JP2925479B2 - 肺小細胞癌検出薬及びその使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血中又は尿を分析
することができる肺小細胞癌検出用キット及び方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】癌細胞は、正常細胞と共通する多くの物
質と共に、正常細胞はほとんど産生しない物質を産生す
ることが知られている。この物質を測定することによ
り、一部の癌細胞や癌患者の存在、特性を診断すること
が可能となっている。癌細胞が異常に多量に産生する物
質には、癌遺伝子産物及び、増殖因子などがあり、細胞
の癌化・増殖・進展に寄与している。また、癌胎児性抗
原やホルモン、酵素などの産生も細胞の癌化の特性と考
えられている。従って、癌細胞に特徴的なこれらの物
質、いわゆる腫瘍マーカーのいずれかを充分な感度で測
定できれば、その癌の診断が可能となる。

【０００３】これまで腫瘍マーカーとして実際に利用さ
れてきたものには、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェ
トプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１２５などの胎児性癌抗
原、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、酸性フォスファ
ターゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）などの酵素類、副
腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、抗利尿ホルモン（Ａ
ＤＨ）、カルシトニン（ＣＴ）などのホルモン関連物質
などの測定系がある。しかしながら、これらの測定系を
用いた癌患者血清の陽性率は高くなく、癌でありながら
既存の腫瘍マーカーは陰性である場合も多く、健常人・
良性疾患患者血清でも偽陽性になってしまうなど特異性
に大きな問題があり、悪性疾病を立証することはできな
かった。

【０００４】したがって、いくつかの測定系を組み合わ
せて診断することが必要となっている。新たな腫瘍マー
カーによりこれまで陽性とならなかった癌患者を診断で
きれば、癌診断の精度を高めることができる。肺癌に関
しては、神経内分泌細胞に由来する小細胞癌と、他の上
皮腫瘍である非小細胞癌に区別されてきた。肺小細胞癌
では、セロトニン、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモ
ン）、カルシトニン、ＧＲＰ（ガストリン放出ペプチ
ド）などの各種ペプチドホルモン類の産生が知られ、ま
た、ＡＰＵＤ系の細胞または、腫瘍に特徴的なＬ−ドパ
・デカルボキシラーゼ（Ｌ−ｄｏｐａ ｄｅｃａｒｂｏ
ｘｙｌａｓｅ）活性の高いこと、神経細胞に特徴的な神
経特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｅｎｏｌａｓｅ）、クレアチンキナーゼＢＢ活性が高
いことが報告されている。

【０００５】肺小細胞癌のマーカーとして現在使用され
ているものには神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、カル
シトニン（ＣＴ）などがあるが、肺小細胞癌患者の陽性
率は充分なものではない。ＧＲＰは、１９７８年ＭｃＤ
ｏｎａｌｄらがブタ胃組織より単離したガストリン分泌
促進作用を有する２７個のアミノ酸よりなる脳腸ペプチ
ドである。ヒトＧＲＰ遺伝子は１９８４年にクローニン
グされ、その後、各種の細胞においては、オールターナ
テイブスプライシングによって３種のＧＲＰ ｍＲＮＡ
が生成され、活性を有するＮ端側のＧＲＰの構造は同一
だがＣ端側構造の異なる３種のＧＲＰ前駆体（ＰｒｏＧ
ＲＰ）が産生されることも明らかにされた。

【０００６】本発明者らは、肺小細胞癌で産生される生
理活性ペプチドのスクリーニングの過程で、ＧＲＰが重
要な産物であり、さらに、肺小細胞癌で産生され得るＡ
ＣＴＨ、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、カルシトニンなど
を含む多種のペプチドの中でＧＲＰが、最も高頻度にか
つ大量に産生されるペプチドであることを明らかにし
た。そして、肺小細胞癌患者で高頻度に血中ＧＲＰ濃度
が高値を呈することを証明した。生理活性ペプチドなど
のシグナル伝達物質は、一般にその生体内での濃度を迅
速に調節する必要性から、生体内での半減期が短く、素
早く分解または修飾され、生理活性を失う事が知られて
いる。ＧＲＰは生理活性ペプチドであることから、一般
的に血中で不安定なことが予想される。このことが、従
来のＧＲＰを測定する方法が、感度の低さから実用的で
はなかった大きな理由の一つに挙げられる。

【０００７】これに対し、生理活性を持たないペプチド
は、それが活性を持たないため生体内で素早く分解され
る必要はない。従って、こうしたペプチドは生体内半減
期が長く、そのため比較的高濃度で存在する場合が多
い。ＧＲＰの場合、始めＰｒｏＧＲＰとして生合成さ
れ、このＣ末端部分が切断され、生理活性を有するＧＲ
Ｐとなる。従って、ＧＲＰとＰｒｏＧＲＰのＣ末端部分
は等モル存在することになるが、ＰｒｏＧＲＰのＣ末端
部分の分解速度は活性を持つＧＲＰよりも遅いため、Ｐ
ｒｏＧＲＰのＣ末端部分の血中濃度はＧＲＰの７０倍も
の高濃度で存在する。

【０００８】Ｈｏｌｓｔ（J. Clin Oncol, Vol. 7 1989
; 1831-1838）らはＰｒｏＧＲＰのＣ末端部分の４２−
５３部分の抗血清を取得し、ＲＩＡ（ラジオイムノアッ
セイ）の系を開発し、肺小細胞癌の有力な癌マーカーと
なりえることを示したが、感度、実用性の面から診断方
法・診断薬としては不十分であった。この方法は大量の
検体を必要とし、そこからの抽出操作が必要であり、抽
出した検体と抗血清と２４時間反応させ、次に放射ラベ
ルしたペプチドと４８時間反応させてＰｒｏＧＲＰを測
定している。このように反応時間として、３日間も必要
としたが、その検出限界能は、約１０pmol／Ｌ、つまり
１０fmol／mlであり、健常人を測定することもできず、
臨床応用には容易ではなく、実用に到っていない。

