CN103940986B - 肌钙蛋白i特定位点抗体制备及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肌钙蛋白I特定位点抗体制备及检测试剂盒。本发明是采用定点水解法获得所需人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的三条肽段，再通过免疫原性修饰后进行动物免疫获得高效价免疫血清，分别利用水解所提取的三条肽段作为配体，聚丙烯酰胺为配基制备亲和层析柱，将获得的高效价血清进行免疫亲和层析，从而获得针对该肽段特异性识别的多克隆抗体。该抗体其优点是亲和力高于相应单克隆抗体，特异性与相应单克隆抗体相当，且制备成本低，相对于单克隆抗体制备流程简单。利用获得的三组多克隆抗体制备成免疫乳胶试剂盒可用于半自动或全自动生发分析仪器测定血清中心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量。
Description
技术领域
本发明涉及肌钙蛋白I特定位点抗体制备及其检测试剂盒。本发明是应用作用于人心肌肌钙蛋白I（cTnI）单肽链特定位点的抗体，及采用该抗体制备测定血清中心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量的免疫乳胶试剂的方法。该发明制备的试剂盒可用于半自动或全自动生发分析仪器。
背景技术
心肌肌钙蛋白I（cTnI）是心肌损伤敏感及特异性最强的标志物之一，在急性心肌损伤及心肌炎中作为判断心肌细胞损伤的金标准，也作为冠动脉综合征危险分层及预后的关键生化标志物。肌钙蛋白属于调节蛋白，分子呈球形，由肌钙蛋白T（TnT）、肌钙蛋白I（TnI）、肌钙蛋白C（TnC）三条肽段组成，其中肌钙蛋白I（cTnI）属于一种碱性蛋白，共210个氨基酸，在血清中游离形式只占4.1%，大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合在一起，以复合体形式存在（WardDG,CornesMP,TrayerIP.StructuralconsequencesofcardiactroponinIphosphorylation.JBiolChem,2002,277(44):41795），此外还有可能以氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解形式释放（WardDG,AshtonPR,TrayerHR,etal.AdditionalPKAphosphorylationsitesinhumancardiactroponinI.EurJBiochem,2001,268(1):179），属于心肌损伤高敏感指标性物质，在“微型心肌损伤”中肌钙蛋白I即可出现阳性结果，因此是临床上作为心肌细胞损伤的标志性生化检测项目之一。
由于肌钙蛋白I（cTnI）在血清中存在的形式多样，而且衰减周期短，因此对识别肌钙蛋白I（cTnI）的抗体有很高要求，且不同方法制备的抗体在测定肌钙蛋白I（cTnI）含量时，所得结果也完全不同，使得临床上对肌钙蛋白I（cTnI）含量测定无法标准化。
临床上对肌钙蛋白I（cTnI）的检测灵敏度及特异性要求很高，虽然测定肌钙蛋白I（cTnI）的方法很多，但是定量测定受到许多因素的影响，从而导致各种检测结果之间相差很大。其中最主要原因是在患者血清中肌钙蛋白I（cTnI）会有不同程度的降解、游离、复合物形式及不同的清除率，形成肌钙蛋白I（cTnI）在血清中的不同半衰期，因此各种检测方法中分别使用针对上述不同抗原决定簇的抗体，其免疫反应必然有很大差异。
目前关于比浊测定法测定肌钙蛋白I（cTnI）的试剂有很多厂家，但是不管是试剂灵敏度，还是特异性都很难满足临床检测要求，这是因为肌钙蛋白I（cTnI）在正常人血清中含量极低，在0.08ng/ml以下，而大多比浊法检测极限在1ng/ml，而且在此检测极限情况下，影响测定结果的因素也被成倍放大。
发明内容
本发明的目的是为了解决以上现有技术测定肌钙蛋白I（cTnI）的试剂中存在灵敏度，还是特异性都很难满足临床检测要求的问题，使得临床上对肌钙蛋白I（cTnI）含量测定标准化；本发明是应用作用于人心肌肌钙蛋白I（cTnI）单肽链特定位点的抗体，及采用该抗体制备测定血清中心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量的免疫乳胶试剂，该免疫乳胶试剂可用于半自动或全自动生化分析仪器准确、特异性的测定血清中心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量。
