JPH04503006A - 血液凝固ＸＩＩａ因子βモノクローナル抗体およびイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血液凝固ＸＩ［ａ因子βモノクローナル抗体およびイムノアッセイ 本発明はイムノアッセイおよびこのアッセイ用の試薬に関する。本発明はとくに 、血液凝固ＸＩ［因子およびその活性型、ＸＩＩａ因子に関する。

ＸＩＩ因子は正常血液中に存在する不活性チモーゲンである。Ｘπ因子は、カリ クレイン、高分子量キニノーゲンおよび負電荷を帯びた表面の存在下、酵素的に 活性な二鎖型に容易に変換される。この８Ｏ−Ｋｄセリンプロテアーゼは、しば しばαＸＩ［ａ因子とも呼ばれ、５２−ＫｄのＨ鎖とこれにジスルフィド結合で 連結した２８−ＫｄのＬ鎖を有する。この因子を蛋白分解すると４Ｏ−Ｋｄのペ プチドがＨ鎖から放出され、またセリンプロテアーゼ活性は維持するがαＸＩ［ ａ因子の２８−にｄ鎖は元の５２−Ｋｄ　Ｈ鎖に由来する小ペプチドフラグメン トにジスルフィド結合している生成物、βＸＩＩａ因子を生じる。多くの場合、 この小ペプチドフラグメントは２０００−ｄの分子量を育するが、サイズの異な るフラグメント、たとえば８００−ｄおよび３０００−ｄのフラグメントも観察 されている。

ｒＸＩＩａＪと略記されるｒＸＴｉａ因子」の語は、本明細書においては、任意 の形の活性化ＸＩ［因子、すなわちセリンプロテアーゼ活性を育するＸπ因子の 任意の誘導体を意味して用いられる。これには、ＸＩ［因子から１ｎＶｉｔｒＯ で製造される任意の形のＸＩ［ａ、およびｉｎ　ｖｉｖ。

で生成し天然原料から得られる任意の形が包含される。

これにはさらに、アミノ酸配列が改変され、たとえばアミノ酸配列に１個もしく は２個以上のいわゆる「保存的」変化、すなわち分子の性質とくにその免疫学的 および酵素的性質に影響しない変化（付加、欠失または置換）が生じた天然蛋白 質の任意の類縁体が包含される。

この語は、天然のＸＩＩａ因子の任意の合成コピーおよび任意の合成類縁体を包 含し、それは化学合成によって製造されたものでも組換えＤＮＡ技術によって製 造されたものでもよい。それは任意の形のαＸＩＩａおよび任意の形のβＸＩ［ ａを包含する。「βＸＩ［ａＪおよび「βＸ１ｌａ因子、ならびに「αＸＩ［ａ Ｊおよび「αＸＩ［ａ因子Ｊの語は、本明細書においては、この種類の任意の形 の分子を意味して同様に使用される。″ ２０００−ｄペプチドフラグメントを有するβＸＩ［ａ因子の一形態のアミノ酸 配列は報告されていて（Ｋ、Ｆｕｊ−ｉｋａｗａ　＆　Ｂ、Ａ、ＭｃＭｕｌｌｅ ｎ：Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８．　１０９２４〜１０９３３．１９８３） 、またその三次構造が推定されている（　Ｄ、　Ｅ、　Ｃｏｏｌら：　Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６０　、　１３６６６〜１３６７６．１９８５）、この形 のβＸＩＩａの切断部位がさらにＣ００Ｉら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６ ２．　１３６６２〜１３６７２．１９８７）によって決定された。すなわち、α ＸＩ［ａはＡｒｇｓｓｓ−ｙａ１ｓｓ＊の間の切断によってＸ■から生成し、β ＸＩＩａはαＸＩ［ａからＡ、ｇｊ！１−Ａ５ｎ！ｍｌ。

Ａｒｇ”　４　＠−Ｌｅｕ３４４および、４．ｇ！１ｌ−ｙ８１１１４の間の切 断によって生成してそれぞれ９および２４３残基の２個のポリペプチド鎖が生じ る。

本発明はとくにヒトＸＴ１ａ因子に関するものであるが、それはヒト蛋白質また は特定のアミノ酸配列を有するＸＩ［ａ蛋白質（上記Ｆｕｊｉｋａｗａ　＆　Ｍ ｃＭｕｌｌｅｎ参照）に限定されるものではない。

コレステロール、低密度リボ蛋白（ＬＤＬ）およびアポリボ蛋白Ｂの血中レベル の上昇が、虚血性心疾患（ＩＨＤ）および急性心筋梗塞（ＡＭＩ）による長期死 亡リスクと正の相関をすることが知られている。。同様の正の相関は高密度リボ 蛋白（ＨＤＬ）およびアポリボ蛋白ＡＩの血中レベルの低下にも見出されている 。

しかしながら、これらのパラメーターのいずれも、各個人のＡＭＩのリスクの予 知には有用ではない。Ｎｏｒｔｈｗｉ−ｃｋ　Ｐａｒｋ病院のＭａｅｄａら（Ｍ ａｅｄａら：Ｌａｎｃｅｔ、　ｉ、　１０５０〜４　；　Ｍａｅｄａ：Ｈａｅｍ ｏｓｔａｓｉｓ、　１３．　１７８〜８５．１９８３　：ＭａｅｄａらＬａｎｃ ｅｔ、　ｉｉ、５３３〜７．１９８６）およびＦｒａｍｊｎｇｈａｍ研究のＫａ ｎｎｅｌ、Ｗｏｌｆ、Ｃａ５ｔｅｌｌｉ　＆　Ａｇｏｓｔｉｎ。

（Ｋａｎｎｅｌ　ら：Ｊ、Ａ、Ｍ、Ａ、２５８　（９）　、１１８３〜６．１９ ８７）は、注意深く制御された条件下には、フィブリノーゲンおよびｖ■因子凝 固活性の測定が、各種脂質の測定よりもよ＜ＡＭＩの可能性を予知できることを 示している。ｖ■因子自体は活性の低い単一鎖蛋白質であるが、もっと活性の高 い二鎖型のＶＩＩａ因子に変換できる。

Ｖ■因子をＶＩｒａ因子に活性化できる物質にはＸａ因子、ＩＸａ因子、ＸＩ［ ａ因子、トロンビンがある。

上に指摘したように、ｖＩ［因子は、注意深く制御された条件下には、各個人の ＡＭＩの可能性の予知に有用であることが示されている。しかしながら、現在利 用できるＶＩ［因子活性の測定方法は、大きな変動を生じやすい。

とくに、血液サンプルの採取に一般的に用いられる静脈穿刺では、上述のように ＶＩＥ因子の活性化の一方法に関与する組織因子の放出量が様々に変動する。し たががって、ＡＭＩの予知に際してのｖ■因子活性の利用には、一般的に使用で きるだけの信頼性がない。

本発明は、食事中の脂質レベルの増加が、ＸＩ［ａ因子たとえばβＸＩ［ａの定 常的濃度の上昇によってｖＩ［因子活性を増大させるという観察に基づくもので ある。すなわち、ＸＩ［ａ因子たとえばβＸＴ１ａは、高脂血症とＸπ因子の間 のきずなの役目をしている。

したがって、心臓疾患、とくに各個人の虚血性心疾患および急性心筋梗塞（Ａ罰 ）の可能性の予知に際し、ＶＭ因子活性の使用と同様に、ただしＶ■因子のサン プルの採取時に起こる組織因子の活性化の欠点を回避して、血漿中のＸＩ［ａ因 子たとえばβＸＩ［ａのレベルの測定の利用が提案される。

しかしながら、本発明の以前には、迅速で、選択的で、約ｔｏｎｇ／ｍｌ以下の レベルのＸＭａを正確に検知できる感度を育し、しかも大規模な利用のために自 動化が容易なＸＩＩａ因子の検定法はなかった。

ＸＩＩａ因子の測定に従来用いられている方法は、色原体基質が加水分解される 酵素アッセイである。上述の感度が低いことに加えて、このアッセイには、色原 体基質が、Ｘａ因子、カリクレインおよびトロンビンを含めた、血漿中に存在す る多数の他の物質によって加水分解されるという欠点がある。したがって、この 加水分解についての推定および補正が必要となり、と（にＸＩ［ａレベルが低い 場合には不正確になることは避けられない。このアッセイは、ＸＩＩａのレベル が約ｔｏｎｇ／ｍｔ以下の場合には、正確な結果が得られるとは考え難い。

ＸＩＩａおよび他の凝固因子のアッセイの改良へのアプローチとしては、改良さ れた色原体基質の供給が考慮されている（たとえば、ＥＰ７８７６４−Ｂおよび ＥＰ２８５０００−Ａ参照）。

他の色原体によらない種類の血液凝固因子のアッセイも提案されていて、たとえ ば、ＷＯ−８６０６４８９−八には表面結合フィブリノーゲンと標識フィブリノ ーゲンの使用が開示されている。また、イムノアッセイも提案されていて、たと えばＥＰ−３２５７２３−Ａには、一般的に、血液凝固因子に対するモノクロー ナル抗体で感作された微粒子担体の使用が開示されている。

Ｊ６２０６５６９３−Ａにはモノクローナル抗−ヒト血液凝固ＸＩ因子抗体が開 示されている。この抗体は、活性型ＸＩ因子ならびに血液凝固ＸＩ因子自体に強 力な親和性を育すると述べられている。このモノクローナル抗体は、様々な形式 のイムノアッセイにより、ヒト血液凝固ＸＩ因子および活性型ＸＩ因子の定量に 使用できる。

Ｘπ因子とαＸＴＩａ因子を認識できるモノクローナル抗体も報告されているが 、これはβＸＩ［ａ因子を認識しない（Ｅ、　Ｊ、　Ｓｍａｌｌら：Ｂｌｏｏｄ 、６５　：　２０２〜２１０．１９８５　）。この著者らは、その抗体がαＸＩ Ｉａ因子がβＸＩ［ａ因子に変換する際に、αＸＩ［ａ因子から放出される４Ｏ −Ｋｄフラグメントに対するものであることを明らかにしていることから、それ は驚くべきことではない。

すなわち、その抗体はＸπ因子およびαＸＩＩａ因子の分子の部分であるが、β ＸＩＩａ分子中には構造的に存在しない抗原決定基に対するものであった。

本発明は、βＸＩ［ａ因子に結合し、Ｘπ因子には実質的に結合を示さないモノ クローナル抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体はβＸＩ［ａ因子に特 異的に結合するか、またはαＸＩ［ａ因子にも結合する。

