JPH0720437B2

JPH0720437B2 - モノクロナ−ル抗体

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Publication number: JPH0720437B2
Application number: JP61070649A
Authority: JP
Inventors: ツオイテンイエスパー; ペレンテアンネテ; クルゼビゴ
Original assignee: Dako AS
Current assignee: Dako Denmark ApS
Priority date: 1985-03-29
Filing date: 1986-03-28
Publication date: 1995-03-08
Anticipated expiration: 2010-03-08
Also published as: EP0201187A1; ATE72052T1; AU5532186A; DK129986A; ES553472A0; ES8800351A1; PT82296A; FI861358A; FI89379B; DE3683532D1; DK159826C; DK159826B; GR860833B; DK129986D0; PT82296B; EP0201187B1; DK145385D0; JPS61280571A; AU584688B2; FI861358A0

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の分野〕本発明は、糖化（glycated）（グリコシル化）ヘモグロ
ビンに対し発生するモノクロナール抗体およびこのモノ
クロナール抗体をヘモグロビンの糖化（グリコシル化）
の程度を調べるために使用することに関する。

〔発明の背景〕

糖化（グリコシル化）ヘモグロビンは、糖尿病患者にお
いて長鎖血液グルコース調整の有意義な指標として受容
されてきたものである。したがって本明細書で使用され
る“糖化ヘモグロビン”とは、グルコースとヘモグロビ
ンのアミノ基の間の非酵素反応により生じる多分アルジ
ミン“”シッフ塩基）型のより不安定なヘモグロビン−
グルコース付加物と比較して、比較的安定なヘモグロビ
ンとグルコース（および場合によりグルコースリン酸）
との縮合物に関する。後者はアマドリ転移〔たとえば、
エム・ロス（M.Roth）:clin.chem.29（1983）1991〕に
より、より安定な（先きに“グリコシル化”と付けた）
型へ転化するものと信じられる。

糖化ヘモグロビンＡ成分は、ヘモグロビンＡを電気泳動
および陽イオン交換クロマトグラフィにかけたとき最初
に識別される。これらのより陰性帯電のためおよび主成
分ヘモグロビンＡ（HbA₀）よりも陽極へのより高い電気
泳動移動速度のために、これは“速い”ヘモグロビン
（HbA₁）と名付けられている。速いヘモグロビンは一連
の少量ヘモグロビンからなり、このうちなかでもHb
A_1a，HbA_1bおよびHbA_1cがそれぞれの移動速度の差異に
したがって同定される。これらのうちHbA_1cは正常人お
よび糖尿病患者双方の赤血球中に最も多量に存在する。
HbA_1cはヘモグロビンＡのβ−鎖のＮ末端バリンで糖化
されるものとして知られている。しかしながら最近の研
究では、糖化はリシン側鎖のアミノ基でも生じ、HbA₀お
よびHbA_1cを含むすべてのヘモグロビンがこのような糖
化部位を含むということが示されている。HbA_1cの不安
定な（アルジミン）前駆体（一般に“プレーHbA_1c”と
呼ばれている）はHbA_1cの上記定義には包含されない。

今では、血液検体中のHbA_1cレベルが個々の血糖調整の
良き指標であることが一般に知られている。正常な成人
はHbA₀として総ヘモグロビンＡの約90％とHbA_1cとして
３−６％を有し、残りはHbA_1aとHbA_1bを含む他の少量ヘ
モグロビンからなる。しかしながら、１型（幼児）およ
び２型（成人）糖尿病患者におけるHbA_1cのレベルは約
６％〜約15％の範囲である。糖尿病患者におけるHbA_1c
レベルの定量は、この測定により先きの２−４ケ月間の
血糖の時間平均値を表わすという点で、糖尿病調整の妥
当性を評価する有効な手段とみなされる〔たとえば、ジ
ェイ．エス．シュワルツら（J.S.Schwartz et.al）:ann
als of Intern.Med.101（1984）710−713〕。

理想的なHbA_1c測定の実験室的手法は、特異的（たとえ
ばプレーHbA_1cの存在により影響されない）で、正確、
精密で、容易に規格化され、安価で滑らかであるべきで
ある。不幸なことに、たとえば陽イオン交換クロマトグ
ラフィ、高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）、アフィ
ニティクロマトグラフィまたは電気泳動（等電点電気泳
動）のような最近使用できうる方法は、これらの特徴の
すべてを同時に満たすものではない。これらの方法の一
般的見地および糖尿病調整のために試みられた実行につ
いてはジエイ．エス．シュワルツら、supra.を参照せ
よ。

免疫学的方法に基づく糖化ヘモグロビンの直接測定は先
行技術において提案されている。この点に関して、なか
でも英国特許第1,580,318号および米国特許第4,478,744
号が参考になる。前者において提案された方法は免疫化
のために比較的多量のヒトHbA_1cを必要とし、後者は抗
原の調製のために実験室的に合成されたペプチドを使用
する。いずれの場合にも免疫検定法は動物抗血清または
いわゆる多クローン性抗体を含むその分画を用いて行な
われる。このような多クローン性抗体は再現性のある方
法で調製するのが難しく、非常に類似したヘモグロビン
の高度に複合化した混合物において十分特異的にHbA_1c
を検定するものとは一般的にみなされていない。

本発明の目的は、ヘモグロビンＡの糖化の程度を実験室
的に測定するためのこれまで公知の方法の欠点を克服す
ることである。本発明は、適当な免疫化、スクリーニン
グおよび選別手段を用いてヘモグロビンの糖化アミノ基
含有エピトープ、とえばヘモグロビンＡのβ−鎖のＮ末
端バリンのものと特異的に結合するモノクローナル抗体
を産生し、担当する非一糖化部位とわずかに結合するか
またはほとんど結合しないという驚くべき知見に基づく
ものである。

