。１０分間、撹拌する。 BDB１００μlを、このようにして生産された混合物の中に入れ、２時間ゆっくりとに攪拌し続ける。定期的にpHを９になるように１M苛性ソーダを加えて調整する。余分な試薬と、PBS緩衝溶剤又は生理学上溶液に抗するペプチドを除去するために、溶液を濾過する。必要であれば、５％の酢酸溶液と濾過することによりシトラコン酸処理された残基の保護を無くす工程の前に実施する。ウシ血清アルブミンと結合されたオリゴペプチドは、ウサギに免疫を付けるために利用された。この従来の手順によれば、１００ｇのペプチドに相当する量の共役根が、一回の接種について使用される。接種は皮内に、３から４週間をおいて３回行なわれる。血清は回収され、オリゴペプチドに向かう抗体（「抗ペプチド抗体」）に対する反応を測定する（例４で説明されるテストによる）。免疫原生のあるペプチドを選ぶために、抗ペプチド抗体と抗自然pl.GPx抗体タイター両方を測定し、抗pl.GPx抗体（ウサギ内部で誘導される）がペプチドを認識することを確認する必要がある。これらの結果を次の表に示す。この選択の後、４配列が保持され、他の分析の対象となる。 − 対応する抗体は赤血球GPX（C.GPX）に対して親和力を持たないことが確認された。 − マイクロタイタープレート上で非溶解にされたpl.GPxの認識と溶液中のpl.G Pxの認識の、抗ペプチド抗体による競争（例５参照）に基づく分析検査により、抗体が溶液中で、タンパク質に結合可能かを確認することができた。約５０％の抑制を得るために必要なpl.GPxの濃縮度は下記のとおりである（３７°で比色法によるリビーリングを行ない、光学濃度、つまり反応抑制剤がない場合の吸収度を示す培養時間は括弧内に示す）。これらの結果を総合的に考えると、ペプチドBXT-02-2015が選択される。その配列は記憶のために下に記述する。これは誌上発表された配列の１０８から１２０に対応する。この配列は、チロシン残基の追加後に、結合を容易にするためにオバアルブミンのＣ末端とＮ末端にグラフトされる。下記の表に示すとおり、グラフティングの第二モードは、非常に高いタイターを誘導する。例２．抗ペプチドポリクロナル抗体の生産上記の例で説明されたように、選択され、オバアルブミンにグラフトされたペプチドは、下記の手順にしたがって、ウサギに注射される。 −注射：皮内注射、PBS緩衝剤中のペプチド１００μgとフロインドアジュバントのvol／vol混合物を一匹当たり１ml接種 −ブースター注射：同じ条件下で（不完全なフロインドアジュバンドと共に）、３から４週間おきに接種 −血液採取、４℃で一晩又は室温で２時間後に血清の遠心分離 −抗体の精製（例３参照）例３．親和力クロマトグラフ法による、抗pl.GPx抗体の精製 pl.GPxに特有の抗体を選択的に回復させるために、回復した血清は（例２）、免疫原の役割をするオリゴペプチドをグラフトされたゲル上において、親和力クロマトグラフ法により精製される。その手順は下記のとおりである。＊１０mgのペプチドを、Ｎ−ヒドロキシサクシミニド（ＮＨＳ−活性化ハイトラップコラム）により前活性化された１mlの高能率セルフアローズゲル（PHAR MACIA）にグラフトする。リガンドに結合されていない活性化グループを非活性化し、エタノールアミンpH８．３の塩水０．５Ｍと、アセテートpH４．０の塩水０．１Ｍを使用して非特殊結合リガンドを洗浄する。これらの溶液は、共に０．５ＭのNaCIを含み、それぞれの工程（３回）で、溶液をそれぞれ６mlずつ、交互に使用する。そして、血清を加える前にコラムとPBS溶液の均衡を取る。＊約１０mlのウサギの血清を、先にPBS溶液と均衡を取ったコラムに入れる。＊コラムをPBS緩衝剤で洗浄。＊０．１Ｍ、pH２のクエン酸塩緩衝剤を通ることにより、特定の抗ペプチド抗体を溶離。＊超濾過膜（１０から３０，０００の切り目）で抗体を濃縮。このようにして精製された抗体は特に、ヒトのpl.GPxを認識する。そして、ヒトのc.GPxとの重大な反応は観察されない。これらの抗体は、非可溶性の支持体に連結したヒトpl.GPx、あるいは液状では溶液中におけるヒトのpl.GPxを認識することができる。例４．