【０００９】特開平６−９８７９４号公報には、ＧＲＰ
の前駆体のＣ−末端の不活性領域３１−９８（ＰｒｏＧ
ＲＰ（３１−９８）（配列番号１））に対して生成せし
めたモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いて
血中のＰｒｏＧＲＰ断片を検出して肺小細胞癌を検出す
る方法が記載されている。しかしながら、本発明者らは
この方法では尿中のＰｒｏＧＲＰ断片を検出することが
難かしいことを発見した。

【００１０】血液を試料とした場合に比較して尿を用い
ることは、測定者側にとっては採血、血球成分の分離と
いった作業が減少され、検体の採取が容易なことから、
患者や検診受診者等の肉体的、精神的負担も大きく減少
する。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、肺小
細胞癌の存在を正確に反映し、しかも生体内及び尿中で
も比較的安定なＰｒｏＧＲＰ分子形を明らかにし、その
断片を特異的に認識する抗体を用いて、血液だけでなく
尿に対しても使用し得る、高感度で実用的な、肺小細胞
癌検出用キット及び方法を提供しようとするものであ
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】従って本発明は、ヒトガ
ストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）の前駆体（ＰｒｏＧＲ
Ｐ）中のＣ−末端側の不活性領域７０−９０（本明細書
においてＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）と略す場合があ
る）（配列番号：１２）を含む６３−９８（ＰｒｏＧＲ
Ｐ（６３−９８）（配列番号：１３）に対して特異的に
結合するモノクローナル抗体を一次抗体及び二次抗体と
して使用して血中又は尿中のＰｒｏＧＲＰ断片を測定又
は検出することを特徴とする肺小細胞癌の検出方法を提
供する。

【００１３】本発明はまた、ＰｒｏＧＲＰ（６３−９
８）（配列番号：１３）に対して特異的に結合するモノ
クローナル抗体２種類を含んで成る、上記の方法を実施
するために有用な、肺小細胞癌検出用キットを提供す
る。ＰｒｏＧＲＰ（６３−９８）（配列番号：１３）に
対して特異的に結合するモノクローナル抗体としては、
モノクローナル抗体２Ｂ１０，３Ｇ２，１Ｅ２，３Ｈ１
等が挙げられ、特に好ましくはハイブリドーマｐｒｏＧ
ＲＰ−２Ｂ１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１１０）とにより
生産されるモノクローナル抗体ＧＲＰ−２Ｂ１０、ハイ
ブリドーマｐｒｏＧＲＰ−３Ｇ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
１０９）により生産されるハイブリドーマＧＲＰ−３Ｇ
２が挙げられる。測定方法としては、エンザイム・イム
ノ・アッセイ（ＥＩＡ）が特に好ましい。

【００１４】

【発明の実施の形態】

１）ヒトＰｒｏＧＲＰと反応する抗体の製造方法 モノクローナル抗体は、その性質上抗血清などと比較し
て、特異性という点で非常にすぐれている。つまり、抗
血清は、類似の抗原決定基を有する２種のタンパク質と
抗体との間に広範な交叉反応を生じやすいが、モノクロ
ーナル抗体を用いることにより、非特異的なバックグラ
ンドの交叉反応性は大きく減少する。また、モノクロー
ナル抗体は、免疫グロブリンの混入等も少なく精製する
ことが可能であり、このことも特異性を高める要因とな
っている。モノクローナル抗体は、半永久的に安定して
供給することが可能である。

【００１５】本発明のモノクローナル抗体は、常法に従
って得ることができる。マウス、ラット等に上記抗原ペ
プチド、例えばＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を単独で、
あるいはアジュバントと混合して定期的に免疫する。望
ましくは３回以上の免疫の後、例えば脾臓、リンパ節を
摘出し、そのＢ細胞を適当な骨髄腫細胞と細胞融合させ
る。細胞融合は、例えばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｅｓｔｅ
ｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７
１９７５）により行なうことができる。得られたハイブ
リドーマ細胞を、例えば１０％ウシ胎児血清を含むＨＡ
Ｔ−ＲＰＭＩ１６４０培地等の適当な培養液中で培養す
る。培養上清中に産生された抗体を例えばＥＬＩＳＡ等
で検出することにより、ＰｒｏＧＲＰに対し特異的に反
応する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択し、
クローン化する。

【００１６】ヒトＰｒｏＧＲＰと反応するモノクローナ
ル抗体は、例えばマウスまたはラット腹腔にハイブリド
ーマ細胞を移植し、得られた腹水から回収することがで
きる。また、ハイブリドーマ細胞の培養上清から回収す
ることもできる。回収したモノクローナル抗体は、硫安
沈殿クロマトグラフィーなどの公知の方法により分離精
製することができる。本発明に用いられた抗血清は、常
法に従って得ることができる。ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツ
ジ、ウサギ、ニワトリ、モルモット等に上記抗原ペプチ
ドを単独で、あるいはアジュバントと混合して定期的に
免疫する。望ましくは３回以上の免疫の後、免疫した動
物の血液、卵等を採取し、抗血清や、抗体を含んだ黄卵
を回収することができる。

【００１７】当該抗体との十分なエピトープ−オーバー
ラッピングが存在する抗体も好適である。このエピトー
プ−オーバーラッピングは競合性試験を用いて容易に検
出できる。このために、たとえば酵素−イムノアッセイ
を用いて、１抗体と、前記の２つの結合配列の１つを免
疫源として用いて得られた１抗体とが、特定の基質もし
くは特定のエピトープへの結合に関してどの程度競合す
るかを試験する。このために、相応する配列のフラグメ
ントを含有する溶液を、標識された形の本発明により製
造された特定の抗体および過剰の当該抗体と共にインキ
ュベートする。

