JPH037597A - 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体、その製造方法および心筋壊死の判定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、心筋トロポニンＴに対する特異的抗体、その
製造方法および心筋壊死測定用の免疫学的試薬に関する
。

（従来の技術） 横絞筋の筋原線維は、共同して作用する２種類のタンパ
クフィラメントからなっており、厚いフィラメントは主
要成分としてミオシンを有しており、薄いフィラメント
はアクチン、トロポミオシンおよびトロポニンを含有し
ている。調節構造タンパクであるトロポニンは、細胞中
で凝集して複合体を形成し、３種類の異なるタンパク カルシウムイオンと結合するトロポニンＣ（分子量１８
０００） アクチンと結合するサブ−ユニットである、トロポニン
Ｉ（分子量２４０００） トロポミオシンと複合するトロポニンＴ（分子量３７０
００） からなっている。

この共通する命名は、複合物がそのようなものとして始
めて精製され、単一のタンパクとみなされ、トロポニン
と命名されて以来の歴史的な理由を有している。後に、
実際には、トロポニンが３種類の異なるタンパクからな
っていることが証明されたが、収縮性器官の薄いフィラ
メント上での各タンパク間の位置関係、および筋肉収縮
の調節に関するそれらの協調性の故に、この命名が維持
された。しかし、それらは、ミオシンまたはアクチンの
ような収縮性器官の他のタンパクに機能的に関連してい
るが、異なるアミノ酸配列を有する３種類の異なるタン
パクである。

重篤な虚血または筋肉細胞壊死が長（続くと、トロポニ
ンＩは血漿に達し、従って、トロポニン！はそのような
疾患のパラメーターであり、既知の梗塞形成酵素ＣＫ、
ＣＫ−ＭＢ、ＧＯＴおよびＬＤＨと同様に診断や、モニ
ターに使用することができる。

しかし、ＣＫおよびＣＫ−ＭＢの測定は梗塞に対して全
く特異的ではなく、梗塞の８０〜９０時間後に血清中で
増加するにすぎないことが証明されている。また、ＧＯ
ＴおよびＬＤＨも、量の増加が多くの他の疾患において
も血液中に見られるが故に心筋に対して特異的ではない
。

心臓トロポニンｌの測定の欠点は、通常、血清が既にト
ロポニンＩをＬ　Ｏｎ９／　ｄの濃度で含有しているこ
とである［ビー・カミンズ（Ｂ、　ＣｕｔＩｌｍｉｎｓ
）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・セルー
ラー・カージオロジ−（ＪｌＭｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｃ
ａｒｄ、　）　１９（１９ｇ？）、９９９−１０’ＩＯ
およびビー・カミンズ（Ｂ、　Ｃｕｍｍ１ｎｓ）、クリ
ニカル・アンド・インベスティゲイティブ・メディスン
（ＣＩｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）　１１３（１９８７）
　１３３３−１３４４参照］。そのため、壁内梗塞にお
いて２相の血清濃度が生じる。平均すると、急性壁内梗
塞を有する３７人の患者において、疼痛開始の後、４時
間口から１６８時間時間口トロポニン■が増加した。動
物モデルにおいても、同様の結果が得られた。が＜して
、トロポニン１について、梗塞発生の後の１０時時間口
ら５０時時間口絶対的診断感度（ａｂｓｏｌｕｔｅ　ｄ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃ　５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）の時間
となると考えられる。すなわち、感度の制約とは別に、
トロポニンＩの血清レベルが変化するため、梗塞発生の
後のＩＯ日日間たはそれ以上の臨床上ＭｖＪなモニター
はトロポニンＩの測定によって行うことはできない。

（発明が解決しようとする課題） したがって、本発明の目的は、これらの欠点を解消し、
心筋梗塞および心筋に対する他の損傷において少なくと
も１５０時間（絶対的診断感度の持続）モニターが可能
な測定方法を提供することである。

（課題を解決するための手段） この目的はトロポニンＴに対する少なくとも１つの抗体
およびトロポニンＴまたは該抗体の結合相手Ｂと一緒に
血清または血漿試料をインキユベートシ、それによって
、トロポニンＴに対する抗体または結合相手Ｂのいずれ
かを測定可能な基で標識し、こうして生成する測定可能
な基を含有する免疫学的複合体を単離し、単離した相ま
たは残りの相中の該測定可能な基を試料由来のトロポエ
ンＴの尺度として測定することを特徴とする免疫検定法
による心筋壊死の測定方法によって達成される。

結合相手Ｂは、トロポニンＴに対する抗体またはトロポ
ニンＴと結合しなければならない。結合相手Ｂは、例え
ば、トロポニンＴに対する第２の抗体またはヒトもしく
は動物由来のトロポニンＴ１または抗体によって結合さ
れるそれらの類似物であってもよい。

ｌは、トロポニンＴに対する抗体およびトロポニンＴに
対する別の抗体と測定可能な基とのコンジュゲート（結
合体）と−緒にインキュベートするのが好ましく、形成
された免疫学的複合体を相分離によって単離し、いずれ
か一方の相中の該測定可能な基を測定する。