特に、Ｘ−線結晶学研究に基づくヘモグロビン分子のモ
デルが、これら残基、特に少なくとも非糖化部位におけ
るこれら残基が分子の中心キャビティに埋もれしたがっ
て免疫がグロブリン抗体のような大きな分子を受け入れ
ることは難しいという点から、HbA_1cβ鎖の糖化Ｎ末端
バリン残基を識別する抗体の発生は驚くべきことに達成
される。このキャビティはいわゆる2,3−ジホスホグリ
セレート（DPG）−ポケットが含まれ、この中にはより
小さいDPG分子がデオキシヘモグロビンの２つのβ鎖の
Ｎ−末端部の間で捕集される。β鎖がオキシヘモグロビ
ンにおいてより接近するようになると、DPG分子はこれ
が結合しているポケットから押し出される。説明につい
ては、アール・イー・ディカーソン（R.E.Dickerson）
とアイ・ゲイス（I.Geis），“Hemoglobin:Structure,F
unction,Evolution,and Pothology"P.40（The Benjamin
/Cummings Pub.Co.,1983）を参照せよ。

〔発明の構成〕

本発明は、齧歯目動物、特にネズミ科動物の系統のもの
であって、ほぼ特異的に、ヘモグロビンＡβ鎖のＮ末端
バリン残基の糖化アミノ基を含むエピトープであるヒト
ヘモグロビンのエピトープと結合するモノクローナル抗
体を提供するものである。

本発明はまた、HbAとの結合に優先してHbA_1cとの結合を
示す齧歯目動物、特にネズミ科動物系統のモノクローナ
ル抗体を提供するものである。本発明の好ましい実施態
様によれば、モノクローナル抗体は検出可能に標識化さ
れた、たとえばビオチニル化形である。

本発明の他の点によれば、糖化ヒトヘモグロビンの検出
のための診断助剤として使用されるモノクローナル抗体
を調製する方法を提供するものである。この方法は、ヘ
モグロビンβ鎖のＮ末端バリン残基の糖化アミノ基から
なるエピトープに優先的に結合する抗体を産生しうるハ
イブリドーマ細胞系を適当な増殖培地で培養することか
らなる。このような抗体を調製する方法は次の段階から
なる：ａ）齧歯目動物、好ましくはネズミをHbA_1cで免疫化
し、ｂ）抗体産生細胞をこれらをミエローマ細胞と融合する
ことにより不滅化してハイブリドーマ細胞を産生させ、ｃ）HbA₀との結合に比較して優先的にHbA_1cとの結合を
示す抗体を産生するハイブリドーマ細胞を優先的に篩い
別けることにより選択し、ｄ）このように選択されたハイブリドーマ細胞を、適当
な組織培養培地でインビトロにてまた組織適合性液中で
インビボにて培養し、続いて前記培地をハイブリドーマ
細胞から分離し、場合によりここで発生したモノクロー
ナル抗体を精製する。

本発明のさらに別の観点によればHbA_1cと優先的に結合
するモノクローナル抗体を産生しうるハイブリドーマ細
胞系を提供するものである。

さらに、上記のモノクロナール抗体、好ましくは検出可
能に標識化された形のモノクロナール抗体を用いた、ヒ
トヘモグロビン供給源におけるHbA_1c測定器具一式なら
びに診断方法を提供するものである。

本発明をさらに詳しく図面を用いて説明する。

第１図は、それぞれ精製したHbA_1cとほとんど非糖化のH
bA₀（後に定義する）と結合するための96個の凹所を有
する10枚の微量滴定板すべてからのハイブリドーマ上清
の第一スクリーニングの結果を示す。ハイブリドーマ
は、２匹のRBF/Dnネズミからの脾細胞をFOX−NYミエロ
ーマ細胞と融合することにより得られる。ハイブリドー
マHEM13F1およびHEM13F2からの抗体ならびに非特異的ハ
イブリドーマHEM13F9からの抗体と、HbA_1cとの結合（斜
線部分）およびHbA₀との結合（黒色部分）をそれぞれ示
す。

第２図は２つのハイブリドーマ細胞系HEM13F1HEM13F2か
ら得られる抗体と、それぞれ免疫化抗原HbA_1cおよびほ
とんど非糖化のHbA₀との結合を示す。

第３図はHEM13F1からの抗体と糖尿病患者からの溶血素
の免疫化分画との結合（破線）を示す。ヘモグロビンの
分別を陽イオン交換HPLCで行なう（実線）。

第４図は、抗体HEM13F1とHbA_1cとの結合の阻止に関する
研究を示す。HbA_1cのβ鎖のＮ末端配列に相当する合成
の糖化ヘプタペプチド、その相当する還元誘導体および
非糖化型のヘプタペプチドを試験する。

本発明の目的のために十分に選択的に特異性を有するモ
ノクローナル抗体を選択することは、ほとんど非糖化部
分を含まない選択される糖化ヒトヘモグロビンならびに
ほとんど糖化汚染物質を含まない後者化合物の両方が入
手可能なことにより容易である。β鎖のＮ末端バリンが
糖化されさらに糖化リシン残基を含んでもよいヒトHbA
_1cは、たとえば陽イオン交換クロマトグラフィまたはHP
LCのような常法にしたがって精製される。精製HbA₀（す
なわち、糖化Ｎ末端バリン残基をほとんど含まないヘモ
グロビンＡ）はまたこのような方法でも得られうる。所
望により、糖化リシン残基を含む成分によるHbA₀の汚染
を、たとえばアール・シャピロら（R.Shapiro et a
l.）、（J.Biol.Chem.255（1980）3120-3127）が記載し
ているように硼酸塩の存在下に赤血球の溶血物を陰イオ
ン交換クロマトグラフィにかけることにより最低に減ら
すことができる。これ以後、このような精製HbA₀を、ほ
とんど非糖化のHbA₀として呼ぶ。