Ｊ６２０６５９３−ＡおよびＳｍａｌｌ　らの場合と異なり、本発明のモノクロ ーナル抗体が活性化Ｘπ因子を認識できて、活性体Ｘ■とそのチモーゲンＸＩＩ 因子自体を識別できることは驚くべきことである。

本発明は、サンプル中のＸＩ［ａまたはβＸＩＩａ因子の検出および／または定 量方法であって、抗原と抗体を相互作用させて生成した抗体−抗原複合体を検出 および／または定量することからなり、その抗体として本発明のモノクローナル 抗体を使用することを特徴とする定性的または定量的イムノアッセイにサンプル を付す方法を提供する。このアッセイには一般に、βＸＩ［ａ因子が標準、とじ て使用される。

本発明はまた、液体サンプル中の抗原のイムノアッセイを実施する方法であって 、抗原とそれに結合する抗体を相互作用させ、既知抗原の既定量を用いて得られ た結果と比較することによってサンプル中に存在する抗原の量を決定することか らなり、その抗体として本発明のモノクローナル抗体、既知抗原としてβＸＩ［ ａ因子を使用することを特徴とする方法を提供する。

本発明のイムノアッセイは、大規模な利用のための自動化装置の使用が容易な、 迅速な定量方法を提供する。

このアッセイはまた、精度および感度が優れ、従来使用されていた色原体アッセ イの有効下限１０ｎｇ／ｍｌより低いＸＩ［ａおよびβＸＩＩａレベルの検出に も十分使用できる。

本発明の抗体およびイムノアッセイは、したがって、とくに研究室または臨床検 査室において多数の検定を実施しなければならない場合の、ＸｎａまたはβＸＩ Ｉａ因子の検定に青用である。本発明の抗体およびイムノアッセイはと（に、疫 学的研究に際し、心臓疾患、とくに各個人の虚血性心疾患および／または急性心 筋梗塞の危険の評価に、上述のＶＩＩ因子のデータと同様に使用できるデータを 得るのに適している。

本発明はしたがって、本発明のイムノアッセイをヒト対象から得られた血漿のサ ンプルについて実施し、その対象の心臓疾患への罹病性を決定するため、検定さ れたサンプル中の抗原レベルについて得られた結果を、その抗原レベルと心臓疾 患への罹病性を関連づける大規模な研究で得られた結果と比較する方法を提供す る。個々の検定と大規模な研究は同一の抗体を用いて実施するのが好ましい。一 般的にまた、同一のイムノアッセイを用いることが好ましい。

本発明のモノクローナル抗体およびイムノアッセイはまた、凝固系および血栓性 疾患の研究に使用することができる。

特定のモノクローナル抗体がβＸｎａ−特異的であるか、またはαＸＩ［ａにも 結合するかを知りたい場合には、これは抗原としてαＸＩ［ａ因子を用いて抗体 に対するイムノアッセイを行うことによって可能になる。所望により、イムノア ッセイは定性的または定量的のいずれにすることもできるが、一般的には、固相 アッセイよりも液相アッセイを使用する方が好ましい。しかしながら、互いに比 較されるすべてのアッセイに同一の抗体を使用する限り、満足すべき結果が得ら れると考えられるので、αＸＩＩａに対する特異性を測定することは重要でない と考えられる（本発明のアッセイの結果は一般にβＸＩＩａ標準に対して決定さ れたものであり、したがりてβＸＩＩａの指標およびβＸＩＩａ重量を表すとみ なされるものであることを銘記すべきである）。

本発明はまた、抗βＸＩ［ａ因子を認識できる少なくとも１種の抗原決定基であ るかまたはそれを包含するβＸＩ［ａのフラグメントであるペプチドを提供する 。

βＸＩ［ａの抗原性フラグメントはそれ自体免疫原性であるかまたは小さすぎて 免疫原性を示さない。後者の場合には、たとえば以下に述べるような他のペプチ ドに接合させることによって、たとえば、免疫原に変換することができる。本明 細書で用いられる「βＸＩ［ａの抗原性フラグメント」の語は、上述のようなペ プチドおよび、それがそれ自体免疫原性でない場合には、そのようなペプチドの 免疫原型の両者を包含する。

免疫原の製造方法は、本技術分野の熟練者にはよく知られている。これらの任意 の方法が、βＸＩ［ａ因子またはその抗原性フラグメントを免疫原にするかまた はその免疫原性を改善するために使用できる。

基本的に、すべての方法は、抗原性でないかまたは十分に抗原性ではない分子に 対して、免疫処置により免疫応答または改善された免疫応答が得られるように、 大きな蛋白質分子を付加することからなる。担体として用いられる蛋白質分子は 、たとえば、キーホールリンベット・ヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、ウシ サイログロブリン、およびツベルクリンの精製蛋白質誘導体である。

たとえば、キーホールリンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）は、二官能性架橋剤 たとえばマレイミド試薬たとえば、スルホスクシンイミジル−Ｎ−マレイミドメ チルシクロヘキサン−１−カルボキシレートを用い、そのペプチドのシスティン のチオール基を介してシスティン含有ペプチドにカップリングさせることができ る（８．１ｓｈｉｋａｗａら：　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　４　：　２ ０９．１９８３参照）。得られた接合体はゲル濾過クロマトグラフィーで精製し 、凍結乾燥することができる。

固有のチオール基をもたないペプチドは、Ｎおよび／またはＣ−末端にシスティ ン残基を導入させることができる。接合体は、固相たとえばプラスチック製マイ クロタイタープレートのウェルのコーティングに使用できる。

βＸＩ［ａ因子は、まず新鮮なまたは新たに凍結した血漿からＸ■因子をたとえ ば、硫酸アンモニウム沈殿と陰イオン交換クロマトグラフィーの組合わせを用い 、たとえば、Ｋ、Ｆｕｊｉｋａｗａ　＆　Ｅ、Ｗ、Ｄａｖｉｅ　（Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　ＩＥｎｘｙｍｏｌ。

８０：１９８〜２１１Ｓ　１９８１）によって報告された方法に従って単離する 方法によって製造できる。ＸＩ［因子をβＸＩ［ａ因子に変換し、得られた混合 物からβＸＩＩａ因子を単離する方法は、Ｋ、Ｆｕｊｊｋａｗａ　１　Ｂ、Ａ。

ＭｃＭｕｌｌｅｎ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８　：　ｌ　０９２４〜１０ ９３３．１９８３）およびＢ、Ａ、ＭｃＭｕｌｌｅｎ　＆　Ｆｕｊｉｋａｗａ（ Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、２６０　：　５３２Ｂ、１９８５）によって記載されている。βＸＩ Ｉａ因子を得るためには、Ｘ■因子をついで、一般的には限定切断に付す。たと えば化学的または酵素的消化により、たとえばトリプシンまたはトリプシン様酵 素を、一般的には高度に希釈した形で、たとえばトリプシン：Ｘ■因子のモル比 １：５００、たとえばトリプシン：Ｘ■因子の重量比１ニア５を使用し、切断生 成物は一般的にはクロマトグラフィーによって分離する。

ＸＩ因子のある種のプレバレージョンは、見掛けの分子量８０．５２および２Ｂ −Ｋｄの３個の蛋白質バンドが観察される場合、還元サンプルの試験から判断す ると、かなりの量のαＸＩ［ａを含んでいる。このような　Ｘ■因子プレバレー ジョンはアミド分解活性も発揮する。

Ｆｕｊｉｋａｗａ　＆　Ｄａｖｉｅによれば、ＶＩＩ因子とαＸＩ［ａ因子はベ ンズアミジン−アガロースカラムクロマトグラフィーを用いて分離できる。溶出 すると２つのピークが観察され、その両者とも血液凝固活性を存する。しかしな がら、第二のピークのみがアミド分解活性を有する。ベンズアミジン−アガロー スカラムに適用された材料が、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析で測定できる βＸＩ［ａを含まないとすれば、第二のピークはαＸＩＩａである。これは、還 元および非還元サンプルを５Ｏ３−ＰＡＧＥに流すことによって確認できる。

βＸＩ［ａの抗原性フラグメントはβＸＴｉａを酵素的または化学的手段で分解 することにより製造できる。たとえば、βＸＩｒａのジスルフィド連結り鎖ペプ チドは、βＸＩＩａの還元およびカルボキシメチル化、ついでクロマトグラフィ ーによるそのフラグメントの単離によって得られる（Ｋ、Ｆｕｊｉｋａｗａ　＆ 　Ｂ、Ａ、ＭｃＭｕｌｌｅｎ：Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５８、　１０９２４．１９８３）。

別法として、βＸＩ［ａの抗原性フラグメントは、そのアミノ酸配列が既知の場 合には、βＸＩＩａそれ自体と同様、合成的に製造できる。ペプチド合成の多く の既知の任意の化学的方法、とくに自動化装置を利用する方法が使用できろ。

本発明の抗原性フラグメントは、βＸＩ［ａそれ自体と同様、組換えＤＮＡ技術 を用いて製造できる（Ｃｏｏ　ｌら、１９８５および１９８７、前出がヒト血液 凝固ＸＩ［因子ｃＤＮＡおよび遺伝子を特性づけている）。これはたとえば、化 学的合成または相当するｍ−ＲＮＡからの逆転写による遺伝子の構築、遺伝子の 適当なベクターたとえばプラスミドたとえばｐＢＲ３２２への挿入、ベクターの 宿主生物たとえば大腸菌への導入、ついで宿主生物での遺伝子の発現によって達 成される。このような操作は現在ではルーチンであり、とくにベクターとしては 、たとえばＰＢＲ３２２が市販品を入手できる。Ｍａｎｉａｔｉｓら：　Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２は、この分野で用いられる技術が詳細に記載されて いる標準的な成書である。一般に、小さなペプチドでは化学的合成が好ましく、 ペプチドが大きくなるほど、化学的合成よりも組換えＤＮＡが経済的に好ましく なる。

とくに指定のない限り、本明細書で用いられる「βＸＩＩａ因子ＪおよびｒβＸ Ｔｉａノの飴にはβＸＩＩａ分子の抗原性フラグメントが包含される。

βＸＴＬａ因子はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の製造に使用 できて、これらの抗体および抗血清は本発明の一部である。上述のように、本発 明のモノクローナル抗体はβＸＩ［ａ因子に結合することが可能で（βＸＩ［ａ の抗原決定基特性を認識できる）、またＸＩ［因子には有意な結合を示さない（ βＸＩ［ａ因子とＸＩＩ因子を識別できる）か、あるいはβＸＩＩａおよびαＸ ＩＩａに結合が可能で、この場合、抗体はβＸＩ［ａおよびαＸｎａＸｎ−共通 の抗原決定基を認識できる。本発明のポリクローナル抗血清はβＸπａに優先的 に結合する。