さらに、トロポニンＴに対する抗体およびトロポニンＴ
と測定可能な基とのフンシュゲートと共に試料をインキ
ュベートし、形成された免疫学的複合体を相の分離によ
って単離し、いずれか一方の相中の該測定可能な基を測
定することが好ましい。

驚（べきことに、心筋壊死（例えば、心筋梗塞、虚血ま
たは狭心症などによる）の測定においては、トロポニン
Ｔ免疫検定法によるほうが、ＣＫ、ＣＫ−ＭＢ、ＧＯＴ
、ＬＤＨまｆ：、はト０ポニ７１（Ｄような他のパラメ
ーターの測定によるよりも有意に高い感度が得られるこ
とがわかった。本発明者らにより確証されたように、こ
の理由は、収縮性器官の他のタンパクとは異なり、試験
の検出限界（０，２５ｎ９／ｘρ）までのトロポニンＴ
の血清ｌ農度を測定するものではないからである。

このことは、トロポニン類間の機能的な関係からトロポ
ニンＩの血清濃度と同様の血清濃度がトロポニンＴに対
して予想されているところからすれば、非常に驚くべき
ことである。さらに、トロポニンＴの血清濃度曲線は、
例えば、壁内梗塞において、トロポニン１の曲線とは有
意に異なっている。トロポニンＩと異なり、経時変化の
曲線は、２相の代わりに３相となり、トロポニンＴは、
疼痛開始の３００時間後まで平均して増加することが判
明している。絶対的診断感度の時間は６時間目から１９
５時間目まで持続する。か（して、絶対的診断感度の時
間は、トロポニン１について知られている時間のほぼ４
倍である。

ラジオイムノアッセイ、酵素免疫検定法、蛍光免疫検定
法等のような全ての通常の免疫検定法は、基本的に本発
明における免疫検定法に適している。

さらに、これらの方法の変法（例えば、競合免疫検定法
、ＩＥＭＡ法等）の全てが適用される。サンドウィッチ
試験が、トロポニンＴの測定に特に有効であることが証
明された。この試験方法では、トロポニンＴに対する固
定化抗体およびトロポニンＴに対する抗体と測定可能な
基とのフンシュゲートを使用する。この試験法の様々な
変形およびこれらの方法の実施に関する詳細は、文献に
充分に記載されている。しかし、例えば、ドイツ特許出
願ＤＥ−Ａ３８３４７６６および／またはＤＥ−Ａ３８
２２７５０に記載されているような他の免疫学的測定法
も本発明に係る抗体を用いることができる。

本発明においては、抗体には、完全抗体、キメラ抗体、
二価抗体およびそれらのフラグメントが包含される。使
用されるトロポニンＴに対する抗体は、ポリクローナル
またはモノクローナルであってよい。好ましくは、モノ
クローナル抗体が使用される。

サンドウィッチ試験において、好ましい具体例として、
トロポニンＴに対する少なくとも２つの抗体を試料溶液
と共にインキュベートする。これによって、第１の抗体
は固相との結合を仲介する。

このために、この抗体は、直接またはスペーサーを介し
て固相と結合するか、または可溶性の形態で存在して免
疫学的反応が行われた後にだけ、固定化することができ
得る。第２の抗体は、ある種の基で直接標識化するか、
または機能的結合によって測定可能な基と結合すること
ができる。このために、該抗体は、特異的結合対の一方
と結合することができ、該測定可能な基は特異的結合対
の他方と結合することができる。第２の抗体および測定
可能な基を含有する複合体が、反応の間に形成される。

第１の抗体の担体への結合（固定化）は、公知の方法に
従って、吸着、化学結合または特異的結合対を介する機
能的な結合によって行われる。

この場合、結合対の一方は固定化されるが、他方は、抗
体と化学的に結合する。次に、この結合対を介して免疫
学的測定反応の前またはその間に抗体を固定化すること
ができる。このような結合対の例としては、ビオチンス
トレプトアビジン／アビジン、ハプテン−抗体、抗原−
抗体、糖−レクチン、ハプテン−結合タンパクが挙げら
れる。

競合試験は、該試験のさらに好ましい変形例である。こ
の場合、測定の前またはその間に固定化されるトロポニ
ンＴに対する抗体、およびトロポニンＴと測定可能な基
とのコンジュゲートが使用される。

本発明に係る抗体の固定化またはトロポニンＴの固定化
のための担体、例えば、チューブ、プラスチック製キ１
ベット、微量滴定プレート、ビーズまたはプラスチック
製微小担体の材料として、ポリスチレン、ビニルポリマ
ー、ポリプロピレン、ポリカーボネート、多糖類、シリ
コーン、ゴムもしくは処理ガラスのような材料を使用す
ることができる［例えば、イー・ティー・マギオ（Ｅ、
Ｔ、　Ｍａｇｇｉｏ）、′エンザイム・イムノアッセイ
°’（ｌＥｎｚｙｍｅ　１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、シ
ーｅニー時シー・ブレス、フロリダ（１９８０）、特に
第１７５−１７８頁；　ＥＰ−Ａ−０６３０６４；バイ
オエンジニアリング（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）
　１６　（１９７４）、９９７．−１００３　；シー・
ジェイ・センダーソン（Ｃ，Ｊ。