【００１８】生じる複合体の不動態化、液相から固相の
分離およびこの双方の相の１方中の結合された標識の立
証により、当該モノクローナル抗体が結合から特定の抗
体をどの程度排除できるかを容易に測定することができ
る。１０⁵ 倍過剰のときの最低５０％の排除が得られる
と、エピトープ−オーバーラッピングが存在し、相応す
る抗体は、本発明の方法に使用するために好適である。

【００１９】２）ＰｒｏＧＲＰ免疫測定系の構築 得られたＰｒｏＧＲＰに対する抗体を用い、放射免疫測
定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫
測定法（ＦＩＡ）などの公知の免疫測定法を構築するこ
とにより、ヒトＰｒｏＧＲＰを測定することができる。
標識として酵素を使うことは有利である。酵素として
は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およ
びＢ−ガラクトシダーゼが好適である。酵素の検出は基
質の添加および生じる色の測定によりおこなう。また、
標識に金コロイド粒子のような目視で判別できるものを
用いても有利である。公知の免疫測定法の一つの例とし
て、いわゆる競合免疫測定法の応用が考えられる。

【００２０】例えば、検体に放射性同位元素等で標識し
たＰｒｏＧＲＰを一定量混合し、さらに抗ＰｒｏＧＲＰ
抗体を混合し検体中のＰｒｏＧＲＰ及び標識ＰｒｏＧＲ
Ｐと反応させる。検体中のＰｒｏＧＲＰは、標識Ｐｒｏ
ＧＲＰと競合して抗ＰｒｏＧＲＰ抗体と反応するため、
検体中にＰｒｏＧＲＰが存在する分、標識ＰｒｏＧＲＰ
との反応が減少する。反応後、抗ＰｒｏＧＲＰ抗体をあ
らかじめ固相担体に結合させておくか、抗イムノグロブ
リン抗体、プロテインＡと抗ＰｒｏＧＲＰ抗体を反応さ
せることにより、結合、非結合標識ＰｒｏＧＲＰを分離
する。

【００２１】一般に用いられる方法により結合していな
い分画を洗い、標識されている放射性同位元素等を検出
する事によりＰｒｏＧＲＰを測定することが可能とな
る。公知の免疫測定法のもう一つの例として、いわゆる
サンドイッチ系の応用が考えられる。例えば、抗Ｐｒｏ
ＧＲＰ抗体をマイクロタイタープレート、ビーズ、ニト
ロセルロース膜、ナイロン膜等の免疫測定法に一般に用
いられる担体に結合させ、これを検体と接触させる事に
より、検体中のＰｒｏＧＲＰを担体上にある抗ＰｒｏＧ
ＲＰ抗体と反応させる。

【００２２】一般に用いられる方法により結合していな
い分画を洗い、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオ
チン等で標識した抗ＰｒｏＧＲＰ抗体と接触させ、担体
上にある抗ＰｒｏＧＲＰ抗体と結合したＰｒｏＧＲＰと
反応させる。一般に用いられる方法により結合していな
い分画を洗い、標識されている放射性同位元素、酵素、
蛍光物質、ビオチン等を検出する事によりＰｒｏＧＲＰ
を測定することが可能となる。また、金コロイドのよう
な視覚的に判定可能な物質を前述の抗体の一方に標識を
して、上述のサンドイッチ系又は競合法に応用し、判定
することも可能である。この測定系に用いる抗ＰｒｏＧ
ＲＰ抗体、標識抗ＰｒｏＧＲＰ抗体は、モノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体、またはその組み合わせのい
づれを用いることも可能である。

【００２３】ここで肝要なことは、担体に結合する抗体
とＰｒｏＧＲＰとの複合体が標識抗体と結合できるよ
う、抗体を組み合わせることであり、このような抗体の
組み合わせは、前述の系を組み立て、その系に適用して
みることにより選択することができる。凝集検定も有利
な実施形であり、前述の抗体の１方で被覆された粒子
と、他の抗体で被覆された粒子を作製する。検出すべき
物質への粒子の結合により、凝集がおこり、これは濁り
変化を目視で判定あるいは検出することができる。

【００２４】本発明の方法により、双方の使用抗体と結
合可能である２個のエピトープを含有するＰｒｏＧＲＰ
のペプチドフラグメントの存在を検出することができ
る。このようなフラグメントは主として腫瘍組織内に生
じ、腫瘍細胞から分泌されていると考えられる。このＰ
ｒｏＧＲＰ測定系を診断薬として用いることにより、血
液のみならず尿もサンプルとして、検診時等での癌患者
のスクリーニング、癌の性質の特定、および癌治療時の
治療効果モニタリング等に有用な情報が得られる。特
に、検体として尿を用いることは、血液と比較してより
測定者側の作業の減少と、検体の採取が容易なことか
ら、検診時での癌患者のスクリーニングへの応用が期待
される。

【００２５】

【実施例】以下、この発明を実施例に基づいてより具体
的に説明するが、この発明は下記実施例に限定されるも
のではない。例１． 血中又は尿中に存在する抗原決定基の検索（実
施例） ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の中で、特に血中及び尿中
に存在する抗原決定基を調べた結果、ＰｒｏＧＲＰ（７
０−９０）を含んだＰｒｏＧＲＰ（６３−９８）部分
は、ＰｒｏＧＲＰ（３１−６２）（配列番号：１０およ
び配列番号：１１）の部分に比較して、多量に存在して
いる可能性が高く、ＰｒｏＧＲＰ免疫活性を検出する上
で必要な領域であることを見いだした（表１）。以下に
その解析方法を述べる。