抗体溶液の滴定この滴定法は、例３によれば、ペプチドの選択中に収集される血清及び、精製された特殊抗体にも応用することができる。本方法はマイクロタイタープレート上に非可溶化された抗体原の認識と、分類された抗抗体により拘束された抗体の発見に基づくものである。従来様々な分野で滴定の為に利用される９６ウェルマイクロプレートを利用するのが好ましい。滴定は、下記の手順により行なわれる。＊１００μlの抗体原溶液（オリゴペプチド又は精製された自然発生pl.GPx ）を、それぞれ２または１μg／mlのもの（感作緩衝剤：１０mM Tris-HCl、pH ８．５、１００mM NaCl）を用いて、マイクロプレートのウェルを感作。＊接着剤付きのシートで、プレートをカバーし、４℃で一晩又は、３７℃で２時間培養。＊ウェルを空にし、例えば、pH７．８の５０mMトリHCl緩衝剤、１５０mMのN aClを用いて室温で３０分で準備した、０．５％ゼラチン等のタンパク質溶液で非特殊結合サイトを満たす。＊ウェルを空にし、１５０mMのNaClと０．１％のトゥイーン２０（Tween20 ）を含有する、pH７．８、５０mMのトリＨＣＬ溶剤で３回洗浄。＊最後の洗浄液を取り除いてから、１００μlの希釈緩衝剤（１５０mMのNaC lと０．１％のトゥイーン２０、及び０．５％のゼラチンを含む、pH７．８の５０mMトリHCl緩衝剤）を、それぞれの行の最初のウェルを除く全てのウェルに分配。使用されていないウェルは、それぞれテストされるそれぞれのサンプル（血清又は精製された抗体）と、抑制血清（マイナス抑制）の沈殿のために開けておく。これらのサンプルは、希釈緩衝剤を用いて５０から２００フォールド（fold ）にしばしば希釈される。どの場合においても、沈殿物の体積は、２００μlである。この希釈（２フォールド連続希釈）は１００μlの溶液をウェルに順番に移すことにより行なわれる。この溶液の移動はテスト対象の２００μlの血清サンプルを持つウェルから始める。このテストの内部ゼロのための、少なくとも一つのウェルを確保する準備をする。これは、光学濃度測定時に行なう。このウェルは血清の希釈に使用してはならず、希釈緩衝剤のみ保持する。最後のウェルから取り除かれる１００μlは処分される。＊接着剤付きのシートでプレートに蓋をし、室温で２時間培養。＊プレートを空にし、ウェルを５回連続洗浄。＊最後の洗浄液を取り除いてから、１００μlのリビーリング溶液、つまり、分類された抗抗体共役体（例えば、アルカリ性フォスファターゼ）を分配。この抗抗体は、その血清を抽出した種（ウサギ、マウス、ヤギなど）に対して特性を持つ。この共役体の溶液は希釈緩衝剤（１５０mMのNaClと０．１％のトゥイーン２０、及び０．５％のゼラチンを含む、pH７．８の５０mMトリHcl緩衝剤）で希釈される。＊接着剤付きのシートでプレートに蓋をし、室温で１時間培養。＊プレートを空にし、ウェルを５回連続洗浄。＊アルカリ性フォスファターゼがリビーリング酵素として用いられた場合、例えば、パラ−ニトロフェニルリン酸塩等の基質溶剤１００μlを分配。pNPPは１．３５ＭのNaClを含むpH９．５の０．１ＭトリHCl緩衝剤中の、１mg／mlの試薬中で準備される。＊プレートに接着剤付きのシートで蓋をし、３７℃で培養。約２０分後、４０５ｎｍでそれぞれのウェルの光学濃度を見る。得られた信号を記録した後、光学濃度値を血清希釈の対数関数として、グラフに表す。タイターの値は希釈値と一致するように定め、抗原抗体複合体の５０％が得られるようにする。例５．特殊抗体の結合のための溶液中における非可溶pl.GPxとpl.GPxとの競争評価例１で説明したとおり、抗ペプチド抗体もまたpl.GPxと溶液中で結合する能力があることから、選択される。この能力は免疫捕獲分析テストにおいて必要不可欠なものであり、本発明の目的である。この能力を評価するために、溶液中のpl .GPxとマイクロタイターに吸収されたpl.GPxの競争テストが下記の手順にしたがって行なわれる。ａ − 分析検査日前＊プレートを１００mMのNaClを含むpH８．５のトリHCl緩衝剤１０mＭ中で、１μg／mlのpl.GPxで感作。＊接着剤付きのシートで、プレートに蓋をし、４℃で一晩培養。