CN110183530A - 瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用 - Google Patents

瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用。该瘦素免疫原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。由该瘦素免疫原制备得到的抗瘦素的单克隆抗体的特异性较好、灵敏度较高。

Description

瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用
技术领域
本发明涉及一种瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用。
背景技术
瘦素(Leptin)是人的ob基因编码的含有167个氨基酸残基的单链蛋白质，其由脂肪细胞分泌到血浆后，在信号肽酶的作用下除去氨基端的21个氨基酸残基。因此，血浆中存在的瘦素全长为146个氨基酸残基，分子量约为16kDa。瘦素具有较好的亲水性，在血浆中大约80％的瘦素与血浆蛋白质结合，只有少部分以游离形式存在。瘦素通过与广泛存在于中枢神经系统、脂肪、心、肝、肺、肾、胰腺等不同组织和器官的特异性受体和相应的信号传导系统发挥生物效应，参与糖、脂肪和能量代谢的调节。
研究发现，在很多生理和病理情况下，人的瘦素水平会发生变化，对许多能量代谢有关疾病的发生、发展、预后和用药疗效检测都具有非常重要的临床指导价值。例如，肥胖者的血清瘦素浓度均高于非肥胖者，因此体内瘦素水平对肥胖的预防和治疗具有一定积极意义；恶性肿瘤患者血清中瘦素水平显著高于正常对照，经治疗后瘦素水平会相应降低，表明瘦素可能作为评价恶性肿瘤患者病情和用药前后疗效监控的指标；在正常妊娠中血清瘦素水平会随妊娠进展逐渐上升，妊娠高血压发生时瘦素水平也呈上升趋势，因此，瘦素对判断妊娠高血压病情具有一定临床价值。总之，瘦素与多种急慢性疾病相关，随着人们对其认识的加深，可以将其更好地应用于临床。
目前，瘦素的检测方法主要依赖于瘦素抗体与检测样本中的瘦素的特异性结合能力。因此，抗瘦素抗体的特异性和灵敏度对于瘦素含量的检测十分重要。
但是，目前市场上特异性较好、灵敏度较高的抗瘦素抗体还较少，不能满足市场的需求。
发明内容
基于此，有必要提供一种瘦素免疫原，由该瘦素免疫原制备得到的抗瘦素的单克隆抗体的特异性较好、灵敏度较高。
此外，还提供一种分泌特异性较好、灵敏度较高的抗瘦素的单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用。
一种瘦素免疫原，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。
上述瘦素免疫原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，由该瘦素免疫原制备得到的抗瘦素的单克隆抗体，能够特异性识别瘦素氨基端的41位～60位氨基酸残基，与瘦素的亲和力和灵敏度较高。
在其中一个实施例中，所述瘦素免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与所述多肽偶联。
一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，包括以下步骤：
用免疫原免疫动物，得到免疫后的动物的脾细胞，其中所述免疫原为上述瘦素免疫原；
将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选得到阳性融合细胞；及
对所述阳性融合细胞进行亚克隆，得到所述分泌瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。
一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞，由上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法制得。
一种抗瘦素的单克隆抗体，由上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌。
一种瘦素免疫原，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽。
在其中一个实施例中，所述瘦素免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与所述多肽偶联。
一种抗瘦素的多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
用上述的瘦素免疫原免疫动物，得到所述抗瘦素的多克隆抗体。
一种抗瘦素的多克隆抗体，由上述抗瘦素的多克隆抗体的制备方法制得。
上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种在制备瘦素检测试剂、制备瘦素检测试纸或制备瘦素检测试剂盒中的应用。
一种瘦素检测试剂，包括上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种。
一种瘦素检测试剂盒，包括上述瘦素检测试剂。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明一实施方式提供了一种瘦素免疫原，使用该瘦素免疫原制备的杂交瘤细胞分泌的抗瘦素的单克隆抗体能够特异性识别瘦素氨基端的抗原表位，并且与瘦素的亲和力强、灵敏度较高，能够应用于制备瘦素检测试剂、制备瘦素检测试纸、制备瘦素检测试剂盒。