５ｅｎｄｅｒｓｏｎ）およびデイ−・ブイ・ウィルソン
（Ｄ、ＶＷｔｌｓｏｎ）、イムノロジー（１ｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ）　２０　（１９７１）、１０６１−１０６５
参照］。特に、アビジンまたはストレプトアビジンで被
覆された担体材料、とりわけポリスチレンが使用され、
好ましくは、Ｅ　Ｐ−Ａ−０２６９０９２に記載された
方法に従って調製される。同様に、結合相手Ｂはトロポ
ニンＴもしくはその類似物またはトロポニンＴと特異的
に結合できるモノクローナル抗体のいずれかを含んでお
り、標識化される。個々の測定方法のための通常の試薬
が標識化に好適である。すなわち、ラジオイムノアッセ
イでは、標識化のために６７Ｃｏのような放射性同位元
素が使用される。酵素−免疫検定法法に一般的に使用さ
れる全酵素が適しており、例えば、ペルオキシダーゼま
たはβ−ガラクトシダーゼが適している。通常の蛍光性
の基は、蛍光免疫検定法のための標識として好適である
。これら様々な試験法の詳細および該方法の変法は公知
である。トロポニンＴまたは抗体と標識との結合は、固
相との結合と類似の方法で、すなわち共有的にまたは特
異的結合対を介して行うことができる。

抗体またはトロポニンＴは、公知の方法に従って、前記
の結合相手のうちの一方と、例えば、カルボジイミドお
よびヒドロキシスクシンイミドを介して、共有結合させ
る。

酵素標識としてペルオキシダーゼ（Ｐ　ＯＤ）を用いる
のが好ましい。

また、本発明のもう１つの態様は、ヒト骨格筋トロポニ
ンＴとの交差反応が５％未満であり、トロポニン！およ
び他の筋原線維タンパクとの交差反応が２％未満である
、心筋トロポニンＴと特異的に結合できるポリクローナ
ル抗体の製造方法を提供するものである。この方法は、
試験動物、好ましくはヒツジを、数カ月（好ましくは４
〜６力月）かけて、４〜６週間おきに少なくとも４回ヒ
ト心筋トロポニンＴおよびアジュバントで免疫化し、生
の血清を単離し、それを免疫吸着的に精製することから
なる。

さらに、本発明のもう１つの態様は、ヒト骨格筋トロポ
ニンＴとの交差反応が５％未満であり、トロポニンＩお
よび他の筋原線維との交差反応が２％未満である、心筋
トロポニンＴと特異的に結合できるモノクローナル抗体
の製造方法を提供するものである。この方法は、試験動
物、好ましくは近親交配させたマウスを、数カ月かけて
、４〜６週間おきに少なくとも４回、ヒト心筋トロポニ
ンＴおよびアジュバントで腹腔内的に免疫化し、８９２
２球を単離し、永久骨髄腫セルライン（細胞系統）と融
合し、クローンを単離し、それらから抗体を単離するこ
とを特徴とする。

好ましくは、水酸化アルミニウムおよびボルダテラ・ベ
ルツシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
）またはフロイントアジ−パントをアジュバントとして
使用する。

よ（知られたケーラー（ＫΦｈｌｅｒ）およびミルスタ
イン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　［ネイチ−ｒ−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　２５６　（１９７５）、４９５−４９７１の方
法に従って、融合の間に得られるハイブリッド細胞の１
次培養を、通常の方法で、例えば市販の細胞ソフタ−を
用いて、または“限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｉｌ
ｕｔｉｏｎ）”によって、クローンする。これらの培養
をさらに用いて、単離した心筋トロポニンＴおよび患者
の血清中の心筋トロポニンＴと陽性に反応させ、骨格筋
から得たトロポニンＴと陰性に反応させる。このように
して得られたハイブリドーマセルラインが本発明のモノ
クローナル抗体を生成する。公知の方法に従って、これ
らのセルラインを培養することができ、それらから生成
したモノクローナル抗体を単離することができる。

この方法で得たハイブリドーマセルラインの例としては
、クローン７、１　Ａ　１２．２−２２（ＥＣＡＣＣ８
９０８０９０１）およびクローン８．１　Ｆ　６．７−
２（ＥＣＡＣＣ８９０３０３０８）が挙げられる。該セ
ルラインは、ヨーロピアン・コレクション−オブーアニ
マル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅｓ）　（イギリス）に各々引用した番号の下
に寄託されている。

このようにして得たポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体は、ヒト骨格筋トロポニンＴに対する交差反
応性が低く、５％未満であり、好ましくは２％未満であ
ること、およびトロポニンＩおよび他の筋原線維タンパ
クとの交差反応性が２％未満であることによって区別さ
れる。

本発明のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
は、血清または血漿のような試料において心筋壊死の特
異的測定に特に適している。抗体は、そのままでこれら
の測定法用として、またはキメラ抗体またはそのフラグ
メント、例えば、対応する免疫学的性質を有するＦａｂ
フラグメントとして用いることができる。か（して、「
抗体」なる用語は、完全抗体およびそのフラグメントを
包含する。

（実施例） 以下の実施例および添付の図面によって、本発明を説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。パー
セントは、重量％を意味する。