HbA_1cに対する抗体は齧歯目動物特にネズミにおいて生
じ、これからの抗体産生細胞たとえば脾細胞を適当なミ
エローマ細胞と融合することにより免疫化してハイブリ
ドーマ細胞を産生する。通常数日間培養したハイブリド
ーマ細胞の培養物からの上清を、たとえば酸素連結イム
ノソルベントアッセイ（ELISA）を用いて、免疫化抗原
（HbA_1c）との陽性結合を示し非糖化HbA₀とはほとんど
結合を示さない抗体についてスクリーニングする。

第一のスクリーニング法微量滴定板に、Bio-Rex70〔エイチ．エフ．ブンら
（H.F.Bunn et al.）:J.Clin.Invest.57（1976）1652−
1659〕でのクロマトグラフィにより調製されたHbA_1cま
たはほとんど非糖化のHbA₀を吸着させることにより塗布
する。使用したELISAは、エー．ボラー（A-Voller）と
イー．デサビグニィ（E.desavigny）（アール・エー・
トンプソンR.A.Thompson:Techniques in Clinical Immu
nology,第２版（1981）157-169:ブラックウェルサイ
エンティフィクパブリケーションズ、ボストン、マサ
チューセッツ）により記載された方法の変形である。微
量滴定板（イムノプレート１、ヌンクNUNC、ロスキル
デ、デンマーク）に、HbA_1c（５μg/ml）とHbA₀（５μg
/ml）のリン酸塩衝化食塩水（PBS:NaHPO₄・H₂O:8.63g;N
a₂HPO₄・12H₂O:67.0g;NaCl211.9g;水で5lに希釈）溶液
を凹所１個当たり50μｌ塗布し、一晩４℃でインキュベ
ートする。このプレートを空らにし、ウシ血清アルブミ
ン（BSA）２％W/V含有PBSで、20℃にて１時間凹所１個
当り200μｌでブロックし、続いてPBS−トゥイーン−20
（PBS中0.05％V/Vトゥイーン−20）で３回洗う。ハイブ
リドーマ培養物からの希釈してない上清（凹所１個当り
50μｌ）を20℃にて１時間施こし、続いて上述するよう
にプレートを洗う。塗布に使用する抗原に対する抗体活
性を、0.5％W/V BSA含有PBSで1:1000に希釈したセイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗−マウス免疫グ
ロブリン（ダコパッツ社Dakopatts A/S、デンマーク）1
00μg/凹所とともに20℃で１時間培養し、さらに３回0.
1Mクエン酸−リン酸緩衝液pH5.0で洗浄し、次いで上述
のようにＯ−フェニレンジアミン（OPD）基質（Ｏ−フ
ェニレンジアミン、2Hcl:8mg;クエン酸−リン酸緩衝液:
15ml;H₂O₂（30％V/V）:5μｌ）で培養することにより比
色測定する。さらに１MH₂SO₄150μｌを加えることによ
り３分後に反応を停止し、492nmでの吸光率を二重ビー
ムコントロン（KONTRON）SLT-210フォトメーター（コン
トロンKontron、チューリッヒ、スイス）で読み、参考
として620nmでも読む。

抗体希釈実験これらの研究のために、上述のようにELISAを行なう
が、ただし容量を増やし、たとえば選択したハイブリド
ーマ細胞からの上清をPBS-BSAで希釈して全容量100μｌ
にして開始する。

10枚のプレートの最初のスクリーニングから得られる結
果を第１図に示す。上清のほとんどの数（320）、たと
えばハイブリドーマHEM13F9からのものは実質的に非糖
化のHbA₀と反応するが、一方２凹所の細胞によって産生
する抗体のみ（１つの抗体はHEM13F1と称し他の１つはH
EM13F2と称する）がHbA_1cと選択的に反応する。

第２図から明らかなように、ハイブリドーマHEM13F1とH
EM13F2から得られる上清を用いたそれぞれHbA_1c黒丸）
とHbA₀（白丸）の精製調製物に対する結合に関する希釈
実験は、抗体HEM13F1（IgG₁）がHbA_1cに対し最も特異的
であることを示す。

他の抗体、HEM13F2は、これもまたIgG₁抗体であるが、H
BA₀と比較してHbA_1cに対し同程度の特異性を示さない
が、しかしそれでもHbA_1cの選択的結合を示す。

２つのハイブリドーマの両方とも通常の方法で希釈条件
を限定しながら再クローニングすることにより安定化
し、これ以上抗体を産生しない種々の細胞の培養物の過
剰増殖を避け、これにより各ハイブリドーマのそれぞれ
の抗体のさらにこれ以上の産生を容易にする。ここで使
用する“再クローン”とは、このような条件下でクロー
ニングすることによりハイブリドーマ母細胞から誘導さ
れるハイブリドーマ細胞系に関する。

HEM13F1の安定な再クローン（HEM13F1A4と称す）は、ヨ
ーロピアンコレクションオブアニマルセルカ
ルチュアーズ（European Collection of Animal Cell C
ultures;ECACC），ピーエイチエルエスセンターフォ
アアプライドミクロバイオロジィアイドリサー
チ（PHLS Centre for Applied Microbiology and Resea
rch），ポートンダウン、サリスバリー，ウイルトシャ
ーSP4 OJG,UKにて、下記に示す日付にて特許手続の目
的で寄託された。ECACCは1977年のブダペスト条約によ
り権限を与えられた国際寄託機関であり、条約第９条に
したがって寄託物の保存を提供するものである。