＊pl.GPx／抗ペプチド混合物を含む溶剤を準備。予備所見： − 加える抗体の量は一定でありアトランダムに設定されるものではない。親和力によって精製された抗体の濃縮溶液の最終的な希釈は、滴定（先の手順参照）後に決定される。この希釈のために、１単位に等しい光学濃度が、３７℃下３０分の培養後に任意に得られる。 − 抗体と自由抗原（pl.Gpx）の為の希釈剤は、１５０mMのNaClと０．１％のトゥイーン２０、及び０．１％のカゼインを含む、pH７．８のトリHCl緩衝剤５０mMで構成される。 − 反応抑制剤の濃縮度は、２０μg／mlから７．５ng／mlの間で変化してもよい。下記のテストは２０から０．０４０μg／mlの間の濃縮度を用いている。２から１０までの番号を付され、抗体−競争混合物（溶液中のpl.GPx）の為の系列の準備に使用されるための試験管に、希釈剤１００μlを分配。４０μg ／mlのpl.GPx溶液を２００μl、試験管１に入れる。試験管１の溶液を１００μl 、試験管２に移し、次に試験管２から試験管３へ移す。以下同様に次の試験管に移す。最後の試験管から集めた１００μlの溶剤は処分する。マイクロプレートウェル中で予想される最終濃縮度の２倍の濃縮度の抗体溶液を準備し、１００μ lの抗体溶液を全ての試験管に分配し、混合物を４℃で一晩培養する。ｂ − テスト当日＊マイクロプレートのウェルを空にする。＊非特殊結合サイトを０．２％から１％のタンパク溶液（ゼラチン、オバアルブミン、ウシ血清アルブミン）で満たす。＊試験管１から１０のそれぞれの系列点１００μlを別々のウェルに注ぐ。＊室温で２時間培養する。＊最終の洗浄剤を処分し、分類された抗抗体共役根（例えば、アルカリ性フォスファターゼ）の溶液１００μlを分配する。この抗抗体は、その血清を抽出した種（ウサギ、マウス、ヤギなど）に特性を持つ。この共役体の溶液は希釈緩衝剤（１５０mMのNaClと０．１％のトゥイーン２０、及び０．５％のゼラチンを含む、pH７．８の５０mMトリHCl緩衝剤）で希釈される。＊プレートを制御着剤付きのシートで蓋をし、室温で１時間培養する。＊プレートを空にし、ウェルを５回続けて洗浄する。＊アルカリ性フォスファターゼがリビーリング酵素として用いられた場合、例えば、パラ−ニトロフェニルリン酸塩等の基盤の溶剤１００μlを分配する。p NPPは１．３５ＭのNaClを含むpH９．５の０．１ＭトリHCl緩衝剤中で、１mg／ml の試薬中で準備される。プレートに接着剤付きシートで蓋をし、３７℃で培養する。約３０分後、４０５nmでそれぞれのウェルの光学濃度を見る。Ｂを反応抑制剤が存在しているときに得られる信号とし、Ｂ₀を反応抑制剤が存在していないときに得られる信号とし、また、ｂ_fをバックグラウンドノイズに対応する信号（抗体と、自由pl.GPxは存在しない）とする。反応抑制剤が弱いほど、観察される信号（Ｂ）は強くなる。Ｂ−ｂ_f／Ｂ₀−ｂ_fの自由pl.GPx濃縮度の対数関数としてのグラフは特殊抗ペプチド抗体によりプレートに結合されたpl.GPxの認識にかかる、自由pl.GPx の濃縮度の上昇の影響を視覚化することができる。また、吸収されたpl.GPxと抗体の結合を５０％抑制するのに必要なpl.GPxの濃縮度を計算することも可能になる。例６． pl.GPxに特別の免疫学的検定法例３に記述されたようにして精製された抗ペプチド抗体は、抽出−飽和、つまり「サンドイッチ」型免疫酵素の分析検査を行なうのに利用される。この分析において、−抗ペプチド抗体は、マイクロプレートのウェル（これらは「捕獲」抗体である）に吸収され、一分析対象のサンプル中に存在するpl.GPxは吸収された抗体により「免疫捕獲」され、−pl.GPxの存在は、酵素に分類される第２「トレーサー」抗体により明らかにされる。分析検査は下記の手順により行なわれる。 −トレーサー抗体として利用される抗pl.GPx抗体は、ヒトプラズマから精製された自然発生タンパク質に対して免疫を持ったウサギから収集された血清から得られる。これらの抗pl.GPx抗体は、カプロン酸更に硫酸アンモニウムを用いて二重抽出により精製さる。これらはこれより、ビオチンと分類される。 −抗ペプチド抗体（例３）は非可溶支持物に連結する。