具体地，该瘦素免疫原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列为：RINDISHTQSVSSKQKVTGL。上述瘦素免疫原针对瘦素的氨基端进行设计，如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列与人的瘦素全长氨基酸序列的41位～60位的氨基酸相同，且与瘦素的羧基端距离较大。以包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽的上述瘦素免疫原免疫动物后得到的抗体，能够特异性地识别瘦素的氨基端且亲和力强，避免干扰其他抗体识别和结合瘦素的羧基端。
在其中一个实施例中，瘦素免疫原还包括载体蛋白，载体蛋白与氨基酸序列如SEQID NO.1所示的多肽偶联。载体蛋白与多肽偶联作为免疫原有利于刺激辅助性T细胞，进一步诱导B细胞免疫反应。具体地，载体蛋白选自血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白(OVA)、兔血清白蛋白及纤维蛋白原中的一种。优选地，载体蛋白选自血蓝蛋白及牛血清白蛋白中的一种。
本发明一实施方式还提供了一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，该制备方法步骤S110～步骤S150。
步骤S110、用免疫原免疫动物，得到免疫后的动物的脾细胞。
具体地，免疫原为上述任一实施例中的瘦素免疫原。进一步地，免疫原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。
在其中一个实施例中，将免疫原与弗式完全佐剂混合并充分乳化后，注射入小鼠体内并不断加强免疫，取血检测血清效价，取效价达到105～106的小鼠的脾脏，得到免疫后的动物的脾细胞。
具体地，首次免疫的免疫原的剂量为90μg～120μg，末次免疫的免疫原的剂量为30μg～60μg，免疫的间隔时间为10天～21天。进一步地，首次免疫的免疫原的剂量为100μg～110μg，末次免疫的免疫原的剂量为40μg～50μg，免疫的间隔时间为14天～21天。
步骤S130、将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选得到阳性融合细胞。
具体地，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，然后经过选择性培养和筛选，得到阳性融合细胞。
具体地，利用SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列筛选分泌抗瘦素抗体的阳性融合细胞。
步骤150、阳性融合细胞进行亚克隆，得到所述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。
具体地，采用有限稀释法进行亚克隆，得到能够稳定分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。
上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，采用上述任一实施例的瘦素免疫原作为免疫原免疫动物，得到的杂交瘤细胞能够稳定分泌抗瘦素的单克隆抗体，且该单克隆抗体能够特异性识别瘦素氨基端的表位，对瘦素的亲和力高、特异性高。
本发明一实施方式还提供了一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。该杂交瘤细胞由上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法制得。该杂交瘤细胞分泌出抗瘦素的单克隆抗体记为LEP-Ab-01。其中，LEP-Ab-01能够针对性地识别瘦素的氨基端的表面抗原，具有高亲和力、高特异性。
本发明还提供一种抗瘦素的单克隆抗体，该单克隆抗体由上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法制备得到的杂交瘤细胞分泌。进一步地，该单克隆抗体为LEP-Ab-01。LEP-Ab-01是按照上述分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法制备得到的杂交瘤细胞分泌的效价最高的单克隆抗体。
上述抗瘦素的单克隆抗体能够特异性识别人的瘦素的氨基端，对人的瘦素的亲和力高、特异性高，且识别的位点与瘦素的羧基端距离较大，避免干扰其他抗体识别和结合瘦素的羧基端。可广泛应用于瘦素检测领域，如用于制备检测瘦素的检测试剂、检测试纸、检测试剂盒等。在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的单克隆抗体具有显著的优势。
具体地，上述抗瘦素的单克隆抗体可以作为捕获抗体。捕获抗体用于捕获待测样品中的抗原。上述抗瘦素的单克隆抗体也可以作为检测抗体。检测抗体用于与被捕获的抗原结合，以便检测。
本发明一实施方式还提供了另一种瘦素免疫原，使用该瘦素免疫原制备得到的多克隆抗体能够特异性识别瘦素羧基端的抗原表位，特异性较好、灵敏度较高，能够应用于制备瘦素检测试剂、制备瘦素检测试纸、制备瘦素检测试剂盒。