抗体HEM13F1のHbA_1cへの特異的結合をさらに第３図にお
いて説明する。ヘモグロビンを陽イオン交換HPLCを用い
てその成分へ分割する。集めたフラクションを、ELISA
にて抗体HEM13F1を結合しうる抗原（固定相）の量につ
いて試験する。このようにして得られた結合曲線はHPLC
クロマトグラムのHbA_1cピークと一致し、一方、他のヘ
モグロビンＡ成分のいずれにも結合能力はほとんどみら
れなかった。

第４図に示された阻害研究は、抗体HEM13F1により識別
されるエピトープがHbA_1cβ鎖の糖化Ｎ末端配列からな
るという説得力のある証拠を提供する。データにより、
合成糖化Ｎ−末端ヘプタペプチドが固定化HbA_1cに対す
る抗体HEM13F1の結合を阻害する一方、相当する還元誘
導体および非糖化ヘプタペプチドのそれぞれについて弱
い阻害を示すかまたは何らの阻害をも示さないことがわ
かる。

糖化ヘモグロビンに対する分析を、ヘモグロビン供給源
たとえば溶血した赤血球で行なうことができる。測定は
イムノアッセイたとえば競合型または免疫計測型アッセ
イで行なうことができる。後者の型の例は、ラジオイム
ノメトリックアッセイ（IRMA）および酵素連結イムノソ
ルベントアッセイ（ELISA）である。競合型アッセイに
おいて、抗原（すなわち糖化ヘモグロビン）は検出可能
な標識物で標識化される。抗原含有検体を糖化ヘモグロ
ビン特異性抗体および標識化抗原とともに培養し、そし
て免疫複合体形成、分離および検出後に、検体における
糖化ヘモグロビンのレベルを測定する。

免疫計測型アッセイを行なう好ましい一つの態様におい
て、抗原（検定すべき検体のものを含む）を固相、たと
えば微量滴定板凹所の表面上で不溶化する。抗体たとえ
ば抗体HEM13F1または抗体の抗原結合分画を検出可能に
標識化する。検体と標識化抗体との培養により不溶化さ
れた抗原−抗体複合体となり、ここで非結合抗体分離後
標識物の量は抗原の量に比例する。

他の免疫計測（サイドイッチ型）アッセイにおいて、１
つの抗体結合抗体を検出可能に標識化する。同じ抗原を
結合する他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化お
よび固定化抗体を培養するとサンドイッチ型が導びか
れ、ここで非結合抗体を分離後、標識物の量は抗原の量
と比例する。免疫計測アッセイは、不溶化および／また
は標識化抗体の添加順序にしたがって、先行、後行また
は同時法で行なわれる。

他の工程たとえば洗浄、攪拌、振とう、濾過または抗原
の予備検定抽出等は、特定の状況に対し望ましいかまた
は必要でなるかもしれないので、勿論、検定に含まれ
る。

特定の濃度、温度および培養時間、ならびに他の検定条
件は、試料中の抗原濃度、試料の性質等のような要素に
したがって変化しうる。当業者は、通常の実験法を用い
ながら各測定に対し有効な最適検定条件を測定すること
ができる。たとえばイムノアッセイは４〜37℃で行なわ
れ、各培養工程は72時間ほどの長さである。

抗原または抗体が結合することができ、本発明で使用す
ることができる多くの担体がある。良く知られている担
体は、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエ
チレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然お
よび変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース
およびマグネタイトである。担体の性質は本発明の目的
に対しある程度可溶性であるかまたは不溶性である。当
業者は結合のための他の多くの適当な担体を知っている
であろうし、または一般的実験法を用いてこのようなも
のを確認することであろう。

本発明検定の特定の実施態様にしたがって、抗体または
その抗原結合分画は検出可能な標識物たとえば酵素、放
射性アイソトープ、螢光化合物または金属、化学ミネッ
センス化合物、または生物ルミネッセンス化合物と結合
してもよい。さらに、これら標識物の所望分子との結合
は当業者にとって一般的な標準技術を用いて行なうこと
ができる。

抗体を検出可能に標識化しうる方法の１つは、酵素への
連結である。この酵素は、順次、後ちにその基質へ照射
したとき、基質と反応して、たとえばスペクトル光度測
定手段または螢光測定手段（ELISA方式）により検出さ
れうる化学的部分を作るであろう。検出可能な標識物と
して使用される酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌク
レアーゼ、△−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アル
コールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グ
リコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌ
クレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グリコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリコアミラーゼ、および
アセチルコリンエステラーゼである。

ELISA方式において感度を向上するために、記載した手
段を、アビジン−ペルオキシダーゼ包合体と反応するビ
オチニル化抗体を用いて変形してもよい。

放射性アイソトープで抗体を標識化することにより抗原
の量を測定することもできる。次いで放射性アイソトー
プの存在を、ガンマカウンターまたはシンチレーション
カウンターを用いるというような手段で測定する。特に
有効なアイソトープは、³H、¹²⁵I、¹²³I、³²P、³⁵S、¹⁴
C、⁵¹Cr、³⁶Cl、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、¹¹¹In、^99mT
c、⁶⁷Gaおよび⁹⁰Yである。

抗原の測定は、また螢光化合物で抗体を標識化すること
によっても可能である。螢光標識化分子に適正な波長の
光を照射すると、その存在が染料の螢光のために検出さ
れうる。最も重要な螢光標識化化合物には、フルオレッ
セインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリス
リン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、Ｏ−フタ
アルデヒドおよびフルオレスカミンがある。

螢光を発する金属原子たとえばEu（ヨーロピウム）およ
び他のランタニドを使用することもできる。これらは金
属キレート化群たとえばDTPAまたはEDTAを用いて所望分
子と接続することができる。