本发明的技术方案
1本发明所涉及的肌钙蛋白I特定位点抗体检测试剂盒，包括针对肌钙蛋白I氨基端、羧基端和中心区域三条目的肽段的特定位点抗体制备的免疫胶乳试剂，缓冲液，促凝剂和氯化钠组成的反应剂。
2.该试剂盒中的免疫胶乳试剂是按以下方法制备的：
（1）通过蛋白水解法将如序列1所述序列的cTnI蛋白序列分解成氨基端，羧基端及中心区域三条如序列2、序列3和序列4所述序列目的肽段，并进行纯化的到相应具有半抗原性质的肽段；
（2）将以上所获得三个肽段经牛血清白蛋白修饰后进行动物免疫，获取作用于该肽段抗原决定簇的抗血清，再利用该肽段制备亲和层析柱进行亲和层析后获取该肽段特异性多克隆抗体纯品；
（3）利用（2）获取的三种抗体分别与微球进行共价偶联后得到的三种抗体微球按一定比例混合后制备成免疫胶乳试剂。
具体实施方案
本发明是采用定点水解法获得所需人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的三条肽段，再通过免疫原性修饰后进行动物免疫获得高效价免疫血清，分别利用水解所提取的三条肽段作为配体，聚丙烯酰胺为配基制备的亲和层析柱，将获得的高效价血清进行免疫亲和层析，从而获得针对该肽段特异性识别的多克隆抗体。该抗体其优点是亲和力高于相应单克隆抗体，特异性与相应单克隆抗体相当，且制备成本低，相对于单克隆抗体制备流程简单（KatrukhaA,BereznikovaA,FilatovV,etal.BiochemicalfactosinfluencingmeasurementofcardiactroponinIinserum.ClinChemLabMed,1999,37(11/12):1091）。
将上述方法获得的抗体分别与不同粒径的羧基聚苯乙烯胶乳微球进行化学固定后，在优化反应剂作用的条件下，与样本中肌钙蛋白I（cTnI）发生免疫复合反应，形成致密立体空间网状结构，在分光光度检测条件下达到定量测定的目的。
具体操作步骤如下：
1.肌钙蛋白I（cTnI）不同肽段抗体的制备：
（1）按常规方法（D.R.马歇克J.T.门永R.R.布格斯等著，朱厚础译.蛋白质纯化与鉴定实验指南.科技出版社，2000版。）提取自人血清中的肌钙蛋白I（cTnI）肽链，并进行氨基酸序列测序，所得氨基酸序列（序列1）：
（2）利用蛋白水解酶定点水解肌钙蛋白I（cTnI）肽链，采用凝胶排阻色谱法和反相高效液相色谱法进行肽段分布测定和纯化，收集需要的肽段。
1）氨基端肽段：长度为70个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端1～70残基之内（序列2）；:
2）中心区肽段：长度为82个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端34～116残基之内（序列3）:
3）羧基端肽段：长度为101个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端110～210残基之内（序列4）:
上述水解用蛋白酶可以蛋白酶K，胰凝乳蛋白酶，无花果蛋白酶，胃蛋白酶，链霉蛋白酶，菠萝蛋白酶，羧肽酶Y。水解时间为0.5～4小时，本发明优选蛋白酶K和羧肽酶Y，水解时间为1小时。
（3）用牛血清白蛋白分别将以上氨基端肽段、中心区肽段和羧基端肽段进行修饰，与弗氏佐剂混合对兔进行免疫，也可选用山羊，本发明优选兔。
上述选用的肽段修饰载体也可选用鸡卵清蛋白，兔血清白蛋白，纤维蛋白原，优选牛血清白蛋白。
（4）获取兔抗人肌钙蛋白I（cTnI）各肽段的高效价混合免疫血清，采用高效液相色谱分离纯化获得各区段目标多肽为配体，聚丙烯酰胺为配基的亲和层析柱，将多克隆抗体血清进行亲和层析
获得的具有高亲和力和特异性的抗体，分别编号：
识别氨基端肽段的抗体为：cTnI-Ab-1
识别中心区肽段的抗体为：cTnI-Ab-2
识别羧基端肽段的抗体为：cTnI-Ab-3
2.抗人心肌肌钙蛋白I抗体致敏的胶乳微球试剂的制备
（1）将cTnI-Ab-1通过共价连接的方法固定于160nm的羧基聚苯乙烯胶乳微球表面。
（2）将cTnI-Ab-2与60nm的羧基聚苯乙烯胶乳微球通过步骤1中同样的方法进行固定。
（3）将cTnI-Ab-3于250nm的羧基聚苯乙烯胶乳微球通过步骤1中同样的方法进行固定。