実施例１ トロポニンＴの単離 緩衝液１： ０．０５モル／Ｑ　トリス（Ｔｒｉｓ）／　ＨＣＱ、ｐ
Ｆｆ７．００．０５モル／ＱＫＣＱ １０酎／１２　　トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　　１
００２ミリモル／１２　ＥＤＴＡ ０．５ミリモル／σＤＴＴ（ジチオトレイトール）０．
０２％アジ化ナトリウム ２ミリモル／Ｑ　ＰＭＳＦ’（フッ化フェニルメチルス
ルホニル） ５ミリモル／（２アミ／カブａン酸 ２、５ｘＱ／　トラジロール（Ｔｒａｓｙｌｏｌ）／　
Ｑｏ、　２Ｒ９ペブスクチン（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）／
ｆ２緩衝液２： ０、０５％ル／２　　ト’）　ス／　ＨＣ（１、ｐＨ７
，０１モル／ＱＫＣＱ ５モル／Ｑ尿素 ２ミリモ＃／（７ＥＤＴＡ ０．０２％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）緩衝液３： ５ミリモル／Ｑリン酸カリウム、ｐＨ７，３２モル／Ｑ
尿素 ０．６モル／１２　ＫＣｌ２ ０．５ミリモル／１２ＤＴＴ ０、０２％アジ化ナトリウ、ム（ｔｖ／ｖ）緩衝液４： ０．０５モル／１２　トリフ、／ＨＣ（ｌＳｐＨ７，８
６モル／Ｑ尿素 ０．０１モル／（ｌＮａｃＱ ２ミリモル／１２ＥＤＴＡ ０．５ミリ％ル／（ＩＤＴＴ ０．０２％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）組織（弁および
血管を除いた左心室）３００９を小片に切り刻み、４℃
で最高１分間、４容量倍の緩衝液１中においてミキサー
で断続的にホモジナイズした。４℃で１５分間、２７５
００９で不溶性成分を遠心分離・し、上清が完全に透明
になるまでペレ・ノドを１ｇの緩衝液■で洗浄した。

このペレットを、５〜６容量倍の緩衝液２に取り、４°
Ｃで３〜４時間撹拌した。これを４°Ｃで１５分間、２
７５００　ｇで遠心分離した。

５ミリモル／ＱＡＴＰを上清に添加しく硫酸アンモニウ
ムの添加後の最終濃度）、４°Ｃの硫酸アンモニウム飽
和水溶液／２ミリモル／ＱＥＤＴＡの添加によって、３
５％硫酸アンモニウムにした。

硫酸アンモニウム溶液は予めＫＯＨで中和しておいた。

ゆっくりと撹拌しながら、４°Ｃで一晩インキユベート
した。その後、４℃で２０分間、２７５００９で沈澱物
を遠心分離した。

上清に固形の硫酸アンモニウムを添加して硫酸アンモニ
ウム４５％飽和にし、４°Ｃで４５１撹拌し、遠心分離
した。３５〜４５％硫酸アンモニウム沈澱物は、トロポ
ニンＴを含有しており、さらに処理した。ベレットを２
５ｘ１２の緩衝液３にとり（ＯＤ２８０ｎｍは１．５〜
２である）、４℃で緩衝液３に対して透析し、その間に
緩衝液を少なくとも２回替えた。

透析した溶液をヒドロキシルアパタイトカラムにかけ［
バイオゲル・エイチ・ティー・ピー（Ｂｉｏｇｅｌ　１
１ＴＰ）、約２５ｍｇタンパク１５０Ｂカラム容量、流
速：１力ラム容量／時間で負荷したコ、４〜５力ラム容
量倍の緩衝液３で再洗浄し、緩衝液３中５ミリモル／Ｑ
〜５５ミリモル／（２のリン酸カリウム勾配液で、１力
ラム容量倍／時で２０時間以内に溶離した。トロポニン
Ｔを含有する画分を５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル勾配５〜２
５％）を用いて測定し、プールし、緩衝液４に対して透
析した。

透析した溶液をカラムにかけ［デイ・イー・ニー・イー
−サーバセル（ＤＥＡＥ−８ｅｒｖａｃｅｌ）　ＳＳ、
２３、カラム容量２０〜３０ＪＩＩ２．流速；１力ラム
容量／時］、３力ラム容量倍の緩衝液４で再洗浄し、緩
衝液４中０．０１モル／１２〜０．２５モル／ＱのＮａ
Ｃｆ２勾配液で、１力ラム容量倍／時で２０時間以内に
溶離した。溶出液中にトロポニン１が見られた。トロポ
ニンＴおよびトロポニンＣは別々に溶出した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥに従って、トロポニンＴを含有する両
分を集め、緩衝液４に対して再透析し、後の使用のため
に一２０℃で凍結させた。筋肉３００９からトロポニン
Ｔ約６〜８次９が得られた。

の単離 ８〜ｔ２週ｆｌのＢａ１ｂ／ｃマウスを、フロイント完
全アジュバントと一緒にトロポニンＴ（実施例１に従っ
てヒト心筋から単離した）１００μ９で腹腔的投与によ
り免疫した。６週間後、４週間おきにさらに３回、各５
０μ９のトロポニンＴで免疫し、水酸化アルミニウムに
吸着させ、ボルダテラ・ペルツシスを腹腔的投与した。