具体地，该瘦素免疫原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽。如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列为：SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGY。
经研究发现，瘦素羧基端106位～120位、116位～130位、126位～140位等氨基酸残基具有明显的生理功能，具有明显活性。包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽的上述瘦素免疫原针对瘦素的羧基端设计，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列与人的瘦素全长氨基酸序列的116位～140位的氨基酸相同，并且与瘦素氨基端距离较大。以包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽的上述瘦素免疫原免疫动物得到的抗体，能够特异性地识别瘦素的羧基端且亲和力强，避免干扰其他抗体识别和结合瘦素的氨基端。
在其中一个实施例中，瘦素免疫原还包括载体蛋白，载体蛋白与氨基酸序列如SEQID NO.2所示的多肽偶联。载体蛋白与多肽偶联作为免疫原有利于刺激辅助性T细胞，进一步诱导B细胞免疫反应。具体地，载体蛋白选自血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白(OVA)、兔血清白蛋白及纤维蛋白原中的一种。优选地，载体蛋白选自血蓝蛋白及牛血清白蛋白中的一种。
本发明一实施方式还提供了一种抗瘦素的多克隆抗体的制备方法，该制备方法包括步骤S210～步骤230。
步骤S210、用免疫原免疫动物，得到免疫后的动物。
具体地，该免疫原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽。进一步地，该免疫原还包括与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽偶联的载体蛋白。
在其中一个实施例中，用免疫原多次免疫兔，得到免疫后的兔。每次免疫时免疫原的剂量为为1mg～2mg，免疫的间隔时间为10天～14天。优选地，每次免疫时免疫原的剂量为为1mg～1.5mg。当然，免疫的部位包括但不限于背部皮下、腹部皮下、腋窝皮下、四肢皮下。
步骤S230、从免疫后的动物中提取并纯化抗瘦素的多克隆抗体。
具体地，从免疫后的动物的血液中分离和纯化抗瘦素的多克隆抗体。
上述抗瘦素的多克隆抗体的制备方法采用包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽作为免疫原，获得抗瘦素的多克隆抗体。
本发明一实施方式还提供一种抗瘦素的多克隆抗体，该多克隆抗体由上述抗瘦素的多克隆抗体的制备方法制备得到。进一步地，该多克隆抗体为LEP-Ab-02。
上述多克隆抗体能够特异性识别瘦素的多个抗原表位，特别是能识别位于瘦素的羧基端的抗原表位，对天然瘦素的特异性高、亲和力强。该多克隆抗体能够应用于瘦素检测领域。例如，能够用于制备瘦素检测试剂、制备瘦素检测试纸、制备瘦素检测试剂盒等。
上述抗瘦素的单克隆抗体及上述抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种在制备瘦素检测试剂、制备瘦素检测试纸或制备瘦素检测试剂盒中的应用。
具体地，本发明一实施方式提供了一种瘦素检测试剂。该瘦素检测试剂包括上述抗瘦素的单克隆抗体及上述抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种。进一步地，瘦素检测试剂包括上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体。更进一步地，瘦素检测试剂包括LEP-Ab-01和LEP-Ab-02。
在其中一个实施例中，上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的其中一种与磁微粒一起包被，形成捕获抗体，则抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的另一种被标记，形成检测抗体。当然，可以采用本领域常用的手段进行标记，例如荧光素标记法、酶标记法、生物素化标记法、胶体金标记法。在其中一个实施例中，选用吖啶酯作为标记。用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽为0.5ng/mL-100ng/mL，并且与酶标材料相比，吖啶酯更节约成本。
上述瘦素检测试剂包括上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种。在检测瘦素时，也具有良好的特异性及灵敏度。
本发明一实施方式还提供了一种瘦素检测试纸。该瘦素检测试纸包括固相载体及包被在固相载体上的捕获抗体。该捕获抗体选自上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的一种。具体地，固相载体为纤维素膜。
进一步地，该瘦素检测试纸还包括检测抗体，该检测抗体选自被标记的上述抗瘦素的单克隆抗体和被标记的上述抗瘦素的多克隆抗体中的一种。更进一步地，捕获抗体为上述抗瘦素的多克隆抗体，检测抗体为被标记的上述抗瘦素的单克隆抗体。将捕获抗体设为上述抗瘦素的多克隆抗体，能够提高上述该瘦素检测试纸的检测灵敏度和特异性。
上述瘦素检测试纸包括上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种，在检测瘦素时，也具有良好的特异性及灵敏度。