（4）关于上述将抗体与微球固定过程中可以选择抗体上羧基残基与氨基微球进行固定，上述3个步骤中微球粒径可以选择50～300nm中任意三种微球。本发明优选160nm，60nm和250nm的羧基微球。
（5）将上述三组微球进行1:2:1（按质量比）进行混合，配制成胶乳试剂，混合比例还可以是：1:2:3，1:3:1，2:3:2三种。
（6）反应剂主要成分如下：
其中促凝剂主要选用：聚凝胺，葡聚糖或者聚蔗糖中的一种或两种。
（7）胶乳试剂主要成分如下：
将三组胶乳微球按上述比例混合，加纯水至1000ml
3.试剂盒的组装
（1）试剂1（反应剂）
（2）试剂2（胶乳试剂）
将三组胶乳微球按上述比例混合，加纯水至1000ml
（3）标准品：纯化人心肌肌钙蛋白I（cTnI） 5ng/ml
pH=5.8的PBS缓冲液
备注：测定时，用pH=5.8的PBS缓冲液将5ng/ml标准液按倍比稀释的方法稀释成浓度分别为5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.313ng/ml五组标准液，采用五点定标的方式做标准曲线。
4.用该试剂盒定量测定样本中人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的步骤
（1）检测仪器及试剂：奥林巴斯AU640全自动生化分析仪，本发明配制的液体双试剂（反应试剂和胶乳试剂）。
（2）可采用新鲜人血清或重组人心肌肌钙蛋白I（cTnI）。
（3）操作步骤如下表1：
表1定量测定样本中心肌肌钙蛋白I（cTnI）的术式
结果计算：样品中肌钙蛋白值（μg/L）=△AT/△AS×校准液浓度
式中：△AT：样本管吸光度值
△AS：校准管吸光度值
附图说明
图1目的心肌肌钙蛋白I(cTnI)多肽片段纯度电泳图图中所示M：Marker，1:心肌肌钙蛋白I（cTnI），2：羧基端肽段，3：中心区肽段，4：氨基端肽段
图2不同位点抗体与不同肽段的免疫电泳图图中所示(a)cTnI-Ab-3分别与氨基端肽段（1），中心区肽段（2），羧基端肽段（3）免疫电泳图；(b)cTnI-Ab-2分别与氨基端肽段（1），中心区肽段（2），羧基端肽段（3）免疫电泳图；(c)cTnI-Ab-1分别与氨基端肽段（1），中心区肽段（2），羧基端肽段（3）免疫电泳图
图3实施例3测定结果与ELISA法的相关性
图4实施例4测定结果与ELISA法的相关性
图5实施例5测定结果与ELISA法的相关性
本发明的积极意义
本发明涉及肌钙蛋白I特定位点抗体制备及其检测试剂盒。本发明是采用定点水解法获得所需人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的三条肽段，再通过免疫原性修饰后进行动物免疫获得高效价免疫血清，分别利用水解所提取的三条肽段作为配体，聚丙烯酰胺为配基制备亲和层析柱，将获得的高效价血清进行免疫亲和层析，从而获得针对该肽段特异性识别的多克隆抗体。该抗体其优点是亲和力高于相应单克隆抗体，特异性与相应单克隆抗体相当，且制备成本低，相对于单克隆抗体制备流程简单。利用该免疫乳胶试剂制备的试剂盒可用于半自动或全自动生发分析仪器测定血清中心肌肌钙蛋白I（cTnI）含量。
本发明中使用的试剂购置于国内相关生物试剂公司，
实施例
以下实施例是为更好的说明本发明，而不对本发明要求保护的技术方案产生限制。
实施例1
——抗人心肌肌钙蛋白I抗体致敏的胶乳微球试剂的制备
1.取pH=7.4的0.1M的PBS缓冲液20ml，加入纯化的人心肌肌钙蛋白I（cTnI，本申请人按常规方法制备），配制浓度为100mg/L，先加入蛋白酶K，最终活力浓度为50KU/L，反应1小时后，加入蛋白酶K特异性抑制剂（EGTA二钠盐），终浓度为100mmol/L，混匀反应10min，然后加入羧肽酶Y，最终浓度为25KU/L充分混匀反应30min。加入羧肽酶抑制剂（二异丙基氟磷酸），终浓度为30mmol/L，混匀反应20min。
2.将上述混合液加入TSKgel4000SW色谱柱，用0.1M，pH=7.4的PBS进行洗脱，在280nm波长条件下对分离样品进行收集和检测（见图1中1泳道）。分别收集相对分子量在7KD（见图1中4泳道），9KD（见图1中3泳道），12KD（见图1中2泳道）的多肽片段，并收集获得的目的多肽片段后，保存于50mmol/L的MES，150mmol/L的氯化钠溶液中，-20℃冷冻保存。