本明細書で用いられる「抗体」の語は、抗原、たとえば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ ’　）２フラグメントに結合できる任意の抗体フラグメントを包含する。

上述のように、本発明のモノクローナル抗体は、実質的にＸ■因子には結合を示 さない。診断の目的でのイムノアッセイに用いる場合は、Ｘ■因子との補正され た交叉反応性は一般に０．１％またはそれ以下でなければならない（下記参照） 。他の目的、たとえば免疫吸着剤として使用する場合には、交叉反応性はもっと 高くてもよい。

本発明のモノクローナル抗体は、βＸＩＩａ因子に対して少なくともｌ　Ｑ　ｌ ０１ｖｌ−１の親和性をもつことが好ましい。

本発明の抗体のＸ■因子との交叉反応性の評価に際して考慮すべき因子は、「純 粋なＪＸＩＩ因子プレバレージョンでも少量のＸＩ［ａが夾雑することはほとん ど避けられないということであるＣ８ｊｌｖｅｒｂｅｒｇ　＆　Ｋａｐｌａｎ　 ：　Ｂｌｏ。

ｄ６０：６４〜７０．１９８２）。存在する少量のＸＩ［ａはほとんどの場合、 問題にはならないが、交叉反５応の程度を評価する場合には、Ｘ■因子中のＸＩ Ｉａの量をできる限り正確に測定する必要があり、これを初期に測定した見掛け の交叉反応ではなく補正された交叉反応の測定のために考慮しなければならない 。たとえば、　Ｘ■因子プレバレージョンは０．５〜０．８％の範囲の　１０Ｘ ｆｆａを含存することが明らかにされている。この値を考慮すると、Ｘ■因子と の見掛けの交叉反応０．５％は、補正された交叉反応０．１％未満になる。とく に指示のない限り、本明細書においては、「交叉反応」の語は補正交叉反応を意 味して使用される。

本発明は、増殖培地中で抗体を産生できるハイブリドーマ細胞系を培養し、増殖 培地から抗体を得ることからなる、本発明のモノクローナル抗体の製造方法を提 供する。

本発明はさらに、抗原を動物に投与して抗体産生細胞を得、得られた抗体産生細 胞をミエローマ細胞と融合し、得られたハイブリドーマをモノクローナル抗体の 産主についてスクリーニングし、この場合、抗原はβＸＩＩａ因子またはその抗 原性フラグメントとする、本発明のモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー マ細胞系の製造方法を提供する。

モノクローナル抗体の製造に用いられる方法はよく知られている（たとえば、Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ、　Ｈ，ＶａｎＶｕｎａｋｉｓ　 ＆　Ｊ、Ｊ、Ｌｏｎｇｏｎｅ纒１．１９８１，７２　（Ｂ）および同誌、１９８ ３．９２（Ｅ）参照）。

モノクローナル抗体は、たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅ−ｉｎの方 法（Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　：　Ｎａｔｕｒｅ　２５６ 　：４９５．１９７５）の改良法によって製造できる。すなわち、雌性Ｂａ１ｂ ／ＣまたはＣ５７／Ｂ１０ｖウスを、βＸＩ［ａまたはβＸＩＩａの抗原性フラ グメントたとえばｌＯ〜３０μｇ、一般的にはβＸＩ［ａ２０μｇまたは他の抗 原の相当量の腹腔内注射によって免疫処置する。

βＸＩ［ａまたは他の抗原は、他の蛋白質分子たとえばウシサイログロブリンま たはツベルクリンの精製蛋白質誘導体に接合させることが好ましい。接合はたと えばカルボジイミド法または異種二官能性試薬を用いて実施できる。免疫原は一 般に、アジュバント、好ましくは完全フロインドアジュバント中に添加する。こ の操作は一般に間隔を置いて、一般には同じ抗原を同じ用量使用して反復する。

たとえば３週間隔でマウスに、完全フロインドアジュバント中接合βＸＩ［ａ２ ０μｇを、適当な応答レベルが得られるまでブースターを投与する。融合前のブ ースターは、屠殺前たとえば屠殺３日前に静脈内に行うのが好ましい。抗体応答 はたとえば、　Ｉｌｌ　ｌ−放射標識βＸＩ［ａ抗原を用いるＲ［Ａ抗血清曲線 分析によってモニタリングする（Ｐ、Ｊ、ＭｃＣｏｎａｈｅｙ　＆　Ｆ、Ｊ、Ｄ ｉｘｏｎ：　Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ。

Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２９　：　１８５．１９６６） 、純度はたとえば還元条件下に流した５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラ フィーを用いて、たとえば確認される。

免疫マウス牌細゛胞をついで、ミエローマ細胞たとえばＮＳＯマウスミエローマ 細胞と、たとえば４０〜５０％ＰＥＧ　４．０００または５０％ＰＥＧ１．５０ ０の存在下に融合させる。次に細胞を培養プレートのウェルに播き、選択メジウ ム上で増殖させる。上清を、精製βＸＩ［ａまたは他のβＸＩ［ａ抗原に対する 反応性について、たとえば固相酵素イムノアッセイにより、たとえばペルオキシ ダーゼ標識抗−マウスＩｇＧを用いて試験する。βＸＩ［ａに対して特異性を示 したすべてのウェルを取り、一般にはさらに二次スクリーニングに付す。二次ス クリーニングは、たとえば、放射標識されたβＸＩ［ａまたはβＸＩＩａ抗原性 フラグメントに対する溶液中結合についての全特異性抗体のスクリーニングであ る。これらは好ましくは、５０％Ｂ　ｗａｘに必要な抗体希釈を測定するために 滴定される。コールドすなわち非標識βＸＩ［ａまたは相当するコールド抗原性 フラグメントに対する用量反応曲線、またＸＩ［因子、プラスミンおよびフィブ ロネクチンに対する用量反応曲線も好ましくは作成する。交叉反応の程度は次式 によってめられる。

（βＸＩ［ａのかわりに抗原性フラグメントを使用する場合には、上記式のこれ を置換する） 既定の見掛けのＸ■因子に対する交叉反応、好ましくは１．５％またはそれ未満 、さらに好ましくは１％またはそれ未満を示す抗体を先に進める。各抗体に対す る親和性定数の値を得るために、用量反応データに対してスキャッチャード分析 を行ってもよい。少なくとも１ｏｌｅ　ｌ−１の親和性定数を有する抗体を一般 には、次のクローニングに進める。好結果のクローンは一般にサブタイプに分け る。細胞をついで好ましくは限界希釈によってサブクローン化し、一般的には酵 素イムノアッセイを用いてβＸＩ［ａに対する抗体の産生について再びスクリー ニングする。各クローニングから選択されたサブクローンはまた、ラジオイムノ アッセイを用いて特異性および用量反応について評価する。

特定の目的で、αＸＩ［ａおよびβＸＩＩａの両者またはβＸＩ［ａのみに結合 を糸すモノクローナル抗体を産生ずるクローンを選択すること、あるいは選ばれ たクローンによって産生される抗体の結合特性を確認することを所望の場合には 、抗原としてαＸＩ［ａを用いるスクリーニング過程をさらに適当な時点で導入 できる。このようなスクリーニングには、Ｆｕｊｉｋａｗａ　ｌ　Ｄａｖｉｅの 方法（上記参照）に従って得られるαＸＩＩａブレバレージョンを使用できる。

しかしながら、αＸＩ［ａのスクリーニングをβＸＩＩａスクリーニング後に実 施する場合には、一般的にはαＸＩＩａ含有ＸＩＩ因子プレバレージョンを上述 のベンズアミジン−アガロースクロマトグラフィーに付す必要はない。一般に、 そのプレバレージョンがβＸＩＩａを含まないことを確立すれば十分である。上 述のように、面相アッセイよりも液相アッセイを用いることが一般に好ましく、 たとえば抗体から放射標識βＸＩ［ａのαＸＩ［ａによる置換が関与するアッセ イが用いられる。

サブクローン化されたハイブリドーマ細胞はＢａ１ｂ／Ｃマウスに腹腔内注射し て腹水を生成させる。免疫グロブリンは腹水から、たとえば４℃で飽和硫酸アン モニウム溶液（等容）を用いて沈殿させることができる。沈殿は、たとえば遠心 分離し、たとえば５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ７，５（最初の腹水 と同容量）に溶解し、ついで同一の緩衝液に対して透析することによって精製す ることが好ましい。免疫グロブリン分画は次に、陰イオン交換クロマトグラフィ ーにより、たとえば蛋白質溶液をＭｏｎｏ−Ｑ陰イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　）に適用し、製造業者の推奨に従って同じ緩衝液中塩勾配を用いて溶 出することによって、さらに精製する。免疫グロブリンを含有する分画はプール し、一般には、−２０℃で凍結して保存する。

別法として、ハイブリドーマ細胞を抗体産生のために培養液中で増殖させ、抗体 を腹水について記載したとほぼ同様にして単離する。

本明細書に記載したハイブリドーマはマウス牌細胞から誘導されたが、本発明は マウスまたは部分マウス起源のハイブリドーマに限定されるものではない。両融 合パートナ−（牌細胞およびミエローマ）は任意の適当な動物から得ることがで きる。

本発明は、βＸＴ１ａに結合するポリクローナル抗血清の使用も包含する。

ポリクローナル抗体の製造に用いられる方法はよく知られている（たとえば、’ 　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆＥｎｚｙｍｅ　ｒｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙｓ“、　Ｐ、Ｔｉｊｓｓｅｎ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃ−ｈ ｎｊｑｕｅｓ　ｊｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｒ，Ｈ。

Ｂｕｒｄｏｎ　＆　Ｐ、Ｈ，Ｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編、　ＥＩｓｅｖ ｉｅｒ、　１９８５、およびＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍ ｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｔ、Ｃ ｈａｒｄ　、同書第３版、１９８７参照）。

ポリクローナル抗血清は、たとえば、他の蛋白質に接合したＩＩＩ［ａ因子、ま たはＸ■因子を抗原として使用し、ヒツジまたはウサギ中で産生させる。

上述のように、本発明はまた、サンプル中のＸＩ［ａまたはＩＩＩ［ａ因子を検 出および／または定量する方法において、抗原と抗体を相互作用させ、得られた 抗体−抗原複合体の検出および／または定量し、この場合、抗体は本発明のモノ クローナル抗体であることを特徴とする定性的または定量的イムノアッセイにサ ンプルを付す方法を提供する。