この非可溶支持物はマイクロタイタープレートウェル、ポリスチレンビーズ、又は抗体を吸収することのできる他の物質でもよい。９６ウェルマイクロプレートを例にとって説明する。プレートは２−１０μg／mlの抗体溶液２００μlで感作される。これらの抗体はpH７から９の塩水（トリス、リン酸塩、炭酸塩緩衝剤）中に存在する。培養には、３７℃で２時間、もしくは４℃で一晩かかる。感作後、プレートは洗浄され、非特殊結合サイトは砂糖の溶液又はカゼイン、ゼラチン、BSA、オバアルブミン等のタンパク溶液で満たす。この工程は３７℃で、３０分から２時間かかる。 −プレートは洗浄され、分析対象のサンプルは一つのウェル当たり１００μ lの溶液中で沈殿される。プレートは３７℃で１から２時間培養される。ウェルはこの後空にされ、洗浄緩衝剤で洗浄される。 −体積１００μlの抗pl.GPx抗体の溶液はそれぞれのウェル内で沈殿される。全て、３７℃で２時間培養される。 −プレートは再び洗浄され、その後、アルカリ性フォスファターゼに分類されたアビディンは、それぞれのウェルで沈殿される。３７℃による培養は１時間続けられる。ウェルを空にし、洗浄し、そして、１００μlのpNPP液を加える前に、空にする。 −それぞれのウェルに入れられた溶液の光学濃度は４０５nmで、９６ウェルマイクロタイタープレートリーダーで測定される。体積５０μlの停止溶液（１Ｍ苛性ソーダ）は、最も高い光学濃度が２から２．５ユニットに達したときに加えられる。つまり、３７℃の培養を２０から３０分続けた後である。次に示す表は、pl.GPx濃縮度の対数関数として測定されたO.D.をプロットすることにより、標準曲線を確立させることができる。分析対象の生体サンプルは、同様の方法で測定され、標準曲線に関連づけて評価される。もし、分光マイクロプレートリーダーが計算に適したソフトウエアを含むのであれば、直接後者により表現することができる。例７．上記例で展開した方法は、分解された血液または組織サンプルにおけるpl.GPx を分析検査するための使用可能状態のキットの開発の基本的な役割をになっていた。このキットは、下記の全ての構成を持つ。１− ９６ウェルの精製された抗ペプチド抗体によって感作された免疫タイタープレート。これは、分割可能なプレート（８、１６、２４、又は４８ウェルのストライプ）でも分割不可能なプレートでもよい。どの場合でも、ストライプ又はプレートは、保存のために乾燥剤と共に発砲剤で梱包されている。２− サンプルを希釈するための溶剤：約０．１％から１％の濃縮度のタンパク質（カゼイン、ＢＳＡ、オバアルブミンなど）を含む緩衝された溶剤（トリス、リン酸塩）、イオン化又は非イオン化界面活性剤、及び保存剤（アジ化ナトリウム、メルチオレート）。３− フリーズドライされた標準物質：これはヒトプラズマから精製されたpl.G Pxで、フリーズドライされたものである。４− 濃縮洗浄緩衝剤：NaClを含む緩衝された溶液（トリス、リン酸塩）、上記のような界面活性剤、及び保存剤。５− 分類されたトレーサー抗体溶液：これは精製されたヒトpl.GPxを用いて動物に免疫を付けることにより得られた、抗ヒトpl.GPxモノクロナル又はポリクロナル抗体であってもよい。これらの抗体はビオチンに分類されるか、リビーリング酵素（アルカリ性フォスファターゼ、つまり、PAL、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、つまり、HRP）と結合される。これらの抗体はトリスもしくはリン酸塩緩衝剤、NaCl（１５０mM）、０．１から１％の過負荷タンパク（BSA，OVA ，カゼイン）、グリセロール、保存剤の混合物の溶液中に存在する。６− リビーリング酵素と結合されたアビディンの溶液：この溶液はトレーサー抗体がビオチン化されたときに限り存在する。エーテルアビデイン又はストレプトアビジンを使用してもよい。このタンパク質はPAL又はHRPと結合することもある。それは過負荷タンパク（BSA，OVA，カセイン）と、リビーリングの種類として受け入れられた保存剤（ペルオキシダーゼのために使用できないアジ化ナトリウム）と共に、塩水（トリス、リン酸塩）中に存在する。