3.将上述步骤收集的多肽片段用pH=6.0的MES缓冲液稀释成浓度为10mg/L，与3倍体积的同浓度牛血清白蛋白进行混合，加入1mg的碳化二亚胺，室温快速混合反应3小时后，转入4℃环境反应24小时，将混合反应液用70KD半透膜进行透析四次，收集透析液，用10KD超滤膜柱浓缩至100ml，在波长280nm波长条件下测定浓缩液中蛋白浓度，根据加入的牛血清白蛋白量和透析液中牛血清白蛋白量计算肽段与牛血清白蛋白的连接率，当连接率大于75%时，则达到修饰要求，则收集经牛血清白蛋白修饰后的肽段。
4.选择3～4个月龄的白兔作为免疫对象，按1.5μg/kg剂量进行淋巴结注射免疫，，每半个月免疫一次，免疫四次后，颈静脉取血，离心法收集血清。
5.同时将步骤2收集的多肽片段分别与琼脂糖凝胶4B配基进行固化，制备亲和层析柱。
6.将收集到的血清用2倍体积的pH=7.4的10mmol/L的PBS稀释，与制备琼脂糖凝胶4B在室温慢速混合（每个肽段免疫获得的血清用对应肽段琼脂糖凝胶4B混合），3小时后，将混合后的琼脂糖凝胶4B上柱，先用pH=7.4的10mmol/L的PBS缓冲液洗脱，去除杂蛋白后改用pH=3.0的甘氨酸缓冲液进行洗脱，并收集其洗脱液，将洗脱液改用10KD飓风超滤膜柱进行浓缩，并用30mmol/L的PBS缓冲液进行置换，即获得cTnI-Ab-1，cTnI-Ab-2，cTnI-Ab-3三组兔抗人cTnI的特定位点抗体，分别用获取的三组肽段与三组抗体进行免疫电泳（见免疫电泳图）
6.分别取160nm,60nm和250nm的三组改性羧基聚苯乙烯微球，分别用碳化二亚胺室温反应15min后，分别加入cTnI-Ab-1，cTnI-Ab-2和cTnI-Ab-3，室温反应4小时，20000r/min离心20min，弃上清，将沉淀物用20mmol/L的PBS分散重悬，即获得各自的抗体致敏胶乳微球。
7.将步骤6获得胶乳微球按cTnI-Ab-1：cTnI-Ab-2：cTnI-Ab-3为一定浓度比例进行配比混合，制备成胶乳试剂。
实施例2
用实施例1中所获取的修饰后多肽片段进行山羊免疫，按7μg/ml的浓度与弗氏佐剂混合，进行羊免疫，初始免疫后，每隔14天加强免疫一次，共免疫四次。其他步骤与实施例1相同。
实施例3
——试剂盒中各组分的配比
反应剂：
胶乳试剂：（1∶2∶1）
将三组胶乳微球按上述比例混合，加纯水至1000ml
校准品：
pH=5.8的PBS缓冲液 20mM
纯化人心肌肌钙蛋白I 5ng/mL
按本实施例中胶乳配比浓度的试剂盒对样本测定结果见表2所示。
实施例4
——试剂盒中各组分的配比
反应剂：
胶乳试剂：（1:2:3）
将三组胶乳微球按上述比例混合，加纯水至1000ml
校准品：
pH=5.8的PBS缓冲液 20mM
纯化人心肌肌钙蛋白I 5ng/mL
按本实施例中胶乳配比浓度的试剂盒对样本测定结果见表2所示。
实施例5
——试剂盒中各组分的配比
反应剂：
胶乳试剂：（2:3:1）
将三组胶乳微球按上述比例混合，加纯水至1000ml
校准品：
pH=5.8的PBS缓冲液 20mM
纯化人心肌肌钙蛋白I 5ng/mL
按本实施例中胶乳配比浓度的试剂盒对样本测定结果见表2所示。
实施例6
按上述实施例制备不同胶乳配比浓度的试剂盒测定同组样本，分别与ELISA法测定结果进行比较，，其结果见表2：
表2不同胶乳配比浓度的试剂盒测定同组样本与ELISA法测试结果的比较
表2中结果说明，本发明中三种不同胶乳配比浓度的试剂盒测定同组样本的结果与ELISA法测试结果比较显示出良好相关性（见图3、图4和图5所示）。
Claims (1)
1.一种肌钙蛋白I特定位点抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括由针对肌钙蛋白I氨基端、羧基端和中心区域三条目的肽段的特异性抗体制备的免疫胶乳试剂，缓冲液，促凝剂和氯化钠组成的反应剂，其中免疫胶乳试剂是按以下方法制备的：
(1)通过蛋白水解法将序列1所述序列的cTnI蛋白序列分解成氨基端，羧基端及中心区域三条序列2、序列3和序列4所述目的肽段，并进行纯化得到相应具有半抗原性质的肽段；
(2)将以上所获得三个肽段经牛血清白蛋白修饰后进行动物免疫，获取作用于该肽段抗原决定簇的抗血清，再利用该肽段制备亲和层析柱进行亲和层析后获取该肽段特异性多克隆抗体纯品；
(3)利用(2)获取的三种抗体分别与微球进行共价偶联后得到的三种抗体微球，按一定比例混合后制备成免疫胶乳试剂。
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