抗体を検出可能に標識化しうる他の方法は、これを化学
ルミネッセンス化合物と結合することである。化学ルミ
ネッセンスを付けた免疫グロブリンの存在は、一連の化
学反応の間に生ずるルミネッセンスの存在を検出するこ
とにより測定される。特に有効な化学ルミネッセンス標
識化合物の例はルミノール、イソルミノール、芳香族ア
クリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム
塩およびシュウ酸エステルである。

同様に生物リミネッセンス化合物もまた標識物として使
用されうる。生物ルミネッセンスは生態形で見られる化
学ルミネッセンスの特別の型で、触媒タンパク質が化学
ルミネッセンス反応の効率を増加する。生物ルミネッセ
ンス分子の存在は、ルミネッセンスの存在を検出するこ
とにより測定される。標識化の目的で重要な生物ルミネ
ッセンス化合物は、ルミフェリン、ルシフェラーゼおよ
びエクォリンである。

本発明の検定に用いられる物質は器具一式の調製に理想
的である。このような器具一式は、内部に２個以上の容
器手段たとえばバイアルびん、試験管等を密閉して保持
しうるように区画化した運搬手段からなり、前記容器手
段の各々はあらゆる所望の方法に使用されるために別々
に分かれた要素の１つからなる。

たとえば、免疫計測アッセイに有効な前記容器手段の第
一は、可溶性で検出可能に標識化されたモノクローナル
抗体HEM13F1の凍結乾燥物または溶液状のものである。
これに加え、運搬手段はまた、少なくとも、予め測定さ
れた濃度のHbA_1cを有するヘモグロビンを含む第二の容
器手段と、好ましくは、第二の容器手段のHbA_1c濃度と
は異なる予め測定された濃度のHbA_1cを有するヘモグロ
ビンを含む第三の容器手段を備えてもよい。次いでこれ
ら後者の容器を用いて標準曲線を作り、これへ未知量の
HbA_1cを含む検体から得られる結果を挿入することがで
きる。他の容器は標識化抗体の量を測定するために必要
な試薬およびたとえば緩衝液のような補助手段である。

本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが、しか
しながらこれにより本発明の範囲が不当に制限されるも
のではない。

〔実施例〕

例A:HbA_1cの精製糖尿病患者からの洗浄赤血球の溶血物をバイオーレック
ス（Bio-Rex）70（バイオーラド社、リッチモンド、カ
リフォルニア、米国）のカラム中で陽イオンクロマトグ
ラフィを行なうことにより、抗原HbA_1cを精製する。こ
の方法はほとんどエッチ．エフ．ブンら（J.Clin.Inves
t.57（1976）1652-1659）により記載された方法であ
る。希釈実験のためにまた後に与えられる例において、
ハイブリドーマ細胞培養物の第一のスクリーニングに用
いられるHbA_1cの供給源は、クロマトグラムのHbA_1cピー
クを表わす分画のプールである。

例B:ほとんど非糖化のヘモグロビンA₀の調製ほとんど非糖化のヘモグロビンA₀は、次に記載するアー
ル・シャピロら（R.Shapiro et al.）（前出）の方法の
変形により、ホウ酸緩衝液中で陰イオン交換クロマトグ
ラフィにより精製する。

DEAEセファロースCL−6B（ファルマシア社）の2.5×4
6cmカラムを、４℃で溶離液Ｉ（5mM/lK₂B₄O₇;pH9.15）
で平衡化する。糖尿病患者からの赤血球のプールを等張
性食塩水で３回洗い、水３容量で溶血させ、遠心分離に
より膜を除く。溶血物（23ml）を溶離液I230mlと水230m
lで希釈し、1NKOHでpHを9.2に調整し、カラムへ流速80m
l/hで施こす。希釈された溶血物に続いて溶離液I115ml
を施こす。ヘモグロビンを、５（溶離液I;500ml）から5
0mM/lK₂B₄O₇（溶離液IIpH9.15;500ml）の勾配物とこれ
に続く溶離液II1000mlで溶出する。

３つのヘモグロビンピークが540nmで検出される。第二
のピークが最も大きく、最大伝導度の約75％で溶出し、
HbA₀として同定される。このピークの前半部分はほとん
ど非糖化のHbA₀からなり、すなわちフロシン法〔イー・
シュライヒャー（E.Schl-eicher）とオー・エッチ・ウ
ィーランド（O.H.Wie-land）;J.Clin.Chem.Clin.Bioche
m.19（1981）81−87〕により測定されるように糖化リシ
ン残基を含まず、HbA_1cを含まない。非糖化HbA₀は透析
してホウ酸塩を除き、pH7.4にてグルコン酸クロルヘキ
シジン0.002％を有する40mM/lリン酸緩衝液中にて４℃
で貯蔵する。

ほとんど非糖化のHbA₀は、ハイブリドーマ細胞培養液の
第一のスクリーニング（第１図）にて試薬の１つとして
および抗体希釈実験（第２図）のために使用される。

例1:免疫化および融合実験 RB（8.12）5Bnrローバートソニアル（Robertsonian）転座染色体を含むRBF/Dn種マウス〔ザジャクソンラ
ボラトリィ（the Jackson Laboratory）社、バーハーバ
ー、メイン、米国から入手〕を、精製HbA_1cで２週間お
きに３回免疫化する。HbA_1c（マウス一匹当りPBS100μ
ｌ中20μｇ）を不完全フロイントアジュバント中で1:1
に乳化し、200μｌを皮下（S.C.）投与する。最後の皮
下投与後20日目に100μlPBS中のHbA_1c20μｇで静脈内
（i.V.）投与してマウスを強化する。さらに３日後にマ
ウスの殺し脾臓を除去してミエローマ細胞と融合する。