【００２６】この方法では、マイクロプレートに共有結
合させた各種ペプチド、すなわち、ＰｒｏＧＲＰ（３１
−９８）（配列番号：１）、ＰｒｏＧＲＰのアミノ酸３
１〜５２の断片（ＰｒｏＧＲＰ（３１−５２）（配列番
号：１０）と略す場合がある）、ＰｒｏＧＲＰのアミノ
酸４４〜６２の断片（ＰｒｏＧＲＰ（４４−６２）（配
列番号：１１）と略す場合がある）又はＰｒｏＧＲＰ
（７０−９０）（配列番号：１２）と、サンプル中の抗
原が、そのペプチドに対する抗体を加えたとき、競合的
にその抗体と結合反応を起こすので、その結果として固
相化したペプチドと反応した抗体量を検出する。もしサ
ンプル中の抗原の、固相化ペプチドに対応する領域が、
サンプル中で抗原抗体反応をおこなえるように、変性や
切断、そしてマスキング等なく露出あるいは保存されて
おれば、ＰｒｏＧＲＰを検出する上で非常によいエピト
ープとなるはずである。

【００２７】ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）（配列番号：
１）をキャリアー蛋白質として、サイログロブリンに結
合させ、リン酸緩衝液pH７．４に溶解し、１．０mg／ml
とし等量のフロイント完全アジュバントと混合し懸濁さ
せた。ニュージーランドホワイト種、ジャパニーズホワ
イト種ウサギに１匹あたりＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）
１００μｇ含有分を免疫した。その後、１０日毎にＰｒ
ｏＧＲＰ（３１−９８）を１００μｇ含有分で６回免疫
を繰り返した。高い抗体価を認めたウサギの採血をする
ことにより、抗血清を得た。

【００２８】次に、各種ペプチドを固相化したマイクロ
プレートウエルに、各種血清、尿サンプルまたはスタン
ダード液を５０μｌずつ加えた。ただちに、反応緩衝液
で希釈した上述のウサギ抗ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）
抗血清を１５０μｌ添加して、４℃で一晩反応させた。
洗浄液で５回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩ
ｇＧを添加して室温で１時間反応させた。洗浄液で５回
洗浄後、オルトフェニレンジアミンを基質として酵素反
応を室温で１時間反応させ、硫酸を添加して反応停止さ
せた。４９２nmの吸光度を測定し、スタンダードの吸光
度から検量線を作製した後、サンプル中のＰｒｏＧＲＰ
抗原活性を検出した。１０例の肺小細胞癌患者血清ある
いは１例の肺小細胞癌患尿中で実施した。各ペプチドの
スタンダード検量線を図１及び図２に示し、結果を表１
に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】各種血清中抗原性の解析を述べる。血清２
は、３種のペプチドの抗原性はほぼ均等でありＰｒｏＧ
ＲＰ（３１−９８）と比較しても大きな差は認められな
かった。血清４や５は、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）に
比較してＰｒｏＧＲＰ（３１−５２）及びＰｒｏＧＲＰ
（４４−６２）はほぼ同じ量の抗原性が認められたが、
ＰｒｏＧＲＰ７０−９０はその約２倍量の活性が認めら
れた。血清６・７および８は、ＰｒｏＧＲＰ（３１−５
２）の抗原性がかなり失われているが、ＰｒｏＧＲＰ
（４４−６２）及びＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）の抗原
性は比較的保持されていた。血清１０例の結果から、Ｐ
ｒｏＧＲＰ（３１−６２）の部分よりもＰｒｏＧＲＰ
（７０−９０）の部分を含んだ領域がよく抗原性が保持
されており、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）に対して約１
３８％であった。

【００３１】尿検体では１例ではあるが、ＰｒｏＧＲＰ
（７０−９０）を含んだ領域の抗原性が多量に存在して
おり、ＰｒｏＧＲＰ（３１−５２）及びＰｒｏＧＲＰ
（４４−６２）はほとんど存在しなかった。特に、Ｐｒ
ｏＧＲＰ３１−５２は血清７，８及び尿１において、Ｐ
ｒｏＧＲＰ（３１−９８）の抗原活性の約１０％以下で
あり、ＰｒｏＧＲＰ免疫活性の検出のためには、Ｐｒｏ
ＧＲＰ（３１−５２）以外の部分に対する抗体をもちい
ることが望ましい。

【００３２】これらのことから、ＰｒｏＧＲＰは血中に
分泌されてから循環中に様々な影響によって分解・修飾
をうけ、そのうちＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）を含んだ
領域は、他の部分よりも安定的に保存される検体が多
く、腎からそのまま排出されるが、Ｎ端側は生体内でな
んらかの影響で分解等を受け、腎からはほとんど免疫活
性を失ってから排出されていくと考えられる。以上の結
果から、ＰｒｏＧＲＰを測定する場合、血液及び尿を検
体としたときは、ＰｒｏＧＲＰ（３１−６２）以外の、
ＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）を含むＰｒｏＧＲＰ（６３
−９８）領域に結合しうる抗体またはレセプターを用い
ることが重要と判明した。

【００３３】例２． モノクローナル抗体の作製（実施
例） 後記の例１により得たＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）（配
列番号：１）をキャリアー蛋白質として、サイログロブ
リンに結合し、リン酸緩衝液（pH７．４）（ＰＢＳ
（−））に溶解し、１．０mg／mlとし、等量のフロイン
ド完全アジュバンドと混和し、懸濁させた。得られた懸
濁液の前記ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）０．０１〜０．
０５mg含有分を４〜６週令のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスに腹
腔内投与した。約１２週間後、免疫化動物に前記と同じ
濃度のＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）のＰＢＳ（−）溶液
０．０１〜０．０３mg含有分を尾静脈内に投与し、投与
３日後、免疫動物より無菌的に脾臓を摘出した。