７− リビーリング基質：アルカリ性フォスファターゼの場合pNPP、また、ペルオキシダーゼの場合オルト−フェニレンジアミン（OPD）。８− 基質希釈緩衝剤：＊アルカリ性フォスファターゼの場合、塩化マグネシウムと保存剤（アジ化ナトリウム又はメルチオレート）を含む、pH９．５の基本緩衝剤（トリス、エタノールアミン）＊ペルオキシダーゼの場合、過酸化水素水（約０．０１２％）と、保存剤（メチオレート）を含む酸性緩衝剤（例えば、ｐＨ５．５のクエン酸塩）９−停止溶液＊アルカリ性フォスファターゼの場合、０．１Ｍのエチレンジアシンテトラアセタト（EDTA）のような金属キレート化剤を含む１Ｍの苛性ソーダ溶液＊ペルオキシダーゼを用いてリビーリングする場合、１Ｍの硫酸溶液。テストの実施は、下記の手順によって行なわれる。 −凝固剤を使わずに、試験管に静脈血を集める。血清を取り除く前に、最低２時間、血液をそのままにしておく。２０００xgで１０分遠心分離にかけ、血清を取り除く。血清のサンプルは４℃で２４時間安定している。それ以上は、サンプルを−２０℃、できれば−８０℃で冷凍するのがよい。 −希釈：血清のサンプルはサンプル希釈用の溶液中で希釈しなければならない。希釈値は、１：４０から１：８０の間で十分である。 −例６で説明された手順を繰り返す。このテストの感度は、非常に優れたものである。同日に同じプレートで行なわれた、３６のブランク（サンプル希釈剤）の同時測定から判断された検出限界は１０ng／ml以下であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マレットパトリシアフランス国サンモール 94100 アブニューガブリエール，１

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト−プラズマ−グルタチオン−ペルオキシターゼ（pl.GPx）のアミノ酸配列の残基Glu108からLys120の配列に対応する合成オリゴペプチド。２．実験動物を使用した抗体製造を目的とする、免疫原性のある共役根の準備をするための、請求項１にかかるオリゴペプチド及びその変位体の使用法。３．前記免疫原性のある共役根は、請求項１のオリゴペプチド配列及びその変位体配列に示されるハプテンにより構成され、該ハプテンには更にアミノ酸、特にチロシン、が一般的にそのN末端又はC末端にグラフトされ、その配列と、キャリアタンパクとポリペプチド構造を結合させるために利用される二機能性の反応体をカップリングさせる働きをすることを特徴とする請求項２にかかる使用法。４．前記キャリアタンパクはオバアルブミン、ウシ血清アルブミン、パテレ（ patelle）のヘモシアニン、又はKLHのグループから選択されることを特徴とする請求項３にかかる使用法。５．前記オリゴペプチド又はその変位体は、ウシ血清アルブミンとカップリングされることを特徴とする請求項３又は４にかかる使用法。６．前記オリゴペプチド又はその変位体は、Ｎ末端又はC末端にチロシンで構成されるアミノ酸をさらに含むことを特徴とする上記いづれかの請求項にかかる使用法。７．請求項２から６のいづれかの使用法により準備された免疫原性のある共役根により製造された抗体。８．請求項７にかかる抗体であって、前記抗体は請求項１にかかるオリゴペプチドをグラフトされたゲル上で、親和力クロマトグラフ法により精製され、特に自然発生した、他のグルタチオンペルオキシダーゼを除くpl.GPxを認識することを特徴とする請求項７にかかる抗体。９． pl.GPxを分析検査する方法であって、請求項７又は８に記載の抗体を支持体にバインドし、分析検査の対象である生体物質のサンプル中のpl.GPxの抗体により免疫捕獲し、分類された非自然pl.GHx抗体によって捕獲されたpl.GHxをリビールすることを特徴とする分析検査方法。１０．請求項９にかかる方法を実施するための使用可能状態のセットであって、ウェルが請求項７又は８に記載の抗体で覆われた、マイクロタイタープレートと、希釈溶液と洗浄緩衝剤と、フリーズドライされたpl.GPx標準体と、分類された抗pl.GPxリビーリング抗体の溶液と、抗体分類をリビーリングするための基質とを有することを特徴とするセット。