２匹のRBF/Dnマウスからの脾細胞（8.5×10⁷細胞）を、
選択可能な酵素マーカー遺伝子座アデノシンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ（APRT^-）とヒポキサンチンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT^-）に欠失のあ
るFOX-NYミエローマ系の1.5×10⁷細胞と融合する。細胞
融合混合物をAPRT活性（APRT⁺選択）を必要とする培地
へ放すと、非融合のAPRT^-ミエローマとAPRT⁺ハイブリド
ーマの両方が排除される〔アール・ティ・タッガート
（R.T.Taggart）と〔アイ・エム・サムロフ（I.M.Samlo
ff）;Sci-ence219（1983）1228-1230〕。融合細胞を、
アデニン（7.5×10^-5M）、ヒポキサンチン（８×10
⁴M）、アミノプテリン（８×10^-7M）およびチミジン
（1.6×10⁵M）（AHAT）が供給された15％V/Vウシ胎児血
清（ジブコ社）を含むRPMI−1640からなる培地中で、全
部で10枚96凹所の微量滴定板（ヌンク社、ロスキルデ、
デンマーク）にてBalb/C-株マウスヌクロファージ供給
層に播種する。

培養物を37℃で12日間５％CO₂含有空気中でインキュベ
ーションし、続いて第一のスクリーニングを行なう。

例2:HbA_1cに特異的なモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマ細胞の単離ハイブリドーマHEM13F1とHEM13F2（第１図参照）を、さ
らに、アデニン、アミノプテリンおよびチミジン（AA
T）を含む15％V/Vウシ胎児血清含有RPMI−1640培地とこ
れら供給物を含まない同種培地中で希釈を限定すること
によりクローンする。両方の場合とも、得られたクロー
ンすべてにより産生する抗体はELISAスクリーニングア
ッセイでHbA_1cと選択的に結合する。これらクローニン
グ実験から再クローンされた安定なハイブリドーマHEM1
3F1とHEM13F2が得られる。これらの再クローンハイブリ
ドーマにより産生する抗体は同一であり、それゆえそれ
ぞれの非クローン親細胞HEM13F1とHEM13F2により産生さ
れるものと比較してHbA_1cに対し同じ選択的結合特異性
を示す。抗体は両方ともネズミIgG₁として定義される。

HEM13F1の再クローン、HEM13F₁A₄は、さらに別の研究用
の抗体を製造するために選択される。産生した抗体は、
クラスおよびサブクラス特異的抗血清のパネルに対し微
量免疫拡散法を用いて特性が決定される。この試験の前
に、ハイブリドーマ上清中の抗体をプロティンＡ−セフ
ァロース（ファルマシア社、スウェーデン）中で精製
する。抗体の結合を確実にするために、上清のpHを8.5
に調節する。溶出をクエン酸−リン酸緩衝液pH4.5で行
い、分画を0.5Mリン酸緩衝液pH7.0で中和し、限外濾過
により濃縮して１μｌ当りタンパク質約5mgにする。抗
体HEM13F1はネズミIgG₁として定義される。

例3:HPLCにより溶血物を分画して得られるHbA_1cに対す
る抗体HEM13Flの結合例Ａで記載したように調製された溶血物を、pH6.0で25m
M/lマロン酸緩衝液（溶離液Ａ）に対し４℃で透析す
る。スペクトラーフィジックス（Spectraphysics）（81
00型）からのHPLC装置を用いてモノエス（Mono S）陽
イオン交換カラム（0.5×5cm;ファルマシア社）にてヘ
モグロビン約1mg/30μｌ容量を分別する。溶出を溶離液
Ａと溶離液Ｂで作られた勾配物で行なう。溶離液Ｂは30
0mM/lLiclで供給された溶離液Ａからなる。流速は2ml/
分であり、温度は37℃である。溶出物を280nmで走査し2
mlの分画を集める。クロマトグラム（実線）を第３図に
示し、これとともに集めた分画で行なわれたELISAの結
果（破線）も図に示す。

第4:阻害研究により評価される抗体特異性阻害分析は、HbA_1cを塗布し、そして“第一のスクリー
ニング法”で記載したように遮断された微量滴定板で行
なう。阻害剤を２倍に希釈して（PBS-BSA50μｌ中に20
μｇから）加え、続いてさらに抗体HEM13F1（２μg/m
l）500μｌを加える。１時間20℃で混合物をインキュベ
ート後、すでに記載したように結合した抗体の量を測定
する。３つの化合物を阻害研究に使用する。すなわち、
米国特許第4,478,744号に記載のようなHbA_1cのβ鎖のＮ
末端部分に相当する合成の非糖化ヘプタペプチド（第４
図において上側曲線）;1−アシノ−１−デオキシフルク
トース部分がNaBH₄で還元された相当する還元ヘプタペ
プチド誘導体〔たとえば、ジェイ．ケイ．クリティス
（J.K.Curtiss）とジジェイ．エル．ウィッタム（J.L.W
itztum）:J.Clin.Invest.72（1983）1427〜1438〕（第
４図において中間曲線）および相当する非糖化ヘプタペ
プチド（第４図において下側曲線）である。阻害研究に
使用したペプチドの組成はアミノ酸分析により確認され
た。