本発明はさらに、液体サンプル中の抗原のイムノアッセイを実施する方法におい て、アッセイは抗原とそれに結合する抗体とを相互作用させ、既知抗原の既定量 を用いて得られた結果と比較することによってサンプル中に存在する抗原の量を 定量するものであって、この場合、抗体は本発明のモノクローナル抗体、既知抗 原はβＸＩＩａ因子であることを特徴とする方法を提供する。

イムノアッセイを実施する方法はよく知られている（たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇｙ、　Ｈ，Ｖｕｎａｋｉｓ　＆　Ｊ、Ｊ。

Ｌａｎｇｏｎｅ編、１９８２．７２　（Ｂ）　；　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄＴ ｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｔｎｕｎｏａｓｓａｙｓ、　Ｐ、Ｔｉｊ ｓｓｅｎ、　Ｌａｂｏｒａｔ−ｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ−ｏｇｙ、　Ｒ，Ｊ 、Ｂｕｒｄｅｎ　＆　Ｐ、Ｈ，Ｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ編、Ｅｌｓｅｖ ｉｅｒ。

１９８５　；　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓ ｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ−１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｔ、Ｃｈａｒｄ 　、同書、第３版、１９８７；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ、　Ｈ，Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓ　＆Ｊ、Ｊ、　Ｌａｎｇｏｎｅ編、１９ ８１，７４　（Ｃ）参照）。

上述のように、イムノアッセイ技術には、定性的および定量的両技術がよく知ら れていて、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）、ウェスタンブロッティング、流 動相沈殿アッセイ、コーティング粒子アッセイ、競合的アッセイ、サンドイッチ アッセイさらに逆および同時サンドイッチアッセイ、ならびに固相ラジオイムノ アッセイ（ＳＰＲＩＡ）がある。

これらの中で、本発明の場合、ＥＬＩＳＡと５ＰＲＩＡがとくに便利である。し たがって、本発明によるモノクローナル抗体のサンプルは、固相支持体たとえば プラスチックまたは他の重合材料の、たとえばプラスチック製マイクロタイター プレートのウェルに吸着させ、検討する血漿サンプルまたは標準溶液を抗体試薬 に接触させてインキュベートし、得られた結合ＸＩ［ａまたはＩＩＩ［ａ因子を 、結合因子または標準にたとえばその分子上の別個のエピトープによって結合で きる標識抗体を用いて検出する。

標識抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。

標識としては、任意の適当な放射性同意元素、たとえばβ−放出体またはα−放 出体、たとえばｌ［Ｔ　、　ｌ！Ｉｉ。

′Ｈおよび１４Ｃが使用できる。酵素標識には、基質としてフェノールフタレン を用いるたとえばアルカリホスファターゼがある。酵素反応は電気化学的方法を 用いて追跡することができる。標識抗−抗体の使用に変えて、結合ＸＩ［ａまた はＩＩＩ［ａは直接、色原体基質を用いて定量することができる。

本発明のモノクローナル抗体を固体支持体上に吸着させる代わりに、βＸＩＩａ それ自体またはその抗原性フラグメントを、競合的アッセイに使用するために結 合させてもよい。さらに別法としては、標識たとえば放射標識βＸＩＩａまたは その抗原性フラグメントを競合的アッセイに使用することができる。

本発明に使用されるラジオイムノアッセイの例を挙げれば次の通りである。すな わち、モノクローナル抗体１１６１−標識βＸＩ［ａ、βＸＴＩａ標準溶液およ び固体支持体たとえば５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−１０００にカップリングさせ た抗−マウス［ｇＧを用い、以下の方法で用量−反応曲線を作成する。モノクロ ーナル抗体腹水を検定緩衝液、たとえば、０．１５ｍ　ＮａＣ１，０，２５％Ｂ ＳＡ、　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　。

３　ｍＭ　ＮａＮおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｆ（Ｃ Ｉ　ｐＨ７，４からなる緩衝液で希釈する。二重検定チューブに、検定緩衝液中 、各モノクローナル抗体溶液、　ＩＩＩ　ｌ−放射標識βＸＩ［ａ溶液および精 製βＸＩ［ａ標準溶液を加える。

標準溶液はβＸＩＩａ保存溶液から調製する。総カウントを与える対照チューブ は検定緩衝液とトレーサー溶液を用いて調整した。すべてのチューブを混合し、 ついでインキュベートする。次に、各チューブに（対照を除く）固定支持体にカ ップリングした抗−マウス［ｇＧの至適量を含有する懸濁液のサンプルを加えた のち、チューブを振盪しながらインキュベートする。この工程後、好ましくはス クロース緩衝液（検定緩衝液＋ｌＯ％Ｗ／Ｗスクロース）をたとえば螺動ポンプ を用いて、各チューブ（対照を除く）中の反応混合物の下に層とする。固定支持 体にカップリングした抗−マウスＩｇＧを沈降させ、ついで各チューブから液体 を除去する。対照を含めた全チューブについてカウントを測定する。各βＸＩＩ ａ標準について得られたカウントを総カウントで除して結合率％を計算する。添 加する総カウントはたとえば１０．０００ｃｐｍとする。上述のラジオイムノア ッセイにおいては、ＩＩＩ［ａをβＸＩＩａの抗原性フラグメントで置換できる 。

本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体とβＸＩ［ａ因子またはその抗原 性フラグメントをそれぞれ別個の容器に入れるかまたは他の方法で分画化してな る、本発明のイムノアッセイを実施するためのキットを提供する。キットにはさ らに、たとえば上述のイムノアッセイを実施するための構成要素を包含してもよ い。本発明のモノクローナル抗体は非標識でも標識抗体でもよい。

抗体は固体支持体上に固定化してもよい。

本発明のキットは、たとえば、 ａ）　（ｉ）本発明のモノクローナル抗体、または（ｉｉ）βＸＩＩａ因子もし くはその抗原性フラグメント、または（ｉｉｉ）本発明の抗体に対する抗体、ｂ ）　（ｉ）βＸＩＩａ因子に直接または間接的に反応できる標識抗体、または（ ｉｉ）標識βＸＩＩａ因子、または（ｉｉｉ）βＸＩ［ａ因子に対する色原体基 質、およびＣ）精製βＸｎａ因子またはその抗原性フラグメント、から構成され る。

構成要素ａ）（ｉ）　、ａ）（ｉｉ）、またはａ）（ｉｉｉ）は、所望により、 固体支持体に結合させてもよい。

キットはさらに他の構成要素、たとえば洗浄試薬溶液および基質溶液を、それぞ れ別個の容器に包含していてもよい。

本発明のポリクローナル抗血清または、とくにモノクローナル抗体は、βＸＩＩ ａ因子またはその抗原性フラグメントの精製における免疫吸着剤として親和性ク ロマトグラフィーに使用することができ、本発明は、本発明のポリクローナル抗 血清、またはとくにモノクローナル抗体からなり、一般的には固体支持体に常法 で（下記参照）吸着または他の形で支持させた免疫吸着体を提供し、またこのよ うに支持された抗体（免疫吸着体）を用いてβＸＩＩａ因子またはその抗原性フ ラグメントを精製する方法を提供する。精製されたβＸＩ［ａ因子または抗原性 フラグメントは、βＸＩＩａ因子を定量するための本発明の方法において、対照 試薬として使用できる。逆に、本発明はまた、βＸＩ［ａ因子またはその抗原性 フラグメントからなり、一般的には常法により（下記参照）固体支持体に吸着ま たは他の形で支持させた免疫吸着体を提供する。

本発明はまた、このような支持された抗原（免疫吸着体）を用いて抗−βＸＩ［ ａ因子抗体および抗血清をスクリーニングする方法および／または精製方法を提 供する。

βＸＩＩａの抗原性フラグメントを好ましくは上述の免疫吸着体の形で使用して モノクローナル抗体のβＸＩ［ａに対する特異性および／または親和性をスクリ ーニングすることは有利である。所望により、免疫吸着体として固体支持体上に 固定化されたαＸＩ［ａ因子またはその抗原性フラグメントを用いて、さらにス クリーニングおよび／または精製を実施することができる。

ポリクローナル抗体は、とくに抗−βＸＩ［ａ因子抗体の含量を増加させるため に、たとえば、ポリクローナル抗体をβＸＩ［ａ因子またはその抗原性フラグメ ントと接触させることにより精製できる。ポリクローナル抗体は、好ましくは、 固体支持体上に固定化されたβＸＩ［ａの抗原性フラグメントと接触させ、得ら れた結合抗体を遊離させる。粗ポリクローナル抗体プレパレーシジンの特異性お よび親和性はこのような方法で実質的に改善することが可能で、したがって得ら れたポリクローナル抗体は市販の検定に使用するのにさらに適当になる。

βＸＩＩａに結合するモノクローナルマウス抗体は、製造業者の指示に従って、 ＣＮＢｒ−活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ　−４８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に共有結 合的にカップリングさせることができる。このようなカラムは、βＸＩ［ａ抗原 の単離に、たとえば血漿からのβＸＩＩａまたはＸ■因子消化物からのβＸＩ［ ａもしくはその抗原性フラグメントの単離に適宜使用することができる。結合し たβＸＩ［ａ抗原はカラムから、たとえば４Ｍグアニジンを用いて溶出させ、溶 出液中の抗原を検出する。たとえばβＸＩＩａはＳ−２３０２ペプチド基質（Ｋ ａｂｉ）を用いて酵素活性により、または１！Ｊ標識βＸＩａを用いて溶出分画 中に検出できる。

上述のβＸＩＩａ抗原、すなわちβＸＩＩａ自体またはその抗原性フラグメント は、製造業者の指示に従い、固有のまたは導入された１個または２個以上のチオ ール基を介して千オール活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に たとえば、カップリングさせることができる。αＸＩ［ａ因子またはその抗原性 フラグメントも同様にカップリングさせることができる。

上述のように、ＸＩ［ａ因子たとえばβＸＩ［ａ因子の活性とｖ■因子活性の間 には、酵素／基質の関係が存在すると考えられ、これはｖ■因子たとえばβＸＩ ［ａ因子活性が、ｖ■因子活性の代わりに、心臓疾患とくに虚血性心疾患（Ｉ） １０）および急性心筋梗塞（ＡＭＰ）の危険の指標として使用できることを示唆 している。