【００３４】次に、メッシュを用いて脾臓を個々の細胞
にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、８−
アザグアニン存在下で数日間培養し、復帰突然変異体を
完全に除いた、対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｐ３×
６３Ａｇ８〔Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５−４９７（１
９７５）〕を前記と同様に洗浄後、その１．１×１０⁷
個と、前記脾臓細胞１．４×１０⁸ 個とを、混合した。
２００×ｇ、５分遠心後、上清除去し、３７℃に保温し
た５０％ＰＥＧ４０００（Ｍｅｒｃｋ）含有ＲＰＭＩ−
１６４０培地１mlを加え、細胞融合させた。

【００３５】融合した細胞は遠心によってＰＥＧを除い
た後、９６穴マイクロプレートを用いて、ヒポキサンチ
ン、アミノブテリン及びチミジン（以下ＨＡＴと略す）
を含む、１５％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有ＲＰＭＩ−１
６４０培地中で１〜２週間培養してハイブリドーマのみ
を増殖させた。その後ＨＡＴを含まない培地中で成育さ
せ、約２週間後、目的の抗体を産生するクローンを以下
に示すＥＬＩＳＡ法により検索し、所望の反応特異性を
有する本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを得た。

【００３６】ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を、リン酸緩
衝液pH７．４（ＰＢＳ）に溶解し、濃度１μｇ／mlとし
たものを、９６穴マイクロプレートの各ウエルに５０μ
ｌずつ分注し、４℃で一晩、もしくは室温１時間以上で
吸着させた。吸着後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有
ＰＢＳ（−）（Ｔ−ＰＢＳ）で３回洗浄し、１％ＢＳＡ
含有ＰＢＳ（−）を１ウエル２００μｌずつ分注し、室
温で１時間処理した。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）を除
き、ハイブリドーマ培養上清、また粗製または精製モノ
クローナル抗体等を各々５０μｌずつウエルに加え、室
温で１時間反応させた。

【００３７】反応後、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄後、１％Ｂ
ＳＡ、１％ポリビニルピロリドン、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ−２０含有ＰＢＳ（−）で５０００倍に希釈した酵素
標識抗マウスＩｑ（Ｇ＋Ｍ）抗体(Jackson社）を１ウエ
ルにつき５０μｌ加え、室温で３０分間反応させた。未
反応抗体をＴ−ＰＢＳで４回洗浄することにより除き、
オルトフェニレンジアミン溶液（和光純薬）を１ウエル
に５０μｌずつ加え、反応させ、室温２０分後、２Ｎ硫
酸溶液で反応を停止させ、波長４９２nmにおける吸光度
を測定した。

【００３８】得られたハイブリドーマをｐｒｏＧＲＰ−
１Ｅ２，ＰｒｏＧＲＰ−３Ｄ６，ｐｒｏＧＲＰ−２Ｂ１
０，ｐｒｏＧＲＰ−３Ｈ１，及びｐｒｏＧＲＰ−３Ｇ２
と命名し、この内ハイブリドーマｐｒｏＧＲＰ−２Ｂ１
０及びｐｒｏＧＲＰ−３Ｇ２はそれぞれ微工研条寄第４
１１０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１１０）及び微工研条寄
第４１０９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１０９）として工業
技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条約に基き１
９９２年１２月９日に寄託された。

【００３９】ウサギ抗マウスＩｇ各イソタイプ抗体(Zym
ed社）を用いた二重免疫拡散法により、これらのハイブ
リドーマの産生するモノクローナル抗体のイソタイプ
は、ＧＲＰ−１Ｅ２，ＧＲＰ−２Ｂ１０及びＧＲＰ−３
Ｇ２がＩｇＧ１，ＧＲＰ−３Ｄ６はＩｇＧ２ｂ，ＧＲＰ
−３Ｈ１はＩｇＭであることが明らかとなった。なお、
ｐｒｏＧＲＰとはＧＲＰ前駆体を意図する。上記の方法
により得たハイブリドーマｐｒｏＧＲＰ−２Ｂ１０，Ｐ
ｒｏＧＲＰ−３Ｇ２，ＰｒｏＧＲＰ−３Ｄ６，ｐｒｏＧ
ＲＰ−１Ｅ２及びｐｒｏＧＲＰ−３Ｈ１の１つをマウス
の腹水に接種し、その腹水から、プロテインＡカラム、
ゲルろ過カラム又はプロテインＧカラムを用いて純度９
０％以上に精製して、それぞれモノクローナル抗体ＧＲ
Ｐ−２Ｂ１０，ＧＲＰ−３Ｇ２，ＧＲＰ−３Ｄ６，ＧＲ
Ｐ−１Ｅ２，ＧＲＰ−３Ｈ１を得た。

【００４０】例３． 尿中で安定なエピトープを認識す
るモノクローナル抗体のスクリーニング（実施例） 各種ペプチドを固相化したマイクロプレートに各種モノ
クローナル抗体を一定量添加し、反応させた。洗浄後、
ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ）を添加し
て一定時間反応させた。洗浄後、オルトフェニレンジア
ミンを基質として酵素反応を室温で３０分間反応させ、
硫酸を添加して反応停止させ、ただちに４９２nmの吸光
度を測定した。その結果を表２のＡに示す。モノクロー
ナル抗体が認識するペプチドと反応すればシグナルは高
くなり、反応しなければ低い反応性を示すこととなる。
表２のＡからモノクローナル抗体２Ｂ１０，１Ｅ２，３
Ｇ２及び３Ｈ１はＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）を、モノ
クローナル抗体３Ｄ６はＰｒｏＧＲＰ（４４−６２）を
認識することがわかった。また、これらの結果を確認す
るため、以下の方法でペプチド阻害試験をおこなった。