本发明一实施方式还提供了一种瘦素检测试剂盒，该包括上述瘦素检测试纸或上述瘦素检测试剂。
在其中一个实施例中，瘦素检测试剂盒还包括其他检测试剂。其他检测试剂可以根据检测需要设置。例如瘦素标准品、缓冲液。
上述瘦素检测试剂盒包括含有上述抗瘦素的单克隆抗体和上述抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种的检测试剂或检测试纸。因此，在检测瘦素时，具有良好的特异性及灵敏度。另外，与选择FITC作为标记材料的板式磁性微粒子化学发光分析试剂盒相比，上述瘦素检测试剂盒的重复性好、结果稳定。与利用表面官能团的胶乳增强免疫比浊试剂盒相比，上述瘦素检测试剂盒的灵敏度高、特异性高、不易受血脂浓度影响。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
免疫原的制备
(1)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽。如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为：RINDISHTQSVSSKQKVTGL；如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列为：SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGY。
(2)通过蛋白偶联技术，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽与牛血清白蛋白偶联，得到用于制备抗瘦素的单克隆抗体的免疫原，记作免疫原1。
(3)通过蛋白偶联技术，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽与牛血清白蛋白偶联，得到用于制备抗瘦素的多克隆抗体的免疫原，记作免疫原2。
实施例2
抗瘦素的单克隆抗体的制备
(1)将实施例1制备的免疫原1与弗式完全佐剂等量混合充分乳化后免疫3只BALB/c小鼠，每只BALB/c小鼠共免疫三次。每只小鼠前两次的免疫原1和弗式完全佐剂的注射量均为100μg，前两次的免疫间隔为14天。在细胞融合之前三天进行第三次免疫：将50μg免疫原1与等量弗式不完全佐剂混合充分乳化后免疫小鼠。然后继续将免疫后的BALB/c小鼠饲养三天，得到免疫后的小鼠。
(2)细胞融合：取免疫后的小鼠的脾细胞，并与预先培养好的Sp2/0骨髓瘤细胞(购自美国典型培养物保藏中心，简称ATCC)在PEG的作用下进行融合，得到融合细胞。
(3)选择性培养和筛选：使用HAT培养基在96孔细胞培养板上培养融合细胞，7天后取融合细胞的上清进行ELISA检测。其中，酶标板的包被抗原为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。挑取OD450﹥1.5孔内细胞作为阳性融合细胞。
(4)细胞克隆：对步骤(3)得到的阳性细胞融合细胞采用有限稀释法进行亚克隆，克隆3次，得到7株能够稳定分泌抗瘦素的单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别编号1～7。其中，编号1的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体记作LEP-Ab-01。
(5)腹水制备：8周龄的BALB/c小鼠注射石蜡10天后随机分为5组，按照一株杂交瘤细胞对应一组BALB/c小鼠分配，将步骤(4)得到的各株杂交瘤细胞扩大培养后注入对应组的BALB/c小鼠的腹部，7天后从各组BALB/c小鼠的腹部分别采集富含抗体的腹水。
(6)腹水效价检测：
将免疫原1分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍，使用间接ELISA检测腹水效价，部分检测结果如下表1所示。表1中，“1#”表示编号1的杂交瘤细胞所对应的组别，“2#”表示编号2的杂交瘤细胞所对应的组别，其他依次类推。
表1
(7)纯化鉴定：采用硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析纯化步骤(5)得到各组腹水。具体地：将步骤(5)得到的腹水分别进行硫酸铵沉淀：在搅拌条件下，将硫酸铵粉末分别加入各组的腹水中，5min-10min内形成各组的硫酸铵饱和溶液。；继续搅拌20min，然后4℃，10000×g离心10min，弃去上清液，将沉淀悬浮于2倍沉淀物体积的1×PBS中，并在1×PBS中过夜透析，除去硫酸铵，从而得到初级纯化物。
然后将初级纯化物过1×PBS平衡后的Protein A亲和层析柱，再用1×PBS洗去未与介质结合的杂蛋白，最后用0.1M甘氨酸洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的各组的单克隆抗体。经SDS-PAGE鉴定，纯化的各组的单克隆抗体的纯度在98％以上。
实施例3
抗瘦素的多克隆抗体的制备
(1)动物免疫：将实施例1制备的免疫原2与弗式完全佐剂等量混合充分乳化后注射2只新西兰大白兔，每只兔的免疫原2的注射量均为1mg。间隔14天后，进行加强免疫：将免疫原2与弗式不完全佐剂等量混合充分乳化后进行免疫注射，每只兔的免疫原2的注射量均1mg。进行三次加强免疫，每次加强免疫的免疫原2与弗式不完全佐剂均为1mg。每次加强免疫之前，采耳动脉血1ml检测抗体效价，至效价不再升高时取静脉血，以备分离纯化抗瘦素的多克隆抗体。