正常またはコレステロール添加食餌で飼育したウサギでＩｌｌ　ｌ−標識ＸＩ因 子の代謝回転を検討した結果は、血管外および血管内コンパートメントでのＸ■ 因子の半減期およびプールサイズにはほとんど変化がなく、また分画での異化率 にはほとんど変化がないのに、コレステロール添加食餌で飼育したウサギでの絶 対異化率は標準食餌で飼育したウサギの場合に比べて大きいことを示している。

ウサギはヒトに比べてカリクレインレベルがはるかに低いので、Ｘ■因子の異化 率の増加は、相当する環境下でのヒトではさらに著しいものであることが期待さ れる。ＸＩ［因子の異化率の上昇の意義は、これがｖ■因子活性に対して有する 影響である。これらの結果は、ＸＩ［ａたとえばβＸＩＩａ因子がＡＭＩの危険 の指標として適していることを示している。

したがって、被験者から得られた血漿サンプルについて実施された本発明のイム ノアッセイのデータはその被験者の心臓疾患、と（に虚血性心疾患および／また は急性心筋梗塞の危険の指標として有用であることが提起される。ある個人につ いて得られた結果とその個人における心臓疾患たとえば虚血性心疾患およびとく に急性心筋梗塞の危険との相関は、これらのパラメーターを、好ましくは他の基 準によって危険があると考えられる固体および危険がないと考えられる固体を含 めた多数の固体での検討によって明らかにすることができる。検討する集団が大 きいほど、相関の正確度はよくなる。このような疫学的研究のデザインおよび遂 行についてはよく知られていて、たとえば上述のＮｏｒｔｈｗｉｃｋ　Ｐａｒｋ 病院およびＦｒａ−ｍｉｎｇｈａｍの研究が参考になる。心臓疾患たとえばＡＭ ［の個人に対する危険の評価は、たとえば上述のような疫学的研究で得られたデ ータを、個人について測定されたデータと比較することによって行われる。

本発明の方法および他の実施態様はまた、血液凝固に関与する機構の検討および 血栓性障害の研究にも有用である。

以下の実施例は本発明を例示するものであって、いかなる意味においても本発明 を限定するものではない。

例１ ＸＩ［およびβＸＩＩａ因子の単離および精製新鮮なまたは凍結したヒト血漿か らのＸＩＩ因子の単離は、Ｋ、　ＦｕｊｉｋａｗａおよびＥ、　Ｗ、　Ｄａｖｉ ｅｓの記載（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ−ｙｍｏｌ、８０：１９８，１９８１）に ほぼ従い、硫酸アンモニウム沈殿と陰イオン交換クロマトグラフィーを組合せて 用いて行った。６．５リツトルの血漿からのＸ■因子の収量は５３ｍｇであった 。

Ｘ■因子から通常の消化によるβＸＩ［ａ因子の製造は、Ｂ、Ａ、ＭｃＭｕｌｌ ｅｎ　＆　Ｋ、Ｆｕｊｉｋａｗａ　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　：　５ ３２８．１９８５）およびに、Ｆｕｊｉｋａｗａ　＆　Ｂ、Ａ、ＭｃＭｕｌｌｅ ｎ（Ｊ、Ｂｆｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８　：　１０９２４．　１９８３）によって 以前に報告された方法を用いて実施した。

Ｘ■因子５３ｍｇを８リツトルの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　／　７５ｍＭＮａＣ１， ｐＨ８，０に対して４℃で一夜透析した。蛋白質溶液を３７℃に加温し、０．７ 　Ｂのトリプシンを加え、３７℃で１５分間平衡化した。大豆トリプシン阻害剤 （ＳＢＴＩ）１、４　ｍｇをついで加えて消化を停止させ、この溶液を３７℃に さらに１５分間保持した。βＸＩ［ａは直ちに、ＤＥＡＢ−Ｓｅｐｈａｃｅｌを 用いて他の成分から分離した。カラムをＴｒｉｓ／　７５　ｍＭ　ＮａＣ１，ｐ Ｈ８，０で、一部の蛋白質が洗浄除去されるまで洗浄し、ついで５０ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ　／　７５ｍＭＮａＣ１→５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ／稈ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ８ ，０を用いて勾配を開始させた。勾配時に２つの蛋白質ピークが溶出した。βＸ ｎａは、Ｘ■因子と異なり血液凝固活性をもたない。溶出液中の生成物の活性は 、合成基質Ｓ　−２３０２（にａｂｉｖｉｔｒｕｍ）および４０５ｎｍにおける 吸収の変化率を用いて測定した。βＸＩＩａは第二のピークに現れる。１４ｍｇ のβＸＩ［ａが得られた（ＸＩ［因子から７０％）。

添付図面の図１は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅ１カラムの溶出液について、時間 に対する２８ＯｎｌＤの吸収のプロットであり、第二のピークにβＸＩ［ａを示 している。

純度は、Ｌａｅｍｍｌ　ｊの方法（Ｋ、　Ｖ、　Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　：Ｎａｔｕ ｒｅ２２７：６８０．１９７０）に従い、還元および非還元条件下で５ＯＳ−Ｐ ＡＧＥによって確認した。アクリルアミド濃度は、スペーサーゲルでは３％、分 離ゲルでは１０％とした。蛋白質バンドはクーマツシーブルー染色で検出した。

添付図面の図２ａおよび図２ｂは、ＸＩＩおよびβＸＩ［ａについてそれぞれの ５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図２８ではＥ　”ｘｓｏ　＝１．４２、図２ｂで はＥ　”ｔａｕ　＝］、　５２である。両ゲルのトラックｌは、２０，１００； ２４．０００　；２９，０００．３６，０００．４５．０００および６６．００ ０の分子量標準によって形成されたバンドである。図２ａのトラック１．　２お よび３は、Ｓ−５ｅｐｈａ−ｒｏｓｅクロマトグラフィー（これはＦｕｊｉｋａ ｗａらによって記載されたＣＭ−セルロースクロマトグラフィーに代えて使用し た）上のＸ■因子ピークからの３つの分画について得られたバンドを示す。図２ ｂのトラック２〜７は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃａｔ　クロマトグラフィーの溶 出液のそれぞれ３２〜２７の分画について得られたバンドである。

例２ （ａ）マウス特異的モノクローナル抗体の製造ヒトβＸＩ［ａに対するマウスモ ノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｃ，Ｋｏｈ ｌｅｒ　＆　Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ：Ｎａｔｕｒｅ２５６　：　４９５．１９７ ５）の改良法によって製造した。

雌性Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに、ａ）ウシサイログロブリンまたはｂ）ツベリクリン の精製蛋白質誘導体に接合したβＸＩ［ａ２０μｇの腹腔内注射によって免疫処 置した。

接合はカルボジイミド法により、または異種三官能試薬を用いて行った。免疫原 は完全フロインドアジュバント中に添加した。３週間隔で、完全フロインドアジ ュバント中、接合βＸＩ［ａ２０μｇをマウスにブースター投与した。融合前の ブースターは屠殺の３日前に静脈内に投与した。

抗体応答は、クロラミン−Ｔ法（Ｐ、Ｊ、ＭｃＣｏｎａｈｅｙ　＆　Ｆ。

Ｊ、Ｄｉｘｏｎ：Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、　Ｉｍｎ＋ｕ ｎｏ１．２９　：　１８５　。

１９６６）で製造した＋１′Ｉ−放射標識βＸＩ［ａを用いＲＩＡ抗血清曲線分 析によってモニタリングした。純度は、還元条件下に行った５ＤＳ−ＰＡＧＥゲ ルのオートラジオグラフィーを用いて確認した。免疫マウス牌細胞は、４０〜５ ０％ＰＥＧ　４．０００の存在下にＮＳＯマウスミエローマ細胞と融合させた。

細胞をついで培養平板のウェル中に播き、選択培地上で増殖させた。上溝につい て、ペルオキシダーゼ標識抗−マウスＩｇＧを用いた固相酵素イムノアッセイに より、精製βＸＩ［ａに対する反応性を試験した。

略述すると、９６ウエルマイクロタイタープレートのウェルを精製βＸＩＩａ　 （リン酸緩衝食塩溶液、ＰＢＳ中ｌＯμｇ／ｍｌ溶液１００μｌ）でコーティン グし、ついでＰＢＳ中２％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）を用いてブロックし た。細胞培養上清をウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートしたのち、 ウェルを３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗−マウスＩｇＧを至適希釈濃度で 添加した。さらに３７℃で１時間インキュベートしたのち、ウェルを再び洗浄し 、１００μｌの基質溶液（０，１Ｍクエン酸塩ｐＨ５，０中６　ｍＭ　Ｈ！０！ および４０ａ＋ＭＯ−）二重レンジアミン）を加えた。３　ＮＨＣｌで発色を停 止させ、吸収を４９２ｎｍで測定した。

βＸＩＩａに対して特異性を示した全ウェルを取り、さらに第二のスクリーニン グを実施した。第二のスクリーニングは、溶液中放射標識βＸＭａへの結合につ いてのすべての特異的抗体のスクリーニングからなる。これらを滴定して５０％ Ｂｍａｘに必要な抗体希釈をめた。コールド（非標識）βＸＩＩａ、ＸＩ［因子 、プラスミンおよびフィブリノーゲンに対する用量反応曲線を作成した。交叉反 応の程度は次式によって決定した。

Ｘ■因子に対する見掛けの交叉反応性が１．５％未満の抗体についてさらに検討 を進めた。各抗体について親和性定数の値を得るために用量−反応データにスキ ャッチャードの分析を行った。親和性定数が少なくとも１０’Ｍ　−’、好まし くは１０１６Ｍ−１までの抗体についてクローニングを進めた。好結果を示した クローンはサブタイプに分けた。

細胞を次に限界希釈によってサブクローン化し、再び酵素イムノアッセイを用い てβＸＩＩａに対する抗体の産生についてスクリーニングした。各クローニング から選択されたクローンはまたラジオイムノアッセイを用いて、特異性と用量反 応についても評価した。βＸＩ［ａに対する抗体を分泌するサブクローン化ハイ ブリドーマ細胞をＢａ１ｂｃマウスに腹腔内注射して腹水を生成させた。

βＸ］Ｉａに対するモノクローナル抗体を含有する腹水を産生ずる６個のクロー ン化ハイブリドーマが得られた。

ｂ）腹水からの免疫グロブリン分画の単離免疫グロブリン分画を、飽和硫酸アン モニウム溶液（等容）を用いて４℃で腹水から沈殿させた。沈殿を遠心分離し、 ５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ７，５（最初の腹水容量と等容）に溶 解し、ついで同じ緩衝液に対して透析した。蛋白質溶液を次にＭｏｎｏ−Ｑ陰イ オン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、製造業者の推奨に従って同一 緩衝液中塩勾配を用いて溶出した。免疫グロブリン含有分画をプールし、−２１ ０℃で凍結して保存した。収量は一般的に、腹水１ｍｌに対して精製抗体１〜５ ａ＋ｇであった。