【００４１】各種モノクローナル抗体を一定量と各種ペ
プチド５μｇ／mlと室温で２時間インキュベーションし
た。その反応液を、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を固相
化したマイクロプレートに添加し、室温で１時間反応さ
せることにより、モノクローナル抗体は液相中ペプチド
と固相化したＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）と競合的に反
応する。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ
（Ｇ＋Ｍ）を添加して一定時間反応させて、固相化した
ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）に結合したモノクローナル
抗体と反応させた。

【００４２】洗浄後、オルトフェニレンジアミンを基質
として酵素反応を室温で３０分間反応させ、硫酸を添加
して反応停止後、ただちに４９２nmの吸光度を測定し
た。ペプチドと無処理のものを各々のモノクローナル抗
体のコントロールとして、その結果を図３に示した。モ
ノクローナル抗体が認識するペプチドと反応すればシグ
ナルは低くなり、反応しなければ固相化したＰｒｏＧＲ
Ｐ（３１−９８）と反応してシグナルは高くなる。表２
のＢから、モノクローナル抗体２Ｂ１０はＧＲＰ（７０
−９０）のペプチドで阻害が認められ、前述と同じ結果
となった。同様にモノクローナル抗体１Ｅ２，３Ｇ２及
び３Ｈ１もＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）をエピトープに
もつと考えられる。

【００４３】

【表２】

【００４４】以上のようにＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）
でスクリーニングしてきた２Ｂ１０，１Ｅ２，３Ｇ２及
び３Ｈ１は確かにＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）の内部を
認識していることが確認された。

【００４５】例４． 血清中及び尿中ＰｒｏＧＲＰの検
出（実施例） ３Ｇ２を吸着させたマイクロプレートの各ウエルに反応
溶液を１００μｌずつ加えてから、検体または希釈した
各スタンダードを１００μｌを加えた。室温中で、２時
間撹拌しながら反応させた。各ウエルを約３５０μｌの
洗浄液で５回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識２Ｂ１０
溶液を２００μｌ加え、室温（２０〜３０℃）で６０分
間反応させた。各ウエルを約３５０μｌの洗浄液で５回
洗浄した。オルトフェニレンジアミン基質溶液２００μ
ｌを加えて、暗所、室温で６０分間静置後反応停止液５
０μｌを加えた。マイクロプレートリーダーを用いて、
ブランクウエルを対照として（波長４９２nm、２波長の
場合は副波長６００〜７００nm）の吸光度を測定した。
各種濃度のＰｒｏＧＲＰスタンダードの吸光度（図３）
から、各々の血清及び尿検体のＰｒｏＧＲＰ濃度（pg／
ml）を求めた。その結果を表３及び表４に示す。

【００４６】

【表３】

【００４７】

【表４】

【００４８】表３から血清を検体としてもこの測定方法
は肺小細胞癌の診断に有用であり、かつ、表４から、尿
中のＰｒｏＧＲＰ免疫活性をも測定することが可能であ
り、健常人と比較して、有意に肺小細胞癌患者尿中で多
量に存在することがわかった。

【００４９】例５． 血清中ＰｒｏＧＲＰの検出（参考
例） モノクローナル抗体２Ｂ１０及び３Ｇ２を混合吸着させ
たマイクロプレートの各ウエルに反応溶液（１％ＢＳ
Ａ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，０．５Ｍ ＮａＣｌを
含むリン酸緩衝液pH７．０）を１００μｌずつ加えてか
ら、血清検体、または希釈した各スタンダードを５０μ
ｌを加えた。プレートをふらん器に入れ３７℃で６０分
間反応させた。各ウエルを約３５０μｌの洗浄液（０．
０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液pH７．３）で
５回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗ＰｒｏＧＲＰウ
サギＩｇＧ溶液を１００μｌ加え、室温（２０〜３０
℃）で３０分間反応させた。各ウエルを約３５０μｌの
洗浄液で５回洗浄した。オルトフェニレンジアミン基質
溶液１００μｌを加えて、暗所、室温で３０分間静置
後、反応停止液（２Ｎ硫酸）１００μｌを加えた。

【００５０】マイクロプレートリーダーを用いて、ブラ
ンクウエルを対照として（波長４９２nm、２波長の場合
は副波長６００〜７００nm）の吸光度を測定した。各種
濃度のＰｒｏＧＲＰスタンダード（ＰｒｏＧＲＰ（３１
−９８））の吸光度から、各々の検体のＰｒｏＧＲＰ濃
度（pg／ml）を求めた。スタンダードから得られた標準
曲線を図４に示し、血清検体の測定結果を次の表５に示
す。例４（実施例）において使用したのと同じ尿検体を
上記の方法により測定した結果を表６に示す。

【００５１】

【表５】

【００５２】

【表６】

【００５３】表５及び表６から明らかな通り、様々な患
者血清及び尿検体を測定したところ、一次抗体としてモ
ノクローナル抗体を使用し、二次抗体としてポリクロー
ナル抗体を使用した場合、血清検体では肺小細胞癌で有
意に高値を示し、健常人血清、肺の良性疾患では、ほと
んど低値を示すことが判明したが、尿検体の分析は困難
であった。

【００５４】例６． 血清又は尿中のＰｒｏＧＲＰの免
疫活性のゲルろ過解析（実施例） 血清または尿１００μｌを、炭酸緩衝液pH８．０で膨潤
させたＳｕｐｅｒｄｅｘ３０pg（１×５０）カラムに添
加し、溶出画分を実施例５の測定法で免疫活性を測定し
た。その結果を図５に示す。この結果から、実施例５の
測定法における血清の免疫活性は、フラクションNo．２
１−２２にメインピークをもち、そのピークの低分子側
に分解産物と予想されるピークの肩が確認された。