(2)纯化：采用硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析纯化步骤(1)得到纯化后的多克隆抗体。具体地：将步骤(1)得到的静脉血离心，得到血清，然后将血清进行硫酸铵沉淀：在搅拌条件下，将硫酸铵粉末分别加入各组的腹水中，5min-10min内形成硫酸铵饱和溶液。继续搅拌20min，然后4℃，10000×g离心10min，弃去上清液，将沉淀悬浮于2倍沉淀物体积的1×PBS中，并在1×PBS中过夜透析，除去硫酸铵，得到初级纯化物。
然后将初级纯化物过1×PBS平衡后的Protein A亲和层析柱，再用1×PBS洗去未与介质结合的杂蛋白，最后用0.1M甘氨酸洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的多克隆抗体，记为LEP-Ab-02。
实施例4
抗瘦素的单克隆抗体和多克隆抗体的配对
以瘦素标准品(购自Abcam)为被检测的抗原，采用双抗体夹心ELISA法，以标记的实施例2制备的交瘤细胞分泌的单克隆抗体为检测抗体，以实施例3制备得到的多克隆抗体为捕获抗体进行配对试验，以检测信号最高的一对抗体作为最适抗体对，并用已知瘦素含量的人血清进行复测确认。
结果表明，与LEP-Ab-02最适配对的为LEP-Ab-01。LEP-Ab-01识别瘦素的氨基端，LEP-Ab-02识别瘦素的羧基端。
实施例5
制备瘦素检测试剂盒
(1)纳米磁珠包被：取50mg羧基化的磁微粒(粒径为1μm)悬浮液，磁分离，留沉淀，然后使用20mM，pH5.5MES缓冲液重悬，加入1mL新鲜制备的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg实施例2制备的LEP-Ab-02，室温下混悬6h，磁分离，去上清，用含2％BSA的100mM pH8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到包被好的磁颗粒，按5mL/瓶分装，4℃保存备用。
(2)吖啶酯标记的抗瘦素的单克隆抗体的制备：取50ul 25mg/mL的实施例3制备的兔源抗瘦素的单克隆抗体(LEP-Ab-01)，加入150ul 0.1M pH9.0的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1.5μL 5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1.5h后取出，用5mL GE Desalting预装柱脱盐处理，先使用TBS平衡层析柱，然后加入反应后的吖啶酯溶液，收集蛋白峰样品保存，按5mL/瓶分装，4℃保存备用。
(3)瘦素定标品的制备：用缓冲液(40mM Tris-Cl，0.5％BSA，1％NaCl，pH8.0)将瘦素标准品配制成浓度为0ng/mL、20ng/mL、60ng/mL，每瓶0.5mL分装冻干，4℃保存备用。
实施例6
瘦素检测试剂盒的性能评价：
将实施例5制备的瘦素测定试剂盒以化学发光测定仪为检测工具，以双抗夹心法进行性能评价。即将待测样品或瘦素标准品和抗瘦素的多克隆抗体(即LEP-Ab-02)包被的磁颗粒反应10min后，进行磁分离。然后加入吖啶酯标记的抗瘦素的单克隆抗体(即吖啶酯标记的LEP-Ab-01)，反应10min后，进行磁分离。然后依次加入化学发光预激发液、化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光强度，从而绘制标准曲线，R2大于0.99，并根据标准曲线计算出待测样品的瘦素含量。
灵敏度的检测：
参照CLSI EP17-A文件推荐实验方法，计算得到实施例5的瘦素检测试剂盒的灵敏度为0.5ng/mL。
线性的检测：
用实施例5的瘦素检测试剂盒和浓度为0.5ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL和100ng/mL标准品做线性分析，计算得到线性相关系数r＝0.9995。根据CLSIEP17-A文件推荐的实验方法计算得出实施例5的瘦素检测试剂盒对瘦素样品检测的线性范围为：0.5ng/ml～100ng/mL。
精密度测定：
取浓度为20ng/mL及60ng/mL两个瘦素样本(由瘦素标准品配制，瘦素标准品购自Abcam)，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批实施例5的瘦素检测试剂盒进行检测，计算瘦素检测试剂盒批内及批间差。
计算结果表明实施例5的瘦素检测试剂盒批内及批间差均小于5％。
干扰性实验：
取浓度为20ng/mL及60ng/mL两个瘦素样本(由瘦素标准品配制，瘦素标准品购自Abcam)然后分别将两个瘦素分为六组，其中的五组分别添加不同的干扰物，剩余的一组作为对照。添加的干扰物为结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、胆固醇和甘油酯，干扰物的质量与混合血清的质量之比为1：20。然后分别测定混合血清及添加了不同干扰物后的混合血清的瘦素含量，计算混合血清与添加干扰物的混合血清的瘦素含量的偏差，以±10％为可接受范围。
计算结果表明，实施例5的瘦素检测试剂盒的干扰性均达到NCCLS的文件标准，可用于临床实验室瘦素状况的准确评估。
对比例1
在目前市场上瘦素含量的测定大多是酶联免疫吸附法，本实验比对血清瘦素测定采用美国DSL 10-23100Human leptin ELISA试剂盒。