例5:患者溶血物中の糖化ヒトヘモグロビンA_1C(HbA_1c）
に対する酵素連結イムノソルベルトアッセイ（ELISA）
糖尿病患者および非糖尿病患者からの溶血物を、赤血球
0.5mlを蒸留水3.5mlで溶解することにより調製する。各
溶血物２μｌをさらにPBS/mlで希釈する。希釈された物
質（100μｌ）を微量滴定板（エムノプレートＩ、ヌン
ク社、ロスキルデ．デンマーク）の個々の凹所へ加え、
一晩４℃でインキュベートするとヘモグロビンが表面へ
吸着する。プレートを空らにし、室温で１時間BSA（PBS
中２％W/V）で遮断し、続いてPBSで３回洗う。検定物質
を有する凹所を次いで抗体HEM13F1（精製IgG₁、PBS100
μｌ中５μg/ml）とともに１時間インキュベートし、PB
Sで３回洗い、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ダコ
パッツDakopatts.デンマーク、PBSで1:1000に希釈）と
抱合した抗マウス免疫グロブリン100μｌとともに１時
間インキュベートする。さらに３時間インキュベーショ
ン後、クエン酸ナトリウム緩衝液、pH5.0で洗い、オル
トフェニレンジアミン（OPD）基質溶液Ｏ−フェニレン
ジアミン、2Hcl:8mg;クエン酸−リン酸緩衝液:15ml;H₂O
₂（30％V/V）:5μｌ）とともに３分間培養する。

１MH₂SO₄150μｌを加えて反応を停止し、492nmで吸光度
を読む。

IEFを用いたHbA_1c％の測定結果をELISAから得られる492
nmでの吸光度と比較する（第１表）。相関係数ｒは0.85
である。

第１表：％HbA_1c（IEF）とHEM13F1を用いてELISAにより
得られた値の比較（二重測定の平均）例6:抗体HEM13F1特異性：HbA_1c対プレーHbA_1c３人の非
糖尿病者で絶食している者からエチレンジアミン四酢酸
塩（EDTA、血液1mlに対し1.5mg）を用いて血液を抜く。
血液細胞を0.9％Nacl溶液で３回遠心分離することによ
り洗う。

各試料から充てんした血液細胞200μｌを３つ取り出
す。試料の２つはそれぞれ20℃と37℃でPBS中100mMグル
コース10mlとともにインキュベートし、第三の試料は対
照物として用いる（４℃で貯蔵）。試料を16時間インキ
ュベートし、その後にCcl₄200μｌ含有H₂O1.4mlを添加
し続いて遠心分離することにより溶血する。上清（PBS
で1:5000に希釈）を抗体HEM13F1を用いてELISAにより分
析し、これと平行に前記例５で記載したのとほぼ同じよ
うに等電点電気泳動（IEF）で分析する。

ELISAからの結果（A₄₉₂として表す）をIEFからの結果
（％（プレーHbA_1c＋HbA_1c）として表わす）と比較す
る。

％（プレーHbA_1c＋HbA_1c）における増加は、主として％
プレーHbA_1cの増加に依る。ELISAにおけるA₄₉₂の値は20
0mMグルコースで血液細胞をインキュベートすることに
よっても著しく影響されない。したがって、本発明のモ
ノクローナル抗体HEM13F1は選択的にHbA_1cと結合し、そ
して場合によってはプレーHbA_1cとわずかに架橋反応を
示すということが結論される。

例7:ビオチニル化HEM13F1抗体を用いた溶血物におけるH
bA_1cに対するELISA HEM13F1のビオチニル化に用いられる方法は、ジィ・ケ
ンダールら（C.Kendall et al.）〔J.Immunological Me
thods56（1983）329−339〕により記載されたものとほ
ぼ同じである。出発物質は抗体HEM13F1（IgG₁）であ
り、上記例２で記載したように精製される。ビオチン−
Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイシド（シグマ社、セントル
イス、米国）12mgをジメチルホルムアミド（メルク社、
ダルムスタット、米国）3.5mlに溶かしてビオチニル化
剤を作る。1mg/mlのHEM13F1IgG₁溶液をpH8.5に調節した
0.1MNaHCO₃中で調製する。免疫グロブリン溶液（1ml）
とビオチニル化剤（60μｌ）の混液を攪拌しながら室温
で４時間インキュベートする。インキュベート後、調製
物を、PBS、pH7.2を３回置き換えて（それぞれ１）、
4.20および20時間に透析する。最後の置き換えは0.1％N
aN₃を含む。ビオチニル化HEM13F1免疫グロブリンは４℃
で貯蔵される。

糖尿病患者および非糖尿病患者からの溶血物を、水3.5m
l中に赤血球0.5mlを溶解しさらにpH4.0の0.1Mクエン酸
−リン酸緩衝液で約1:1000まで希釈することにより調製
する。希釈した試料（各々10μｌ）を微量滴定板（イ
ム）プレートＩ）の個々の凹所へ加え、一晩または室温
にて30分間機械的攪拌機の中でインキュベートし、表面
へヘモグロビンを吸着させる。プレートを空らにし、室
温で30分間遮断剤（0.1M PBS;0.145M Nacl;0.5％（W/
V）BSA、pH7.2）で遮断し、続いて洗浄緩衝液（0.01M P
BS;0.145M Nacl;0.05％トウィーン20）で３回洗う。
試料物質を有する凹所を次いでビオチン標識化抗体HEM1
3F1の緩衝液（0.001 MPBS;0.01M Nacl;0.5％（W/V）BS
A、pH7.2）1mlにつき約１μｇの溶液100μｌで１時間培
養し、続いて緩衝液で洗浄する。次いで凹所を、セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ（ベクターラボラトリイズ社
VECTOR Laboratories,Inc.カリフォルニア、米国により
供給）と抱合したアビジンの溶液100μｌでインキュベ
ートし、0.5M Nacl;0.5％（W/V）BSAを有する0.01M PB
S,pH7.2中で1:10,000に希釈する。凹所を洗浄緩衝液で
３回洗い、次いでOPD基質溶液（ダコパッツ社、デンマ
ーク、コード番号52000）とともに5-10分間インキュベ
ートする。1M H₂SO₄100μｌを加えて反応を停止し、492
nmでの吸光率を読む。溶血物の相同する試料をIEFによ
り二重に分析する。