最後の免疫の１週間後に、血液試料を採取し、試験動物
の血清中の抗体力価を測定した。

免疫が陽性であれば、融合を行う。融合の４日、３日お
よび２日前に、それらを、各々、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝
化食塩水）中トロポニンＴ１００μ９で静脈内投与によ
り再度免疫した。

融合のために、免疫したマウスの１Ｘｌｏ”ｆｆ臓細胞
を、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）［エンザイモロジー（Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、７３．１９８１、ｐ、３の方法
］に従って２×１０７骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８−
６５３、ＡＴＣＣ−’ＣＲＬ　８３７５）と混合し、そ
の後、１０分間遠心分離した（３００９．４°Ｃ）。細
胞を血清不含培地で洗浄し、４００９で再度遠心分離し
た。上清を吸引し、細胞沈殿物に５０％ＰＥＧ溶液［分
子量４０００、メルク・カンパニー（Ｍｅｒｃｋ　Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）］　１　ｚＱを添加した。その後、室温で
１５分間のうちに、胎児ウシ血清（Ｆｅ２）を含まない
ＲＰＭＩ　１６４０培地［ＲＰＭＩ−ローズウェル・パ
ーカー・メモリー・インステイチュ−）（Ｒｏｓｅｗｅ
ｌｌ　Ｐａｒｋｅｒ　Ｍｅｍｏｒｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ）］を用いて、ゆっくりと２０ｍＱに希釈した。その
後、細胞懸濁液を４００９で１０分間遠心分離し、細胞
沈降物を選択培地（ＲＰＭＩ　　１６４０．１０％ＦＣ
３，１００ミリモル／Ｑヒポキサンチン、１ｘ’ｉ／ｘ
Ｑアザセリン）に取った。成長因子に関しては、供給細
胞の代わりとしてＨＢＯ２［ヒト内皮培養上清（Ｈｕｍ
ａｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＳｕｐ
ｅｒｎａｔａｎｔ）］　［ココラスターカンパニー（Ｃ
ｏｓｔａｒＣｏｍｐａｎｙ）、Ｎｏ、６１１０コを用い
た。

ウェル当たり５ＸｌＯ’細胞で２４ウエルブレ−ト［ナ
ンク・カンパニー（Ｎｕｎｃ　Ｃｏｍｐａｎｙ）］上に
融合細胞を撒いた。７〜１０日後にクローンの成長が肉
眼で見られた。実施例３に記載のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によ
って、１次培養の培養上澄液を試験した。

抗原−特異的な抗体を含有する１次培養を、９６ウエル
細胞培養プレート（ナンク・カンパニー）上で蛍光活性
化細胞ソーターを用いてさらにクローンした。供給細胞
の代わりとしてＨＦＯ２を用いた（前記参照）。

このようにして、ハイブリドーマセルラインクローン７
．１Ａ１２．２−２２および８．１Ｆ６．７−２の両者
を単離することができた。これらは受託機関ＥＣＡＣＣ
［ヨーロピアン・コレクション・サブ・アニマル・セル
・カルチャー７：　（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅｓ）］に、下記受託番号の下で寄託されている： ＥＣＡＣＣ８９０６０９０１（＝クローン７、１Ａ１２
．２−２２）およびＥＣＡＣＣ８９０３０３０８（＝ク
ローン８．　ＩＦ６．７−２）。

腹水を得るため、プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎ）　０　
、５　ｒｉ（ｌで１回または２回前処置をしたＢａ１ｂ
／ｃマウスに５Ｘ１０’ハイブリドーマ細胞を腹腔内注
射した。

２〜３週間後、マウスの腹から腹水を得ることができた
。通常の方法でこの腹水から抗体を単離することができ
た。これらモノクローナル抗体はヒト心筋トロポニンＴ
に対して特異的に指向し、骨格筋から得たトロポニンＴ
との交差反応性は全く示さないか、または僅かしか示さ
なかった。次に、これらをＭＡＢ　　７．１Ａ１２．２
−２２（クローン７．１Ａ１２．２−２２由来）または
ＭＡＢ８．１Ｆ６．７−２（クローン　８．１Ｆ６．７
−２由来）と命名した。