Ｃ）抗体の酵素標識 腹水またはポリクローナル抗血清からの精製免疫グロブリンを、チオール−マレ イミド法（Ｅ、　Ｉｓｈｉｋａｗａら：Ｊ。

ｒｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　４　：　２０９．　１９８３）を用いてアルカリホ スファクターゼに接合させた。得られた接合体は、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　− ３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーによって 精製した。

βＸＩＩａに対するモノクローナルマウス抗体を、ＣＮＢｒ活性化５ｅｐｈａｒ ｏｓｅ−４８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、製造業者の指示に従って共有結合によ りカップリングさせた。精製［ｇＧ５〜１０ｍｇが非膨潤ゲルＩｇに結合した。

このカラムは、血漿からまたはＸＩ［因子のトリプシン消化物からのβＸＩ［ａ の単離に使用した。結合したβＸＩＩａのカラムからの溶出には４Ｍグアニジン を用い、βＸＩ［ａは溶出分画中、Ｓ−２３０２ペプチド基質（Ｋａｂｉ）を使 用して酵素活性により、または■ｓ　ｌ−標識βＸＩ［ａを用いて検出した。

ＸＩＩおよびβ−ＸＩ［ａに対する抗血清は、天然ＸＴ１因子および接合βＸＩ Ｉａを用い、標準方法によってヒツジまたはウサギで産生させた（Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＩｏｇｙ、Ｈ。

ｖａｎ　Ｖｕｎａｔｉｓ　＆　Ｊ、Ｊ、Ｌａｎｇｏｎｅ編、１９８１．７２（Ｂ ）おβＸＩ［ａのラジオイムノアッセイ 例２に記載の方法によって得られたモノクローナル抗体２０２／２．６．”’　 Ｉ−標識βＸＩＩａ、βＸＩ［ａ標準溶液および５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−１ ０’　００　（ＳＡＭ−Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）にカップリングさせたヒツジ抗− マウスＩｇＧを用い、以下の方法によって用量−反応曲線を作成した。すなわち 、モノクローナル抗体２０２／２．６腹水を検定緩衝液（０，１５Ｍ　ＮａＣ１ ，０，２５％ＢＳＡ、　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　３　ｍＭ　ＮａＮ５および０ ．１％　Ｔｒｊｔｏｎ含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，４）で１　： 　１０００に希釈した。４ｍｌ容量のポリスチレン検定チューブに二重に、検定 緩衝液中５０μｌのモノクローナル抗体溶液、５０μｌの放射標識βＸＩ［ａ溶 液および１００μｌの純粋βＸＩ［ａ標準溶液を加えた。標準溶液はβＸｎａ保 存溶液の倍加希釈によって調製した。保存溶液の濃度は次式：　Ｅ　’＊＊＊＝ 　１５．２　（Ｋ、Ｆｕｊｉｋａｗａ　＆　Ｂ、Ａ。

ＭｃＭｕｌｌｅｎ：Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２８０．　２５８　：　ｌ　０ ９２４゜１９８３）を用いて計算された。

総カウントを与える対照チューブには１５０μｍの検定緩衝液および５０μｌの トレーサー溶液を含有させた。

すべてのチューブをＶｏｒｔｅｘで混合し、ついで２１±１　”Ｃで１９時間イ ンキュベートした。この期間ののち、至適量のＳＡＭ−８ｅｐｈａＣｒｙｌを含 有する懸濁液を各チューブ（対照を除く）に加え、ついでチューブを振盪しなか ら２１±１　”Ｃで１時間インキュベートした。この工程ののち、スクロース緩 衝液（検定緩衝液＋ｌＯ％Ｗ／Ｗスクロース）を螺動ポンプを用いて各チューブ 中の反応混合物（対照を除く）の下に層とする。ＳＡＭ−Ｓｅｐｈａｃｒｙｌを ２１±１　”Ｃで３０分間沈降させたのち、各チューブから液体を除去すると、 残留物的０．３　ｍｌが得られる。対照も含めて全チューブを多重ウェルガンマ −カウンター中で６０秒間カウントした。結果は表１および添付図面の図３に示 す。後者はｌ″ｓ　１　β・ＸＩＩａの結合百分率に対するβＸＩ［ａ濃度の用 量−反応曲線である。各βＸＩ［ａ標準について得られたカウント数を総カウン ト数で除して結合百分率とした。加えた総カウントは１０，０００ｃｐｍで添加 コールド　結合百分率（％） βＸＩ［ａの濃度　平均％ （μｇ／ｍｌ）　１　２ ９０　２．１　！、８　２．０ ４５　２．３　２．４　２．４ ２２．５　２．６　３．０　２．８ １１．３　３．４　３．２　３．３ ５．６　４．６　４．０　４．３ ２．８１　５．８　６．２　６．０ １．４］　９．３　９．６　９．４ ０．７３　１３．６　１２．８　１３．２０．３５　１９．０　１９．５　１９ ．２０．１８　２４．０　２５．０　２４．５０．０９　２６．７　２６．７　 ２６．７０．０５　２９．８　２７．９　２８．８０．０２　２７．７　２８． ４　２８．００．０１　２９．２　２９．４　２９．３０．００５　２８．７　 ２８．９　２８．８０．００　２９．０　３０．２　２９．６例６ ヒトβＸＩＩａに対するマウスモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌ ｓｔｅｉｎの一般的方法によって製造した免疫原は、βＸＩＩａをツベルクリン の精製蛋白質誘導体（ＰＰＤ）に、異種二官能性試薬スルホＳＭＣＣを用いて接 合させて調製した（Ｐ、　Ｊ、　Ｌａｃｈｍａｎｏら：５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐ ｅｐｔｉｄｅｓａｓ　Ａｎｔｉｇｅｎ、Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙ ｍｐｏｓｉｕｍ　１１９．　２５〜５７．１９８６）。

Ｎ−スクシンニジミル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−）　（ＳＰＤＰ 、　６　ｍｇ）をエタノール（５ｍｌ）に溶解した。　ＰＰＤ（Ｈｅａｆ試験用 、５ｔａｔｅｎｓ　Ｓｅｒｕｍ　ｒｎｓｔｉｔｕｔ、Ｄｅｎ−ｍａｒｋ）の０． １　Ｍ　ＰＢＳ　ｐＨ７，４中５ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。

ＰＰＤ溶液（１ｍｌ）と５ＰＤＰ溶液（５μｌ）の混合物を室温で３０分間イン キュベートしたのち、生成物を０．１ＭＰＢＳ　ｐＨ７，４に対して透析した。

誘導体化されたＰＰＤをジチオスレイトール（５０ｍＭ濃度で）と室温で３０分 間インキュベートして、遊離のチオール基を曝露させた。反応混合物をついで、 １００ｍＭ塩化ナトリウム含有０．　Ｉ　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５に 対して透析した。

上記例１の記載に従って製造した精製βＸＩＩａを０．１Ｍホウ酸塩緩衝液ｐＨ ８，０に対して透析し、最終濃度を５Ｉｎｇ／ｍｌに調整した。スルホ−スクシ ンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー ｔ−（ｓｕｌｐｈｏ−ＳＭＣＣ）の溶液を０．１　Ｍホウ酸塩緩衝液ｐＨ８，０ 中に調製した。この溶液１００μｍをβＸｎａＸｎ−、スルホ−ＳＭＣＣ：βＸ Ｉ［ａのモル比が１００：１となるように添加した。混合物を室温で３０分間イ ンキュベートしたのち、０．１　Ｍ　ＰＢＳ、　ｐＨ７，４に対して透析した。

活性化βＸＩＩａと活性化ＰＰＤの等重量を４℃で１８時間インキュベートし、 ついで混合物を０．１　Ｍ　ＰＢＳ、ｐＨ７，４に対して透析した。この材料を 免疫処置に使用した。

（ｉｉ）牌リンパ球の調製 雌性Ｃ５７／ＢＩＯまたはＢａ１ｂ／　ＣマウスをＢＣＧで感作し、１日後に、 完全フロインドアジュバント中βＸ　Ｉ［ａ−ＰＰＤ免疫原２０μｇで免疫処置 した。２適間隔でマウスに、不完全フロインドアジュバント中免疫原２０μｇを ブースター投与した。２回目のブースターから２週後に融合前ブースターを静脈 内に投与し、３日後に動物を屠殺した。

マウスの免疫応答は、クロラミン−Ｔ法を用いて取り込み約５０〜７５μＣｉ／ ｍｇで製造したＩＩＩ　［−放射標識βＸＩＩａを用いるＲ［Ａによってモニタ リングした。純度は、還元条件下に行った５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオ グラフィーを用いて確認した。

ＲＩＡの操作は次の通りである。希釈した標識βＸＩ［ａ（１５，０００ｃｐｖ ａ　／チューブ）１００μｌに検定緩衝液Ｉｆ（０，５％　ｗ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ 　（商標）、１％　Ｗ／Ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０１％Ｗ／ Ｖ　ナトリウムアジド含存すン酸緩衝食塩溶液〕中に希釈した抗血清１００μｌ を添加した。さらに１００μｍの緩衝液を加え、混合物を２０℃で２０時間イン キュベートした。結合した標識βＸＩＩａは第二の抗体系（６％　ｗ／ｖ　ＰＥ Ｇおよび５０μｇの１／１００正常マウス血清を含存する検定緩衝液ＩＩ中１／ １００のＤａｋｏ抗−マウス抗体）を用いて分離した。傾瀉したのち、上溝につ いて、ガンマ−カラター中、６０Ｓ／チユーブの読取りを行った。

（ｉｉｉ）融合プロトコール 抗体力価１１５．０００以上、好ましくは１　／２０．０００以上の応答マウス から牌細胞を採取し、穏やかにホモジナイズし、３回洗浄し、ついでダルベツコ の改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁した。使用したミエローマ細胞系はＭ ＲＣＬａｔ＋ｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃ ａｍｂｒｉｄｇｅから入手したＮＳＯ（非クローン化）であった。対数増殖期の ミエローマ細胞をＤＭＥＭ中で洗浄した。