【００５５】尿では、フラクションNo．２１−２２付近
のピークは認められず、血清で分解産物と予想されたピ
ークのみを、フラクションNo．２５−２６の付近に認め
た。これらの結果から、主に血液中では、分子量１００
００−１２０００前後の蛋白として存在し、生体内を循
環中に部分分解をおこし、分解したものがすみやかに尿
中に排出されるということが予想された。そして、その
尿中の分解産物は、主にＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）を
含んだ分子量２５００−７０００前後のものが多く含ま
れていると考えられる。

【００５６】参考例１．ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の
作製 （１）クローニングベクターの構築 図１に示す通り、ＰｒｏＧＲＰ遺伝子を約６０塩基対か
ら成るＤＮＡフラグメントに分割し、それぞれをホスホ
アミダイト法により合成した。

【００５７】

【表７】

【００５８】合成したフラグメントを逆層クロマトグラ
フィーにより精製し、Ｔ４リガーゼによる酵素反応によ
りＰｒｏＧＲＰ遺伝子を得た。得られた遺伝子の５′−
及び３′−末端はそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ部位及び
ＳａｌＩ部位を持ち、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し
たクローニングベクターｐＵＣ９に挿入した。これを用
い大腸菌ＪＭ１０７株を形質転換し、４０μｇ／mlのア
ンピシリン、ＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌ存在下、Ｌ培地に
て一晩培養し、候補株を得た。

【００５９】得られた候補株よりプラスミドを抽出した
後、サンガー法により挿入遺伝子の塩基配列を調べ、設
計した通りの遺伝子配列を持つことを確認した。この目
的とするＰｒｏＧＲＰを含むクローニングベクターを持
つ菌をｐＵＣ−ＧＲＰ（３１−９８）／ＪＭ１０７と命
名した。

【００６０】（２）発現ベクターの構築 ｐＵＣ−ＧＲＰ（３１−９８）／ＪＭ１０７株より制限
酵素ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩで消化し、約２２０塩基対の
ＰｒｏＧＲＰ遺伝子断片を抽出し、別途、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ，ＳａｌＩで消化した発現ベクターｐＡＴ−Ｔｒ
ｐＥ−ＴＧＦ−αの大断片とＴ４リガーゼを用いて結合
した。これを用い大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、４
００μｇ／mlのアンピシリン存在下、Ｌ培地にて一晩培
養し、候補株を得、これをｐＡＴ−ＴｒｐＥ−ＧＲＰ
（３１−９８）／ＨＢ１０１株とした。

【００６１】（３）発現蛋白質の精製 構築した発現ベクターを含む上記ｐＡＴ−ＴｒｐＥ−Ｇ
ＲＰ（３１−９８）／ＨＢ１０１株について培養を行な
い組換えタンパク質の発現を調べた。ｐＡＴ−ＴｒｐＥ
−ＧＲＰ（３１−９８）／ＨＢ１０１を４０μｇ／mlの
アンピシリンを含む３２mlのＬ培地中で一晩培養した
後、３．２１の０．５％カザミノ酸を含むＭ９培地に接
種し、３７度で培養し、６００nmにおける吸光度が０．
４になるまで培養したところでインドールアクリル酸を
最終濃度３０μｇ／mlになるように加え、さらに２０時
間培養を継続した後、遠心分離により１０ｇの菌体を集
めた。集めた菌体を２mg／mlのリゾチーム、２mM ＥＤ
ＴＡ及び１００mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を含
む溶液中に懸濁し、０度、３０分間放置した。さらに超
音波処理を行ない菌体を粉砕した後、遠心操作により不
溶性画分である沈殿を得た。

【００６２】得られた不溶性画分に８Ｍ尿素溶液を加え
可溶化し、遠心分離により上清を集め、ＤＥＡＥトヨパ
ール（TOSO社製）カラムクロマトグラフィーにより分離
精製した（溶出液：Ａ：２０mMトリス塩酸／６Ｍ尿素
（pH８．０）Ｂ：０．５ＭＮａＣｌ／溶出液Ａ（pH８．
０）、グラジエント濃度：ＡからＢを直線勾配／３００
分、カラム：φ１．６×４０cm、流速１ml／分）。溶出
画分を集め、透析、凍結乾燥を行ない、臭化シアンによ
りＴｒｐＥ部分を切断、除去した。これは、７０％ギ酸
中にタンパク質濃度が１％になるように発現組成物を加
え、臭化シアンを１００当量加え、３７度で２４時間放
置することにより行なった。

【００６３】さらに透析、凍結乾燥後、逆層ＨＰＬＣ
（溶出液；Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸／水、Ｂ：６
０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸／水）
により精製を行ない、３０mgのＰｒｏＧＲＰ（３１−９
８）のタンパク質を得た。このものの純度は逆層カラム
クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により単一のものであることを確認した。
またペプチドシーケンサーによるアミノ酸配列決定によ
り目的とするＰｒｏＧＲＰ配列を有していることを確認
した。

【００６４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AGT ACT GGT GAG AGC TCT TCT GTT TCT GAA CGT GGA TCC CTT AAG CAG 48 Ser Thr Gly Glu Ser Ser Ser Val Ser Glu Arg Gly Ser Leu Lys Gln 5 10 15 CAG CTT CGC GAA TAC ATC CGT TGG GAA GAA GCT GCT CGT AAC CTG CTA 96 Gln Leu Arg Glu Tyr Ile Arg Trp Glu Glu Ala Ala Arg Asn Leu Leu 20 25 30 GGC CTG ATC GAA GCT AAA GAA AAC CGT AAC CAC CAG CCG CCG CAG CCG 144 Gly Leu Ile Glu Ala Lys Glu Asn Arg Asn His Gln Pro Pro Gln Pro 35 40 45 AAA GCT TTA GGT AAC CAG CAG CCG TCT TGG GAC TCT GAA GAC TCT TCG 192 Lys Ala Leu Gly Asn Gln Gln Pro Ser Trp Asp Ser Glu Asp Ser Ser 50 55 60 AAC TTT AAA GAC 204 Asn Phe Lys Asp 65