両モノクローナル抗体は、サブクラスＩｇＧ１／カッパ
に属する。

実施例３ ヒト心筋トロポニンＴに対する抗体のスクリーニング試
験 免疫したマウスの血清中のトロポニンＴに対する抗体の
存在および特異性を測定するために、／％イブリッド細
胞の培養懸濁液または腹水において、試験の基本として
ＥＬＩＳＡ法を用いた。すなわち、被覆緩衝剤（０，２
モル／Ｑ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム、ｐＨ９，
３〜９．５）中、室温で１時間、ヒツジ由来のヒトトロ
ポニンＴに対する１０μｇ／ｘ（ｌポリクローナル抗体
（ＩｇＧ）（免疫吸着的に精製；骨格筋トロポニンＴと
交差反応せず、心筋トロポニンＴと交差反応する；実施
例７に従って調製）で微量滴定プレートを被覆した。０
．９％塩化ナトリウム溶液および１％ウシ血清アルブミ
ンで２０分間再被覆した。その後、洗浄緩衝液（０，９
％塩化ナトリウム溶液）で洗浄した。室温で１時間、振
盪しながら、ウェル当たりｌＯＯμＱを用いて、抗原、
精製した１μ９／酎ヒトトロポニンＴまたは「天然（ｎ
ａｔ　１ｖｅ）　Ｊ　トロポニンＴ１すなわち梗塞血清
（１：２に希釈）のインキュベーションを行った。次い
で、洗浄緩衝液で再度２回洗浄した。室温で１時間、振
盪しながら、ウェル当たり１００μｇを用いて、試料を
インキュベートした。次いで、洗浄液で再度２回洗浄し
た。次に、さらに、室温で１時間、振盪しながら、ウェ
ル当たり２５１ＵのＰＡＢ＜Ｍ−Ｆａｇ＞５−Ｆａｂ（
Ｉ　Ｓ）−ペルオキシダーゼコンシュ’７’−４１００
μＱと一緒にインキュベートした。ここで、ＰＡＢ＜Ｍ
−Ｆ　ｃｇ＞　Ｓ　−Ｆ　ａｂ（Ｉ　Ｓ　）は、免疫吸
着によって精製したヒツジ由来のポリクローナル抗−マ
ウスＦｃγ抗体のＦａｂフラグメントである。洗浄緩衝
液を用いた洗浄工程の後、通常の方法（例えば、室温で
３０分間、ＡＢＴＳを用いて、４０５ｎｍでの吸光度の
差をｆｆ１Ａで測定した）で、ペルオキシダーゼ活性を
測定した。

実施例４ ヒト骨格筋トロポニンＴとの交差反応性の測定実施例３
の記載に従って、本発明の方法を行った。最初に、心筋
トロポニンＴの反応性を測定した。次に、交差反応を試
験する抗原（骨格筋トロポニンＴ）を各モノクローナル
抗体に、濃度を増加させながら添加した。

その後、交差反応を下記式に従って算出したＣ＝最大シ
グナルの５０％に達するために必要な抗原の濃度。

室温で１時間、または４°Ｃで一晩、０．２ミＩＪモル
／１２炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）に入れたマウス抗体
のＦａｇ領域に対する１０μ９／ｙ（ｌヒツジポリクロ
ーナル抗体で、微量滴定プレートを被覆した。

その後、２０分間、インキュベーション緩衝液（０，９
％塩化ナトリウム溶液および１％ウシ而面アルブミン）
で再被覆し、次いで、洗浄緩衝液［０゜９％塩化ナトリ
ウム溶液、０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０
　］で洗浄した。その後、インキュベーション緩衝液（
１％ウシ血清アルブミン含有０．９％塩化ナトリウム溶
液）中１０μ９／ｚ（ｌモノクローナル抗体（ＭＡＢ　
７．　Ｉ　Ａ　１２．２−２２、ＭＡＢ　　１）１００
μＱを添加し、室温で１時間、振盪しながらインキュベ
ートした。

ペルオキシダーゼコンジュゲートとして存在する第２の
モノクローナル抗体（ＭＡＢ　　８．ＩＦ６゜７−２、
ＭＡＢ　　２）を、室温で、溶液（１００ｚＵ／ｆｆ１
１２）中、抗原（１μ９／ｍ（ｌ心筋トロポニンＴ）と
−緒に予備インキュベートした。

ＭＡＢ　　１と一緒にプレートをインキュベートした後
、過剰の抗体を洗浄によって除去した。その後、インキ
ュベーション緩衝液中１％マウス正常血清でプレートを
再被覆した。予備インキュベートしたトロポニンＴ／Ｍ
ＡＢ　　２ペルオキシダ一ゼ複合体１００μｇをプレー
ト上に置き、室温で１時間、振盪しながらインキュベー
トした。結合したペルオキシダーゼ活性を、基質として
ＡＢＴＳを用いて肉眼で観察できるようにした。ＭＡＢ
　２がＭＡＢ　　１と同一であるかまたは重複したエピ
トープであると認識すると、ＭＡＢ　　１／トロポニン
Ｔ／ＭＡＢ　　２の間にペアが形成されず、その結果、
基質反応が起こる。得られた結果は、モノクローナル抗
体７．１Ａ１２．２−２２および８．１Ｆ６．７−２の
両者が心筋トロポニンＴ抗原の異なるエピトープに指向
していることを示した。