牌細胞（ＩＸＩＯ”）をミエローマ細胞（７Ｘ１０’　）と混合し、遠心分離し 、液体を除去した。得られた細胞ペレットを３７゛Ｃの水浴中の容器に取った。

１分間を要して、食塩水Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７，５中ポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ）　１５００の５０％　Ｗ／Ｖ溶液Ｉｎり１を加え、混合物を穏やかに１． ５分間攪拌した。５分間を要して、無血清ＤＭＥＭ５０　ｍｌを加え、ついで混 合物を遠心分離した。

上溝を捨て、細胞ベレットを１８％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有ＤＭＥＭ　１０ 　ｍｌに再懸濁した。得られた細胞懸濁液の一部ｌＯμｌを標準多重ウェル組織 培養プレートの４８０のウェルのそれぞれに添加した。各ウェルは標準ＨＡＴ培 地（ヒボキサンチン、アミノプテリン、チミジン）２ｍｌとＢａ１ｂ／Ｃ細胞の フィーダ一層５Ｘ１０’マクロファージ／ウェル濃度を含有した。ウェルを９％ ＣＯ３大気中、湿度９０％、３７℃に保持した。ウェルについて下記のようにモ ノクローナル抗体の産生を分析した。抗体産生細胞を生成したウェルから細胞を 採取し、標準限界希釈クローニング操作によってクローン化した。

（ｉｖ）固相酵素イムノアッセイを用いるハイブリドーマのスクリーニング ハイブリッドを示すすべてのウェルを以下のように固相酵素イムノアッセイ（Ｅ ＩＡ）を用いてスクリーニングした。

９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ、 　Ｐｏ１ｙｓｏｒｂ力タログ番号４−７５０９４）を上述の例１の記載に従って 得られた精製βＸＩ［ａにより、ＭＥＳ−食塩溶液（２０１ｎＭ２−（Ｎ−モル ホリノエタンスルホン酸）、１５０ｍＭ食塩、ｐｏ　６．５）中ｌμｇ／ｍｌの 溶液１００μ】を用いて一部コーティングし、ついでＭＥＳ−食塩溶液中１％乳 蛋白質を用いてブロックした。増強ＭＥＳ−食塩溶液（０，０５％ｗ／ｖ　Ｔｙ ｔｅｅｎ、１％ｗ／ｖ　ＢＳＡおよび０．０５％Ｗ／Ｖチメロサール含有ＭＥＳ −食塩溶液）中１：１に希釈した細胞培養上清をウェルに加え、３７℃で１時間 インキュベートしたのち、ウェルを０．０５％ｗ／ｖ　Ｔｗｅｅｎおよび０．０ ５％　Ｗ／Ｖ　チメロサール含有ＰＢＳで３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダ ーゼ標識抗−マウスＩｇＧ　（Ｂｉｏ−ｒｅｄ、抗−Ｈ繊持異的）を増強ＭＥＳ −食塩溶液中１：２５００に希釈して添加した。さらに３７℃で１時間インキュ ベートしたのち、ウェルを再び洗浄し、基質溶液（０，１Ｍクエン酸塩、ｐ）１ ５．０中６　ｍＭ　ＨｔＯ＊および４０ｍＭ０−フェニレンジアミン）１００μ ｌを加えた。３Ｎ　ＨＣｌ１００μｍで発色を停止させ、吸収を４９２ｎｍで測 定した。βＸＩＩａとＸＩＩ因子の結合の間に良好な区別を示したウェルを抗血 清曲線分析で１！ｓ１−標識に対して滴定した。標識βＸＩ［ａの結合と力価１ ０中１以上を示したすべてのウェルを、用量反応およびＸ■因子との交叉反応の 程度の式■を用いた分析に付した。

この予備的データから見掛けの交叉反応性１．５％を示す６個のハイブリドーマ を選択してクローニングを行った。

各県からの代表的クローンを、Ｘ■因子（ＦＸＩ［）、プラスミンおよびフィブ ロネクチンとの交叉反応性について、ＲＩＡによりさらに分析した。表２には、 Ｘ■因子に対する見掛けの交叉反応性を決定するため、３個の好ましいクローン についての用量反応曲線を示す。

表　２ 一部のクローンのＸｌｒ因子に対する見掛けの交叉反応性を測定するためのＲＩ Ａ用量反応 クローン番号 ＦＸＩ［ａの濃度　２０１／９　２／２１５　２／１５ｎｇ／ｍｌ　結合％ ０．０　１００　１００　１００ ０、５　９５　８７　８７ １．０　９１　８７　？９ ２、５　７６　５６　５７ ５、０　５８　３３　４０ １０．０　３２　１７　２１ Ｘｌｒの濃度 ｎｇ／ｍ１ 用量反応曲線に対してスキャブチャード分析を行い、親和性定数（Ｋａ）の値を めた。３個の好ましい細胞系についてのデータを以下の表３に、Ｘ■因子に対し て高い交叉反応性を示す他のクローンについての一部のデータとともに示す。

（ｖ）ＸＩＩ因子との補正交叉反応性の評価抗−βＸＩ［ａ抗体とＸ■因子の交 叉反応性の評価に際して考慮すべき因子は、「純粋なＪＸＩ［因子であっても少 量のＸＩＩａの夾雑はほとんど避けられないということであるＣＣ８１ｌｖｅｒ ｂｅｒ　＆　Ｋａｐｌａｎ：Ｂｌｏｏｄ　６０　：　６４〜７０゜１９８２）。

この夾雑はほとんどの目的において重要ではないが、少量のＸＩ［ａの存在でも 、抗−βＸＩ［ａ抗体のＸ■因子との交叉反応性の検討結果には明らかに影響す る。したがって、交叉反応性の測定に使用したＸ■因子サンプル中のβＸＩ［ａ のレベルの評価を行うことが必要と考えられた。＞　１０ｎｇ／　ｍｌのレベル の夾雑も検出できるＸＩ［ａの色原体アッセイを使用した。

Ｘ■因子サンプル中のＸＩＩａ濃度の測定［純粋なＪＸＩＩ因子中に存在するＸ Ｉ［ａのアミド分解活性は、５０μｍのβＸＩ［ａ標準または予めＸ■濃度を測 定したＸ■因子サンプル（吸収係数の測定によって定量；　Ｆｕｊｉｋａｗａ　 ＆　ＭｃＭｕｌｌｅｎ、前出、参照）に、６５ＩＩＩＭＴｒｉｓ、　１３５　ｍ １食塩、０．０１％ＢＳＡ、ｐＨ８中２＋ｎＭＰｒ。

−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリン（Ｓ　２３０２．Ｋａｂｉ）２００μｌ を添加して測定した。室温で６０分間インキュベートしたのち、４０５ｎｍの吸 収の測定により、基質の加水分解を定量した。サンプルのアミド分解活性をβＸ Ｉ［ａ標準の場合と比較した。得られた結果を以下の表４に示す。

表　４ βＸＩ［ａおよびＸ■因子のアミド分解活性サンプルまたは　４０５ｎ０１の　 βＸＩＩａ標準の濃度　吸収　（ｎｇ／ｍｌ） βＸＫａ標準 ０　０、０６ １０　０、１０ ２５　０．１５ ５０　０、２５ １００　０、４１ Ｘ■因子サンプル １２００　０、０９　＜１０ １２０００　０、３０　６０ ２４０００　０、５０　＞１００ Ｘ■因子のβＸＩＩａによる夾雑％は次式によって計算した。

得られた結果はＸＩ［因子のＸＩ［ａによる夾雑は０．５〜０．８％の範囲内で あることを示している。

βＸＩ［ａについてのイムノアッセイを、以下の例７に記載のモノクロナール抗 体接合体２０１／９および２０２／１６．１．９を用いて実施した。使用したβ ＸＩＩａ標準およびＸ■因子サンプルの濃度は上述の色原体試験に記述した通り であった。結果は表５に示す。

βＸｎａ濃度ｎｇ／ｍｌ　５５０　ｎｍの吸収０．０　０．１１４ １．０　０．２１３ ２、５　０．３５４ ５、０　０．５８７ １０、０　０．９９９ １５、０　１．４０５ ２５、０　１．９６０ Ｘ■因子の濃度μｇ／ｍｌ　５５０ｎｍの吸収０、２３　０．２６６ ０、４６　０．３２２ １、２０　０．６５２ ２．３０　１．０６５ ５、８０　１．９０５ 見掛けの交叉反応性は０．５％の領域にあると計算されたが、上述のようにＸ■ 因子のＸＩ［ａによる夾雑を考慮に入れると、補正された交叉反応性は０．１％ 未満であることがわかった。

（ｖｉ）抗体の製造 βＸＩ［ａに対する抗体を分泌するサブクローン化ハイブリドーマ細胞を、Ｂａ １ｂ／Ｃマウスの腹腔内に注射して腹水を産生させるか、または培養液中で増殖 させた。

腹水から４℃で、等容量の飽和硫酸アンモニウム溶液を用いて免疫グロブリン分 画を沈殿させた。沈殿を遠心分離し、最初の腹水と同じ容量の２０　ｓ＋Ｍ　Ｔ ｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ７，５（緩衝液Ａ）に溶解させ、ついで同一の緩衝液 に対して透析した。蛋白質溶液を次に、ＰｈａｒｍａｃｉａのＦＰＬＣ（商標） 装置を用い、Ｍｏｎｏ−Ｑ　（商標）陰イオン交換カラム（ＨＲ１０／　１０　 Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で分画化した。溶出は緩衝液Ａと緩衝液Ｂ　（ＩＭ　Ｎ ａＣ１を添加した緩衝液Ａ）の勾配を用い、２ｍ１／分の流速で実施した。溶出 液は２８０ｎｍでモニタリングし、１ｍｌの分画毎に収集した。

免疫グロブリンを含有する分画をプールし、−２０℃で凍結して保存した。

培養液からの免疫グロブリン分画の単離にも実質的に同じ方法を使用した。

（ｖｉｉ）ハイブリドーマの寄託 ハイブリドーマ細胞系は以下のように、ＩＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＰＨＬＳ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄｆ）ｅｓｅａｒｃｈ、Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、 ５ａｌｉｓｂｕｒｙ　ＳＦ３．ＯＪＧ、Ｅｎｇｌａｎｄに寄託された。

２／２１５　（ＢＦＸｌｌａ）１９９０年１月１６日寄託、寄託番号９００１１ ６０Ｂ。

２０１／９　（ＥＳＢＴ４　１．１）１９９０年１月１８日寄託、寄託番号９０ ０１１８９３゜ ２０２／１６．１．９　（Ｅ！５ＢＴ９２．９）　１９９０年１月２５日寄託、 寄託番号９００１２５１２豊ユ モノクローナル抗体２／２１５を用いたアッセイ９６ウエルマイクロタイタープ レートのウェルを抗体２／２１５で、コーティング緩衝液（０，１％ナトリウム アジド、０．０２％硫酸ゲンタマイシン含有０．１５Ｍ食塩、０、１　Ｍリン酸 緩衝液、ｐＨ７，４）中抗体の５μｇ７’ａｌブレバレージョンをウェルあたり １００μｌ用い２０〜２５℃において一部コーティングした。