【００６５】配列番号：２ 配列の長さ：４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 AATTCATGAG TACTGGTGAG AGCTCTTCTG TTTCTGAACG TGGATCC 47

【００６６】配列番号：３ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTAAGCAGC AGCTTCGCGA ATACATCCGT TGGGAAGAAG CTGCTCGTAA CCTG 54

【００６７】配列番号：４ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTAGGCCTGA TCGAAGCTAA AGAAAACCGT AACCACCAGC CGCCGCAGCC GAAA 54

【００６８】配列番号：５ 配列の長さ：６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCTTTAGGTA ACCAGCAGCC GTCTTGGGAC TCTGAAGACT CTTCGAACTT TAAAGACTAA 60 TAAG 64

【００６９】配列番号：６ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTAAGGGAT CCACGTTCAG AAACAGAAGA GCTCTCACCA GTACTCATG 49

【００７０】配列番号：７ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCTAGCAGG TTACGAGCAG CTTCTTCCCA ACGGATGTAT TCGCGAAGCT GCTG 54

【００７１】配列番号：８ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TAAAGCTTTC GGCTGCGGCG GCTGGTGGTT ACGGTTTTCT TTAGCTTCGA TCAG 54

【００７２】配列番号：９ 配列の長さ：６２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCGACTTATT AGTCTTTAAA GTTCGAAGAG TCTTCAGAGT CCCAAGACGG CTGCTGGTTA 60 CC 62

【００７３】配列番号：１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ペプチド 配列 Ser Thr Gly Glu Ser Ser Ser Val Ser Glu Arg Gly Ser Leu Lys Gln 5 10 15 Gln Leu Arg Glu Tyr Ile 20

【００７４】配列番号：１１ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ペプチド 配列 Leu Lys Gln Gln Leu Arg Glu Tyr Ile Arg Trp Glu Glu Ala Ala Arg 5 10 15 Asn Leu Leu

【００７５】配列番号：１２ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ペプチド 配列 Asn Arg Asn His Gln Pro Pro Gln Pro Lys Ala Leu Gly Asn Gln Gln 5 10 15 Pro Ser Trp Asp Ser 20

【００７６】配列番号：１３ 配列の長さ：３６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ペプチド 配列 Gly Leu Ile Glu Ala Lys Glu Asn Arg Asn His Gln Pro Pro Gln Pro 5 10 15 Lys Ala Leu Gly Asn Gln Gln Pro Ser Trp Asp Ser Glu Asp Ser Ser 20 25 30 Asn Phe Lys Asp 35

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、固相化したペプチドＰｒｏＧＲＰ（３
１−９８）又はＰｒｏＧＲＰ（３１−５２）と液相中の
種々の濃度のＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）とを抗−Ｐｒ
ｏＧＲＰ（３１−９８）ポリクローナル抗体に対して競
争させた場合の、ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）の濃度と
固相に捕捉された該ポリクローナル抗体との関係を示す
グラフである。

【図２】図２は、固相化したペプチドとしてＰｒｏＧＲ
Ｐ（４４−６２）又はＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）を用
いた場合の図１と同様の結果を示すグラフである。

【図３】図３は、モノクローナル抗体３Ｇ２を固相化
し、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識２Ｂ１０抗体
を用いてＥＬＩＳＡ法によりＰｒｏＧＲＰ（３１−９
８）を測定した場合の標準曲線を示すグラフである。

【図４】図４は、モノクローナル抗体２Ｂ１０及び３Ｇ
２の混合物を固相化し、二次抗体としてペルオキシダー
ゼ標識抗ＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）抗体を用いてＥＬ
ＩＳＡ法によりＰｒｏＧＲＰ（３１−９８）を測定した
場合の標準曲線を示すグラフである。

【図５】図５は、血清又は尿中のＰｒｏＧＲＰ免疫活性
のゲル濾過における溶出パターンを、ＰｒｏＧＲＰ（７
０−９０）に対して特異的に反応する２種類のモノクロ
ーナル抗体を用いて観察した結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/53 C12P 21/08 G01N 33/574 G01N 33/577 C12N 15/09

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）
   の前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）中のＣ−末端側の不活性領域
   ６３−９８（ＰｒｏＧＲＰ（６３−９８））（配列番
   号：１３）に対して特異的に結合するモノクローナル抗
   体を一次抗体及び二次抗体として使用して血中又は尿中
   のＧＲＰ断片を測定又は検出することを特徴とする肺小
   細胞癌の検出方法。
2. 【請求項２】 ＰｒｏＧＲＰ（６３−９８）（配列番
   号：１３）に対して特異的に結合するモノクローナル抗
   体２種類を含んで成る、請求項１に記載の方法を実施す
   るための肺小細胞癌検出用キット。
3. 【請求項３】 ヒトガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）
   の前駆体（ＰｒｏＧＲＰ）中のＣ−末端側の不活性領域
   ７０−９０（ＰｒｏＧＲＰ（７０−９０））（配列番
   号：１２）に対して特異的に結合するモノクローナル抗
   体を一次抗体及び二次抗体として使用して血中又は尿中
   のＧＲＰ断片を測定又は検出することを特徴とする肺小
   細胞癌の検出方法。
4. 【請求項４】 ＰｒｏＧＲＰ（７０−９０）（配列番
   号：１２）に対して特異的に結合するモノクローナル抗
   体２種類を含んで成る、請求項３に記載の方法を実施す
   るための肺小細胞癌検出用キット。