実施例６ ＥＬＩＳＡ法によるトロポニンＴの測定のための酵素−
免疫検定法 試薬１ １．２５μ９／酎ビオチニル化ＭＡＢ　　７．ｌＡｌ２
．２−２２［ジェイ・エイチ・ピーターズ等（ＪＨ，Ｐ
ｅｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、）、モノクローナレ・アンチ
ケルベル（Ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌｅ　Ａｎｔｉｋ６ｒｐ
ｅｒ）、スブリンゲル・ベルラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　
Ｖｅｒｌａｇ）、ベルリン、１９８５、第２０９頁〜第
２１２頁］ １０ミリモル／１２クエン酸塩緩衝剤 ４７ミリモル／Ｑリン酸塩緩衝剤、ＰＨ８，３５０ｘＵ
／ｘ１２ペルオキシダーゼとモノクローナル抗体８．１
　Ｆ６．７−２とのコンジュゲート［ダブリュ・チップ
（Ｉｌ、　Ｋｎａｐｐ）、ケイ・コル−バー（Ｘ、　Ｋ
ｏｌｕｂａｒ）、ジー・ウィック（Ｇ、　１ｉｃｋ）の
編集によるイムノフルオレセンス・アンド・リレイテツ
ド・ステイニング・テクニクス（ｌｅ＋ｎｕｎｏｆ　１
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　　ａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　
　Ｓｔａｉｎｉｎｇ’　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）（第
２１５頁〜第２２４頁、エルスヴアイア（Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ）／ノース・ホランド（Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１１．ａ
ｎｄ）、アムステルダム）におけるエム・ビー・ウィル
ソン（Ｍ、Ｂ１１１ｓｏｎ）、ピー・ケイ・ナカネ（Ｐ
、　Ｋ、　Ｎａｋａｎｅ）（１９８７）の方法と類似の
方法で調製した、活性の値はペルオキシダーゼに関係す
る］。

試薬２ １００ミリモル／ｅリン酸塩−クエン酸塩緩衝剤、ｐＨ
４，４ ３，２ミリモル／ａ過ホウ素酸ナトリウム１．９ミリモ
ル／Ｑ　ＡＢＴＳ（２，２°−アジノジ−［エチルベン
ゾチアゾリン−スルホネート（６）］）。

試料として、３．５、ｌｏまたは２５　ｎ９／　ｍＱ　
トロポニンＴを追加したヒト血清を用いた。

ストレプトアビジンで被覆したポリスチレン管（ＥＰ−
Ａ−０２６９０９２に従って調製）を用いて反応を行っ
た。

測定法： ２０〜２５℃で６０分間、管中で、１ｘ（ｌの試薬１と
一緒に試料０．２１４Ｑをインキュベートした。

吸引し、水道水で２回洗浄した。次に、試薬２を添加し
、２０〜２５℃で３０分間インキュベートし、光度計で
４２０ｎｍでの吸光度を測定した。

この方法で、標準曲線（第１図）が得られ、これによっ
て、患者試料のトロポニンＴＲ１度を測定することがで
きる。

離および精製 最初に、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中０．
１ｕ／ｍＱヒトトロポニンＴの溶液５５μｇでヒツジを
免疫した。さらに、７日目、１４４日目よび３００日目
免疫を行った。次に、３０日毎に免疫した。これらの後
の免疫には、各々、ＣＦＡ中０　、０５　Ｒ９ＩＲＱト
ロポニンＴ溶液２８μｇを用いた。６力月後、生の血清
が得られた。

生の血清ＩＱにエアロジル（Ａｅｒｏｓ　ｉ　１）　［
製造元：デグッサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）］　１５９を添加
し、室温で１時間撹拌し、遠心分離した。その後、上清
に１．７モル／Ｑ硫酸アンモニウムを添加し、室温で２
時間ゆっくりと撹拌した。その後、沈殿物を遠心分離し
、透析緩衝液（１５ミリモル／Ｑリン酸カリウム、５０
ミリモル／Ｃ塩化ナトリウム、ｐＨ７，０）０、２１２
中でホモジナイズし、透析緩衝液ｌＯρに対して４°Ｃ
で４回透析した。遠心分離の後、透析した生成物を、溶
離液として透析緩衝液を用いて、ＤＥ５２セルロースに
よって精製した。

溶出液を補足し、１５　ｔａｇ／　ｘ（ｌのタンパク濃
度で、５０ミリモル／１２リン酸カリウム、ｐＨ７，５
，１５０ミリ％に／Ｑ塩化ナトリウム（ＰＢＳ）、０．
１％アジドの最終濃度にし、室温でトロポニンＴ免疫吸
着剤カラムにかけ、ＰＢＳｌｏ、１％アジドでタンパク
を洗浄除去した。その後、１モル／１２プロピオン酸で
溶離した。

８５℃で一晩、ＤＭＳＯ中ｌＯ％（Ｖ／Ｖ）　３−　（
、トリエトキシシリル）プロピルアミンで乾燥した後、
Ｈ，Ｏで洗浄したスフェロジル（Ｓｐｈｅｒｏｓ　ｉ　
ｌ）　［ｏ　−ン・ボウレンク（Ｒｈｏｎｅ　Ｐｏｕｌ
ｅｎｃ）　Ｘ　ＯＣＯＯ５コおよび１５％硝酸をスフェ
ロジルーＮＨ，に転換して、トロポニンＴ免疫吸着剤を
調製した。この反応の後、ＤＭＳＯおよびインプロパツ
ールで１し、この吸着剤を５０℃で乾燥した。

スフェロジル−ＮＨ，を１０％グルタルジアルデヒド溶
液（ｐＨ３，７）と混合し、５５℃で２時間加熱した。

その後、真空下、ガラスフィルターによって懸濁液を濾
過した。ついで、スフ二ロジルの７容量倍の再蒸留水で
洗浄し、５容量倍の１０ミリモル／Ｑリン酸カリウム、
ｐＨ８，０１０，１モル／Ｃ塩化ナトリウムで再度洗浄
した。次いで、用いたスフェロジルの約５０％の容量の
ｌＯミリモル／Ｑリン酸カリウム、ｐＨ８１０，１モル
／Ｑ塩化ナトリウム中、スフエコジル１酎当たりトロポ
ニンＴ１０ｕを丸底フラスコに入れた。フラスコを、室
温で一晩、回転エバポレーター上で回転させた。