测定方法：取瘦素校准品、质控品及实施例6中的干扰性实验样本，性能评估方法同实施例6。根据该试剂盒说明书进行实验操作并对结果进行计算，对比实施例5和实施例6中瘦素测定试剂盒评估结果。
计算结果表明，对比例1中美国DSL 10-23100Human leptin ELISA试剂盒与瘦素测定试剂盒结果符合率达到90％，一致性好。经过性能评估，瘦素测定试剂盒在灵敏度及抗干扰性均优于比对试剂。
对比例2
采用市售的人瘦素肽段(22位～56位氨基酸残基，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，即VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQK)作为免疫原制备单克隆抗体，记为C-Ab-10。具体地，制备C-Ab-10的方法与实施例2制备LEP-Ab-01的方法大致相同，其不同在于，对比例2的免疫原为采用市售的人瘦素肽段(22位～56位氨基酸残基)。
以瘦素标准品(购自Abcam)为被检测抗原，分别以标记的C-Ab-10和标记的LEP-Ab-01作为检测抗体，采用间接ELISA法进行效价对比，检测结果如下：
结果显示，使用市售免疫原制得的单抗效价低于LEP-Ab-01，本案的免疫原制得的单抗性能更好。
对比例3
采用市售的鼠源瘦素肽段(116位～130位氨基酸残基，具体序列如SEQ ID NO.4所示，即SCSLPQTSGLQKPES)作为免疫原制备多克隆抗体，记为LEPC-Ab-01。将LEPC-Ab-01与LEP-Ab-02分别作为捕获抗体，与检测抗体LEP-Ab-01进行配对实验，分别以瘦素标准品和含有高浓度瘦素的人血清作为被检测抗原，采用双抗体夹心ELISA法进行检测，检测结果如下：
结果显示，使用市售免疫原制得的多抗LEPC-Ab-01与LEP-Ab-01的组合测得的效价低于本案LEP-Ab-02与LEP-Ab-01的组合，本案的免疫原制得的多抗与LEP-Ab-01的组合性能更好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
<120> 瘦素免疫原、杂交瘤细胞、单克隆抗体、多克隆抗体及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys
1 5 10 15
Val Thr Gly Leu
20
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr
20 25
<210> 3
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr
1 5 10 15
Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser
20 25 30
Lys Gln Lys
35
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种瘦素免疫原，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽。
2.根据权利要求1所述的瘦素免疫原，其特征在于，所述瘦素免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与所述多肽偶联。
3.一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
用免疫原免疫动物，得到免疫后的动物的脾细胞，其中所述免疫原为权利要求1或2所述的瘦素免疫原；
将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选得到阳性融合细胞；及
对所述阳性融合细胞进行亚克隆，得到所述分泌瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞。
4.一种分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，由权利要求3所述的分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法制得。
5.一种抗瘦素的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求4所述的分泌抗瘦素单克隆抗体的杂交瘤细胞分泌。
6.一种瘦素免疫原，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽。
7.根据权利要求1所述的瘦素免疫原，其特征在于，所述瘦素免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与所述多肽偶联。
8.一种抗瘦素的多克隆抗体，其特征在于，制备所述抗瘦素的多克隆抗体的步骤包括：
用权利要求6～7任一项所述的瘦素免疫原免疫动物，得到所述抗瘦素的多克隆抗体。
9.权利要求4所述的抗瘦素的单克隆抗体和权利要求8所述的抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种在制备瘦素检测试剂、制备瘦素检测试纸或制备瘦素检测试剂盒中的应用。
10.一种瘦素检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述的抗瘦素的单克隆抗体和权利要求8所述的抗瘦素的多克隆抗体中的至少一种。
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