吸光値は、IEFで測定されるHbA_1cの公知％を含む試料の
492nmの吸光度をプロットして得られる標準曲線を用い
て全ヘモグロビンのHbA_1cパーセントへ転化される。

全部で48名の個体においてそれぞれイムノアッセイおよ
びIEFによりHbA_1c（％）を測定して得られる結果を次の
第２表に示す。２つの分析方法の相関係数は0.92であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ハイブリドーマHEM13F1およびHEM13F2からの
抗体ならびに非特異的ハイブリドーマHEM13F9からの抗
体と、それぞれHbA_1cとHbA₀との結合を示すグラフ、第２図は抗体希釈実験によるハイブリドーマHEM13F1お
よびHEM13F2からの抗体とHbA_1cとHbA₀との結合を示すグ
ラフ、第３図はHEM13F1からの抗体と糖尿病患者からの溶血素
の免疫分画との結合状態を示すグラフ、第４図は糖化ヘプタペプチド、その還元誘導体および非
糖化型ヘプタペプチドを用いた抗体HEM13F1とHbA_1cとの
結合の阻止率に関するグラフ、を表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/20 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献特開昭54−145210（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−182367（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−172064（ＪＰ，Ａ) 米国特許4478744 クラス260（ＵＳ, Ａ) ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，39［８］（1933）Ｐ．1717−1723

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトHbAoとの結合と比較してヒトHbA_1cの
エピトープとの優先的結合を示す齧歯目系統のモノクロ
ナール抗体であって、前記エピトープがヘモグロビンＡ
β鎖のＮ末端バリンの糖化アミノ基を含んで成り、そし
て該抗体がヒトHbA_1cに対して生じたものであることを
特徴とするモノクロナール抗体。
【請求項２】ハイブリドーマ細胞系HEM13F1またはその
再クローンから得られる特許請求の範囲第１項記載のモ
ノクロナール抗体。
【請求項３】ハイブリドーマ細胞系HEM13F1の再クロー
ンが細胞系HEM13F1A₄である特許請求の範囲第２項記載
のモノクロナール抗体。
【請求項４】ハイブリドーマ細胞系HEM13F2またはその
再クローンから得られる特許請求の範囲第１項記載のモ
ノクロナール抗体。
【請求項５】検出可能に標識化された形の特許請求の範
囲第１項〜第４項のいずれか１に記載のモノクロナール
抗体。
【請求項６】ビオチニル化形の特許請求の範囲第５項記
載のモノクロナール抗体。
【請求項７】ヒトHbAoとの結合と比較してヒトHbA_1cの
エピトープとの優先的結合を示し、該エピトープがヘモ
グロビンＡβ鎖のＮ末端バリンの糖化アミノ基を含んで
成り、そして抗体がヒトHbA_1cに対して生じたものであ
るモノクロナール抗体を産生しうる齧歯目由来のハイブ
リドーマ細胞系を増殖培地で培養することを含んでな
る、モノクロナール抗体の調製方法。
【請求項８】ハイブリドーマ細胞系が細胞系HEM13F1ま
たはその再クローンである特許請求の範囲第７項記載の
方法。
【請求項９】ハイブリドーマ細胞系の再クローンがハイ
ブリドーマ細胞系HEM13F1A4である特許請求の範囲第８
項記載の方法。
【請求項１０】ハイブリドーマ細胞系が細胞系HEM13F2
またはその再クローンである特許請求の範囲第７項記載
の方法。
【請求項１１】ヘモグロビンＡをモノクロナール抗体と
接触させ、結合したモノクロナール抗体の量を測定する
ことを含んでなるHbA_1cの測定方法において、前記モノ
クロナール抗体がヒトHbA₀との結合と比較してヒトHbA
_1cのエピトープとの優先的結合を示す齧歯目系統のモノ
クロナール抗体であって、前記エピトープがヘモグロビ
ンＡβ鎖のＮ末端バリンの糖化アミノ基を含んで成り、
そして該抗体がヒトHbA_1cに対して生じたモノクロナー
ル抗体であることを特徴とする測定方法。
【請求項１２】HbA_1c及びHbA₀の混合物を含んで成る試
料中のヒトヘモグロビンを固相の表面に直接不溶化し、
該不溶化されたヘモグロビンをHbA₀に比べてヒトHbA_1c
に対して結合選択性を有するモノクロナール抗体と接触
せしめ、結合したモノクロナール抗体の量を測定し、そ
して結合したモノクロナール抗体の測定された量を試料
中の糖化ヘモグロビンの量に関連付ける、ことを含んで
成る特許請求の範囲第11項に記載の方法。
【請求項１３】２個以上の容器を内部に密閉保持するた
めに区画化された担持手段と、特許請求の範囲第２項記載のモノクロナール抗体を含有
する第一の容器と、予め測定した濃度のHbA_1cを有するヘモグロビンを含む
第二の容器と、を有するHbA_1c測定用キットであって、前記モノクロナ
ール抗体が、ヒトHbA₀との結合と比較してヒトHbA_1cの
エピトープとの優先的結合を示す齧歯目系統のモノクロ
ナール抗体であって、前記エピトープがヘモグロビンＡ
β鎖のＮ末端バリンの糖化アミノ基を含んで成り、そし
て該抗体がヒトHbA_1cに対して生じたモノクロナール抗
体であることを特徴とするキット。
【請求項１４】予め測定した濃度のHbA_1cを有するヘモ
グロビンを含有する第三の容器をさらに含み、前記第三
の容器の予め測定したHbA_1cの濃度が第二の容器の予め
測定したHbA_1c濃度と異なる特許請求の範囲第13項記載
のキット。