濾過の後、スフェロジルを０．９％ＮａＣｌ２溶液およ
びエタノールアミン溶液で、再度、数回洗浄した。その
後、３容量部のエタノールアミン溶液を添加し、室温で
１時間インキュベートした。濾過を再開した後、再度Ｎ
ａＣｌ２溶液で洗浄した。その後、ＰＢＳで免疫吸着剤
をｐＨ７，５に調節し、ＰＢＳ／アジ化ナトジナトリウ
ム化した。４°Ｃで貯蔵した。

実施例８ 心筋壊死の測定 実施例６に従って、不安定な狭心症の症状を有する３７
体の患者の血清において、トロポニンＴ測定の酵素−免
疫検定法を行った。

これらの患者のうち１３人（３０％）においてトロポニ
ンＴの有意な増加が見られた。これは、トロポニンＴの
測定が、トロポニン■試験と比較して小さい梗塞の検出
に対して明らかに高い感度を有することを示した。

壁内梗塞において、トロポニンＴの血清濃度曲線は、ト
ロポニンＩのそれとは有意に異なる。これは第２図に示
されているが、該第２図は、壁内筋梗塞を有する５２人
の患者の平均血清濃度曲線を示す。この梗塞グループに
おいて、平均としてのトロポニンＴが、疼痛開始の後、
〉３００時間増加することがわかった。このグループの
患者における絶対的診断感度の時間は、６時間口〜１９
５時間目までである。

梗塞のサイズが太き（異なっている（Ｑ−波および非−
Ｑ−彼ＡＭＩ）比較的大きい患者のグループにおいて、
トロポニンＴの絶対的診断感度の時間は、疼痛開始の後
、１２〜１４０時間目であった。

トロポニンＴ放出は、サイドシルのおよび構造的に結合
したマーカータンパクの特性を示す。再潅流したＡＭＩ
において、顕著なトロポニンＴビークが１白目に見られ
、これは非−再潅流ＡＭＩには存在しなかった（第３図
）。初期のトロポニンＴ放出における濯流依存性の変化
を用いて、血栓崩壊療法の効果を浸潤せずに予測するこ
とができる。トロポニンＩを含む他のマーカータンパク
については、同様の結果が全く見られなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、トロポニンＴアッセイの標準曲線を示すグラ
フである。 第２図は、壁内心筋梗塞を有する５２人の患者のトロポ
ニンＴの平均血清濃度を示すグラフである。 第３図は、疼痛開始の後、＜３．５時間の梗塞再潅流し
た患者２０人（Ｅ　Ｒ）、疼痛開始の〉３゜５時間の再
潅流をした患者２０人（ＬＲ）、および非−再潅流の梗
塞を有する患者２４人（ｐ　ｏ）における血清中のトロ
ポニンＴ濃度の相対的な増加の局所的に加重価を与えた
回帰線による滑らかな走査プロットを示すグラフである
。成功裏に再潅流した梗塞における顕著な初期トロポニ
ンＴ放出に注意すべきである。 ハフラング

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）トロポニンＴに対する少なくとも１つの抗体およ
   びトロポニンＴまたは該抗体の結合相手Ｂと一緒に血清
   または血漿試料をインキュベートし、それによって、ト
   ロポニンＴに対する抗体または結合相手Ｂのいずれかを
   測定可能な基で標識し、こうして生成する測定可能な基
   を含有する免疫学的複合体を単離し、単離した相または
   残りの相中の該測定可能な基を、試料由来のトロポニン
   Ｔの尺度として測定することを特徴とする免疫検定法に
   よる心筋壊死の測定方法。
2. （２）トロポニンＩおよび他の筋原線維タンパクに対す
   る交差反応性が＜２％であり、骨格筋トロポニンＴに対
   する交差反応性が＜５％であるトロポニンＴに対するモ
   ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
3. （３）数ヵ月間かけて、４〜６週間おきに少なくとも４
   回、ヒト骨格筋トロポニンＴおよびアジュバントで被験
   動物を免疫し、生の血清を単離し、ついで、免疫吸着的
   に精製することを特徴とするトロポニンＩおよび他の筋
   原線維タンパクに対する交差反応性が＜２％であり、骨
   格筋トロポニンＴに対する交差反応性が＜５％であるト
   ロポニンＴに対するポリクローナル抗体の製造方法。
4. （４）数ヵ月間かけて、４〜６週間おきに少なくとも４
   回、ヒト骨格筋トロポニンＴおよびアジュバントで被験
   動物を免疫し、Ｂリンパ球を単離し、これらを永久骨髄
   腫セルラインと融合し、抗体を単離するクローンを単離
   することを特徴とするトロポニンＩおよび他の筋原線維
   タンパクに対する交差反応性が＜２％であり、骨格筋ト
   ロポニンＴに対する交差反応性が＜５％であるトロポニ
   ンＴに対するモノクローナル抗体の製造方法。