ヒト血漿サンプルまたはβＸＩ［ａ標準１００μｍをウェルに加え、プレートを ２０〜２５℃で１時間インキュベートした。次に、各ウェルを洗浄緩衝液（１０ ｍＭホウ酸塩緩衝液、５０ｍＭ食塩、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，０， ０５％ナトリウムアジド（ｐＨ７，４）で洗浄したのち、予メチオールーマレイ ミド法（Ｅ、　Ｉｓｈｉｋａｗａら：Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ−ａｓｓａｙ　４　： 　２０９．　１９８３）を用いてアルカリホスフ１．９はＸＩＩ因子高交叉反応 性抗体である）の混合物を添加した。抗体接合体はそれぞれβＸＩ［ａに対して 滴定して至適希釈度を決定した。ついで接合体はこれらの希釈度で混合した。接 合体の希釈液は０．１　Ｍ食塩、１ｍＭ塩化マグネシウム六水和物、０．　Ｉ　 Ｍ　Ｔｒｉｓ、　０．１　ｍＭ塩化亜鉛、０．１％ｗ／ｖ　ナトリウムアジド、 ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および１％ＢＳＡである。２０〜２５℃で１ 時間インキュベートしたのち、各ウェルを再び洗浄緩衝液で洗浄した。

プレートを吸着剤パッド上に押しつけて液体を吸取ったのち、フェノールフタレ ンーリン酸基質溶液（０，０２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ含有０．５Ｍジェタノールア ミン、ｐＨ８，６中１．０ｇ／リットル　フェノールフタレンーリン酸（ＰＮＰ ））　１００μｍを添加した。プレートを２０〜２５℃で１５分間インキュベー トしたのち、停止溶液（０，４Ｍ炭酸ナトリウム、０．１Ｍ３−（シクロへキシ ルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸四ナト リウム塩、０．４Ｍ水酸化ナトリウム）１００μｌを加えて基質の加水分解を停 止させた。停止溶液の添加後、５５０ｎｍの吸収を測定した。

結果を以下の表６に示す。

表　６ βＸ１ｌａｔｌｌ準およびヒト血漿サンプルの５５０ｎｍの吸収５５０ｎｍの吸 収　βＸＩＩａ濃度（ｎｇ／ｍ１）ｏ、ｏ　ｏ、ｏ　ｏ、ｏ標準 ０．０４７　、０．０５０　１．０標準０．１２０　、０．１１８　２．５標準 ０．２６４　、０．２４７　５．０標準０．５８３　、０．５５６　１０．０標 準１．５４９　、１．４７８　２５．０標準０．３４７　、０．３１４　６．４ 　、６．０サンプル０．２４５　、０．２４４　４．８　、４．８サンプル０． ３８７　、０．３７６　７．０　、６．９サンプル０．３６４　、０．３００　 ６．６　、５．８サンプル０．３３０　、０．３１０　６．２　、５．８サンプ ル０．４３７　、０．４５７　７．８　、８．２サンプル０．１４０　、０．１ ４３　２．８　、２．８サンプル０．１７９　、０．１？３　３．６　、３．５ サンプル０．４５４　、０．４３６　８．２　、７．９サンプル０．３１６　、 ０．３０２　６．０　、５．８サンプル例８ ポリクローナル抗血清から精製した抗体を用いたアッセイ 抗体２０１／９および２０２／１６．１．９の代わりに、例４の記載のようにＸ ■因子に対して産生されたポリクローナル抗血清から得られ、ついで例６の記載 のようにアルカリホスファターゼに接合させた抗体を用いる以外は、例７の記載 と同様にしてアッセイを行った。

βＸＩ［ａ濃度ｎｇ／ｍｌ　５５０　ｎｍの吸収０　０．０４８　、０．０５４ １０　０．２０９　、０．２０５ ２５　０．４００　、０．３９６ ５Ｇ　０．５６４　、０．５４７ ７５　０．７２１　、　０．６８９ １００　０．７７４　、　０．７７７ １２５　０．８２３　、　０．８１６ １５０　０．８２３　、　０．８４５ ２００　０．８９１　．０．９１１ 例８に記載したと同様に、予めモノクローナル抗体２／２１５でコーティングし たマイクロタイタープレートのウェルに、βＸＩ［ａ標準１００μｌを添加した 。プレートを２０〜２５℃で１時間インキュベートした。次に、各ウェルを洗浄 緩衝液（例７参照）で洗浄したのち、色原体基質溶液（２ｍ１Ｊ　Ｓ２３０２　 （Ｋａｂｉ　Ｄｉｇｎｏｓｔｉｃａ。

Ｕｘｂｒｉｄｇｅ）　６５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１３５　＋ｎｌＪ食塩）２００ μｍを添加した。３７°Ｃで１時間インキュベートしたのち、各ウェルに１％酢 酸５０μｌを加えて反応を停止させた。マイクロタイタープレートリーダーを用 いて４０５ｎｍにおける吸収を測定した。

結果は表８に示す。

βＸ　Ｉｆ　ａ濃度ｎｇ／ｍｌ　４０５　ｎｍの吸収０　０．０５８　、０．０ ５７ １０　０．０７７　、０．０７２ ５０　０．１４８　、０．１５５ １００　０．２４１　．０．２２６ １５０　０．２７５　．０．２９３ ２００　０．３０８　．０．３００ ２５０　０．３１０　．０．３０６ 注意：このアッセイ法はβＸＩ［ａ濃度的１０ｎｇ／ｍ１未満では正確ではなく 、血漿サンプル中のβＸＩ［ａの定量に十分な感度はない。しかしながら、もっ と高い濃度のβＸＩ［ａたとえば、単離および精製時、ならびに得られた製品バ ッチにおけるβＸＩｒａの評価には有用である。

劾 補正書の翻訳文提出書　（靜法帽８４条（＋）８）

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．βＸＩＩａ因子に結合し、ＸＩＩ因子には実質的に結合を示さないモノクロ ーナル抗体。
2. ２．αＸＩＩａ因子にも結合する「請求項１」記載のモノクローナル抗体。
3. ３．ＸＩＩ因子との補正された交叉反応性は０．１％またはそれ未満である「請 求項１または２」記載のモノクローナル抗体。
4. ４．　ハイブリドーマ細胞系２／２１５（ＥＣＡＣＣ９００１１６０６）もしく はそのリクローン、またはハイブリドーマ細胞系２０１／９（ＥＣＡＣＣ９００ １１８９３）もしくはそのリクローンによって産生されるモノクローナル抗体。
5. ５．検出可能な標識が付与されている「請求項１〜４」のいずれかに記載のモノ クローナル抗体。
6. ６．　固定支持体に固定化された「請求項１〜４」のいずれかに記載のモノクロ ーナル抗体。
7. ７．　「請求項１〜４」のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイ ブリドーマ細胞系、またはそのリクローン。
8. ８．　ハイブリドーマ細胞系２／２１５（ＥＣＡＣＣ９００１１６０６）もしく はそのリクローン、またはハイブリドーマ細胞系２０１／９（ＥＣＡＣＣ９００ １１８９３）もしくはそのリクローン。
9. ９．　「請求項１〜４」のいずれかに記載のモノクローナル抗体を製造する方法 において、その抗体を産生できるハイブリドーマ細胞系を増殖培地中で培養し、 増殖培地から抗体を得る方法。
10. １０．βＸＩＩａ因子に結合し、ＸＩＩ因子に実質的に結合を示さないモノクロ ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を生成させる方法であって、動物に 抗原を投与して抗体産生細胞を得、得られた抗体−産生細胞をミエローマ細胞と 融合し、得られたハイブリドーマをモノクローナル抗体の産生についてスクリー ニングし、この場合、抗原はβＸＩＩａ因子またはその抗原性フラグメントであ る方法。
11. １１．液体サンプル中の抗原のイムノアッセイを実施する方法であって、抗原と それに結合する抗体との間で相互作用させ、既知の抗原の既定量を用いて得られ た結果を参照してサンプル中に存在する抗原の量を決定することからなるアッセ イであり、この場合、抗体は「請求項１〜４」のいずれかに記載のモノクローナ ル抗体であり、既知抗原はβＸＩＩａ因子である方法。
12. １２．サンプル中のＸＩＩａ因子またはβＸＩＩａ因子を検出および／または定 量する方法であって、サンプルを、抗原と抗体の間で相互作用を行わせて得られ た抗体−抗原複合体を検出および／または定量する定性的または定量的イムノア ッセイに付すことからなり、この場合、抗体は「請求項１〜４」のいずれかに記 載のモノクローナル抗体である方法。
13. １３．液体サンプルはヒト被験者から得られた血漿サンプルであり、その被験者 の心臓疾患する罹病性を決定するために、検定サンプル中の抗原レベルについて 得られた結果を、検定抗原レベルと心臓疾患への罹病性の相関の大規模な検討で 得られた結果と比較する「請求項１１または１２」に記載の方法。
14. １４．「請求項１１〜１３」のいずれかに記載のイムノアッセイを実施するため のキットであって、別個の容器内に入れるかまたは他の分画化方法によって、「 請求項１〜４」のいずれかに記載のモノクローナル抗体、およびβＸＩＩａ因子 またはその抗原性フラグメントを包装したキット。
15. １５．「請求項１１〜１３」のいずれかに記載のイムノアッセイを実施するため のキットであって、別個の容器内に入れるかまたは他の分画化方法によって、ａ ）（ｉ）「請求項１〜４」のいずれかに記載の、所望により固体支持体上に固定 化されたモノクローナル抗体、または（ｉｉ）βＸＩＩａ因子もしくはその抗原 性フラグメント、または（ｉｉｉ）「請求項１〜４」のいずれかに記載の抗体に 対する抗体もしくは所望により固体支持体上に固定化されたその抗体、ｂ）（ｉ ）直接もしくは間接にβＸＩＩａ因子と反応可能な標識抗体、または（ｉｉ）標 識βＸＩＩａ因子、または（ｉｉｉ）βＸＩＩａ因子に対する色原体基質、およ びｃ）精製βＸＩＩａ因子もしくはその抗原性フラグメントである対照試薬を包 装したキット。